Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка ассоциированной вакцины против инфекционного бронхита кур и ньюкаслской болезни

На правах рукописи

Для служебного пользования № 7 дсп от 08.02.2000 г. экз. № Щ

УДК 619:616.98:578.834.11.578.831.1:615.371

ФРОЛОВ Сергей Владимирович

РАЗРАБОТКА АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР И НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология,эпизоотология, микология и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, старший

научный сотрудник Борисов A.B.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Куриленко А.Н. (МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, г. Москва)

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Диев В.И. (ВНИИЗЖ, г. Владимир)

Ведущее учреждение: Всероссийский государственный научно-

исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г. Москва).

Защита состоится «4» апреля 2000г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д120. 60. 01. при Всероссийском научно -исследовательском институте защиты животных Минсельхозпрода РФ по адресу: 600900, г. Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ. ^ С &

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных*. =;" Л-

/ . Автореферат разослан «3» марта 2000г. — -ч

к-'

Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Семенова

ППг.Цэ

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Специфическая профилактика вирусных болезней птиц занимает ведущее место в условиях современного ведения промышленного птицеводства. Вакцинопрофилактика инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве проводится раздельно с применением моновакцин против каждой инфекции с интервалом в 1-2 недели.

В целях обеспечения ветеринарного благополучия птицеводческих хозяйств возникает необходимость профилактических прививок против двух, трех и более вирусных болезней.

В то же время известно, что одним из важнейших вопросов упрощения и оптимизации прививочного календаря, является создание поливалентных или ассоциированных вакцин.

В настоящее время доказано, что применение ассоциированных вакцин, а также комплексной и ассоциированной иммунизации в сравнении с многократными прививками различными монопрепаратами имеет несомненные преимущества в плане значительного сокращения времени на создание иммунитета одновременно к нескольким инфекциям, совершенствования громоздких схем профилактических прививок и снижения аллергических реакций. Основными преимуществами ассоциированных вакцин, комплексных и ассоциированных прививок является то, что при этом резко сокращается число инъекций, а количество вводимых антигенов не уменьшается.

В связи с этим большое значение придается применению ассоциированной вакцины против ИБК и НБ, преимущество которой заключается в создании иммунитета сразу к двум болезням одновременно при экономии времени и трудозатрат.

В последние годы в нашей стране в ряде птицехозяйств применяли дорогостоящую ассоциированную вакцину против ИБК и НБ - «Ма5» + «клон 30» (Интервет, Голландия), которая обеспечивала надежную защиту

от ИБК, но иммунный ответ к НБ был низким. Поэтому возникла острая необходимость создания отечественной ассоциированной вакцины против ИБК и НБ, лишенной вышеперечисленных недостатков.

Однако многие вопросы, связанные с получением и применением ассоциированной вакцины против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни, требовали доработки в области технологии получения вакцины, а так же изучения ее свойств. Вакцинные штаммы этих вирусов имеют различные иммунобиологические и антигенные свойства и возникает необходимость подбора штаммов, обеспечивающих создание напряженного иммунитета у птиц. В то же время возникает необходимость изучения совместимости вакцинных штаммов при создании их ассоциации и влияния ассоциированных вакцин на иммунный ответ птиц после введения, а также в определении сроков наступления иммунитета у птиц. Недостаточно изучены вопросы влияния путей введения вакцины на иммунный ответ птиц.

Таким образом, разработка технологии изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни и изучение иммунобиологических свойств этой вакцины являются весьма актуальными и требуют решения.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлась разработка технологии получения ассоциированной вакцины против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни и изучение иммунобиологических свойств этой вакцины.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- подобрать и изучить вакцинные штаммы вируса инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни для изготовления ассоциированной вакцины;

- отработать оптимальные условия, режим получения и компонентный состав живой ассоциированной вакцины против ИБК и НБ;

- отработать условия культивирования вакцинного штамма вируса

ИБК;

- изучить иммунобиологические свойства живой ассоциированной вакцины против ИБК и НБ;

- определить иммуногенную эффективность ассоциированной вакцины из вирусов ИБК и НБ при различных методах применения;

- изучить свойства ассоциированной вакцины в процессе длительного хранения;

провести лабораторные и производственные испытания "ассоциированной вакцины против ИБК и НБ;

разработать нормативно-техническую документацию на ассоциированную вакцину против ИБК и НБ.

Научная новизна. В результате проведенных исследований подобраны вакцинные штаммы вируса инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни, которые пригодны для получения ассоциированных вакцин и обладают выраженными антигенными и иммуногенными свойствами. Отработан метод культивирования штамма "Н-120" вируса ИБК. Изучены иммунобиологические свойства ассоциированной вакцины против ИБК и НБ и определена иммуногенная эффективность этой вакцины при различных методах применения. Установлено, что ассоциированная вакцина против ИБК и НБ может применяться методом выпаивания с водой, крулнокапельного распыления, интраназально и окулярно. Определены оптимальные иммунизирующие дозы для указанных методов применения. Обнаружено наличие вариантных штаммов вируса ИБК на территории РФ с помощью серологических методов. Приготовлена экспериментальная серия полиштаммной инактивированной вакцины против ИБК из вариантных штаммов, встречающихся на территории нашей страны. Она оказалась стерильной, безвредной и иммуногенной, а ее высокая антигенная эффективность подтверждена серологическими методами.

Практическая значимость. В результате выполненных исследований разработана ассоциированная вакцина против ИБК и НБ для различных методов введения, которая может успешно применяться в хозяйствах с различным направлением ведения птицеводства. Ассоциированная вакцина стерильна, безвредна, ареактогенна и обладает высокой

имуногенной активностью. Ассоциированная вакцина прошла производственные комиссионные испытания в 9 птицехозяйствах объединения «Кубаньптицепром» на поголовье более 2 млн. птиц.

