Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Этио-эпизоотологические особенности микоплазмоза свиней и усовершенствование методов его диагностики и лечения

08-4 3024

На правах рукописи

Жонголовнч Анна Евгеньевна

ЭТИО-ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКОИЛАЗМОЗА СВИНЕЙ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Омск - 2008

Работа выполнена в институте ветеринарной медицины Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Красиков Александр Пантелеевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Плешакова Валентина Ивановна

доктор ветеринарных наук, профессор Бажин Михаил Аристоклевич

Ведущее учреждение

Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИЭВС и ДВ)

Защита состоится 23 декабря 2008 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д. 220.050.03 при ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» в институте ветеринарной медицины по адресу: 644122, г. Омск-122, ул. Октябрьская, 92, тел.: 24-15-35, тел./факс: 23-30-31 (для Н.П. Жабина). E-mail: ivm_orngau@omsknet.ru www/ omgau.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института ветеринарной медицины ОмГАУ.

Автореферат разослан « ¿.Y» ~&~2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доцент

Н.П. Жабин

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Развитие свиноводства на промышленной основе ■заострило в числе многих других проблему сохранения репродуктивных способностей маточного стада. Экономический ущерб от микоплазмоза обусловлен снижением массы тела животных, потерей племенных качеств, замедлением роста и развития, низкой оплатой корма, появлением заморышей, гибелью поросят и значительными затратами на лечение и оздоровительные мероприятия.

В данное время широко дискутируется вопрос о первостепенной роли микоплачм н патогенезе заболенаннй со смсншшюн 'этиологией, их сочетапном действии с другими бактериями и вирусами. Общего ответа быть не может, но микоплазмы. являясь самостоятельной группой, к содружестве с другими микроорганизмами усиливают свое патогенное действие (Г.Г. Миллер, И.В. Ракоискал. 1991; Л.Я Пустонар, 1995; П.Г1. Фукс. 1995). Особое значение это явление приобрело в последние годы, т.к. в условиях хозяйств все чаше одновременно обнаруживаются несколько инфекций. Микоплазмоз повышает восприимчивость свиней к вторичным инфекциям, что делает его течение более тяжелым, зачастую приводя к гибели.

Лабораторная диагностика мнкоплазмозон требует усовершенствования, так как при выделении возбудителей этих болезней используют сложные микробиологические методы, пока еще не доступные для большинства лабораторий (Фукс П.П., Калашник Н.В., 1995; Гречухин, Л.И., 1997).

В связи с этим весьма актуальным является пропедеиие своевременной диагностики микоплазмоза в ассоциации с сопутствующими микроорганизмами, что позволит выявлять больных животных, носителей и разрабатывать меры по борьбе с этим заболеванием. Все это послужило основанием для проведения данных исследований.

Цель работы. Усовершенствовать экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней, в том числе при ассоциативных формах его проявления и разработать схемы лечения больных животных.

Задачи исследований:

- изучить эпизоотическую ситуацию по микоплазмозу свиней и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей;

- изучить культуральиые, морфологические, биохимические и патогенные свойства выделенных от свиней микоплазм;

- разработать и испытать в производственных условиях экспресс- методы диагностики микоплазмоза свиней и его ассоциативных форм проявления, а также эффективные и рациональные схемы лечения, дать им экономическое обоснование.

Научили новизна. Выявлена широкая распространенность в хозяйствах Омской и Тюменской областей микоплазмоза свиней, в том числе в ассоциациях с некоторыми другими инфекциями. Изучены основные свойства микоплазм, выделенных от свиней. Усовершенствованы экспресс-методы диагностики микоплазмоза: микробиологический - с помощью специальных

питательных сред для индикации и идентификации микоплазм и уреаплазм и серологические - для выявления микоплазм и их антигенов в биоматериале, а также антител в сыворотке крови с помощью РНИФ и РНГА.

Получены приоритетные справки № 2007135196 / 13 (038479) от 21.09.2007 г. на способ получения микоплазмозных диагностических сывороток для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) путем гипериммунизации кроликов и № 2007135195 / 15 (038478) от 21.09.2007 г. на способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней, а также уведомления о положительном результате формальной экспертизы от 07.11.2007 г.

Разработаны научно-обоснованные рациональные схемы лечения свиней при микоплазмозе с учетом его ассоциативных форм.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации вносят определенный вклад в развитие науки микоплазмологии и микропаразитоценологии.

Разработанные методики дают возможность получать микоплазмозные антигены и антисыворотки для РНИФ и эритроцитарный диагностикум для РНГА. Применение экспресс-методов диагностики, отраженных в методических рекомендациях «Экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней» позволит своевременно выявлять больных животных и микоплазмоносителей, и разрабатывать меры борьбы и профилактики, контролировать эпизоотическую обстановку по данной инфекции. Применение разработанных схем лечения при микоплазмозе свиней, в том числе и в ассоциации с другими инфекциями, создаст условия для более эффективного проведения мероприятий по борьбе с данной болезнью.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ «Проблемы ветеринарной и зоотехнической наук и пути их решения» (Омск, 2006-2008), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006, СО РАСХН ВНИИБТЖ), Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск УГСХА, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции «Патология сельскохозяйственных животных и пути её профилактики» (Омск, 2007, СО РАСХН ВНИИБТЖ), 7-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008, СО РАСХН ВНИИБТЖ).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе одна в научном журнале, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ («Ветеринарная патология»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов,

практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 218 источников, в том числе 90 зарубежных авторов.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований для практического применения отражены в методических рекомендациях: «Экспресс - методы диагностики микоплазмоза свиней» (Утверждены Ученым советом ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, протокол № 9 от 28.05.2008 г., секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол № 4 от 05.06.2008 г. и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 2 от 30 июня 2008 г.).

Материалы диссертации внедряются в хозяйствах Омской и Тюменской областей и используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней, микробиологии, вирусологии и иммунологии института ветеринарной медицины ОмГАУ, институте повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ, а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса.

Основные положения, выносимые па защиту:

1. Распространение микоплазмоза свиней и ассоциативных форм его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей.

2. Усовершенствованные экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней.

3. Результаты экспериментального изучения различных схем лечения и методы лабораторного контроля их эффективности при микоплазмозе свиней и ассоциативных формах его проявления.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Тема диссертационной работы является составной частью комплексной государственной программы «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» (№ гос. регистрации 01.2.001100602).

Исследования проводились в лаборатории микстинфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней ИВМ ОмГАУ, в лаборатории зоонозных инфекций НИИПОИ Роспотребнадзора, в Омской областной ветеринарной лаборатории и хозяйствах Омской и Тюменской областей.

Объектом исследований являлись свиньи различных возрастных групп с выраженными клиническими признаками пневмонии, артритов, эндометритов и конъюнктивитов.

Материалом для исследований служили пробы сыворотки крови, цервико-вагинальной слизи, носовых истечений, суставной жидкости, патологический материал от погибших животных и абортированных плодов.

Для диагностики использовали эпизоотологические, клинические, патологоанатомические и лабораторные методы.

Микробиологические исследования проводили, используя разработанные совместно с ФГУ Омского НИИТТОИ, жидкие и твердые питательные среды для индикации и идентификации микоплазм и уреаплазм. Микроскопирование проводили при помощи светового микроскопа «Ломо» (х 900). Для видового определения микоплазм использовали ключ Gourlay and Howard (1979).

Для серологических исследований применяли реакцию непрямой гемагглютинации - для обнаружения антител в сыворотке крови животных, реакцию непрямой иммунофлуоресценции - для выявления антител и антигенов в пробах био- и патологического материала, полученного от вынужденно убитых и погибших животных. Фиксацию мазков проводили по методу Моди с соавт. (1958), а постановку РНИФ по методике, предложенной Уэллером и Кунсом (1945).

Для проведения исследований применяли стандартные антигены, используемые для постановки РА и РСК, и полученные нами микоплазмозные антигены, а в качестве антител - гомологичные антигенам кроличьи и свиные антисыворотки, антивидовые для РНИФ и специфические сальмонеллезные, листериозные для РПИФ люминесцентные сыворотки меченные ФИТЦ (ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), а также полученные нами микоплазмозные, уреаплазмозные кроличьи сыворотки и изготовленные ранее в лаборатории миксгинфекций против хламидиоза, пастереллеза, диплококкоза (Лобанова Н.В., 2004).

Люминесцентную микроскопию проводили с помощью микроскопа ЛЮМАМ Р-8 при увеличении в 900 раз. Степень флуоресценции антител оценивали по 4-х крестной системе (Вайтекер и др., 1958).

