Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка экспресс-метода индикации микоплазм крупного рогатого скота.

2 1 ДГі? ВКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ

МЕДИЦИНИ

На правах рукопису

Г О Н Т А Р Ь

Алла Михайлівна

РОЗРОБКА ЕКСПРЕС-МЕТОДУ ІНДИКАЦІЇ МІКОПЛАЗМ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

16.00.03 — ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія, мікологія і імунологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Харків — 1997

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії вивчення хвороб молодняка Інституту експериментальної і клінічної ветеринарно: медицини УААН.

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, академік УААН Фукс Поліна Павлівна.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, член-кор,еспондент УААН Герман Вячеслав Валентинович,

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Стегній Борис Тимофійович.

Провідна організація —■ Харківський зооветеринарний інститут МСГ і продовольства України, м. Харків.

Захист дисертації відбудеться « 1997 року

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 02.32.01 при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН: 310023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можн^ ознайомитися у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини (м. Харків, вул. Пушкінська, 83).

Автореферат розіслано « А2 » ______ 1997 р.

Актуальність проблеми та ступінь дослідженості тематики дисертації

Серед захворювань в умовах тваринницьких господарств широко розповсюджені хвороби органів дихання, статевої системи, молочної залози. По кількості нанесених тваринництву економічних збитків перелічені хворобч займають одне з перших місць і тому їх ліквідація постає перед ветеринарною наукою і практикою як одне з першочергових та найважливіших завдань.

При вирішенні цієї складної та актуальної проблеми одним із вагомих та маловивчених питань є вияснення ролі мікоплазм у виникненні та розвитку різноманітних патологій. Високий процент виділення мікоплазм від хворих тварин дозволяє припустити, що ці мікроорганізми можуть відігравати провідну роль (Андреев Є. В., 1980, Борисович Ю. Ф. та ін., 1987) -

На цей період від великої рогатої худоби виділено більше ніж 25 видів мікоплазм. За даними світової літератури та раніше про' ведених досліджень в Україні (Митрофанов П. М., 1980, Boklisch

Н., 1987, Коромислов Г. Ф., 1987, Фукс П. П., 1991) М. bovis відноситься до найпатогенніших видів, викликає патологію респіраторних та генітальних органів, ураження молочної залози й суглобів.

Широкому розповсюдженню мікоплазмової інфекції серед різних вікових груп худоби сприяє відсутність простих та експресних методів діагностики.

Методи виділення, культивування та ідентифікації мікоплазм потребують затрат часу і не завжди дають позитивні результати.

Це, перш за все, пов’язано з необхідністю адаптації патогенних мікоплазм, які паразитують у тісному зв’язку з клітинами тварин, до безклітинних живильних середовищ. З іншого боку, умовно-патогенні та сапрофітні штами мікоплазм швидкозростаючі і блокують ріст повільнозростаючих патогенних штамів.

Існуючі мйтоди індикації мікоплазм якісні і потребують спеціального обладнання. Метод ІФА для виявлення мікоплазм не впроваджено у ветеринарну практику, що, перш за все, пов’язано з високою його собівартістю.

Правильно і своєчасно поставлений діагноз є запорукою успіху при недопущенні заносу збудника та його розповсюдження.

Мета роботи

Головна мета роботи — розробити еритроцитарний діагности-кум на основі моносиецифічних антитіл для індикації М. Ьоуіз.

Завдання досліджень

1. Розробити технологію одержання моносиецифічних антитіл до мікоплазм із високоактивної антитільної сировини.

2. Визначити технологію одержання антитільного діагностику-му для індикації М. Ьоуіб та випробувати для цього різноманітні носії.

3. Провести порівняльне випробування розробленого методу індикації з класичними методами виділення мікоплазм.

4. Випробувати запропонований метод індикації М. Ьоуіз в лабораторно-виробничих умовах.

