Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Распространение аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота в некоторых хозяйствах Республики Казахстан и их специфическая профилактика

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ ВЕТЕШНАРШЯ АКАДЕМИЯ им. К.И.СКРЯБИНА -

На правах рукописи

1УМАБАЕВ .ХОСМАРЗА КОЛНАГАМБЕТОВИЧ ,

РАСПРОСТРАНЕНИЕ ШНОВИРГСНШ И1ЙЕКЦИИ И ХЛАМИДООЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В НЕКОТОРЫХ ХОЗЯЙСТВАХ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН И ИХ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОТИЯАШКА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Моогаа 1994

Работа выполнена в Республике Казахстан и?в Московской ветеринарной академии им. К.И.Скрябина.

Наивдй. руководитель; доктор ветеринарных наук , Белоусова Р.В,

Официальные ^оппоненте?

доктор ветеринарии? наук, профессор Орлянкич Б,Г. . доктор ветеринарную (шук Соболев В.В.

Ведурап организация - Всероссийский научно-исследовательский . и технологический институт биологаче-, свой прокывленности

Защита состоится Ц ■ " года ь [0 *~часов

на заседании специализированного сс&ета К 120.36.05 по засите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Московской ветеринарной академии им.К.И,Скрябина (109^72, Москва, ул. Акаде-иика Скрябина, 24, телефон 377-93-83).

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке академии.

. Автореферат разослан "ЛЬ " ! 199 Ч г. /

Ученый секретарь специализированного совета

Федосеева Т.Н.

ОНШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

%к _ . . "; - . ; . ■ ■ ■ - • ■ V - ,

Актуальность теми. Масс оды» инфекционные болезни молодняке являются наиболее важной проблемой в равной степени присущей различным видам сельскохозяйственных животных. Заболевания молодня-. ка наносят неисчислимый ущерб животноводству. В настоящее время общеизвестно, что в развитии респираторных, и желудочно-кишечных болезней участвуют различные вирусные агента (вирусы ПГ-3, ИРТ, аденовирусы и другие) и несколько видов бактерии (ластереллы, сальмонеллы и другие) и хламидии.

. Ветеринарная наука 1 последние г*оды созвала ряд препаратов для диагностики и специфической профилактики заболеваний вирусной и бактериальной этиологии. Однако, ситуация по массовым болезням молодняка остается очень напряженной. Попытки профилакти-ровать рерпираторно-кишечкие болезни вакцинами из указанных вирусных агентов в, ряде случаев желаемого аффекта не дают, так как ' они не обеспечивают профилактики основных состамяюпих вирусно-бактериальной ассоциации. .

. Ряд. исследователей сообщает о значительной этиологаческой роли аденовирусов и хламидий в рёспираторко-ЛпиечноЙ патологии телят ( ¿.ВвгЬувМге е^.а!.'• , 19<54;р.а.а1(1аау , 1965 ; 3. •

МоЪапгу виа1,. 19б5;р.н0ж111ц1£1 ,1970; Х.Харалаибиев, Д.Огнянов и др., 1973; Н.Н.Крвков, З.Ф.Зудилина, 1976;Н.Ма^еу?в1са ег.а1. , 1978;а.Евр!па& ¿г.а!. , 1990; В.Г.Гумеров с соавт., 1982;' Л.В.По-.гуляева и др., 1995; Н.А.Алиева, А.Г.Ахнедова, 1987; и др.). За, рубежом против этих инфекций применяют комбинированные вакцины. В России и странах СНГ ассоциирован)«* вакцин претив адеиоинфек-ции и хламидиоаа крупного рогатого скоте нет.

: Цель и задачи исследований. Изучить распространение аденовирусной и хламидийной инфекций в некоторых регионах страны и провес ти изучение зксяерикенгальних образцов инактивированной ассо- • циированной вакцин» на лабораторных и естественно восприимчивых 'животных. В соответствии с цельв били посглллени следующие залечи: '

I. Вменить степень -распр»с»ранения аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота я некоторых хозяйствах Кусга-иайской к Целиноградской областей Республики Казахстан и а некоторых хозяйствах Российской Федерации»

{-13 /л... -; ■. ■ : . л ■'

2. Выделять и идентифицировать полевые изъяты аденовйруо« крупного рогатого окоте. '-•■*■'::.,. , ^ : . ' г .

. 3. Изучить антигенную актвность образцов* ассоциировали Д вакцины на лабораторных (крысы) й естественно восприимчивых жи-вотннх (телята)..-'..":. \

4. Избить зпизоотолоГическув эффективность образцов инакти-вированней ассоциированной вакцины против аденовирусной инфекции и хламидкоза крупного рогатого скога, неблагополучных хозяйств вах по данкЬ* инфекциям^..•-'.'.■ -"•-.'"■..