Для изготовления эритроцитарного диагностикума для РИГА в качестве клеточной основы использовали эритроциты барана, а для стабилизации 20%-й р-р формальдегида. Фиксацию эритроцитов проводили по методу Фили в модификации Красикова А.П. (2002).

Для диагностики миконлазмоза методом полимеразной цепной реакции использовали тест-систему «МИК-КОМ» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва. ПЦР-диагностику проводили на базе Омской областной ветеринарной лаборатории совместно с сотрудниками молекулярно-диагностического отдела Хатько Н.Ф., Ковалевской А.А.

Расчёт экономической эффективности проводили по методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утвержденной Департаментом ветеринарии РФ 21.02.1997 г. Статистическую обработку материалов проводили согласно методам математической статистики, принятым в биологии и медицине с использованием таблиц Стыодента (А.Т. Усович, П.Т. Лебедев, 1970), а также с помощью программы Microsoft Excel 2000.

2.2. Изучение эпизоотической ситуации по микоплазмозу свиней и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей

По результатам проведенных исследований было установлено, что микоплазмоз свиней имеет широкое распространение в хозяйствах Омской и

Тюменской областей (табл. 1,2 и 3), причем доля микоплазмоза в ассоциациях значительно больше, чем других инфекций.

Таблица 1

Распространение микоплазмоза и ассоциативные формы его

Хозяйства К-во проб Инфицировано, (%). М±т, р < 0,05

Ё о с; 1 X а 5 11 4 I | Г я * 8. я >,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

лпх Ефремова М.Н. 20 0,0 20,0± 8,9 0,0 - - 10,0± 6,7 - 70,0± 10,2 25,0± 9,7

ЗАО Рось 10 30,0± 14,5 0,0 20,0± 12.6 10,0± 9,5 50,04 15,8 30,0± 14.5 20,0± 12,6 90,0* 9.5 60,0± 15,5

АК Ударный 10 0,0 20,0± 12,6 40,0± 15.5 - 10,0± 9,5 0.0 - 80,0± 12,6 50,0± 15,8

ООО Тнтаи* 10 0,0 10,0± 9,5 0,0 - 30,0± 14,5 30,0± 14,5 - 90,0± 9,5 40,0± 15,5

ЗАО Новоачовское 20 0.0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 90,0± 6,7 50,0± ¡1.2

ЗАО Кам.Курское 20 0,0 0,0 25,0± 9,7 - 25,0± 9.7 0,0 0,0 70,0± 10.2 55,0± 11,1

ООО Атлант 10 30,0± 14,5 50,0± 15,8 30,0± 14,5 - 50,0± 15,8 30,0± 14,5 - 90,0± 9,5 60,0± 15,5

СПК им. Чапаева 20 0,0 15,0± 7.9 20,0± 8,9 35,0± 10,6 30,0± 10,2 - 85,0± 7,9 40,0± 10,9

КФХ Вохм1Ш Е.Е. 20 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - б0,0± 10,9 35,0± 10,6

КХ Трейзе В.Ф. 20 10,0± 6,7 0,0 5,0± 4,8 - 40,0± 10,9 35,0± 10,6 - 70,0± 10,2 35,0± 10,6

Рощино 7 0,0 0,0 57,1± 18,7 - 42,8± 18,7 0,0 0,0 57,1± 18,7 57,1± 18,7

Всего(11) 167 23.3± 3,2 23,0± 3,2 28,1± 3.4 10,0± 2.3 35,2± 3,7 27,5± 3,4 20,0± 3,1 77,4± 3,2 46,1± 3,8

Примечание: сальм - сальмонеллы, паст - пастереллы, хлам - хламидии, лепт -лептоспиры, лист - листерии, дипл - диплококки, энтерок - эктерококки, мик - микоплазмы, в т.ч. уреа - в том числе уреаплазмы, - - не исследовали.

1 - ЛГТХ Ефремова М.Н. Калачинского р-на Омской обл.; 2 - ЗАО «Рось» Калачинского р-на Омской обл.; 3 - ООО «Агрокомплекс Ударный» Горьковского р-на Омской обл.; 4 - ООО «Группа компаний Титан»* - материал получен из РК; 5 - ЗАО «Новоазовское» Азовского р-на Омской обл.; 6 - ЗАО «Кам.Курское» Муромцевского р-на Омской обл.; 7 - ООО «Атлант» Бердюжского р-на Тюменской обл.; 8 - СПК им. Чапаева Казанского р-на Тюменской обл.; 9 - КФХ Вохмина Е.В. Ишимского р-на Тюменской обл.; 10 - КХ Трейзе В.Ф. Ишимского р-на Тюменской обл.; 11 - «Рощино» Тюменского р-на Тюменской обл.; 12-Еремеевское Полтавского р-на Омской обл.; 13 - ОАО «ОПХ СибМИС» Таврического р-на Омской обл.; 14 - ООО «Комплекс» Исетского р-на Тюменской обл; 15 - ЗАО «Согласие» Заводоуковского р-на Тюменской обл.

Так, при комплексном обследовании свиноматок из разных хозяйств наиболее насыщенный микробный пейзаж был выявлен в ЗАО «Рось», ООО «Атлант» (табл. 1). Высокую инфицированность свиноматок микоплазмами и уреаплазмами наблюдали в ООО «Агрокомплекс Ударный» (80%), ООО «Титан» (90%), ЗАО «Кам. Курское» (70%), ЛПХ Ефремова М.Н. (70%), СПК им. Чапаева (85%), КХ Трейзе В.Ф. (70%), а также в «Рощино» (57,1%).

В КФХ Вохмина Е.В. и в ЗАО «Новоазовское» микоплазмоз был обнаружен в виде моноинфекции у 60% и 90% свиноматок соответственно.

Таблица 2

Распространение микоплазмоза и ассоциативные формы его _проявления у поросят_

Хозяйства Кол-во проб Инфицировано, (% ), М±ш, р < 0,05

Ё е 3 5 с х С о п 1 1 ¡3 вз С § § * X 2 В* Я * 8. * >,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

АК Ударный 40 0,0 20,0± 6,3 40,0± 7,7 70,0± 7.2 70,0± 7,2 70,0± 7.2 60,0* 6,3 82,0± 6,1 65,0± 7,5

ООО Титан 10 0,0 0,0 0,0 0,0 20,0* 12,6 30,0± 14,5 0,0 80,0± 12,6 40,0± 15,5

ЗАО КамКурское 25 20,0± 8,0 40,0± 9,8 20,0± 8.0 • 40,0± 9,8 56,0± 9,9 • 100,0 ±0,0 48,0± 9,9

ООО Атлант 10 0,0 20,01: 12,6 0,0 10,01: 9,5 30,0± 14.5 0,0 0,0 80,01 12,6 20,0± 12,6

СПК им.Чапаева 10 0,0 0,0 0.0 0,0 20,0= 12,6 20,0± 12,6 10,0± 9,5 90,0± 9,5 40,0± 15,5

КФХ Вохмин ЕЕ. 20 0.0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 75,0± 9,7 35,0± 10,6

КХ Трейзе В.Ф. 20 0,0 0,0 0,0 0,0 15,0± 7,9 20,0± 8,9 0,0 65,0± 10,6 40,0± 10,9

ООО Комплекс 9 0,0 0,0 11,1± 10,5 ■ 0,0 0,0 0,0 66,6± 15,7 44,4± 16,5

Всего (8) 144 20,0± 3,3 26,6± 3,7 23,7± 3,5 40,0± 4.1 32,5± 3,9 39,2± 4,0 35,0± 3,9 79,8± 3,3 41,5± 4,1

Таблица 3

Инфицированность микроорганизмами патологического материала от погибших или вынужденно убитых свинеИ ___и абортированных плодов_

Хозяйства К-во проб Инфицировано, (%), М±п1, р < 0,05

Ё и с; К а ч I £ о .д 3 3 и I- а с § § х X X У Я г* о. «

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

АК Ударный 9 0,0 0,0 0,0 0,0 11,1± 10,5 11,1± 10,5 0,0 22,2± 13,8 11,1± 10,5

Еремеевское 12 0,0 0,0 0,0 - 41,6± 14,2 16,6± 10,7 - 33,3± 13,6 8,3± 7,9

ОПХ СибМИС* 7 0,0 0,0 0,0 0,0 14,3± 13,2 0,0 0,0 57.lt 18,7 42,8± 18,7

СГПС им. Чапаева 20 0,0 10,0± 6,7 15,0± 7,9 - 25,0± 9,7 15,0± 7,9 ■ 85,0± 7,9 45,0± 11,1

КФХ Вохмин Е.Е. 20 0,0 0,0 0,0 - 30,0± 10,2 25,0± 9,7 - 65,0± 10,6 30,0± 10,2

КХ Трензс В.Ф. • 20 5,0± 4,9 10,0± 6,7 0,0 - 25,0± 9,7 25,0± 9,7 • 80,0± 8,9 30,0± 10,2

Рохцино 8 0,0 0,0 12,5± 11,7 - 0,0 0,0 50,0± 17,7 25,0± 15,3

ООО Комплекс 8 0,0 12,5± 11,7 0,0 - 0,0 0,0 - 12,5± 11,7 0,0

Согласие 7 14,2± 13,2 14,2± 13,2 14,2± 13,2 - 0,0 14,2± 13,2 - 28,5± 17,0 14,2± 13,2

Всего (9) 111 9,6± 2,8 П,6± 3,0 13,9± 3,3 0,0 24,5± 4,1 17,8± 3,6 0,0 48,2± 4,7 25,8± 4,1

Примечание: * - абортированные плоды.