Теоретична і практична цінність досліджень та їх наукова новизна

Вперше в Україні запропоновано високочутливий і специфічний еритроцитарний діагностикум на основі моноспецифічних антитіл для індикації М. Ьоуіб у спермі, патологічному матеріалі та назальних секретах від великої рогатої худоби. Одержаний діагностикум по чутливості не поступається мікоплазмовиділенню на селективних живильних середовищах, забезпечує точність та швидкість постановки діагнозу.

Розроблено технологічний і ефективний метод одержання моноспецифічних антитіл до М. Ьоуій з допомогою дисоціації імунних комплексів (позитивне рішення експертизи № 93007560 на видачу патенту України від 21.11.1996 р.).

Виконана робота дає змогу:

— використовувати молозиво першого надою для одержання моноспецифічних антитіл до мікоплазм; '

— застосовувати дисоціацію імунних комплексів як метод іму-носорбції для виділення специфічних антитіл до всіх видів мікоплазм великої рогатої худоби;

— налагодити масовий контроль на М. Ьоуіє сперми бугаїв-плідників на ДПС з допомогою антитільного діагностикуму в реакції РИГА, що забезпечуватиме недопущення заносу збудника;

— проводити експрес-індикацію М. Ьоуіє в патологічному матеріалі та назальних секретах від телят.

Рівень реалізації та впровадження наукових розробок

■ Основні результати досліджень впроваджені в практику у вигляді: «Методичних рекомендацій по виготовленню, застосуванню

іерімунної сироватки крові великої рогатої худоби для профі-ктики та терапії інфекційних пневмоентеритів телят», затверд-:них Методичною комісією ІЕКВМ від 10.11.1993 р.

«Методичних рекомендацій по виготовленню та застосуванню итроцитарного діагностикуму на основі моноспецифічних анти-і для індикації М. Ьоуіє», затверджених Методичною комісією ;КВМ від 11.10.1996 р., протокол № 6.

Апробація та публікація результатів досліджень

Основні положення дисертаційної роботи були повідомлені та •говорені на звітних зборах Вченої Ради ІЕКВМ (м. Харків, 192—1996), на Українській конференції молодих вчених: «Су-сні проблеми ветеринарної медицини» (Київ, 1994), на практичні конференції: «Збереження молодняка с.-г. тварин — запорука звитку тваринництва України» (Харків, 1994), на Міжнарод. 8 науково-практичній конференції: «Общая эпизоотология: им-яологические, экологические и методологические проблемы» (Хар-з, 1995), на 1 Міжнародній практичній конференції «Ветеринар-іе и зооинженерные проблемы животноводства» (Вітебськ, 1996). За темою дисертації опубліковано 6 наукових праць.

Структура та обсяг дисертації

Дисертаційна робота виконана иа-//£ сторінках машинописно. тексту і містить: вступ ( іГ стор), огляд літератури ( гХ?стор), асні дослідження (</4 стор), заключения (7 стор), висновки .6 стор), практичні пропозиції ( г.стор), додаток, що являє собою жументацію, яка підтверджує результати власних досліджень.

Список літератури складається із 259 джерел, з них 112 інозем-. Робота ілюстрована 16 таблицями та 3 рисунками.

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових результатів, що виносяться на захист

Особистий внесок дисертанта полягає у повністю самостійному іконанні всього обсягу методичної, екпериментальної роботи, про-іденні серологічних, мікробіологічних досліджень, статистичній іробці отриманих даних та їх оцінці.

На підставі аналізу результатів експериментів та співставлен-[ їх з даними літератури дисертантом сформульовані такі поло-ення, які виносяться на захист:

— методика відбору тварин-донорів для одержання високоак-івної антитільної сировини;

— технологія одержання моноспецифічних антитіл до мікоплазм гіперімунної сироватки крові кроля та із високоімунного моло-

іва від корів;

— технологічні параметри отримання еритроцитарного діагн( тикуму на основі моноспецифічних антитіл до М. bovis та апроб ція РНГА для виявлення мікоплазм у спермі, патологічному мат ріалі, назальних секретах великої рогатої худоби.

Ліатеріали та методи досліджень

Робота виконувалась в лабораторії вивчення хвороб молодняі Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медициі УААН в період з 1992 до 1996 року.