Научная нодизна. I. Впервые в Казахстане от бельннх телят выделены и идентифицированы эпизоотические идолята аденовирусов крупного рогатого скота, относящиеся К 1-й и 11-й интигйннин подгруппам. 2. Проведено генное Ткпироваиие и80ляга аденовирусе крупного рогатого1 окотй на основании'анализа алектрофвретических профилей продуктов рг>стрикционногс гидролиза его ДНК. 3. Рекеиеи-дована единая перевивбеиая. линия клеток Т-1 для первичного выделения аденовирусов крупного рогатого окота как 1-й, тек и 11-Й подгрупп. Впервые разработана (в лабораторных условиях) инак-тивированная ассоциированная вакцина против аденовирусной инфек^ ции и, хлаиидирза крупного рогатого скота й показана ее эффективность, 5. »¡зучена динамика поствакциоамьнах антител в крови телят, ' 'V/- .'■ "7 -У'•'.'■"■

Практическая значимость работа. Рекомендована единая перевиваемая линия:клеток 1-1 для первичного выделения аденовирусов крупного рогатого скота 1-й и 11-Я подгрупп. Отработано оптимальное' соотношение аденовирусных антигенов/1-й и П-й подгрупп (0,5: I), что внесено в угвердденную (1.06.90г.) Нормативно-техническую докумеитацио "Вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота". На основании разработанной методики изготовления инактявированной ассоциированной вакцины против аденовирусной и хламйдиоза:крупного рогатого скота,будет, составлена НТД ка о тог препарат.

На -завиту выносятся: материалы.по изучению распространения , аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота, в том числе выделение й идентификация полевых изолятов аденовирусов, результаты"разработки и изучения в,зкспериментальных условиях ассоциированной вакцины для-специфической профилактики аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота.

Реализация результатов исследований. Результаты работы внедрены в учебный процесс учении советом в.втеринарно-бкалогмческого факультета МВА (протокол КЗ от 21.12.93).

Апробация работы. Основные положения.диссертации доложены, .-»бсужденн и одобрен« на. 2-ой научно-практической и научно-методической конференции молодых ученых с участием деятелей науки стран СНГ и Зарубежья в Москве (1993); на расширенном межкафедральнои совещании на кафедре вирусологии, микробиологии и биотехнологии Московской ветеринарной академии им.К,И.Скрябина в 1993.г.

Публикация научных исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.и I находится в печати.

Объем"и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 188 .страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и истод®*, результатез собственных исследований, обсуждения, вняодоа, рекомендаций по использования • научных выводов,' списка, литературы и приложения. Работа содержит 35 таблиц, ТО фотографии. Список литературы вклсчает 265 источников, в том число 139 иностранных авторов. ,

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .- .

Материалы и методы исследований. Работа выполнена э 19911993 гг., на кафедре вирусологии, микробиологии и биотехнологии, лаборатории вирусологии ИВА, хозяйствах, лаборагортях, облветот-делах Кустанайской и Целиноградской областей Республики Казахстан, в Акционерном обществе "Шва1', Белгородской области, фрагмента работы выполнены в В ГОКИ, ВН10Ш1, ВНИИ с/х биотехнологии и ВИЗВе.

Для выяснения эпизоотической ситуации-в отношении аденови-руоной инфекции и х'лаиидиоза крупного рогатого скота нами был проведен анализ за 5 лет статистических данных ветупраплекия двух областей (отчеты' за 198^-1991 гг.), а также результатов лабораторных исследований на аденовируснуп инфекцию и хлемидиоз крупного "рогатого скота в хозяйств«* Куотанайской и Целнноградокой областей. Распространение аденовирусной инфекции, хламидиоза и парв-гриппа-3 среди крупного рогатого ехота изучали по разовым сыэорот-кем, которые получали из лабораторий я хозяйств этих областей. Пробы сывороток крови для исследования брали в основном от коров, а также от биков-произведитемй и теяочек Ц-5 «веянного возраста,'

не менее lOj? от стада. Всесквороткикрови исследовали в ЕрГА на аденовируснув инфекцию, i РСК на хламидиоз и в РТГА на парагрипп-3, rio общепринятым методикам* ;■.