При исследовании биоматериала от поросят наиболее пестрый микробный пейзаж наблюдали в ООО «АК Ударный», ЗАО «Кам. Курское» (табл. 2). Высокая инфицированность микоплазмами поросят также была в

8

ООО «Титан» (80%), ООО «Атлант» (80%), СПК им. Чапаева (90%), КХ Трейзе В.Ф. (65%), ООО «Комплекс» (66,6%).

В виде моноинфекции микоплазмоз поросят был зарегистрирован в одном хозяйстве КФХ Вохмин Е.В. (75%).

При исследовании проб патологического материала от погибших или вынужденно убитых свиней и аборт-плодов (табл.3) наибольшая инфицированность органов микоплазмами и уреаплазмами наблюдалась в СГ1К им. Чапаева (85%), КХ Трейзе (80%), КФХ Вохмин (65%).

Таким образом, по результатам комплексных исследований хозяйств Омской и Тюменской областей установлено, что микоплазмоз свиней имеет широкое распространение. Из 15 обследованных хозяйств микоплазмоз был обнаружен во всех, при этом в виде моноинфекции он был зарегестрнрован в двух хозяйствах (13%), а в остальных носил ассоциативный характер.

2.3. Микробиологические методы диагностики микоплазмоза свиней

2.3.1. Индикация и идентификация микоплазм на питательных средах

Для выделения микоплазм на питательных средах брали для исследования цервико-пагинальные смывы и соскобы со слизистой оболочки влагалища у супоросных свиноматок, а также после опороса, жидкость из пораженных суставов, носовые истечения у поросят, а также паренхиматозные органы (печень, почки, селезенку, легкие, сердце, лимфатические узлы), абортированные плоды.

Для культивирования посевов использовали жидкие и плотные питательные среды для индикации и идентификации глюкозоферментирующих, аргининзависимых микоплазм и уреаплазм.

Посевы на средах инкубировали при 37'С в течение 48-96 часов, учет-роста проводили визуально по изменению цвета среды.

Для более подробного изучения культурапьных свойств микоплазм, культуры, выросшие на жидких питательных средах, пересевали на аналогичные плотные среды, содержащие 1,3% агара Дифко. Посевы инкубировали при 37-38'С в течение 5 суток. Чашки просматривали под малым увеличением микроскопа (х 45-70) через 24-72 часа и на 5-е сутки инкубации.

На плотных средах микоплазмы представляют собой круглые, не сливающиеся друг с другом колонии, которые имеют характерный вид «яичницы-глазуньи» с врастающим в агар центром и более нежной поверхностной периферией. Встречаются зернистые колонии без выраженной центральной зоны. Культуры штаммов рода Mycoplasma образуют колонии размером 0,5-3,0 мм. Размер колоний уреаплазм не превышает 0,05-0,5 мм.

Для учета титра микоплазм использовали метод титрации цветообразующей единицы, на жидкой индикаторной среде готовили 10-кратные разведения микоплазм. Инкубировали при 37°С в течение трех суток. Наибольшее разведение микоплазм, при котором изменяется цвет среды, рассматривается как конечная точка титрации, содержащая одну ЦОЕ. Также

вели подсчет колонеобразующих единиц в 0,1 мл 10-кратных разведений исходной культуры. Результаты учитывали подсчетом колоний на плотной среде, допуская, что каждая колония получена из одной клетки. Подсчитав количество колоний, определяли количество единиц, образующих колонии.

Таким образом, питательные среды, разработанные Омским НИИ ПОИ Роспотребнадзора совместно с ИВМ ОмГАУ, можно применять и для диагностики микоплазмоза свиней. Наряду с индикацией они позволяют проводить и идентификацию микоплазм и уреаплазм по основным показателям: ферментация глюкозы, гидролиз аргинина и разложение мочевины, а также посредством титрации оценивать степень их накопления в ЦОЕ и КОЕ.

2.3.2. Основные биологические свойства микоплазм 2.3.2.1. Морфологические свойства

При изучении тинкториальных и морфологических свойств микоплазм и уреаплазм готовили мазки из трехсуточных культур, высушивали их на воздухе, фиксировали метиловым спиртом или ацетоном в течение 5-10 минут и окрашивали краской Романовского - Гимзе (разведенной буферным раствором pH 7,2 в соотношении 1:3) в течение 3-4 часов. Затем мазок промывали и просматривали под иммерсионной системой микроскопа. Микоплазмы полиморфны, преимущественно кокко-овоидно-псрстневидной или разветвленной формы размером 0,3-0,5 мкм розово-фиолетового оттенка. Могут встречаться и фиолетовые шары размером 3-6 мкм, единичные палочки (2-5 мкм), скопления зернистой и гомогенной массы с синеватым оттенком. Микоплазмы грамотрицательные, красного цвета.

2.3.2.2. Биохимические свойства

Видовую принадлежность выделенных от свиней культур микоплазм определяли по биохимическим свойствам. Изучали ферментацию глюкозы, гидролиз аргинина, разложение мочевины (на диагностических жидких и плотных питательных средах при культивировании микоплазм и уреаплазм), протеолитическую активность, редукцию тетразоля, фосфатазную активность, образование пленки и пятен.

Выделенные от свиней культуры были отнесены к: M.hyorhinis, M.hyosynoviae, Ureaplasma sp. (табл. 4).

Таблица 4

Морфологические и биохимические свойства микоплазм, выделенных от свиней

Род и вид Морфология микоплазм Ферментация глюкозы Гидролиз арпшиыа «Е 1 >■ S Пленка и njrma К « § § ? Я 11 || С 8 Фосфат, активность

M.hyorhinis Очень короткие югги, редко с ответвлениями + - - - •f - +

М. hyosynoviae Кокковидные формы, короткие нити - + - + - - -

Ureaplasma sp. Сферические, иногда почкующиеся клетки - - + - - + -

2. 3. 2. 3. Патогенные свойства

Для изучения патогенных свойств заражали мышей микоплазмами, выделенными от свиней. Использовали 20 белых мышей, которых разделили на 4 группы по 5 голов в каждой. Животным 1-й группы вводили антиген из M.hyorhinis, 2-й - M.hyosynoviae, и 3-й - Ureaplasma sp., 4-я группа служила контролем. В течение 10 дней после заражения погибло 3 мыши, зараженные M.hyorhinis, по 2 мыши - M.hyosynoviae и Ureaplasma sp. Остальные особи, в том числе контрольной группы, на 10 сутки были девитализированы, а их внутренние органы исследованы микробиологическим методом. По результатам исследований летальность мышей при заражении их M.hyorhinis составила 60%, M.hyosynoviae и Ureaplasma sp. - 40%, при индексе инфицированное™ 76, 76 и 84 соответственно.

2.4. Серологические методы диагностики микоплазмоза 2.4.1. Получение микоплазмозных антигенов и диагностических антисывороток для РНИФ

Миконлазмозные антигены и гипериммунные антисыворотки против полевых штаммов микоплазм, выделенных от свиней, получали с целью использования их в РНИФ.

Антигены готовили из трехсуточных культур микоплазм (M.hyorhinis, M.hyosynoviae и Ureaplasma sp.), которые отмывали от питательной среды путем центрифугирования при 6 тыс/об 30 минут, осадок после трехкратного ресуспензирования и последующего центрифугирования разводили до концентрации 1,7 млрд. м.т. в 1 мл по бактериальному стандарту мутности (ГИСК им. Тарасевича JI.A.).