В роботі використовувались: •

Тварини: корови, нетелі, новонароджені телята, телята вікс З- 6 міс, кролі. ^

Мікоплазми: бульйонні культури референтних штамів мікопла; М. bovis, М. bovigeuitalium, М. bovirhinis із музею ІЕКВМ.

■ Бактерії: музейні штами бактерій Stahp. saprophititus albi Е. coli, Salm. suis, P. aeruginosa із колекції бактеріальних культ; лабораторії мікробіології та імунології ІЕКВМ. Бактерії культив вались на МПА, МПБ.

Віруси: вакцинний штам вірусу ІРТ-ІПВ «ТК», штам віру* ІРТ-ІПВ «Молдавський», референтні штами вірусів ВД-ХС «Ор гон», Г1Г-3 «SF-4», а також референтні штами ротд.-вірусу «Тіме валь», корона-вірусу «ВС-1». Віруси пасирували на перещеплюв них культурах НТ, НВ, ТрТ. Культури клітин вирощували на с редовищах 199, ІГЛА з 0,5% ГЛА з додаванням до 10% інакт вованої сироватки крові великої рогатої худоби. Пеніцилін ' стрептоміцин додавали із розрахунку по 100 ОД/мл.

Сироватки: сироватки крові від здорових та хворих тварин, с роватки молозива, які одержували за методом Чекишева (1975 гіперімунпа сиров&тка крові кроля до М. bovis, а також діагности ні сироватки із набору для діагностики ІРТ-ІПВ, ВД-ХС, ПГ-3.

Еритроцити: формалінізовані по Weinbach (1958) еритроцит бика та барана, еритроцити бика, які піддавались агрегації за м тодом Горіної та Оловникова (1975).

Для досліджень було використано 150 проб сперми в нативной та замороженому стані. Проби нативної сперми доставляли в л бораторію в термосі із льодом, в глибокозамороженому стані — посудині Д’юара. Проби до досліджень зберігали при —20°<

Назальні секрети від телят різних вікових груп зберігали пг —20°С.

Патологічний матеріал від загиблих телят: шматочки внутрії ніх органів та суглобна рідина.

Мікоплазмовиділення дослідного матеріалу проводили у відп відиості з «Методичними вказівками по виділенню, культивуванні* підтримці та ідентифікації мікоплазм», розробленими ВІЕВ (К< валенко Я. Р. та ін., 1971), та Методичними рекомендаціями «Гі

[італьний мікоплазмоз великої рогатої худоби та заходи боротьби з іим» (Курбанов І. А. та in., 1982).

Визначення антитіл у сироватках крові та молозива проводили допомогою серологічних реакцій: _

РНБА застосовували для виявлення антитіл до мікоплазм, ві* іусів ІРТ-ІГ1В, ВД-ХС з використанням бактеріальних антигенних иагностнкумів, запропонованих Фукс П. П. (1991).

РЗГА застосовували для виявлення антитіл до вірусів ПГ-3 (в кодифікації Стеценка В. І., 1976), а також для серологічної діаг-юетики рота- і корона-вірусних інфекцій («Методичні рекомендації іля лабораторної індикації та лікувально-профілактичних міроири-'мств при рота- й корона-вірусних ентеритах новонароджених те-іят», Харків, 1983).

РИГА для індикації М. bovis у дослідному матеріалі внкону-іали мікрометодом з допомогою набору Такачі. В лунки мікропа-іелі вносили по 0,025 мл гліцеринізованого (0,5%) фізіологічного юзчину >NaCl (pH 7,0). В перші лунки вносили по 0,025 мл попе-едньо оброблений дослідний матеріал: сім’яну рідину, клітини сперли, патологічний матеріал та назальні секрети і шляхом послідов-юго перенесення досягали двократних розведень дослідного ма-еріалу від 1 : 2 до 1 : 256. Потім в усі лунки планшету вносили по ),025 мл еритроцитарпого діагностикуму в робочому розведенні.