Нормативно-техническая документация на разработанную вакцину одобрена ученым советом института и утверждена Департаментом ветеринарии Российской Федерации. Ассоциированная вакцина против ИБК и НБ внедрена в промышленное производство и применяется в птицеводческих хозяйствах России.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

- подбор и изучение вакцинных штаммов вируса инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни, пригодных для изготовления ассоциированной вакцины;

- обоснование оптимальных условий получения и компонентного состава живой ассоциированной вакцины против ИБК и НБ;

- результаты изучения иммунобиологических свойств живой ассоциированной вакцины против ИБК и НБ;

- обоснование методов применения ассоциированной вакцины против ИБК и НБ;

- результаты изучения свойств ассоциированных вакцин в процессе длительного хранения;

- тилирование вируса ИБК по наличию специфических антител в сыворотках крови в РН и РТГА;

- оценка антигенной активности полиштаммной инактивированной вакцины против ИБК серологическими методами.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были доложены на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1997-1999г.г. и на научных конференциях ВНИИЗЖ (г. Владимир, 1997; 1998).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ

Директором ВНИИЗЖ утверждены «Методические указания по определению уровня антител к вирусу инфекционного бронхита в реакции

торможения гемгглютинации» и «Методические указания по постановке реакции нейтрализации при инфекционном бронхите кур».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 172 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 239 источников, в том числе 45 работ отечественных исследователей. Работа иллюстрирована 33 таблицами, 3 рисунками и дополнена приложением документов, подтверждающих внедрение результатов работы в ветеринарную практику.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

В работе использовали следующие материалы:

Вакцинные штаммы вируса Ньюкаслской болезни:

1. производственный, лентогенный штамм «Ла-Сота»;

2. производственный, лентогенный штамм «В1»;

3. производственный, лентогенный штамм «БОР-74 ВГНКИ».

Вирулентный штамм вируса Ньюкаслской болезни.

Вирулентный, велогенный штамм «Т» (Томилинский) использовали в

острых опытах для контрольного заражения опытных и контрольных групп птиц при проверке напряженности иммунитета против Ньюкаслской болезни.

Вакцинные штаммы вируса инфекционного бронхита кур:

1. производственно-вакцинный штамм «Н-120»;

2. производственно-вакцинный штамм «Н-52»;

3. вакцинный штамм «Ма5»;

4. вакцинный штамм «Д274»;

5. вакцинный штамм «4/91».

Вирулентный штамм вируса инфекционного бронхита кур.

Вирулентный штамм «Чапаевский» использовали для контрольного заражения опытных и контрольных групп птиц при проверке напряженности иммунитета против инфекционного бронхита кур.

Все перечисленные штаммы получены из ВГНКИ.

Вакцины:- опытные серии вакцины против ИБК и НБ живой сухой, изготовленные в условиях ВНИИЗЖ в 1996-1998г.г.;

- коммерческие ассоциированные вакцины против ИБК и НБ фирм «ТАД» (Германия), «Шафит» (Израиль), «Нобилис» (Голландия);

- производственные серии вакцины против ИБК и НБ живой сухой, изготовленные в условиях ВНИИЗЖ в 1998-1999 г.г.;

- производственные серии вакцины против ИБК из штамма «Н-120» живой сухой, изготовленные во ВНИИЗЖ;

- производственные серии сухой вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота», изготовленные во ВНИИЗЖ.

Питательные среди и растворы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар, мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом, агар Сабуро, тиогликолевая среда, казеиновый бульон. 1%-ные эритроциты СПФ-цыплят 15 дневного возраста. 1%-ные эритроциты петуха 6-месячного возраста. Физиологический раствор (pH 7,2), 1% раствор трипсина, йодированный спирт, дистиллированная вода.

Стабилизаторы: гидролизат лактальбумина, сахароза, желатоза, обезжиренное стерильное молоко, глютамат натрия, поливинилпирролидон, пептон.

Сыворотки. В экспериментах находилось более 2000 проб сывороток крови птиц разного возраста, взятых до прививки и в различные сроки после вакцинации опытными и производственными сериями ассоциированной вакцины.

Эмбрионы кур. В лабораторных экспериментах было использовано более 3000, а для изготовления производственных серий более 10000 СПФ эмбрионов кур, которые получены от фирм «Lohmann Tierzucht» (Германия) и «Spafas» (США).

Птица. В экспериментах использовали более 1200 серонегативных птиц разного возраста мясных и яичных пород, полученных из хозяйств, благополучных по ИБК и НБ, а также 90 СПФ-цыплят. В производственных испытаниях было вакцинировано более 2 млн. птиц яичных и мясных пород.

Определение совместимости вирусов инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни

С целью изучения взаимного влияния различных штаммов вирусов ИБК и НБ провели эксперименты по совместному культивированию в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Куриные эмбрионы заражали в аллантоисную полость, время инкубирования-72 часа при температуре 36,5°С. Для контроля накопления вирусов проводили культивирование штаммов по отдельности. После культивирования вируссодержащую экстраэмбриональую жидкость (ЭЭЖ) собирали и титровали на СПФ КЭ.

В дальнейшем определяли возможность совместного введения в организм птицы вакцинных штаммов вируса ИБК и вируса НБ. Птицу в возрасте 21 суток вакцинировали методом выпаивания, двукратно в дозах, предусмотренных наставлениями по применению соответствующих моновакцин.

Результаты оценивали по характеру поствакцинальных реакций и по уровню антител к вирусу ИБК в ИФА, к вирусу НБ в РТГА в различные сроки после вакцинации.