Гипериммунизацию кроликов проводили по схеме D. Schimmel, в модификации А.П. Красикова, H.H. Новиковой, (2000) путем дробной внутривенной инокуляции микоплазмозного антигена каждые 3-4 дня с применением иммуностимулятора левамизола подкожно при первых двух введениях антигена. Для этого 6 кроликов весом 2,5-3 кг, разделили их на 3 группы по 2 головы на каждую культуру. На 7, 14, 21 и 30 сутки после гипериммунизации изучали динамику синтеза антител в РНИФ, учет реакции проводили в крестах, свечение менее чем на два креста считали отрицательным.

Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:10 - 1:20. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:320 - 1:640, а на 21-е и 30-е сутки синтез антител достиг максимального уровня 1:640 -1:1280.

2.4.2. Изучение специфичности и активности сывороток и антигенов в РНИФ

Для определения активности и специфичности, полученных нами микоплазмозных антигенов и гипериммунных сывороток в РНИФ использовали убитые антигены в концентрациях 250, 500 млн. м.т. и 1 млрд. м.т., и сыворотки

в разведениях от 1:10 до 1:640. Для изучения специфичности микоплазмозных антигенов в РНИФ применяли микоплазмозные сыворотки, а также сыворотки против хламидиоза, лептоспироза, листериоза, сальмонеллеза, пастереллеза в разведении 1:10.

Микоплазмозные антигены показали высокую специфичность. Положительная реакция отмечалась только с гомологичными кроличьими антисыворотками. Наилучшая активность микоплазмозных антигенов в РНИФ проявлялась в концентрации 500 млн. м.т.

Была установлена высокая внутривидовая специфичность полученных микоплазмозных антисывороток в РНИФ, которые реагировали только с гомологичными антигенами и были активны во всех разведениях.

2.4.3. Изготовление микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) для реакции непрямой гемагглютинации

Приготовление эритроцитарного диагностикума проводили в несколько этапов: дробная формалинизация эритроцитов барана; получение антигена из трех культур микоплазм; сенсибилизация формалинизированных эритроцитов антигеном; трехкратное отмывание диагностикума буферным раствором.

Постановку РНГА проводили по следующей методике: испытуемые сыворотки разводили в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН- 6,4), начиная с 1:25. К каждому разведению добавляли по одной капле (0,05 мл) МЭД, перемешивали встряхиванием и оставляли при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакцию оценивали по четырехкрестной системе. Конечным титром считали последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.

2.4.3.1. Изучение специфичности и активности МЭД в РНГА

Для изучения специфичности и активности полученного МЭД проводили постановку РНГА в обьеме 0,5 мл в полистироловых пластинках, с микоплазмозными (Г, А, У и смешанной Г+А+У) сыворотками в разведениях от 1:10 до 1:640. В качестве контроля использовали фосфатный буферный раствор (рН - 6,4) и заведомо отрицательные и положительные на миконлазмоз сыворотки: свиней в разведениях 1:25-1:1600 и кроликов в разведениях 1:101:640.

Для контроля специфичности полученного МЭД ставили РНГА с гетерологичными сыворотками. МЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, пастереллезной, лептоспирозной, листериозной, сальмонеллезной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными микоплазмозными сыворотками.

Для контроля активности полученного МЭД проводили постановку РНГА с кроличьими микоплазмозными сыворотками, а также с положительными и отрицательными на микоплазмоз свиными сыворотками. С микоплазмозными сыворотками по отдельности и со смешанной сывороткой против трех видов микоплазм полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения

1:160. В контроле с негативной сывороткой и буферным раствором положительные реакции отсутствуют.

Таким образом, полученный МЭД высокоспецифичен и обладает достаточной активностью в РНГА при микоплазмозе свиней. Его можно использовать для обнаружения антител к микоплазмам в сыворотке крови больных свиней и микробоносителей, принимая за диагностический титр разведение исследуемой сыворотки 1:25.

2.4.4. Сравнительная оценка диагностической ценности микробиологического и серологических (РНИФ, РНГА) методов диагностики микоплазмоза свиней в производственных условиях

Для изучения чувствительности РНИФ в сравнении с микробиологическим методом исследовали биоматериал от больных животных, а также патологический материал от погибших, вынужденно убитых свиней и абортированных плодов.

При исследовании цервико-вагинальной слизи от свиноматок на питательных средах глюкозоферментирующие микоплазмы выделялись в среднем в 42% случаев, аргининзависимые микоплазмы в 21% и уреаплазмы в 29%, а в РНИФ - в 49%, 33% и 41% соответственно.

При исследовании проб цервико-вагинальной слизи и сыворотки крови при помощи микробиологического метода, РНИФ и РНГА определяли количественные показатели (ЦОЕ, КОЕ) микоплазм на питательных средах и титр микоплазмозных антител в крови в РНИФ и РНГА. При сравнительном анализе титра антител и количеством выделяемых на питательных средах микоплазм, в большинстве случаев обнаруживается прямая пропорциональная зависимость, т. е., чем больше возбудителя в исследуемом материале, тем выше титр антител в крови животного.

При исследовании носовой слизи от поросят на питательных средах M.hyorhinis была обнаружена в 42% случаев, M.hyosynoviae в 28% и Ureaplasma в 26%, а в РНИФ -59%, 48% и 34% соответственно. При исследовании суставной жидкости от поросят на питательных средах M.hyorhinis была выделена в 33% случаев, M.hyosynoviae в 30% и Ureaplasma в 26%, а в РНИФ -40%, 50% и 30% соответственно.

При исследовании патологического материала от свиней на питательных средах глюкозоферментирующие микоплазмы выявлялись в 16% случаев, аргининзависимые микоплазмы в 9% и уреаплазмы в 14%, а в РНИФ -27%, 12% и 25% соответственно.

Таким образом, РНИФ не уступает по чувствительности микробиологическому методу исследования, а в некоторых случаях даже превосходит его. РНИФ позволяет в течение одного часа поставить диагноз на микоплазмоз. Кроме того, с помощью данного метода можно одновременно с индикацией микоплазм определять и их принадлежность к М. hyosynoviae, М. hyorhinis и Ureaplasma sp.

Для изучения чувствительности РНИФ и РНГА при диагностике микоплазмоза свиней провели выборочные исследования сыворотки крови свиней под контролем микробиологического метода диагностики. В целом при

исследовании сыворотки крови от свиней из 10-ти хозяйств на микоплазмоз с помощью РНИФ было выявлено 69,6%, а в РНГА 63,3% больных и микоплазмоносителей. Оба метода дополняют Друг друга (табл. 5).

Таблица 5

Чувствительность РНИФ и РНГА по результатам исследования на микоплазмоз

сыворотки крови поросят и свиней

№ Хозяйства Количество проб РНИФ, РНГА,

п/п крови % %

1. ЗАО «Новоазовскос» 120 ремонтный молодняк 71±4,1 65±4,3

2. ООО« АК Ударный» 10 ремонтный малсшияк 100±0,0 90±9,5

3. ЗАО «Кам. Курское» 20 свиноматки 70±10,2 55±11,1

25 поросята 100±0,0 76x8,5

4. ООО «Титан» 10 ремонтный молодняк 90±9,5 60±15,5

5. ОАО «Атлат» 20 ремонтный молодняк 80±8,9 60±10,9

6. СПК им. Чапаева 15 свиноматки 66,6± 12,2 60±12,6

10 поросята 90±9,5 70±14,5

7. КФХ Вохмнн 15 свиноматки 60±12,б 66,6±|2,2

20 поросята 75±9,7 65±10,6

8. КХ Трейзе 20 свиноматки 60±10,9 50±11,2

20 поросята 65x10,6 45±11.1

9. «Рощино» 7 свиноматки 14,3±13,2 57,1±18,7

10. ООО «Комплекс» 9 поросята 33,3±15,7 66,6±15,7

Всего: 321 69,6±2,6 63,3±2,7

Для изучения диагностической ценности изученных методов провели комплексное исследование биоматериала от свиней и поросят из свиноводческих хозяйств Омской и Тюменской областей (табл. 6).

Таблица 6

Диагностическая ценность комплекса методов (микробиологический, РНИФ и РНГА) _исследований на микоплазмоз в производственных условиях _

Хо- РНИФ РНГА Михро-

зяй- Кол-во проб / результат в % в% бпол.