Облік реакції проводили через 2 години за виглядом осаду. За гитр мікоплазмового антигену в дослідних пробах приймали мак-мімальне його розведення, яке викликало аглютинацію сенсибілі-юваннх еритроцитів.

При постановці РНГА використовували контролі:

1. Контроль на самоаглютпиацію: гліцеринізований (0,5%) філологічний розчин та живильне середовище Хоттінгера+сенсибі-іізовані еритроцити.

2. Контроль на специфічність: гетерогенні культуральні рідині вірусів: ІРТ-ІПВ, рота-, корона-, ПГ-3, ВД-ХС, та мікоплазм:

bovigenitalium, М. bovirhinis + сенсибілізовані еритроцити.

3. Контроль на активність: бульйонна культура М. bovis+сен-:нбілізовані еритроцити.

Біохімічні дослідження:

визначення кількості білка в дослідних елюатах антитіл проводили з допомогою спектрофотометра та за методом Лоурі/

— для визначення кількості Ig G та Ig М використовували метод радіальної імунодифузії за Манчіні (1965);

— гомогенність дослідних препаратів перевіряли методом електрофорезу в ПААГ.

Статистичну о'бробку одержаних результатів проводили з допомогою комп’ютера IBM PC/AT з використанням програм ветеринарної статистики, . '

Одержання високоактивної сировини для виділення антитіл

Важливим етапом при розробці еритроцитарного антитільног діагностикуму для експрес-індикації М. bovis став пошук високо активної імунної сировини.

З цією метою використовували гіперімунні сироватки крові 2 кролів. Для цього проводили імунізацію тварин антигеном М. bovi за методикою Al-Aubaidi, Fabricant (1971). Антиген М. bovis одер жували із тридобової культури мікоплазм шляхом їх концентра ції в 100 разів у порівнянні з початковим об’ємом. Антиген змі шували з неповним ад’ювантом Фрейндта і вводили його кроляг триразово комбінованим способом. Через 61 день від початку іму нізації тварин знекровлювали. Серологічна активність одержани: гіперімунних сироваток до М. bovis складала в середньому 8 log в РНБА.

Для одержання молозивного імуноглобуліну відбирали групі глибокотільних корів. В період сухостою у тварин відбирали кров сироватку якої досліджували в РИБА на наявність антитіл ді М. bovis. Титр специфічних антитіл до згаданого збудника складаї 8—9 log2. Від тварин із зазначеним в сироватці крові титром анти тіл відбирали молозиво першого надою. Із нього одержували си роватку, з якої імуноглобуліни добували за методом Чекишев; (1975). Титр антитіл до М. bovis в молозивному імуноглобулін складав 10 log2 і більше. ■

Таким чином, основною сировиною для добування специфічни: антитіл до М. bovis виявились: гіперімунна сироватка крові кролі та молозивний імуноглобулін.

Розробка ефективних методів одержання моноспецифічних антитіл для Індикації М. bovis

Моноспецифічпі антитіла до мікоплазм одержували методам] імуносорбції з використанням імуногельсорбенту н методу дисо ціації імунних комплексів.

Методологія одержання специфічних антитіл побудована на єди них принципах, які включають в себе такі етапи: 1) антиген, де якого одержують специфічні антитіла, переводять в нерозчинні становище і формують імуносорбент. 2) інкубація імуносорбент; з антисироваткою й утворення комплексу антиген-антитіло. 3) руй нування імунного комплексу та елюція специфічних антитіл.

При одержанні імуносорбенту ми керувались методиками Ру косуєва (1973), Avrameas (1969), основаними на полімеризації ан тнгену з утворенням нерозчинних агрегатів, використовуючи глу таровий альдегід як функціональний реагент. ' '

Антитіла елюговали розчином 0,1 М НСІ-глІцинового буфера (pH 2,5), кисле середовище нейтралізували сухим бікарбонатом до pH 7,0.

Після цього визначали кількість загального білка, імуноглобу-лінів та їх класи.