Для вирусовчделекяя / яспольвовали смивы о коиьюнктавнглаз. со слизистой оболочки носовой полоетя, прямой хишки и кровь от больных телят из двух хозяйств. Исследовано 20 проб, от 5 животных, в возрасте 4-5 месяцев. Изолированна вируса прововили в пер-вично-трипсинилярованной культур« клеток тестикул бычка (ТБ) и flf ревиваемой культуре клеток почки телекка (T-I). В этих системах провели с летах" пассаха с интервалом 10-12 дней. Пробно вира* кенным ЦПД до начала идентификации хранили при -20°С. Изучение язолжтов проводили я сравнении с эталонными штаммами аденовируса крупного рогатого скота I и 7 серетипов.

Параллельно с вирусовыделением от ятях же больных телят были исследованы i ТНГА <на аденоинфекцию) ив РСК (на хламидиоз) парные сыворотке крови.

Индикацию вируса биотаниллированным ДНК-зондом в пробах со с роком -хранения около 2-х лет осуществляли по модифицированной схеме (w.Mann et.ai, 1989; В.В.Сзетлкчкин, Т.М.Гончарова, 1993)i Работу проводили бовместно о сотрудником институте биологического приборостроежя АН Светжичкииым В. В. И/дипломницей ветбиофака Гокчаровой Т.И.); г ; ; V v'^.v i ' '"'л1-^.^-'^

Злектронно-иякроокопическое исследование полевых изодятов бы ло проведено в ВГНКИ, в лаборатории инструментальных методов исследований, под руководством старпего научного сотрудника Могильт ного НИ. - методом негативного контрастирования.

Характер ядерных изменений изучали методом флуорохрснирова-ния при окраске акридиновым оранжевым. Также групповую принадлежность выделенных внрусов-иэолятов определяли в реакции иммунофлуо-ресценция СР№$)» которув ставили в прямом варианта с фити-коиы)-гатамя сывороток I и II—ой подгрупп из диагностичеокого набора биофабричного изготовления. v :

|дя серостпированйя полевихкзслятовиспользовади реакцию '.. нейтрализации в культуре клеток Г-I, ко тору», оценивали по индексу нейтрализации (использовали эталонные сыворотки 1,2,3,5,7,8 типов). Для более точного типирования выделенного изолята провели рестрикционный анализ его ДНК, предварительно проведя клонирование вируса методом,предельных:равведений.; ; |. : . , : ,

> Рестрякционный анализ. Очистку л концентрирование аденИиру-

coi проводили по методу ( j.p.Andereon et.al, 1971), состоящему ия 2-х этапов; I) концентрирование вирионов осаждением; 2) очистка вируса. Выделение вирусной ДНИ осуществляли по методу ( А.н.ЕЪ-irsa der et.al, 1969). Вгпролиа ДНК специфическими эндонуклеазами проводили по методике (Т.С.Денисова и др.., 1979), Фракционирование фра тентов ДНК методом электрофореза проводили по методу (С. ííuider . , -1971»). Работа проводилась под руководством Т.С.Денисовой и С.А.Иенашевой,. в ВНИИ с/х биотехнологии.

— Изучение антигенной активности образцов инактивированной ассоциированной вакцины.' Для опытных образцов ассоциированной вакцины использовали инактавированные димерэтиленимином аденозирусы крупного'рогатого скота 1-го и 7-го серотапов (I и II подгруппы соответственно), инактивированкув культуру хламидий, полученную по методу сотрудников ВЙЗВ ¡О.Д.Караваева и И.А.Калугиной. В качестве адытанта пркменяли аэросил. . •

Изучение аитиггнной активности вакцины на лабоггаторшх животных. Работу' проводила на белих крысах с массой тела 23D-TO0 г. Раалнчнме образцы вакцины вводили животным внутримитачно дважды

0 интерналои 14 дней, полное' обескровливание проводили через 14 дней после второго введения препарата. Сыворотки на наличие антител к аденовирусам исследовали в двух серологических реакциях (мик-рометодвми): в. реакции нейтрализации (РН) и реакции непрямой гем-агглвтикации (РИГА).

В первой опыте сравнивали антигенную активность двy¡L образцов вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, со-, держащих различное соотношение аденовирусов I и II подгруппы (0,5:

1 и 1:1 соответственно). Для,зтой цели использовали 15 белых крыс, которые были разделены на 3.группы. Вакцину вводили животным 1-й

н 2-й группы в дозе' пр I мл внутримышечно. Ревакцинацию проводили через Ы дней тем же методом и в такой же дозе. Крыс 3-ей группы не вакцинировали (контроль), им вводили культуральнув жидкость, H« сокержаиуо вируса, и тех ке объемах.