ства сыво- цервико- суст. пат. нос. сыво- метод.

ротка вагин. жид- ыат-л ели ротка %

крови слизь кость зь крови

№1 - - - - - 10/90 10/90

№2 10/90 10/90 10/80 - - 10/60 20/75

№3 120/71 20/90 - - - 120/65 20/85

№4 10/100 10/80 9/22,2 40/65 10/90 59/64,4

№5 45/85 20/90 - - 25/92 45/65,5 45/75

№6 - - - - - - 20/70

№7 - - - 7/57,1 - - 7/42,8

№8 - - - - - - 12/33

№9 25/78,3 20/85 10/90 20/85 - 25/64 50/64

№10 35/67,5 20/60 - 20/65 - 35/65,7 40/45

№11 40/62,5 20/70 - 20/80 10/60 40/47,5 50/62

№12 20/80 10/90 10/60 - - 20/60 20/65

№13 9/33,3 - - 8/12,5 - 9/66,6 8/25

№14 - - - 7/28,5 - - 7/28,5

№15 7/14,3 - 8/50 - 7/57,1 8/25

Всего: 321/69 130/81,8 30/76,6 99/50 75/72,3 331/66,5 376/56,6

Примечание: материал получен из хозяйств: №1 - ЗАО «Рось», №2 - ООО «Группа компаний Титан», № 3 - ЗАО «Новоазовское», № 4 - ООО «Агрокомплекс Ударный», № 5 -ЗАО «Кам. Курское», № 6 - ЛПХ Ефремова, №7 - ООО «ОПХ СибМИС», №8 - Еремеевское, №9 - СПК им. Чапаева, №10- КФХ Вохмина, №11 - КХ Трейзе, №12 - ОАО «Атлант», №13 - ООО «Комплекс», №14 - ООО «Согласие», №15 - ОООлРощино».

Установлено, что РНИФ и РНГА равноценны по чувствительности при микоплазмозе свиней. Комплексное их применение для исследования сыворотки крови и цервико-вагинальной слизи позволяет в среднем на 9% больше выявлять больных свиней и микоплазмоносителей. При этом положительные результаты РНГА и РНИФ подтверждаются результатами микробиологического исследования в 56,6%, что указывает па их высокую диагностическую ценность.

2.4.5. Сравнительное изучение чувствительности микробиологического, серологического (РНИФ) экспресс-методов диагностики микоплазмоза свиней и метода полимеразиой цепной реакции

Чувствительность РНИФ и ПЦР изучали в сравнении с микробиологическим методом диагностики микоплазмоза свиней. Материалом для исследований служила цервико-вагинальная слизь от свиноматок, подозреваемых в спонтанном заражении микоплазмозом, а также патологический материал от павших или вынужденно убитых свиней и абортированных плодов.

ПЦР обладает высокой чувствительностью (80-83%) и специфичностью, возможностью индикации возбудителя в различных образцах, позволяет проводить как единичные диагностические исследования, так и осуществлять широкомасштабный мониторинг поголовья в различных свиноводческих хозяйствах. РНИФ менее чувствительна (37,1-73,3%), чем ПЦР, но также высокоспецифична, менее трудоемкая и очень быстрая (экспресс-метод). Кроме того, с помощью специфических микоплазмозных сывороток можно идентифицировать возбудителя до вида. Но основным методом диагностики микоплазмоза остается выделение возбудителя на питательных средах (31,466,6%), что дает возможность получения чистой культуры и последующего изучения ее биохимических свойств и патогенности, а также чувствительности к антибиотикам.

2.5. Изыскание средств и методов лечения свиней при микоплазмозе, в том числе, ассоциированном с другими инфекциями

2.5.1. Определение чувствительности выделенных от свиней культур микоплазм к антибактериальным препаратам in vitro

Методом серийных разведений на жидких диагностических питательных средах (пробирочный вариант) определяли антибиотикочувствительность выделенных от свиней культур микоплазм и уреаплазм.

Наибольшую чувствительность микоплазмы проявили по отношению к энрофлоксацину, гентамицину, линкомицину, тетрациклину, норфлоксацину, тилану и триметоприму (табл. 7). Уреаплазмы, в отличие от микоплазм, были наиболее чувствительны к эритромицину и резистентны к ципрофлоксацину.

Наиболее активные в отношении выделенных культур микоплазм и уреаплазм антибактериальные препараты (энрофлоксацин, линкомицин, тетрациклин, тилан и др.) были использованы нами в опытах по изучению

различных схем лечения микоплазмоза свиней и ассоциативных форм его проявления в производственных условиях.

Таблица 7

Минимальная подавляющая концентрация различных антибиотиков в отношении

»А Антибиотик M.hyorhinis M.hyosynoviae Ureaplasma sp.

1 Энрофлоксацнн <0,2 <0,2 <0,2

2 Гснтамкцин 0,4 1,56 0,8

3 Линкоыицнн <0,2 0,4 6,25

4 Тетрациклин 12,5 6,25 12,5

5 Окснтетрацкхлин 6,25 3,12 3.12

6 Лсвомицстин 12,5 >50 >50

7 Эритромицин 25 >50 3,12

8 Цнпрофлоксацкн <0,2 0,8 >50

9 Норфлоксации <0,2 3,12 3,12

10 Амокснциклни >50 >50 >50

И Тилап 12,5 6,25 6,25

12 Тилозииа тартрат 6,25 12,5 25

13 Тиланик 3,12 3,12 25

14 Трнмстоприм 6,25 3,12 12,5

15 Сульфадимезин 12,5 50 >50

16 Норсульфазол 25 >50 >50

2.5.2. Изучение различных схем лечения свиней при микоплазмозе и ассоциативных формах его проявления

Схемы лечения испытывали на свиноматках с клиническими признаками эндометритов, абортами, мертворождаемостью и мумификацией плодов в анамнезе (опыт 1) и поросятах с признаками бронхопневмоний, артритов (опыт 2). Свиноматок разделили на 5 групп, поросят на 6 групп по 5 голов в каждой. До лечения и через 15 дней после него проводили микробиологические и серологические исследования сыворотки крови, цервико-вагинальной и носовой слизи. Критерием оценки эффективности схем лечения служило отсутствие микробоносительства у животных после лечения.

Таблица 8

Схемы лечения свиней при микоплазмозе и ассоциативных формах _ его проявления__

Группы жив-ых Характеристика групп Применяемые препараты Курс л счеши*

Опыт 1. Свиноматки

1-> Мик. Энрофлокс 5% 0,5-1 мл на 10 кг в тея. 3-5 дн

2-« Мик. + сальм. Тетрациклип ПВП 0,1 мл на 1 кг однократно

3-« Хлам. + уреапл. Левотетрасульфин ПЭГ 1 мл на 10 кг двукратно, интервал 3 дня

4-« Мик. + уреапл. Контрольная но леченая группа -

5» Клинически здоровые жив-с Контрольная иятахтная группа

Опыт 2. Поросята

!-> Мнк. + уреапл. Линкоыицнн 0,5-1 мл на 10 кг в теч. 5-7 дн

2-« Мик + паст. Энрофлокс 5% 0,5-1 ил на 10 кг в теч. 3-5 дн

3-я Мих. + урсапл. + леггг. + лист. Тилоцнхлип ПЭГ 0,1 мл на 1 кг однократно

4-я Мик. + хлам. + салъм. + лист. Лсвотетрасульфип ПЭГ 1 мл на Ю кг двукратно, интервал 3 дня

5* Мик. + паст. + сальм. Контрольная группа, леченная по схеме, применяемой в хозяйстве (Нитокс). 1 мл на 10 кг однократно

6-я Клинически здоровые жив-с Контрольная кпггакгаая группа -

Наиболее эффективной схемой лечения свиноматок при микоплазмозе оказалась 1-ая при использовании Энрофлокса-5%, а при лечении от микоплазмоза в сочетании с сальмонеллезом - 2-ая с применением Тетрациклина ПВП. При лечении поросят, инфицированных микоплазмами и уреаплазмами, наиболее эффективной была 1-я схема с применением линкомицнна, а при смешанной инфекции микоплазмоза с пастереллезом - 2-ая (Энрофлокс-5%) и 5-я (Нитокс) схемы (табл. 8).

Применение разработанных схем лечения свиней в хозяйстве позволило предотвратить экономический ущерб на сумму 57936 руб., при этом экономический эффект от проведённых лечебно-профилактических мероприятий составил 47936 руб., а экономический эффект на один рубль затрат составил - 4,8 руб.