Тестування антитіл проводили в. серологічних реакціях з набором вірусних антигенів ІРТ-ІПВ (РНБА), ВД-ХС (РНБА), ПГ-3, рота-_,корона-вірусів (РЗГА) і Б-антигенами М. bovigenitalium, М. bovirhinis в РНБА.

В результаті досліджень в одержаних препаратах були виявлені специфічні антитіла лише до М. bovis, що дозволило довести їх моносиецифічність.

Найвищу концентрацію специфічних антитіл виявлено в елю-атах, одержаних із молозивного імуноглобуліну (5,25 log2). Серологічна активність препаратів специфічних антитіл, виділених з гіперімунної сироватки, складала 3,75 log2. -

Це пояснюється тим, що згадана вище антиснроватка вміщує антитіла низької авідності, які легко виділяються з імуносорбенту навідміну від сироватки крові гіперімунізованих тварин.

Антитіла до М. bovis, одержані з допомогою імуногельсорбен-ту, складалися з Ig G та Ig М. Це було підтверджено методом електрофорезу в ПААГ.

Таким чином, проведені дослідження довели можливість одержання моноспецифічних антитіл до мікоплазм методами імуно-сорбції. Але, враховуючи складність даного методу, ми запропонували спосіб одержання препарату специфічних антитіл з допомогою дисоціації імунних комплексів.

Запропонований спосіб базується на тому, що із процесу виключається використання імуносорбенту. його заміняє формаліні-зований антиген із референтного штаму М. bovis.

Антиген змішували з антисироваткою у співвідношенні 1 : 1. Імунні комплекси осаджували ПЕГ-115. Для їх дисоціації використовували 0,1 М НСІ-гліциновий буфер (pH 3,0). Елюцію антитіл проводили центрифугуванням осаду імунних комплексів при 7000 об/хв в цьому ж буфері з pH 2,2 протягом 20 хв. Елюапг швидко нейтрадізовували сухим бікарбонатом до pH 7,0.

В результаті досліджень найвищий показник титру (6,75 log2) специфічних антитіл отримано при використанні молозивного імуноглобуліну.

При вивченні елюатів антитіл в серологічних реакціях з гетерогенними вірусними і мікоплазмовими антигенами отримані негативні результати, які дозволили довести моноспецифічність одержаних препаратів лише до М. bovis (таблиця і).

Таблиця 1 — Серологічна активність елюатів антитіл, одержаних з допомогою дисоціації імунних комплексів,

X іо22, М+ш

Титри антитіл в елюата* до гетерогенних антигенів

Назва Титр АТ елюатах вірусів ■ мікоплазм

сировини для одержання ІК ІРТ- ІПВ вд- хс ПГ-3 рота(. коро, на. М. | М. Ьоуі- і Ьоуі-йепі- І гЬі-Іаі. 1 шэ

РНБА РНБА РНБА РЗГА РНБА

1. Гіперімунна сироватка крові кроля 4,5± 0,29 0 0 0 0 0 0 . 0

2. Молозивний імуно-глобулін

6,75±0,28

Таблиця 2 — Характеристика елюатів, одержаних з допомогою дисоціації імунних комплексів, X І0£2, М+іті

Назва антисироватки при одержанні ІК

Титр специфічних антитіл до М. Ьоуіб (РНБА'

Концентрація імуноглобулінів, мг/мл _____

М

1. Гіперімунна сироватка 4,5±0,29

крові кроля проти М. Ьоуіб

2. Молозивний імуноглобу- 6,75 ±0,28 Лін

1,0

1,5

0,11

При дослідженні методом електрофорезу в ПААГ моноспеци-фічні антитіла з титром 6—7 1о§2 розміщувались в зоні рухомості імуноглобулінової фракції, а-при використанні реакції імуноди-фузії за Манчіпі — визначені як клас ^ й (таблиця 2).

Таким.чином, запропонований спосіб одержання моноспецифіч-них антитіл дозволяє виділяти їх у високих титрах, використовуючи як сировину молозивний імуноглобулін. ■

Розробка антитільного діагностикуму для індикації М. Ьоуів

Під час розробки антитільного діагностикуму для індикації М. Ьо\'І8 ми запланували етапи досліджень:

1. Випробування різних носіїв специфічних, антитіл...........