Определение условий культивирования вакцинных штаммов

В опытах использовали матровую расплодку лиофилизованного вируса ИБК штамма «Н-120» с инфекционной активностью 7,0 1дЭИД50/мп-РКЭ заражали в аллантоисную полость, на хорионаллантоисную оболочку и в амнион. Оценку накопления вируса проводили по титру инфекционной активности в ЭЭЖ.

Оптимальный возраст эмбрионов, обеспечивающий максимальное накопление вируса, определяли заражением 8, 9, 10 и 11-дневных РКЭ. Температуру инкубирования зараженных эмбрионов определяли культивированием вируса при разных температурных режимах от 35,0 до 38,0°С. Оптимальную инфицирующую дозу (испытывали дозы Ю30; Ю40 и Ю5,0 1дЭИД50/0.2ш,) и сроки репродукции вируса ИБК штамма «Н-120» определяли на эмбрионах кур, зараженных различными дозами по инфекционному титру ЭЭЖ, собранной через 48, 72, 96 часов после заражения.

Вируссодержащий материал штаммов ИБК и НБ для производственных серий вакцины готовили отдельно. Для заражения куриных эмбрионов использовали метровые расплодки вирусов, разведенные стерильным физиологическим раствором из расчета 1000020000 ЭИДзолш вируса ИБК и 100000-200000 ЭИД50/МЛ вируса НБ.

Для изготовления вакцины использовали эмбрионы (живые и погибшие) 36-72 часовой инкубации для вируса ИБК и только живые эмбрионы 96 часовой инкубации для вируса НБ. Экстраэмбриональную жидкость проверяли на стерильность и инфекционную активность.

Определение биологической активности вирусов

Биологическую активность вирусов ИБК и НБ определяли титрованием на развивающихся СПФ-эмбрионах кур 10-дневной инкубации.

Титр вирусов рассчитывали по методу Кербера в модификации И.П Ашмарина.

Определение безвредности, антигенной и иммуногенной активности вакцины

Проверку вакцины на безвредность проводили выпаиванием 10-кратной иммунизирующей дозы 10 цыплятам. За цыплятами вели наблюдение в течение 10 суток.

Для проверки вакцины на иммуногенность цыплят иммунизировали методом выпаивания двукратно с интервалом 10 суток.

Для определения антигенной активности вакцины по компоненту ИБК сыворотки крови иммунизированных цыплят исследовали методом ИФА. Обработку, полученных в ИФА результатов проводили согласно прилагаемой инструкции. Далее в тексте значения титров представлены в виде величин, обратных разведениям.

Оценку антигенной активности вакцины по компоненту НБ проводили в РТГА.

Иммуногенность отдельных серий вакцины проверяли по устойчивости привитых цыплят к контрольному заражению вирулентными штаммами вирусов ИБК и НБ.

Контрольное заражение вирулентными штаммами «Чапаевский» вируса ИБК и «Т» вируса НБ проводили на 10, 14, 21, 60 дни после вакцинации. Одновременно заражали подопытных и контрольных цыплят. Вирус вводили интратрахеально и внутримышечно. За зараженными цыплятами вели наблюдение 10 суток.

Методы иммунизации

При испытании методов иммунизации ассоциированной вакцины сравнивали четыре метода.

Метод выпаивания. Вакцину разводили с таким расчетом, чтобы в ранее определенном объеме воды на 1 голову содержалась 1 доза вакцины.

Метод крупнокапельного распыления. Иммунизацию проводили из расчета 1 доза в 0,25мл для цыплят моложе 10 дневного возраста и 1доза в мл для белее старшей птицы. Разведенную водой вакцину распыляли над соответствующим количеством птиц с расстояния 30-40см, при тусклом освещении.

Интраназальный/окулярный метод. Для этого метода применения вакцину разводили физиологическим раствором из расчета 0,1мл (2 капли) на одну дозу препарата. Две капли вакцины закапывали в одну ноздрю или в один глаз.

Методика постановки РТГА и РН при инфекционном бронхите кур Постановку данных реакций осуществляли согласно «Методическим указаниям по определению уровня антител к вирусу инфекционного бронхита в реакции торможения гемагглютинации» и «Методическим указаниям по постановке реакции нейтрализации при инфекционном бронхите кур».

Статистическая обработка результатов исследований

Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятой методике (И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Подбор вакцинных штаммов вирусов ИБК и НБ для изготовления ассоциированной вакцины

Исследования были начаты с подбора вакцинных штаммов вирусов ИБК и НБ, пригодных для использования в составе ассоциированной вакцины. С целью изучения взаимодействия разнотиповых вирусов в составе ассоциированного препарата были проведены 2 серии экспериментов.

В первой серии экспериментов изучали взаимовлияние штаммов при культивировании в РКЭ. Для контроля накопления вирусов ИБК и НБ проводили культивирование штаммов по отдельности. Испытаны штаммы «Н-120», «Н-52», «Ма5» вируса ИБК и штаммы «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ» вируса НБ.