В опыте Е 2 изучали антигенную активность 2-х образцов ассоциированной вакцина против аденовирусной инфекции и хламидиоза крупно- ' гв рогатого скота, которае различались по содержании хламидий ног о компонента в их состав», квотные этого опита (20 голов) были разделены, на U группы, соответственно испытуемым образцам мкцины. Крисам 1-й и 2-Й групп вводили ассоциированную вакцину по 1,3 мл •

• и 1,5 мл, содержащей 0,3 мл и 0,5 мл хляиидийно^о кокпонек^л соответственно., Ливотныи 3-ей Группы вводили вакцину, содержай?*) только аденовирусный компонент,в дозе 1,0 мл', а крыс 4-й группа.' оставили в качгсгве контроля, км вводили культуральнул жидкость. " В опыте У? изучали в сравнительной аспекте антигенную активность образцов мкцины, которые отличались как соотнопением входящих в них компснзчтов, так и дозой препарата,вводимого белым крысам. В , опыте испсд'зовали 7 групп животных (по 5 голов в каждой).Крысаы 1-й и 2-й групп вводили ионовахцину против; аденовирусной инфекций' (образец * I) в дозе 2,0 и 0.5 мл соответственно. Для 3-й и 4-й групп животных применяли ассоциированну» вакцину (образец * 2) в дозе 1,3 и 0,65 ил соответственно. Животных 5 и 6~оЯ групп вакцинировали образцом * 3 в- дозе 1,5 й 0,75.;1Ы''и'';7:,гигпп«1;_вмя»';вотав^' лена в качестве контроля. !

Опыт_)М проводили с цельп определения сроков и режима хранения инактивкрованных вакц»н< изготовленных аналогично опыту * 2. Препараты т>асфассвав8ли и хранили при температуре >-6° в течение 2-х лет. Черев б, 12 и 24 месяца хранения пробы препарата вводили внут-римивечно крысам (по 5 голов) в до9а?::1,0 мл - коновакцкну' (образец £ -:-о'бр«аец.> .3, двугранно с интервалом. 14 дней. О сохранении антигенных св&йлтв вакцины судили по, степени сохранения способности ее индуцировать образ»« ванне специфических антител у привитых жизбояшх. У<5ой крыс проводили через 14 дней после 2-ой мкцинавди/ ,

Изучение антигенной активности вакцины на телятах. Опытные образцы ассоциированной инактивированной вакцины проверяли на стерильность на питательных.средах: ШБ, МПА, МППБ и;агаре Чапека . общепринятыми методами. Безвредность каждого образца вакцины устанавливали на 10 белых мышах массой 15-20 г, который вводили по 0,2 мл препарата в миицу бедра, н на5-ти белых крисох при аналогичной инокуляции по 1,0'ил вакцины. Наблюдыше за животными вели в течение 10 дней. Полноту инактивации вируса в испытуемых образцах вакцины определяли в перевиваемой :культурауклеток Т-1 на протяжении 5-и последовательных "слепых" йарсажей. Пассажи в культуре клеток проводили разведенной вакциной 1:10 с интервалом в. 12-.

. 14 дней, предварительно подвергая инокулированнув культуру клетох , трехкратному замораживанию (-70°) и оттаиванию. Исследования по хламидийному компоненту проводили сотрудники ВИ2Ва|( Ю.Д.Каравагв, И.А.Калугина). Отсутствие не инактивированных хламйдий г образцах ,

вакцины проверяли в перевиваемой культуре клеток почкт* сайги до •5-и пассажей. Антигенную активность хламидийного комплекта изучали на морских свинках.

Антигенные свойства образцов вакцины изучали на :елятах 1,53 месячного возраста, черно-пестрой и красно-стёпной породи. Опиты проводили в откормочном комплексе акционерного обцэства "Нива", Белгородской области. До начала опытов телят обследовали клинически в течение Iö дней. Группы животных подбирали по принципу аналогов. У всех телят перед вакцинацией исследовали сыворотки крови для определения исходного уровня специфических антител к аденовирусам (в РИГА) и к хламйдиям (в КЖ). Вакцину вводили внутримышечно с интервалом 30 дней дважды. Антигенную активность зораяцов вакцины определяли по тигру антител в сыворотках крови телят к 'аденовирусам в (РИГА);, имыуноферментиого анализа (ИМ) и в КЖ к хламйдиям.через месяц после первого введения препарат« а далее , ежемесячно (до 6. месяцев);

Результаты серологического исследования проб сине,роток крови обработаны статистически, ...

В первом-опыте сравгазали антигекнув активность двух сбрязцов вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота (аналогично 1-му "опыту, на крысах). В опыте использовали 30 телят. Все они были нумерованы и разделены на 3 группы. Препарат вводили дважды по 5 мл. • ' .