0

0

о

о

о

о

о

2. Пошук ефективних і технологічних методів фіксації та тя.ні-зації носія.

3. Визначення оптимальних режимів сенсибілізації носія елюа-тами специфічних антитіл.

4. Вибір оптимального стабілізатора для антитільного діагно-•етикуму.

Результати випробування різних носіїв для специфічних антитіл показали, що найефективнішим виявилося використання еритроцитів бика. При застосуванні еритроцитів барана діагностикум мав низьку серологічну активність з бульйонною культурою М. Ьо-vis, а при випробуванні інертного бактеріального носія викликав спонтанну аглютинацію.

При виготовленні еритроцитарного діагностикуму розроблено основні технологічні етапи: формалінізація еритроцитів бика 2,5%-ним розчином формальдегіду протягом 12 годин; танізація форма-лінізованих еритроцитів бика розчином таніну в розведенні 1:20000 протягом 20 хв при 37 °С та сенсибілізація їх елюатами моноспецифічних антитіл (робоче розведення 6—7 Iog2) протягом 40 хв з буферним розчином pH 6,4; співвідношення еритроцитів та сенситину 1:1. Для стабілізації діагностикуму використовували

0,5% розчин гліцерину.

Специфічність одержаного діагностикуму перевіряли за допомогою постановки РИГА з культурою М. bovis, а також з набором гетерогенних антигенів вірусів (1РТ-ІПВ, ВД-ХС, ПГ-3, рота-, корона-), мікоплазм (культури М. bovigenitalium, М. bovirhinis), бактерій (Е. coli, St. albus, Salm. suis, Ps. aeruginosa). Свою активність та специфічність еритроцитарний діагностикум зберігав протягом 6 міс. за умови його зберігання при 4 °С (термін спостереження) .

В результаті випробування діагностикуму в реакції РИГА свою високу активність та специфічність він показав з культурою М. bovis (1:64), а з набором гетерогенних антигенів вірусів, бактерій та мікоплазм інших видів були одержані негативні результати.

Таким чином, запропонований еритроцитарний діагностикум на основі моноспецифічних антитіл до М. bovis виявився високочутливим та специфічним і може бути використаний для індикації вказаного збудника.

Використання реакції непрямої гемаглютинації для виявлення М. bovis в дослідному матеріалі

Під час випробування діагностикуму в реакції РИГА для індикації М. bovis використовували дослідний матеріал: пативну та глибокозаморожену сперму бугаїв-плідників; патологічний матеріал від мертвонароджених телят та загиблих телят періоду ново-народженості; назадьні секрети хворих телят різного віку.

При цьому значну увагу приділяли первинній обробці дослідного матеріалу.

Сперму обробляли методом ультразвукової дезінтеграції в режимі 22 кГц протягом 40—60 сек для виключення можливості появи в РИГА хибно-позитивних результатів.

Оброблені ультразвуком клітини сперми центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв. Надосадову рідину паралельно з сім’яною досліджували в реакції РИГА з антитільним діагностикумом.

Назальні секрети телят обробляли шляхом 5;разового заморожування та відтавання. Осад відділяли центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв, надосадову рідину вивчали в РНГА з антитільним діагностикумом.

Проби патологічного матеріалу розтирали стерильним піском, після чого екстрагували середовищем Хоттінгера. Надосадовий екстракт вивчали в РНГА з антитільним діагностикумом.

Методом РНГА з антитільним діагностикумом досліджено проб: сперми—40; патологічного матеріалу—55, назальних секретів —ЗО.

Дані порівняльного дослідження сперми бугаїв-плідників, патологічного матеріалу та назальних секретів ВРХ на контамінацію М. Ьоуів методами РНГА та мікоплазмокиділення.