ВЫВОДЫ

1. Микоплазмоз свиней широко распространен в хозяйствах Омской и Тюменской областей. Из 15-ти обследованных хозяйств в виде моноинфекции он зарегистрирован в двух (13%), а в остальных проявляется в ассоциативной форме.

2. Разработанные Омским НИИ ПОИ Роспотребнадзора совместно с ИВМ ОмГАУ жидкие и плотные питательные среды для индикации микоплазм и уреаплазм чувствительны и специфичны и позволяют выделять микоплазмы и уреаплазмы из биоматериала при жизни и патологического материала от свиней, дифференцировать их по основным биохимическим показателям и определять их концентрацию в КОЕ и ЦОЕ.

3. Выделенные от свиней из хозяйств Омской и Тюменской областей микоплазмы по биохимическим свойствам относятся к: М. ЬуогЫшБ, М. Ьуозупоу1ае и 11геар!азта эр.

4. Антигены, полученные из выделенных от свиней культур микоплазм, и гомологичные диагностические кроличьи антисыворотки активны в РНИФ и выявляют 50-82% больных животных и микоплазмоносителей. При этом специфичность РНИФ подтверждается результатами бактериологических исследований в 56% случаев. Данный метод позволяет одновременно с индикацией определять и видовую принадлежность микоплазм,

5. Разработанный микоплазмозный эритроцитарный диагностикум для РНГА специфичен и высокочувствителен: выявляет 66,5% больных свиней. РНГА и РНИФ дополняют друг друга и позволяют обнаруживать на 5-20% больше (в среднем на 9%) больных животных. Они имеют

17

преимущество перед микробиологическим методом диагностики, являются более технологичными и могут применяться одновременно с проведением массовых серологических исследований свиней на другие инфекционные болезни.

6. ПЦР является перспективным тестом в общем комплексе диагностики, она выявляет 80-83% положительных на микоплазмоз проб и дополняет микробиологический диагноз посмертно и прижизненно в 51,6% и 13,4 % случаев.

7. Выделенные от свиней культуры микоплазм и уреаплазм обладают высокой чувствительностью к препаратам фторхинолонового ряда (энрофлосацин, норфлоксацин), макролидам (гилан, тилозин), тетрациклину, линкомицину.

8. При микоплазмозе у свиноматок наиболее эффективной является схема лечения с использованием Энрофлокса-5%, а при микоплазмозе, ассоциированном с сальмонеллезом - с применением тетрациклина ГТВП. При лечении поросят от микоплазмоза и уреаплазмоза наиболее эффективна схема с применением линкомицина, а при смешанной инфекции микоплазмоза с пастереллезом - с использованием энрофлокса-5% и нитокса. Экономический эффект от внедрения предложенных рациональных схем диагностики и лечения составляет 4,8 рубля на один рубль затрат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Ветеринарной практике предложены рациональные методы диагностики микоплазмоза свиней (микробиологический, РНИФ и РНГА), которые подробно изложены в методических рекомендациях: «Экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней», с целью своевременного выявления и изоляции больных животных и микробононосителей, а также схемы лечения свиней при микоплазмозе и ассоциативных формах его проявления. Материалы диссертации могут быть использованы:

- для написания монографий, инструкций и наставлений;

-в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по микробиологии и эпизоотологии;

- в научно-исследовательских институтах и учреждениях ветеринарной медицины при решении вопросов диагностики, профилактики и лечения микоплазмоза свиней

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Распространение урогенитального микоплазмоза свиней и ассоциативных

форм его проявления в хозяйствах Ишимского района Тюменской области / А.П. Красиков, А.Е. Жонголович // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: сб. науч. тр. Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии -Ульяновск, 2006. - С. 379-381.

2. Усовершенствование экспресс-методов диагностики микоплазмоза свиней /

А.Е. Жонголович, Г.В. Березкина // Патология сельскохозяйственных

ливошмч и ими LC нрофи.ыкшчи кО. iiayi. ip НИМИ ЬГЖ СО I'\CXH-Омск, 2007 - С. 74-81 ЗМвкопшчш книиси \Г Жош.иопич, I В. Ьерглипа - ИроЫечм HuiL-punapiioii и лю1к-\иичсскои наук и и>1и их решеиия кО па.ч ip ИВМ ОмГАУ -ОМкК, 2008 С 74-Г)

4 Ч\вктвше ibiiocn. и лил шшичсхкая ценность чинробисипничекко'о и

iepo юшчсгких (И1ИФ, Р1П Л) методон чиапюииьи чиьопллмша (.виной Л 11 Кр пикон, Л1 Жшполович lîcrepmiapii м чаю гагия - Москва. 2008

5 Сравнение рлны\ мет и юн лиапкклики млмишазчом uihiiiM Al

Жшмолопич, Ml Красиков Першсмины развития aipapi-ки па>ки и .Пфаюиапия- ей на\ч ip ИВМ Оч! \У - ОмкК. 2008. I 140-148 fi. С\ечы 1СЧСПИ» при чикон.шчнм-ассиниировапнпи ичфекнин о.ипес А У Аошо ИШ11Ч, НЮ Дмшриен.1 Вестник Ом1 \У ci'eimviijkf. посняшсншлй VO-.ik'iHiu МВМ ОмГ-W- 0чкО>08 -( 112-110 7 (.'раннию'ппмя харакирисшьм ыбпратримч чешлои mai п.к гики миконла 1M.HJ свиней VI Жош.м.жнч. А II Красиков. 11 Ф \а >.к<> \ki\jjii.iibic пробили.! (.охранения ы»Г"м.я naît шшя (. ибири кШ.а'ч тр ОмГМА-Омск, 2008 -Т 2.-С. 178-181

Отпечатано в топографии ООО «ОПУС» Заказ №230 от 20 11 2008г Тираж 100 экз

Актуальность темы. Развитие свиноводства на промышленной основе заострило в числе многих других проблему сохранения репродуктивных способностей маточного стада. Экономический ущерб от микоплазмоза обусловлен снижением массы тела животных, потерей племенных качеств, замедлением роста и развития, низкой оплатой корма, появлением заморышей, гибелью поросят и значительными затратами на лечение и оздоровительные мероприятия.

В данное время широко дискутируется вопрос о первостепенной роли микоплазм в патогенезе заболеваний со смешанной этиологией, их сочетанном действии с другими бактериями и вирусами. Общего ответа быть не может, но микоплазмы, являясь самостоятельной группой, в содружестве с другими микроорганизмами усиливают свое патогенное действие (Г.Г. Миллер, И.В. Раковская, В.Э. Березин, 1991; А .Я Пусто-вар, 1995; П.П. Фукс, 1995; С. Liu, RJ. Baier, X.J. Qu, 1997). Особое значение это явление приобрело в последние годы, т.к. в условиях хозяйств, особенно крупных, все чаще одновременно обнаруживаются не- . сколько инфекций. Микоплазмоз повышает восприимчивость свиней к вторичным инфекциям, что делает его течение более тяжелым, зачастую приводя к гибели.

Развитие техники и методов микоплазматологии лишь недавно позволило начать исследования по определению роли микоплазм в патологии органов воспроизводства свиней. Одновременно у свиней обнаружены уреаплазмы, их значение в патологии свиней изучено недостаточно.

Лабораторная диагностика микоплазмозов и уреаплазмозов требует усовершенствования, так как при выделении возбудителей этих болезней используют сложные микробиологические и культуральные методы, пока еще не доступные для большинства лабораторий (Фукс П.П., Калашник Н.В., Герус Г.Б., 1995; Гречухин, А.Н., 1997).

В связи с этим весьма актуальным является проведение своевременной диагностики микоплазмоза в ассоциации с сопутствующими микроорганизмами, что позволит выявлять больных животных, носителей и разрабатывать меры по борьбе с этим заболеванием. Все это послужило основанием для проведения данных исследований.

Цель работы. Усовершенствовать экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней, в том числе при ассоциативных формах его проявления и разработать схемы лечения больных животных.

Задачи исследований:

- изучить эпизоотическую ситуацию по микоплазмозу свиней и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей;

- изучить культуральные, морфологические, биохимические и патогенные свойства выделенных от свиней микоплазм;

- разработать и испытать в производственных условиях экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней и его ассоциативных форм проявления, а также эффективные и рациональные схемы лечения, дать им экономическое обоснование.