Таблица 1

Накопление вируса НБ при совместном культивировании со

штаммами вируса ИБК

Штаммы вируса ИБК Штаммы вируса НБ Титр вируса (!д ЭИД50/мл)

контроль опыт разность*

Н-120 Ла-Сота 9,70±0,15 9,6010,14 0,10

Бор-74 9,5210,10 9,4510,07 0,07

В1 9,7010,15 9,5010,12 0,20

Н-52 Ла-Сота 9,70*0,15 9,0210,07 0,68

Бор-74 9,5210,10 8,9110,09 0,61

В1 9,7010,15 8,8810,10 0,82

Ма5 Ла-Сота 9,70±0,15 9,4810,08 0,22

Бор-74 9,5210,10 9,3310,10 0,19

В1 9,7010,15 9,2010,13 0,50

Примечание *- разность между значениями биологической активности контроля и опыта

Табл. 1 демонстрирует, что накопление использованных штаммов вируса НБ при совместном культивировании со штаммом «Н-120» не

отличалось от уровня контроля. При культивировании со штаммом "Н-52" уровень накопления штаммов вируса НБ понижался на 0,61-0,82 1дЭИД50. Уровень накопления штамма "ВГ вируса НБ понижался при совместном культивировании со штаммом "Ма5" вируса ИБК на 0,5 1дЭИД50 и не изменялся у штаммов "Ла-Сота" и «Бор 74 ВГНКИ».

Было установлено, что штаммы вируса НБ практически не влияли на накопление вируса ИБК при совместном культивировании в КЗ.

Во второй серии экспериментов исследовали иммунный ответ на штаммы вируса ИБК и НБ при использовании их в составе ассоциированной вакцины.

Таблица 2

Иммунный ответ цыплят на ассоциированное введение штаммов

вирусов ИБК и НБ

Штаммы вируса ИБК Штаммы вируса НБ Титр антител к вирусу НБ (1од2)

контроль опыт Р

Н-120 Ла-Сота 7,5±0,3 6,9±0,3 >0,05

Бор-74 6,3±0,2 6,1±0,4 >0,05

В1 5,3±0,3 5,0±0,2 >0,05

Н-52 Ла-Сота 7,5±0,3 6,3±0,2 <0,05

Бор-74 6,3±0,2 4,9±0,2 <0,05

В1 5,3±0,3 4,2±0,3 <0,05

Ма5 Ла-Сота 7,3±0,3 5,7±0,3 <0,05

Бор-74 6,3±0,2 5,0±0,1 <0,05

В1 5,3±0,3 4,1 ±0,2 <0,05

Из табл. 2 следует, что штамм «Н-120» вируса ИБК при ассоциированной иммунизации не влиял на уровень антигемагглютинирующих антител ко всем штаммам вируса НБ. Уровень

накопления антител ко всем штаммам вируса НБ понижался при «

ассоциированной иммунизации со штаммами «Н-52» и «Ма5» вируса ИБК.

В свою очередь при ассоциированной иммунизации со штаммом «Ла-Сота» вируса НБ уровень антител к штамму «Н-120» был выше, к штамму «Н-52» - оставался неизменным, а к штамму «Ма5» понижался по сравнению с иммунизацией монопрепаратами. Уровень антител к штаммам «Н-52» и «Ма5» при ассоциированной иммунизации со штаммами «В1» и «Бор-74 ВГНКИ» был значительно ниже.

Нами определены штаммы вирусов ЦБК и НБ («Н-120» и «Ла-Сота» соответственно), которые имели наименьшую ингибицию при совместном культивировании в РКЭ и минимально влияли на уровень гомологичного иммунного ответа.

3.2. Оптимальный режим получения и компонентный состав живой ассоциированной вакцины против ИБК и НБ

Важным моментом при изготовлении ассоциированных вакцин является оптимальное соотношение биологической активности выбранных штаммов с составе сырья.

Неправильный выбор исходной активности вирусов может быть причиной низкой антигенной активности одного из них или обоих в составе ассоциированной вакцины.

Было установлено, что при изготовлении ассоциированной вакцины необходимо использовать вирус ИБК с титром не ниже 6,5 1дЭИД5о/мп, а вируса НБ с титром не ниже 9,0 1дЭИД5о/мл. Использование для изготовления вакцины вирусов ИБК и НБ с меньшим титром является технологически нецелесообразным.

Известно, что используемые ассоциированные вакцины должны иметь хорошо сбалансированные объемы входящих в нее компонентов.

На основании полученных результатов оптимальным соотношением штаммов вирусов ИБК и НБ при смешивании является отношение 1:2-1:4.

При определении компонентного состава ассоциированной вакцины нами была проведена серия опытов по подбору стабилизирующей среды, обеспечивающей максимальное сохранение инфекционной и иммуногенной активности вирусов при лиофилизации. Этим условиям наиболее полно

отвечала защитная среда ВНИИЗЖ, которая обеспечивала минимальные потери инфекционой активности вирусов, а иммуногенная активность, высушенного препарата была сравнима с таковой при вакцинации нативным материалом.

3.3. Отработка условий культивирования вакцинного штамма "Н-120"

вируса ИБК

Условия культивирования вакцинного штамма «Н-120» вируса ИБК в нашей стране не отрабатывались. Поэтому ряд исследований был посвящен отработке условий культивирования вакцинного штамма «Н-120» вируса ИБК.

Проведенные эксперименты показали, что оптимальный способ заражения является введение вируса ИБК в аллантоисную полость РКЭ. Этот способ заражения позволял нарабатывать вирус с инфекционной активностью 7,4±0,4 1дЭИД50/мл- Оптимальное время инкубирования РКЭ равнялось 72 часам. Данный период инкубирования позволял получать ЭЭЖ с наивысшей концентрацией вируса ИБК.

Наибольшее накопление вируса ИБК в РКЭ происходило при заражении 10-суточных куриных эмбрионов при температуром режиме культивирования 36,С)±0,5°С. Для того чтобы получать вируссодержащий материал с активностью 7,5±0,2 1дЭИД50/мп для заражения необходимо использовать дозу (табл. 3), содержащую 104 ЭИД50/0,2мп- Более высокие заражающие дозы не увеличивают общего урожая вируса.

Таблица 3

Влияние заражающей дозы на уровень накопления вируса ИБК

№ Биологическая активность ВИБК :

п/п Заражающая доза (ЭИД50/о.2мл) (1дЭИД50/мл)

1 Ю30 6,6±0,2 ,!