В опыте № 2:изучали в сравнительном аспекте антигеннуа активность 3-х образцов вакцины (аналогично 2-му опыту на крысах), Ассоции-рованнув вакцину вводили двукратно с интервалом 30 ддак по 7,0 мл (образец * I,> 2). Моковаквдну - па 5,0 мл (образец № 3). В третьем опыте изучали антигенкув активнос-ть образцов ассоциированной вакцины, кото^е отличались соотношением входящих в них аденовирусного и хламидийногб компонентов и дозой препарата вводимого' телятам. В опыте испсльзовали 32 теленка, которые были разделены на группы (три опытных и одна контрольная - по 8 годов). Животным первой и второй групп вводили образец вакцины № I (соотношение аденовирусного и хламидийного компонентов 2,5:1 соответст- ' ценно) в доз»: первой группе по 7,0 мл, второй щ? 3,5 мл; телят третьей группы прививали вакциной (образец №2), в которой соотношение аденовирусного и хламидийного компонентов было 1:1, в дозе по О мл, Нивотных четвертой группы не вакцинировали (конт- • роль). • - - ..

. ' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ■ » • >1

: Анализ статистически^ дтеках по забоаедаемости к падеу? хрупкого рогатого скота ft результатов исследований на аденозирус-иуг инфекции я хламидиоз.

Анализ статистических данных показал, что.за 4 года■в Куота-найской oSjsoi* било зарегистрировано больных - 1655332 голов крупного рогатого скота, в том числе 916386 телят (69,8^), пало 98672, голов, в тон числе №261 молодняка (65i), причем гибель молодняка имела тенденцию к 'повышенно Сот 62 до 11%). В Целиноградской области за 5 лет зарегистрировано больных - 889841 голов., в том числе 3ËC02Î телят(42,7£). Гибельмолоднякав течение этих лет колебалась в пределах 35;7-*A,3jf, Падеж животныхот инфекционную заболеваний составлял от 8,8 до 20,5, а от незаразных '•» 79,5 -91,2%. Причем, наибольший процент падежа и вынужденного убоя среди можушяка приходиг на болезни органов дыхания и пищеварения (94,9-95,If). В хозяйствах этого региона за I987-I99I годы заре- ' гистрировано значительное количество (76270 голов) абортирован- , них и мертворожденных тёдятг невыясненной этиологии.

Й9уче«ке роли аденовирусов и тслаиидйй в респирсторно-кишоч-ной патологии практически только;начинается. Так,за 5 лет и® аде« иойнфекцив крупного рогатого скота было исследовано всего лишь 218 проб сыворотки крови, из которых 11%ийелиантитела я диагностических татрах. На хламидиоз исследовано 1287 проб первично (преимущественно из племстанций). Выявлено б,серопо?итйвных • • животных. .'.'■■■." ■ .'•""' '■"'"■'•v "v:-* \. "

Таким образом, статистические данные и результата лабораторных исследований свидетельствуют о циркуляции аденовирусов и хламид ий среди крупного рогатого окота в хозяйствах Казахстане. В свяви с этим, мы провели работу по выяснению широты распростри нения этих агентов среди животных данного региона и их »теологической роли в респираторно-ащечных заболеваниях крупного рогатого скота. . V.Г'.."-'-'-'

Распространение аденовирусной и хламидиозной инфекций в некоторых хозяйствах Республики Казахстан,и России. При серологическом исследований 676 проб сывороток крови крупного рогатого скота из 19 хозяйств Казахстан«; процент сероцоги-

тивных тавотных'» хозяйствах колебался от 19,5 ДО 100 на аденоин-фвкцию, от 3,6 до 60.на хламидйози от 70 до. 100# на ПГ-?3. Анти, тела обнаруживали к аденовирусам обеих антигенных подгрупп, Так,-в Кустг" Иской области, в двух районах процент серопозитивных тавотных колебался к аденовирусам I п/гр. - .80-89,3; ко 11-й п/гр,-76,2-51,8; к хламидйй)«' 15-19,5 и ПГ-3 - 83,75-98,1. В Целиной • , градской области - к I п/гр.-57,2; Ц-й - 79,2; к хламидиям -31,б и ПГ-З - 9'+,5. Серологичеокие; исследования, проведенные в хозяйствах России, также свидетельствовали о широкой циркуляции этих агентов среди животных. Процент серопозитивных животных составил 73,7 и 63,4.(к I и II п/гр. соответственно) и к хламидиям

Полученные данные свидетельствует о широкой циркуляции сре- • дя животных аденовирусов, вируса ПГ-3 и хламидий и позволяет предполагать, что а респираторно-кииечной патологии телят принимают • участие не менее трех агентов:.аденовирусы, хламидии и вируо ПГ-3.