Научная новизна. Выявлена широкая распространенность в хозяйствах Омской и Тюменской областей микоплазмоза свиней, в том числе в ассоциациях с некоторыми другими инфекциями. Изучены основные свойства микоплазм, выделенных от свиней. Усовершенствованы экспресс-методы диагностики микоплазмоза: микробиологический — с помощью специальных питательных сред для индикации и идентификации микоплазм и уреаплазм и серологические - для выявления микоплазм и их антигенов в биоматериале, а также антител в сыворотке крови с помощью РНИФ и РИГА.

Получены приоритетные справки № 2007135196 / 13 (038479) от 21.09.2007 на способ получения микоплазмозных диагностических сывороток для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) путем гипериммунизации кроликов и № 2007135195 / 15 (038478) от 21.09.2007 на способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней, а также уведомления о положительном результате формальной экспертизы от 07.11.2007 г.

Разработаны научно-обоснованные рациональные схемы лечения свиней при микоплазмозе с учетом его ассоциативных форм.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации вносят определенный вклад в развитие науки мико-плазмологиии и микропаразитоценологии.

Разработанные методики дают возможность получать микоплаз-мозные антигены и антисыворотки для РНИФ и эритроцитарный диаг-ностикум для РНГА. Применение экспресс-методов диагностики, отраженных в методических рекомендациях «Экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней» позволит своевременно выявлять больных животных и микоплазмоносителей, и разрабатывать меры борьбы и профилактики, контролировать эпизоотическую обстановку по данной инфекции. Применение разработанных схем лечения при микоплазмозе свиней, в том числе и в ассоциации с другими инфекциями, создаст условия для более эффективного проведения мероприятий по борьбе с данной болезнью.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2006 г. «Научные и практические проблемы ветеринарной медицины, животноводства и перспективы их решения» (Омск, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006, СО РАСХН ВНИИБТЖ), Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск УГСХА, 2006 г), Межрегиональной научно-практической конференции «Патология сельскохозяйственных животных и пути её профилактики» (Омск, 2007, СО РАСХН ВНИИБТЖ), 14-ой научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2008 г. «Проблемы ветеринарной и зоотехнической наук и пути их решения» (Омск, 2008), 7-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008, СО РАСХН ВНИИБТЖ).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе одна в научном журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная патология»).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 218 источников, в том числе 90 зарубежных авторов.

110 выводы

1. Микоплазмоз свиней широко распространен в хозяйствах Омской и Тюменской областей. Из 15-ти обследованных хозяйств в виде моноинфекции он зарегистрирован в двух (13%), а в остальных проявляется в ассоциативной форме.

2. Разработанные Омским НИИ ПОИ Роспотребнадзора совместно с ИВМ ОмГАУ жидкие и плотные питательные среды для индикации микоплазм и уреаплазм чувствительны и специфичны и позволяют выделять микоплазмы и уреаплазмы из биоматериала при жизни и патологического материала от свиней, дифференцировать их по основным биохимическим показателям и определять их концентрацию в КОЕ и ЦОЕ.

3. Выделенные от свиней из хозяйств Омской и Тюменской областей микоплазмы по биохимическим свойствам относятся к: М. hyorhinis, М. hyosynoviae и Ureaplasma sp.

4. Антигены, полученные из выделенных от свиней культур микоплазм, и гомологичные диагностические кроличьи антисыворотки активны в РНИФ и выявляют 50-82% больных животных и мико-плазмоносителей. При этом специфичность РНИФ подтверждается результатами бактериологических исследований в 56% случаев. Данный метод позволяет одновременно с индикацией определять и видовую принадлежность микоплазм.

5. Разработанный микоплазмозный эритроцитарный диагностикум для РНГА специфичен и высокочувствителен: выявляет 66,5% больных свиней. РНГА и РНИФ дополняют друг друга и позволяют обнаруживать на 5-20% больше (в среднем на 9%) больных животных. Они имеют преимущество перед микробиологическим методом диагностики, являются более технологичными и могут применяться одновременно с проведением массовых серологических исследований свиней на другие инфекционные болезни.

6. ПЦР является перспективным тестом в общем комплексе диагностики, она выявляет 80-83% положительных на микоплазмоз проб и дополняет микробиологический диагноз посмертно и о прижизненно в 51,6% и 13,4 % случаев.

7. Выделенные от свиней культуры микоплазм и уреаплазм обладают высокой чувствительностью к препаратам фторхинолонового ряда (энрофлосацин, норфлоксацин), макролидам (тилан, тило-зин), тетрациклину, линкомицину.

8. При микоплазмозе у свиноматок наиболее эффективной является схема лечения с использованием Энрофлокса-5%, а при микоплазмозе, ассоциированном с сальмонеллезом — с применением Тетрациклина ПВП. При лечении поросят от микоплазмоза и уреаплазмоза наиболее эффективна схема с применением линко-мицина, а при смешанной инфекции микоплазмоза с пастерелле-зом - с использованием Энрофлокса-5% и Нитокса. Экономический эффект от внедрения предложенных рациональных схем диагностики и лечения составляет 4,8 рубля на один рубль затрат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Ветеринарной практике предложены рациональные методы диагностики микоплазмоза свиней, которые подробно изложены в методических рекомендациях: «Экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней» (Утверждены Ученым советом ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, протокол № 9 от 28.05.2008 г., секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол № 4 от 05.06.2008 г. и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 2 от 30 июня 2008 г.).

Результаты исследований по диагностике и лечению свиней используются в учебном процессе на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней ИВМ ОмГАУ, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМА и в Тюменском институте подготовки кадров агробизнеса.

1.4. Заключение

Микоплазмы — мельчайшие прокариоты, способные самостоятельно вызывать ряд инфекционных болезней животных, птиц и человека. Их обнаруживают при поражениях респираторных органов, мочеполовой системы, суставов и глаз.

Они способны прикрепляться к респираторному эпителию и оказывать на него деструктивное действие, приводя к нарушению энергетического и белкового обмена и иммунологического состояния тканей, вызывают аутоиммунный процесс в организме. Это приводит к снижению функциональной активности иммунной системы, удлинению инфекционного процесса, вплоть до персистирующего его течения. Длительное нахождение микоплазм, создающих пусть мелкие, но множественные очаги поражений, обусловливает реальную опасность проникновения в кровяное и лимфатическое русла, а также непосредственно в органы и ткани различных микробов и вирусов. Они обладают механизмами, направленными на ускользание от защитных систем макроорганизма. Микоплазмы также обладают активным, разрушающим воздействием на защитные системы макроорганизма. Вступают в синерге-тические отношения с вирусной и бактериальной, условно патогенной микрофлорой, создают условия для ее активного роста и развития.

Особое место в разрешении вопроса о патогенности микоплазм занимает сочетанное действие их с другими бактериями и вирусами. Сейчас широко дискутируется вопрос о первостепенности важности микоплазм в патогенезе заболеваний со смешанной этиологией. По-видимому, общего ответа быть не может, но микоплазмы, являясь самостоятельной группой, в содружестве с другими микроорганизмами усиливают свое патогенное действие. Особенно большое значение этот синергизм приобрел в последние годы, поскольку в условиях хозяйств, особенно крупных, все чаще одновременно обнаруживаются 2-3 или больше инфекций.

Поэтому, принимая во внимание особенности течения и патогенез болезни, следует проводить своевременную диагностику микоплазмоза в ассоциации с сопутствующими микроорганизмами, что позволит выявлять больных животных, носителей и разрабатывать меры по борьбе с этим заболеванием. Для своевременной и точной постановки диагноза необходимо применение высокочувствительных и специфичных методов, которые позволят в короткие сроки обнаружить и отдифференцировать возбудителя.

Необходимость комплексной диагностики обусловлена недостаточной эффективностью отдельных методов, трудностью выделения и культивирования возбудителя. Поэтому окончательный диагноз на ми-коплазменную инфекцию необходимо устанавливать на основании выделения и идентификации возбудителя различными методами.

Основными методами индикации и идентификации микоплазм остаются микробиологические методы — с использованием специальных микоплазмозных питательных сред, а вспомогательными - серологические, иммунологические и молекулярно-биологические методы.

Поскольку микоплазменная инфекция часто осложняется вторичной микрофлорой, для обеспечения эффективности лечения необходимо правильно установить диагноз, определить чувствительность микрофлоры к антибиотикам, а затем подбирать антибактериальные препараты. При ассоциативной форме микоплазмоза наиболее эффективно будет применение комплекса из двух-четырех препаратов, имеющих разный механизм действия.