2 104и 7,5±0.2*

з ю50 7,4±0.3*

Примечание: * - различия весьма существенны при Р<0,001

1-4

3.4. Изготовление опытных серий ассоциированной вакцины против

ИБК и НБ

Для наработки необходимого количества вируссодержащего сырья были получены матровые расплодки вирусов ИБК и НБ с биологической активностью не ниже 106,° ЭИД5о/мп для вируса ИБК и не ниже Ю8,0 ЭИД£0Лш для вируса НБ. Имея данные расплодки вирусов, приступали к наработке вируссодержащей ЭЭЖ.

Матровые расплодки разводили стерильным физиологическим раствором (рН 7,2) из расчета Ю4,0-1О4,2 ЭИД50/МЛ для вируса ИБК и Ю50~ Ю" ЭИДьо/млДЛя вируса НБ.

Приготовленной суспензией заражали РКЭ в аллантоисную полость в объеме 0,2мл и инкубировали при 36,0±0,5°С и относительной влажности 60-70% в течение 72 часов для вируса ИБК и 96 часов для вируса НБ. Для изготовления вакцины использовали все эмбрионы (живые и погибшие) после 36-72 часовой инкубации для вируса ИБК и только живые эмбрионы 96 часовой инкубации для вируса НБ.

ЭЭЖ от каждых 20-30 эмбрионов собирали в отдельные флаконы вместимостью 200-500мл. Содержимое флаконов сливали в общий стерильный сосуд, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок собирали в общую емкость. Биологическая активность вируссодержащего материала, идущего на составление серии вакцины, должна быть не ниже 6,5 1дЭИД5о/мл для вируса ИБК и 9,0 1дЭИД50/Мп для вируса НБ.

После получения кондиционного вирусного сырья в каждый из компонентов вакцины по отдельности добавляли защитную среду для лиофилизации из расчета: на 600мл вирусной суспензии 100мл 50% раствора сахарозы, 250мл 20% раствора гидролизата лактальбумина и 50мл 10% раствора желатозы. Полученные жидкие полуфабрикаты вирусов ИБК и НБ перемешивали на шуттель-аппарате в течение 15-30 мин. Затем их объединяли в общую емкость и вновь тщательно перемешивали.

При изготовлении моновакцин против ИБК и НБ используют сходные режимы сушки. Для изготовления ассоциированной вакцины за основу мы взяли режим сушки, используемый при производстве вакцины против ИБК.

В результате исследований получены экспериментальные серии ассоциированной вакцины с биологической активностью по вирусу ИБК 6,50*7,50 1дЭИД5о/мли по вирусу НБ 9,00+10,00 ^ЭИДбо,^. Данным способом изготовлено 6 экспериментальных серий ассоциированной вакцины, из которых 3 использовали для дальнейших испытаний.

3.5. Изучение иммунобиологических свойств опытных серий живой ассоциированной вакцины против ИБК и НБ

3.5.1. Определение биологической активности ассоциированной вакцины.

Одним из основных критериев качества вакцинных препаратов является изменение биологической активности вирусов во время лиофилизации и стабильность вакцины в процессе хранения.

В опытах установлено, что активность вакцинных штаммов после лиофильной сушки остается на прежнем уровне или снижается незначительно, что свидетельствует об оптимальных условиях сушки ассоциированной вакцины.

Таблица 4

Сохраняемость вирусов в опытных сериях ассоциированной вакцины

Инфекционная активность (в !д ЭИД5о,мл)

Сроки хранения (в месяцах)

исходная 12 24

ИБК НБ ИБК НБ ИБК | НБ

'7,42±0,30 9,83±0,20 7,42±0,20 9,75+0,30 7,25±0,30 | 8,75±0,30

В наших опытах показано, что инфекционная активность ассоциированной вакцины через 12 месяцев хранения при 4°С по вирусу ИБК не изменяется, по вирусу НБ снижается на 0,08 ЭИД50/ил, через 24

месяца хранения снижается на 0,17 1дЭИД50/мл по вирусу ИБК и на 1,08 1дЭИД50/мл по вирусу НБ.

3.5.2. Определение условий применения живой ассоциированной вакцины против ИБК и НБ

Важное значение для изучения иммуногенной активности вакцины имеет определение иммунизирующей дозы. Полученные в наших опытах результаты, а также усредненные расчетные данные, показывают, что прививные дозы вакцины, защищающие 80% имунизированных цыплят против контрольного заражения вирулентным штаммом вируса ИБК, должны содержать 3,19 1дЭИД50 штамма «Н-120» для окулярного метода; 3,23 1дЭИД50 для интраназального метода; 3,37 1дЭИД50 при вакцинации методом выпаивания и 3,37 1дЭИД5[) при вакцинации методом крупнокапельного распыления.

Полученные в наших опытах результаты, а также усредненные расчетные данные, показывают, что прививные дозы вакцины, защищающие 80% иммунизированных цыплят против контрольного заражения вирулентным штаммом вируса НБ, должны содержать 6,09 1дЭИД50 штамма «Ла-Сота» для окулярного метода; 6,00 1дЭИД50 для интраназального метода; 6,26 1дЭИД50 при вакцинации методом выпаивания и 6,20 1дЭИД5() при вакцинации методом крупнокапельного распыления.

Можно отметить (рис. 1, 2), что величины иммунизирующих доз при различных методах апликации для каждого вируса в составе ассоциированной вакцины, не имеют существенных различий. Поэтому для испытанных методов рекомендованы универсальные иммунизирующие дозы равные 3,51дЭИД50 вируса ИБК и 6,5 1дЭИД50 вируса НБ.