Выделение и идентификация вируса от.больных животных. • ..Выделение вируса от больных животных. При вирусологическом исследовании 20 проб от 5-ти больных .телят о ярко выраженными признаками поражения респираторло-кипечиого тракта было выделено 4 • ;4итопат1песких агента на перевяааемоД культуре клеток, Т-1. Характер цитопяегичесюп: изменений бил сходен с изменениями, наблюдаемым* при инфицировании клет-м эталонными аденовирусами 1-го и 7. го серотипов. На «рвичиой г.ультуре клеток ТБ ЦПЛ стало проявляться толькб после 6-го пассата» Всю дальнейшую работу мы проводили на Т-Г, так как она оказалась более чувствительной и мм отабильно могли ее иметь для проведения исследования.

Наряду о даруеввнделением» мы провели индикацию вируса в полевом материале с использованием йистиниллированного ДНК-зонда. .7 всех больных животных, от которых был взят материал, выявлена ДНК аденовирусов крупного рогатого скота. Наиболее четкую картину гиб-, ридизации наблюдали в пробах смывов;глаз и носовой полости. Не обнаружена вирусная Л(НК г пробах крови. Видимо, количество ее в крови ;было ниже.порога чузствитёльноста используемого метода.

Таким образом, метод биотиниллирэванного ДНК-зонда-высокочувствителен и выявляет вируснуй ДНК после длительного хранения исследуемого материала (до 2-х дет - срок наблюдения).

; Злектронно-микрсскопическое исследование вирусов-иаолятов■показали, что выделения® вирусы .имеют , аналмчгшуп для аденовирусов • морфологии (диаметр 80- им, форма икоеаэдра.,'капсид имеет 252.кап-.

с опер«; кубический тип симметрии).

Метод флуорохромирования. При окрашивании акридином оранжевым к^|ток через 48-72 часа пооле их заражения обнаруживали, клетки ;со светящимися зеленим цветом включениями, ¡характерными как для аде-• нови русов -1-й и II-й подгрупп. ' _ . : "

Определение групповой принадлежности в РИЕ. При окрашивании • инфицированных клеток флуоресцирующей сывороткой' Т~Я подгруппы обнаруживали единичные клетки, в ядрах которых наблюдали интенсивное зеленое свечение, В препаратах, окрашенных флуоресцирующей сы- . короткой. II—R .подгруппы, большинство клеток имели характерные светящиеся гранулы в ядрах. ....',:.,/;•■

Ccpoтипиpoвaниe в PH. По результатам реакции нейтрализации' ." ' (FH) выделенные изоляты были отнесены к "3-му серо типу .(индекс нейтрализации - 5,0 ig) . •. ' V

Рестрикциокный анализ. Данный метод основан не сравнивании олектрофаретических подвижноетей и молекулярных масс фрагментов . гидролиза ДНК различнвми рестриктазами. Нами было нспольаовако 5 •. рестряктаз (Есод I, В*а Hl.'Xho I, Нра IyPsV' I), Сходство изоля-' , та "Б" с' различными аденовирусами крупного рогатого скота (тапы I, 3,^,6,7) определялось• ца оейовании степени комиграциифрагмеитов рестрикции, которая определяется как отношение числа фрагментов о одинаковыми молекулярными наосами•к общему числу фрагментов ДНК сравниваемых вирусов. Наибольшее сходство изолята "Б".по степени ¡ коииграцни фрагментов отмечаете* б вирусом 3-го типа (25,7#) и наименьшее с 1-м типом (7)2), Однако, генный тип его: отличался о?" эталонного штамма 3-го типа. , ' ^.'-^v-,

Этиологическая роль выделенных вирусов.» заболевании телят была доказана при исследовании, парных сывороток крови, взяты* о? больных животных с интервалом 2 недели. Во вторых пробах сыворотки крови 'татр антител к аденовирусам 1-Я, и Н-й подгрупп увеличился в 8 раз и .к хламидиям у 3-х ¡швоткых из пяти титр антител увеличился в 2 раза. Полученные данные свидетельствуют о' довольно широком но» сительетве аденовирусов и хламидий среди крупного рогатого скота и участие их в этиологии ъсспираторко-кишвчных заболеваний телят.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что от телят 4-5-т* месячного возраста о клиническими признаками поражения респираторного и. кивечиого тракта выделены цитопатогенные агенты, которыа по морфологии вирмоков, типу нуклеиновой киелотк, .xapc.t-теру ЦПД, морфологии внутриядерных вклвчеккй и ?Ш отмщены к «е-

- 1,4 -

новируе&я 1-й и П-й подгрупп. Из популяции вирусов-иэолятов выделен аденовирус. 3-го серотипа, генный тип которого отличается от эталонно штамма 3-го типа.