Проанализировав все вышеизложенные данные, можно сделать заключение о том, что разработка методов диагностики при микоплаз-мозе свиней требует усовершенствования, а для лечения больных животных необходимо изыскание наиболее рациональных и эффективных схем применения комплексных препаратов с учетом ассоциативных форм течения микоплазмоза.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Тема диссертационной работы является составной частью комплексной государственной программы «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» (№ гос. регистрации 01.2.001100602).

Исследования проводились с 2005 по 2008 гг. в лаборатории мик-стинфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней ИВМ ОмГАУ, в лаборатории зоонозных инфекций НИИПОИ Роспотребнад-зора, в Омской областной ветеринарной лаборатории и хозяйствах Омской и Тюменской областей.

Объектом исследований являлись свиньи различных возрастных групп с выраженными клиническими признаками пневмонии, артритов, эндометритов и конъюнктивитов.

Материалом для исследований служили пробы сыворотки крови, цервико-вагинальной слизи, носовых истечений, суставной жидкости, патологический материал от погибших животных и абортированных плодов.

В экспериментальных условиях использовали: 6 кроликов и 20 белых мышей.

Для диагностики использовали эпизоотологические, клинические, патологоанатомические и лабораторные методы.

Для индикации и идентификации возбудителей применяли серологические и бактериологические методы. Окрашивание мазков проводили по Граму и Романовскому — Гимзе.

Для серологических исследований применяли реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) — для обнаружения антител в сыворотке крови животных, реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) - для обнаружения антител и антигенов в пробах био- и патологического материала, полученного от погибших и вынужденно убитых животных. Фиксацию мазков проводили по методу Моди с соавт. (1958), а постановку РНИФ по методике, предложенной Уэллером и Кунсом (1945).

Микробиологические исследования проводили, используя разработанные совместно с ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора, жидкие и твердые питательные среды для индикации и идентификации микоплазм и уреаплазм. Определение титра микоплазм и уреаплазм проводили на жидких диагностических питательных средах в цветообразующих единицах (ЦОЕ), а на плотных средах в колонеобразующих единицах (КОЕ). Свойства выделенных микроорганизмов изучали по общепринятым методикам.

Микроскопирование проводили при помощи светового микроскопа «Ломо» (х 900). Для видового определения микоплазм использовали ключ Gourlay and Howard (1979).

Патогенность выделенных культур определяли постановкой биопробы на белых мышах.

Для проведения исследований использовали стандартные антигены, используемые для постановки РА и РСК, и полученные нами мико-плазмозные антигены, а в качестве антител — гомологичные антигенам кроличьи и свиные антисыворотки, антивидовые для РНИФ и специфические сальмонеллезные, листериозные для РПИФ люминесцентные сыворотки меченные ФИТЦ (ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), а также полученные нами кроличьи сыворотки против микоплазмоза, уреаплазмоза и ранее полученные в лаборатории микстинфекций против хламидиоза, пастереллеза, диплококкоза (Лобанова Н.В., 2004).

Микоплазмозные антисыворотки к полевым штаммам микоплазм, выделенным от свиней, получали путем гипериммунизации кроликов по схеме D. Schimmel, в модификации А.П. Красикова, H.H. Новиковой, (2000).

Люминесцентную микроскопию проводили с помощью микроскопа ЛЮМАМ Р-8 при увеличении в 900 раз. Степень флуоресценции антител оценивали по 4-х крестной системе (Вайтекер и др., 1958).

Для изготовления эритроцитарного диагностикума для РИГА в качестве клеточной основы использовали эритроциты барана, а для стабилизации 20%-й р-р формальдегида. Фиксацию эритроцитов проводили по методу Фили в модификации Красикова А.П. (2002).

Для диагностики микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции использовали тест-систему «МИК-КОМ» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва. ПЦР-диагностику проводили на базе Омской областной ветеринарной лаборатории совместно с сотрудниками молекулярно-диагностического отдела Хатько Н.Ф., Ковалевской А. А.

Чувствительность выделенных культур микоплазм и уреаплазм к химиотерапевтическим средствам определяли методом серийных разведений (пробирочный вариант) на жидких питательных средах.

Опыты по сравнительному изучению эффективности различных схем лечения свиней при спонтанной микоплазмозной и микоплазмоз-ассоциированной инфекции проводили в ЗАО «Камышино-Курское» Муромцевского района Омской области.

Расчёт экономической эффективности проводили по методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утвержденной Департаментом ветеринарии РФ 21.02.1997 г.

Статистическую обработку материалов проводили согласно методам математической статистики, принятым в биологии и медицине с использованием таблиц Стьюдента (А.Т. Усович, П.Т. Лебедев, 1970), а также с помощью программы Microsoft Excel 2000.

2.2. Изучение эпизоотической ситуации по микоплазмозу свиней и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей

При изучении эпизоотической ситуации по микоплазмозу свиней и ассоциативным формам его проявления нами было проведено комплексное обследование некоторых свиноводческих хозяйств Омской и Тюменской областей. Для этого мы использовали эпизоотологический, клинический, микробиологический и серологические методы. Материалом для исследования служили сыворотка крови, цервико-вагинальная слизь от свиноматок, носовые истечения и внутрисуставная жидкость от поросят, патологический материал от павших или вынужденно убитых свиней и абортированных плодов.

По результатам исследований было установлено, что микоплазмоз свиней имеет широкое распространение в хозяйствах Омской и Тюменской областей (табл. 1 - 3; рис. 1 - 3), причем доля микоплазмоза в ассоциациях значительно больше, чем других инфекций. Так, при комплексном обследовании свиноматок из разных хозяйств наиболее насыщенный микробный пейзаж был выявлен в ЗАО «Рось», в ассоциации с микоплазмами и уреаплазмами обнаружены лептоспиры у 30%, хла-мидии у 20%, энтерококки у 10%, сальмонеллы у 50%, пастереллы у 30% и диплококки у 20% животных (табл. 1). В ООО «Атлант» мико-плазмы и уреаплазмы выделены у 90% свиноматок в ассоциации с хла-мидиями (30%), лептоспирами (30%), листериями (50%), пастереллами (30%), сальмонеллами (50%). Высокую инфицированность свиноматок микоплазмами и уреаплазмами наблюдали в ООО «Агрокомплекс Ударный» (80%), ООО «Титан» (90%), ЗАО «Кам. Курское» (70%), ЛПХ Ефремова М.Н. (70%), СПК им. Чапаева (85%), КХ Трейзе В.Ф. (70%), а также в «Рощино» (57,1%) (рис. 1).

В КФХ Вохмина Е.В. и в ЗАО «Нрвоазовское» микоплазмоз был обнаружен в виде моноинфекции у 60% и 90% свиноматок соответственно.

При исследовании биоматериала от поросят из ООО «Агроком-плекс Ударный» микоплазмы и уреаплазмы были выделены у 82% животных, а также обнаружены листерии у 20%, хламидии у 40%, энтерококки, сальмонеллы и пастереллы у 70%, диплококки у 60% поросят (табл. 2). У поросят ЗАО «Кам. Курское» также наблюдали пестрый микробный пейзаж: микоплазмы и уреаплазмы были выявлены у 100% животных, лептоспиры и хламидии у 20%, листерии и пастереллы у 40%, сальмонеллы у 56% обследованных животных.

Высокая инфицированность микоплазмами поросят также была в ООО «Титан» (80%), ООО «Атлант» (80%), СПК им. Чапаева (90%), КХ Трейзе В.Ф. (65%), ООО «Комплекс» (66,6%) (рис. 2).

В виде моноинфекции микоплазмоз поросят был зарегистрирован в одном хозяйстве КФХ Вохмин Е.В. (75%).

При исследовании проб патологического материала от погибших или вынужденно убитых свиней и абортированных плодов наибольшая инфицированность органов микоплазмами и уреаплазмами наблюдалась в СПК им. Чапаева (85%), в сочетании с хламидиями и пастереллами (15%,), сальмонеллами (25%) и листериями (15%), а также в КХ Трейзе В.Ф. (80%) (табл. 3). Несколько меньше микоплазмами и уреаплазмами были инфицированы пробы, взятые в ОАО «ОПХ СибМИС» (57,1%), КФХ Вохмина Е.В. (65%) (рис. 3). При исследовании патологического материала из ООО «Агрокомплекс Ударный» микоплазмы и уреаплазмы обнаружены в 22,2% проб, «Рощино» в 50%, ЗАО «Согласие» 28,5%, и ООО «Комплекс» выделены микоплазмы в 12,5% проб.