100 л 80 60 40

л н s

3 га п

04

о

—♦—выпаивание -»-ККР (спрей) -*-.интраназально —х—окуляр но . . . . .—

— 1 1 1

1,5 2 2,5 .

ДОЗа (1д ЭИД50)

3,5

4

Рис. 1. Зависимость устойчивости птиц к ИБК от дозы ассоциированной вакцины при разных способах вакцинации

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

доза (!д ЭИД50)

Рис. 2. Зависимость устойчивости птиц к НБ от дозы ассоциированной вакцины при разных способах вакцинации

Опытами по определению сроков формирования иммунитета установлено (табл. 5), что цыплята, двукратно привитые ассоциированной вакциной методом выпаивания, становятся невосприимчивыми к Ньюкаслской болезни в 90% случаев через 10 суток после первой вакцинации, а к инфекционному бронхиту кур в 90% случаев на 10 сутки после повторной вакцинации, проведенной с интервалом 10 суток.

Таблица 5

Сроки образования и продолжительность иммунитета у птиц, привитых ассоциированной вакциной

Результаты заражения и титры антител в различные сроки после вакцинации (сут) к вирусу ИБК в ИФА, а к вирусу НБ в РТГА (1од2)

Ви рус % защ. титр анти тел °/о защ. титр анти тел % защ. титр анти тел % защ. титр анти тел % защ. титр анти тел % защ. титр анти тел

10 10* . 20 30 60 90

ИБК 40 460± 34 90 6751 45 100 18481 85 100 22311 259 юо 15431 270 90 9081 47

НБ 90 6,2± О.З 100 6,91 0,4 100 7,1 ± 0,1 90 7,21 0.2 100 5,6± 0.3 100 4,51 0,4

Примечание: * - 10 сут после двукратной вакцинации

В сыворотке крови птиц анти-ГА к вирусу НБ выявляются в титрах 6,2±0,3 1од2 на 10 сутки после превой вакцинации, достигая максимального уровня 7,2±0,2 1од2 через 30 суток после повторной вакцинации. В сыворотках крови птиц антитела к вирусу ИБК выявляются в титрах 675±45 на 10 сутки после второй иммунизации, достигая максимального уровня 2231+259 через 30 суток.

Нами были проведены опыты по определению влияния возраста птиц и материнского иммунитета на гуморальный иммунный ответ после вакцинации ассоциированной вакциной.

В результате установлено, что с'амые высокие титры защитных антител (табл.6) к обеим инфекциям выявлялись у цыплят, вакцинированных двукратно к вирусу ИБК-1920±210 и 2100±281, к вирусу НБ 6,2±0,2 1од2и 7,1±0,4 1од2 и однократно в 30-суточном возрасте к вирусу ИБК-1750±261, а к вирусу НБ- 7,0±0,3 1од2.

У цыплят, вакцинированных однократно в 10- и 20-суточном возрасте, титры защитных антител были значительно ниже: к вирусу ИБК 778±27 и

805±103 соответственно, к вирусу НБ-3,4±0,3 !од2 и 3,6±0,3 1од2 соответственно.

Таблица 6

Влияние сроков и кратности применения ассоциированной вакцины против ИБК и НБ на гуморальный ответ цыплят

№ п/п Кратность -вакцинации Возраст, сут Титры антител

ИБК* НБ"

ДО вакцинации после вакцинации до вакцинации после вакцинации

1 однократно 10 - 778±27 4,1±0,2 3,4±0,3

2 однократно 20 - 805±103 2,7±0,3 3,6±0,3

3 однократно 30 - 1750±261 1,4±0,2 7,0±0,3

4 двукратно 10-20 - 1920±210 4,1±0,2 6,2±0,2

5 двукратно 20-30 - 2100±281 2,7±0,3 7,1±0,4

Примечание: *- среднее значение титра антител в ИФА

**- среднее значение титра антигемагглютининов в РТГА, 1од2

Таким образом, при выборе схемы иммунизации ассоциированной вакциной необходимо учитывать уровень материнских антител к вирусу НБ и возраст птицы.. Если первая иммунизация птицы проводится до 30-суточного возраста, а уровень материнских антител к вирусу НБ более 3 1од2, вакцину необходимо применять .двукратно с интервалом 10 суток. Для выработки напряженного иммунитета к вирусу ИБК в этом возрасте необходима двукратная вакцинация. Птице, старше 30 суточного возраста, достаточно однократной иммунизации для выработки напряженного иммунитета к обеим инфекциям.

Эффективность вакцинации определяется рядом факторов, среди которых качество используемой вакцины и метод ее применения являются основными.

В серии опытов определяли эффективность четырех методов иммунизации ассоциированной вакциной: выпаивания с водой, крупнокапельнсго распыления, окулярного и интраназального. При всех

испытанных методах вакцинации образуются высокие титры антител против обоих вирусов, но самые лучшие результаты получены при крупнокапельном и интраназапьном методах иммунизации. При контрольном заражении, проведенном после вакцинации, процент устойчивых к заражению цыплят равнялся 90-100%, что подтверждает наличие напряженного иммунитета у вакцинированной птицы после иммунизации различными методами.

3.6. Лабораторные и производственные испытания ассоциированной вакцины против ИБК и НБ

В лабораторных испытаниях опытной серии №3 ассоциированной вакцины, показано, что она не контаминирована бактериальной и грибной микрофлорой, биологическая активность по вирусу ИБК составила 7,4 1дЭИД50/мп, по вирусу НБ-10,25 1дЭИД50мп. Вакцина безвредна в течение 10 суток клинического наблюдения при введении 10-кратной иммунизирующей дозы. Антигенная активность на 21 день после двукратной вакцинации была высокой. Титр защитных антител составил 2038±202 к вирусу ИБК в ИФА и 6,5±0,21од2 анти-ГА к вирусу НБ в РТГА.