Антигенные свойства экспериментальной инактивированной ассо-• циированной вакцины против аденоинфекции и хламидиоза крупного рогатого скота на лабораторных животных.

Антигенная активность ноновакцины, содержащей различное соотношение аденовирусного компонента. Оба образца обладали выраженной антигенной активностью,* однако уровень антител в крови животных к аденовирусам I и II подгрупп резко,отличался, так у крыс, которым вводили вакцину Собразец * I -соотношение аденовирусов I и II п/гр. Ш>, татр антител к вирусу П-й подгруппы был значительно, ниже Сна 4;3 и РН и РИГА соответственно), чем вирусу 1-й под-

группы (Р^ 0,05). Высокой антигенной активностью обладал и образец * 2 (соотношение аденовирусов I и II п/гр.О,5:1). Уровень антител был в пределах 9,57-10,21 (в РН и РИГА), при этом разница между титрам?; антител к аденовирусам I г II подгрупп была меньше 1^г(Р>0,С5).

Тает« образе», образец вакцины, содержащий вирусном актигека аденоваруоа I. подгруппы в два раза меньше, обладал достаточно высокой антигенной ак явностью гс обеим подгруппам аденовирусов.

' В дальнейиих опытах мы использовали образцы вакцин, содержание в своем состаьз антигены аденовирусов 1-Й и П-й подгруппы в ооотнйпекии 0,5:1.

Сравнительная антигенная активность ассоциированной вакцины и моновакцнны. При сравнительном изучении антигенной активности 2-х образцов ассоциированной' вакцины (образцы Л I, * 2 - о различным со-отиоиешпм аденовирусного а хламидийного компонентов -1:0,3 и 1:0,5 соответственно) и мбновакцнны (образец * 3, содержащий только аденовирусный компонент) установлена их высокая антигенная активность. Титр антител к аденовирусен бил в пределах 8,4-10,1^^.в Р11 и 11,212,5 в РИГА. Антигег>"зя активность испытуемых образцов оказалась практически одинаковой;-хотя, у животных, привитых моновакциной (образец М 3) в РН титр' антител бил незначительно выше (на 0,7-1,2>Цг). Разница недостоверна (Р> 0,05).

Таким образом, наличие хламидийного компонента в экспериментальных образцах ассоциированной вакцины не}снижало антигенной ак-■ тйвности аденовирусного антигена. ;

Влияние дозы ассоциированной вакцина на'ант.;генный ответ жи- .; ватных. У крыс всех групп титр антител к аденовирусам I и II под-rgpn был достаточно,высоким (от 6,79 до 10,4 р РН и 8,42 до 11,51 ba^i в РИГА), Наивысший антигенный ответ на ассоциированную вакцину наблюдали у животных группы #' 5, привитых образцом Э (соотношение компонентов 1:0,5, доза 1,5 мл),'титр антител составил; в РН: . 9,5-10,4*^ и в РИГА 10,6-11,5 Самый низкий уровень 'антител > отмечали у крыс группы » вакцинированных образцом 2 (соотиоие-ние компоненте» 1:0,3, доза 0,65 мл)/ титр антител был в пределах 6,7-9,1РН и 8,4-10,7 бс^в РИГА'. В наших исследованиях на удалось статистически установить существенных различий в иммунои от- • лете животных на введение им различных доз (от 0,75: до 1,5 мл) ассоциированных вакцин, _

Таким образом, полученные- в. опытах на белых крысах результа- , ты показали, что снижение i составе вакцины аденовирусного антигена 1-й подгруппы в два раза не ведет к понижению антигенной активности ее к обеии подгруппам, наличие клсмидиЯного компонента не снижала антигенной активности препарата в отношении аденовирусов.

Влияние сроков хранения препарата на его антигенную активнее сть'. При хранении трех образцов вакцины в условиях 4-6° а течение 6 месяцев антигенная активность ее снижалась незначительно (в пределах 0,3-0,4 2o<jtB н 0,I-0,7^tB РИГА).. Далее, до 12 месяцев,, эти покааателн сохранялись практически на таком же уровне. Через 24 месяца хранения титр антител г аденовирусам 1-й подгруппы составлял 9,5-10,8 , ко второй -8,35-9,20*0^8 РН и РИГА соответственно. Активность образцов вакцины /снизилась , по сравкенкп с исходной, • на 0,6-1,0&хц в РН и 0,8-1,0 W» 'РИГА. г

Таким образом, при хранении образцов вакцины в течение 24 месяцев при температуре 4-6°. антигенная активность их снижалась незначительно. Они, как в виде моно-; так и ассоциированной вакцины, оказались активны при длиной режиме хранения в течение-2-х лет.