Виділено мікоплазм (серотип М. Ьоуіб) Коефі- цієнт кореля- ції

Об’єкти досліджень Кількість проб на селективних середовищах метод РНГА з антитільним діагностикумом

всього 1 % всього І %

Клітини сперми 40 17 42,0 22 55,0

Сім’яна рідина . 40 15 37,5 25 62,5 —0,79

Внутрішні органи: абортованих плодів 17 7 42,1 9 52,9

мертвонарод-жених телят 13 7 53,8 10 76,9

загиблих телят періоду ново-народженості 10 • 5 50,0 7 70,0 —0,49

загиблих телят віком 3—6 міс. 25 7 28,0 7 28,0

Назальні секрети ЗО 5 16,6 18 60,0

Під час постановки реакції РНГА контролем були: культура

М. Ьоуіб, гетерогенні антигени: культуральних вірусів (ІРТ-ІПВ, 10

рота-, корона-, ПГ-3, ВД-ХС) та мікоплазм (культури М. bovi-genitalium, М. bovirhinis). Відсутність спонтанної аглютинації діагностикуму перевіряли заміною дослідного матеріалу гліцерині-зованим (0,5%) фізіологічним розчином NaCl (pH 7,0).

Для виявлення М. bovis в дослідному матеріалі застосовували класичні методи мікоплазмовиділення згідно з «Методичними вказівками» (Коваленко Я. P., 1979).

В результаті постановки РНГА з антитільним діагностикумом М. bovis виявили в дослідному матеріалі в 50—55% випадках, що на 20—25% вище у порівнянні з класичними методами виділення мікоплазм. Коефіцієнт кореляції складав —0,49 та —0,79 відповідно (таблиця 3).

Таким чином, запропонований еритроцитарний діагностикум на основі моноспецифічних антитіл до М. bovis можна застосовувати для експрес-індикації мікоплазм в різноманітному дослідному матеріалі.

висновки

1. Розроблено високочутливий еритроцитарний діагностикум на основі моноспецифічних антитіл для індикації М. bovis при патології молочної залози, респіраторно-статевої системи великої рогатої худоби.

2. Моноспецифічні антитіла до М. bovis одержано методами імуносорбції з використанням біфункціонального реагенту й імунних комплексів.

3. Встановлено, що при застосуванні методу імунних комплексів максимальний титр специфічних антитіл (6—7 log2) можливо одержати із молозивного імуноглобуліну.

4. При дослідженні методом електрофорезу в ПААГ моноспецифічні антитіла з титром 6—7 log2 розміщувались у зоні рухомості імуноглобулінової фракції, а при використанні реакції імунодифу-зії за Манчіні — визначені як клас Ig G.

5. Розроблено універсальну технологію одержання моноспецифічних антитіл для індикації М. bovis та інших видів мікоплазм великої рогатої худоби.

6. Основні етапи одержання антитільного діагностикуму включають: формалінізацію еритроцитів бика 2,5%-ним розчином формальдегіду протягом 12 годин; танізацію формалінізованого нссія розчином таніну в розведенні 1:20000 протягом 20 хв при 37 °С; сенсибілізацію танізованих еритроцитів елюатами моноспецифічних антитіл (робоче розведення 6—7 log2) протягом 40 хв в буферному розчині з pH 6,4; ’співвідношення еритроцитів та сеноитину 1:1. Для стабілізації діагностикуму використовували 0,5% розчин гліцерину.

7. Результати Комісійного випробування еритроцитарного діаг-ностикуму підтвердили його високу чутливість та специфічність лише з культурою М. bovis.

8. Порівняльне дослідження сперми, патологічного матеріалу на контамінацію М. bovis методами РИГА та мікоплазмовиділен-ня показало співпадання результатів при більшій чутливості запропонованого методу. Коефіцієнт кореляції складав —0,79 та —0,49 відповідно.

. 9. Розроблений метод експрес-індикації мікоилазм призначено

для прискореної діагностики, дозволяє масово контролювати велику рогату худобу на мікоплазмову інфікованість,

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

Основні результати впроваджені в практику у вигляді:

1. «Методичних рекомендацій по виготовленню, застосуванню гіперімунної сироватки крові великої рогатої худоби для профілактики та терапії інфекційних пневмоентеритів телят», затверджених Методичною комісією ІЕКВМ від 10.11.1993 р.