После лабораторных испытаний опытную серию №3 ассоциированной вакцины против ИБК и НБ применяли на 9 птицефабриках объединения «Кубаньптицепром». Показана высокая антигенная активность ассоциированной вакцины, что подтверждено актами испытаний. У привитых птиц формировался высокий уровень защитных антител к вирусам ИБК и НБ, способных защитить молодняк кур от заражения. Ассоциированная вакцина не снижала показатели сохранности и привесов птиц, не увеличивала конверсии кормов.

Полученные результаты послужили основанием для составления НТД на вакцину против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни живую сухую, которая была, утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 09.03.1999г. После утверждения НТД ВНИИЗЖ выпущено и реализовано более 20 млн. доз вакцины, которая применяется на многих птицефабриках РФ.

3.7. Типирование вируса ИБК по наличию специфических антител в сыворотках крови в РН и РТГА и оценка антигенной активности полиштаммной инактивированной вакцины против ИБК серологическими методами

В связи с появлением случаев клинической картины ИБК на привитом поголовье проведены исследования по типированию вируса ИБК по наличию специфических антител в сыворотке крови с птицефабрик из различных регионов РФ.

Таблица 7

Результаты исследования сывороток крови птиц различных

птицефабрик РФ в РН с целью серотипирования штаммов вируса ИБК

Название птицефабрики Титры антител против серотипов (1од2)

. 793/В Д207 Масс.

Ворсменская 3,0±0,5 2,0±0,6 4,7±0,2

Истра-Сенежская 4,2±0,4 1,0±0,5 2,5±0,9

Таганрогская 8,7±0,3 н/и 9,7±0,3

Галичская 2,0 н/и 6,5±1,1

Аткарская 2,0 4,5±1,1 3,5±0,4

Волжская 3,5±0,3 3,5±0,4 5,0±0,1

Ореховская 5,4±0,2 4,0±0,2 6,7±0,1

Линдовская 6,2±0,1 3,7±0,2 5,4±0,2

Примечание: н/и - не исследовались

Установлено, что на обследованных птицефабриках РФ имеются специфичные антитела к трем серотип&м: Масс., Д207 и 793/В. Судя по полученным в РН данным (табл. 7), наибольшее распространение (на 6 из 8 обследованных птицефабриках) имеют штаммы вируса ИБК, антигенно-родственные серотипу Масс. Кроме того, встречаются штаммы вируса ИБК антигенно родственные серотипам Д207 (на одной птицефабрике) и 793/В (на 4-х птицефабриках).

В связи с полученными результатами о циркуляции на территории РФ штаммов вируса ИБК, относящихся к различным серологическим группам возникла необходимость изготовления вакцин из нескольких антигенно-различных штаммов. Нами совместно с сотрудниками лаборатории

ветеринарных вакцин была изготовлена экспериментальная серия полиштаммной инактивированной вакцины, состоящая из серотипов Масс., Д207 и 793/В и изучены ее антигенные свойства.

Таблица 8

Результаты исследования сывороток крови птиц, привитых

полиштаммной инактивированной вакциной в РН и РТГА

Срок после вакцинации (сутки) Титры антител (1од2)

РН РТГА

серотипы вируса ИБК

793/В Д207 Масс. 793/В Д207 Масс.

Контроль, до вакцинации 3,0 3,0 2.5±0.1 2,5±0,1 2,5±0,1 4,0

14 3,4*0,1 3,8±0,1 4,6±0,1 3,8±0,1 3,6±0,1 4,7±0,1

21 5,7±0,1 5,8±0,1 7,2±0,1 4,9±0,1 4,7±0,1 6,9±0,3

На основании проведенных серологических исследований было установлено (табл. 8), что полиштаммная инакгивированная вакцина против ИБК вызывает образование высокого уровня специфических антител к используемым в ее составе штаммам вируса ИБК на 14 сутки после вакцинации, который продолжает нарастать до 21 суток.

4. Выводы

1. Разработана технология получения отечественной высокоиммуногенной ассоциированной вакцины против инфекционного бронхита кур и Нькжаслской болезни, которая в экспериментальных и производственных условиях оказалась безвредной, ареактогенной для птиц с 10 дневного возраста.

2. Для производства ассоциированной вакцины подобраны и обоснованы штаммы вирусов: для инфекционного бронхита кур - штамм «Н-120», для Нькжаслской болезни - штамм «Ла-Сота», которые имели наименьшее взаимное влияние в составе ассоциированной вакцины.

3. Отработаны оптимальные условия культивирования вакцинного штамма «Н-120» вируса инфекционного бронхита кур, обеспечивающие получение больших объемов вируссодержащего материала с титром биологической активности 7,4±0,41дЭИД5о/мл, пригодного для производства вакцины: заражение куриных эмбрионов 10 дневного возраста проводится в аллантоисную полость в дозе 104,сЭИД5о/Мл, культивирование при температуре 36,0±0,5°С в течение 72 часов.

4. Обоснованы методы и схемы применения ассоциированной вакцины против ИБК и НБ. Ассоциированная вакцина эффективна при применении интраназально, окулярно, крупнокапельным распылением и выпаиванием с водой по схеме: цыплят до 30-суточного возраста вакцинировать двукратно с интервалом 10 суток, молодняк старше 30-суточного возраста можно вакцинировать однократно.

5. Установлено, что при комплектовании компонентов ассоциированной вакцины для обеспечения стабильности иммуногенной активности необходимо использовать вирус инфекционного бронхита кур с титром биологической активности не ниже 6,5 1дЭИД5о/ыл. а для вируса Ньюкаслской болезни - не ниже 9,0 1дЭИД5о/ыл, добавлять стабилизатор ВНИИЗЖ перед лиофилизацией.

> 6. Установлено, что при любом методе вакцинации оптимальная иммунизирующая доза вируса ИБК составляет не менее 3,5 1дЭИД50, а вируса НБ не менее 6,5 1дЭИД50.

7. Напряженный иммунитет к вирусу НБ формируется на 10 день после однократной вакцинации, а к вирусу ИБК на 10 день после двукратной и сохраняется не менее 3 месяцев.

8. При производственном применении сухой ассоциированной

»

вакцины против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни в птицеводческих хозяйствах на поголовье более 2 млн. птиц получены положительные результаты. Ассоциированная вакцина не вызывала побочных действий, не влияла на продуктивность птиц и обеспечивала формирование напряженного и длительного иммунитета.

9. Установлено, что биологическая активность сухой ассоциированной вакцины при хранении в течение 12 месяцев при температуре 4-НЗсС снижается незначительно. При этом отмечено, через 12 месяцев хранения активность вируса Ньюкаслской болезни снижается на 0,08 ¡дЭИДя/ш,, а через 24 месяца на 1,08 1дЭИД50/мл, активность вируса инфекционного бронхита кур через 24 месяца хранения снизилась на 0,17 1дЭИД50/„„.

10. Предложено для определения иммунного статуса птиц и серотипирования штаммов ИБК использовать реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцию нейтрализации (РН). Установлено, что на птицефабриках Российской Федерации циркулируют штаммы, относящиеся к различным .серотипам вируса ИБК. Показана принципиальная возможность изготовления полиштаммной инактивированной вакцины против различных серотипов вируса ИБК.

5. Практические предложения

Результаты научных исследований были использованы и вошли в следующие нормативно-технические документы, инструкции, методические указания, которые внедрены в ветеринарную практику и предложены для практического использования:

1. Технические условия (ТУ 9384-052-00008064-97) на вакцину против инфекционного бронхита кур из штамма «Н-120» живую сухую (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 03. 09.1997г.).

2. Временное наставление по применению вакцины против инфекционного бронхита кур из штамма «Н-120» живой сухой №13-4-2/1042 (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 03. 09.1997г.).

3. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против инфекционного бронхита кур из штамма «Н-120» живой сухой (утверждена директором ВНИИЗЖ 15.10.1996г.).

4. Технические условия (ТУ 9384-008-00008064-99) на вакцину против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни живую сухую (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 09. 03.1999г.).

5. Временное наставление по применению вакцины против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни живой сухой №13-4-2/1520 (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 09. 03.1999г.).

6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против инфекционного бронхита кур и Ньюкаслской болезни живой сухой (утверждена директором ВНИИЗЖ 02.12.1998г.).

7. Технические условия (ТУ 9384-010-00495527-99) на вакцину против инфекционного бронхита кур иа штамма «Н-120» живую сухую (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 02. 11.1999г.).

8. Наставление по применению вакцины против инфекционного бронхита кур из штамма «Н-120» живой сухой №13-4-2-/1775 (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 02. 11.1999г.).

9. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против инфекционного бронхита кур из штамма «Н-120» живой сухой (утверждена директором ВНИИЗЖ 10.04.1999г.).

10. Методические указания по определению уровня антител к вирусу инфекционного бронхита в реакции торможения гаагглютинации (утверждены директором ВНИИЗЖ 29.12.1999г.).

11. Методические указания по постановке реакции нейтрализации при инфекционном бронхите кур (утверждены директором ВНИИЗЖ 29.12.1999г.).

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фролов C.B., Хлыбова Т.В., Некрасов A.B., Борисов A.B., Гусев A.A.

Изучение сухой вакцины против ИБК // Пробл. инфекц. патологии с/х ж-ных: тез. докл. конф...- Владимир. - 1997. -С.148-149.

2. Борисов A.B., Гусев A.A., Фролов C.B., Хлыбова Т.В. и др.

Антигенные, иммуногенные и реактогенные свойства живой сухой вакцины против ИБК // Пробл. инфекц. па тол. с-х ж-ных: Тез. докл. конф...- Владимир, 1997. - С.147-148.

3. Борисов A.B., Г/сев A.A., Хлыбова Т.В., Фролов C.B. и др.

Оптимальные условия культивирования вакцинных штаммов вируса ИБК // Пробл. инфекц. патол. с-х ж-ных: Тез. докл. конф...- Владимир, 1997.-С. 144.

4. Борисов A.B., Гусев A.A., Хлыбова Т.В., Фролов C.B. и др.

Сравнительная характеристика некоторых штаммов вируса ИБК // Пробл. инфекц. патол. с-х ж-ных: Тез. докл. конф...- Владимир, 1997. -С. 153-154.

5. Фролов C.B., Хлыбова Т.В., Борисов A.B. и др. Вакцинопрофилактика

ИБК отечественными живыми вакцинами II Современные аспекты вет. патол. ж-ных: Матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ. -Владимир, 1998. - С.197-203.

6. Фролов C.B., Хлыбова Т.В., Борисов A.B. и др. Иммунобиологические

свойства живой вакцины против ИБК и НБ // Современные аспекты вет. патол. ж-ных: Матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ. -Владимир, - 1998. - С. 183-192.

7. Борисов A.B., Хлыбова Т.В., Фролов C.B. Инфекционный бронхит кур //

Вет. мед. Украины. - Киев, 1998. - №5. - С.28-29.

Отпечатано на базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ

Тираж 80 экз.. 2000г.