2. «Методичних рекомендацій по виготовленню та застосуванню еритроцитарного діагностикуму на основі моноспецифічних антитіл для індикації М. bovis», затверджених Методичною комісією ІЕКВМ від 11.10.1996 р.

СПИСОК РОБІТ,

ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гонтарь А. М. Методи одержання чистих антитіл для індикації мікоплазм ВРХ // Сучасні пробл. вет. медицини: Матеріали / Укр. конф. молодих вчених.1— Київ. 1994—С. 3—4.

2. Фукс П. П., Гонтарь А. М. Розповсюдження М. bovis серед ВРХ різних віковил груп /У Збереженість молодняка с.чг. тварин—(запорука розвитку тваринництва України: Матеріали / Наук-практ. конф.—Харків, 1994.—С. 67.

3. Гонтарь А. М., Фукс П. П. Сравнительная характеристика полученных

разными способами чистых антител к микоплазмам крупного рогатого скота // Общая эпизоотология: иммунол., эколог, и методол. пробл.: Материалы / Меж-дунар. науч. конф.— Харьков, 1995.— С. 502—505. ,

4. Гонтарь А. М., Фукс П. П. Использование чистых антител к микоплазмам

крупного рогатого скота для создания эритроинтарных диагностикумов И Обшяя эпизоотология: имм]унол., экол. и методол. пробл.: Материалы / Междунар. науч. конф.— Харьков, 1995.—С. 506—508. ■

5. Фукс П. П., Гонтарь А. М. Применение эритроцитарного антительного диагностикума для индикации Mycoplasma bovis в сперме быков-пронзводите. лей // Вет. и зооннженер. пробл. животноводства: Материалы / I Междунар. науч.-практ. конф.—Витебск, 1996.’—С. 141—(142.

6. Гонтарь А. М. Применение реакции непрямой гемагглютинации для выяв-

ления Mycoplasma bovis в патологическом материале и назальных секретах крупного рогатого скота // Вет. медицина: Міжвід, тематич, зб,—Харків, 1997.—> Вип. 72,—С. -

Гонтарь А. М.

Разработка экспресс-метода индикации микоплазм крупного рогатого скота.

Диссертация в виде рукописи на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, г. Харьков, 1997.

Защищаются 6 научных работ, которые содержат результаты исследований по разработке эритроцитарного диагностикума на основе моноспецифических антител для индикации Mycoplasma bovis.

Установлено, что метод диссоциации иммунных комплексов обеспечивает получение моноспецифических антител к Mycoplasma bovis с наибольшей серологической активностью при использовании молозивного иммуноглобулина.

Предлагаемый экспресс-метод индикации М. bovis в исследуемом материале дает возможность выявлять указанный возбудитель на 15—25% больше, чем по сравнению с классическими методами микоплазмовыделения.

Gontar’ А. М.

Elaboration of rapid method of bovine mycoplasma indikation.

Manuscript of thesis for candidate’s degree (veterinary medicine) in specialized fields 16.00.03 — veterinary microbiology, virology, epizootology, micology and immunology.

Institute of experimental and clinical veterinary medecine of UAAS, Kharkov, 1997.

6 scientific publications, containingthe results of investigation to elaborate the erythrocytary diagnosticum on a basis of monospecific antibodies for Mycoplasma bovis indication are defended. It has been ascertained that the immune complex dissociation method ensures production of monospecific antibodies to Mycoplasma bovis with the utmost serologi activity when the colostral immunoglobulin is used.

The proposed rapid method of M. bovis indication in the test material allows to detect the above-mentioned causative agent by 15—25% more as compared to the classic methods of mycoplasma isolation.

Ключов1 слова: моноспециф1чт анптла, еритроцитарний fliar-иостикум, мшоплазми, молозивний 1муноглобулш, мисоплазмовидь ,ленкя.