Антигенные свойства аксгсеримснтальной ийактивировышой ассоциированной вакцин против адекои^екц'ии и хламидиеза крупн»-- го рогатого скота на естественно восприимчивых животных.

В начала мы изучили антигенную активность моновакцины, оодар-жавей, различно» соотнесение аденовирусного антигеиа 2-й и П-й подгрупп. Высокий амзмгаиныЯ ответ после ревакцинации отмечали у животных, привитых образцом * I (сеотнорение аденовирусных антигене« 6,5:1) к обеим антигенным подгруппам аденовирусов С1Г,0-12,2^*)

' . : - и - •

в течение двух месяцев, Затем титр антител у них постепенно снижался через 4 месяца он составлял 10,5-11,0 удерживался на отом уровне, с незначительной тенденцией к снижению до 6 месяцев (срок наблюдения).Среднее значение титров антител в 1й>А к аденовирусам >, обеих подгрупп после ревакцинации составляло 1:1600. У телят, вакцинированных ббразцом №. 2 (соотношение аденовирусных антигенов 1:1), динамика уровня антител к 1-Й подгруппе аденовирусов практически была аналогичной. Однако, титр антител ко 11-й подгруппе аденовирусов был значительно ниж», чем к 1-й, и не превышал 5,8 1>аз-. ница достоверна (Р< 0,05)Результаты в РИГА коррелировали с данными ША, Так, титр антител к 1-й подгруппа был на уровне 1:1600, а ко И-й - 1:800. ' , -

Таким образом, вакцина, содержадая в своем составе соотношение аденовирусных антигенов 1-й и II-й подгрупп - 0,5:1, оказалась , бола» антмгенко активной к адеяовируоам обеих подгрупп.

Сравнительная антигенная активность ассоциированной вакцины и ноновакцииы.Титр антител у животных 1-й группы, привитых образцом * I (содержащий в своем составе хламидийный компонент и соотношение . аденовирусных антигенов 0,5:1) и 3-ей группы, вакцинированных об^ разцом * 3 (6*8 хламидийного компонент®, соотношение аденовируоных антигенов 0,5Л) через 30 дней после первого введения препарата бил в пределе? 10,0-10,2 и 8,0-8,8к аденовирусам I и II подгруппы соответственно; После второй вакцинации происходило увеличение титров атател, их максимальный уровень (II,0-I2,5?o<b) наблюдали через 1-2 месяца. Затем он постепенно снижался (на 0,5 ^jv в месяц) и к 180 дню составил 10,0-10,к 10,0-9,5 к I и II подгруппам соответственно. Представленные данные свидетельствуют, что у животных, привитых образцами вакцин как о хламчдийным, так и без хламидийного компонента, титр антител к обеим подгруппам аденовирусов практически был одииаков в течение 6 месяцев (Р>0,05). Титр антител у телят 1-й и 3-й групп в РА был ия одинаковом уровне (1:1600) к аденовирусам I и II пвдгрупп. Однако, у телят порой ! группа, вакцинирманных образцом » 2(содержащий хламидийный компонент и соотношение аденовирусных антигенов I и II подгрупп - 1:1) уровень антител к обеим подгруппам аденовирусов резко отличало* в течение всего опыта (6 месяцев). Тигр антител к аденовирусам TI подгруппы был значительно ниж* (на 1,5-3,7 чем к аденовирусам V ^vlioa подгруппы (Р< 0,001). В ЙФА титр антител ко И-й подгруппе , ' 'такте был ниже (1:800), чем к 1-й (1:1600). Эти данные согласуются

с результатами опытов на крысах и первого опыта ка телятах.

В отношении хламидийного компонента в результате исследований не было обнаружено существенного различия в уровне антител у животных, привитых образцами ассоциированной вакцины с различным соотношением аденовирусных антигенов (0,5:1 и 1:1),. Ревакцинация сопровождалась повышением титра антител'более чем в 2 раза до 6,75 и 7,28&><и. Затем он постепенно снижался и х б месяцам бил в пределах 4,6-5,01од,_.

Влияние дови ассоциированной вакцины на антигенный ответ телят. Титр антител к аденовирусам обеих подгрупп у животных всех групп (М- 1,2 и 3, доза препарата 7,0, 3,5 и 2,0 мл соответственно) был достаточно высок (Э^^в^^'к I подгруппе и 7,6-9,0 ко II подгруппе). Спустя месяц после ревакцинации животных он был я пределах 10,6-12,5 В дальнейшем, титр антител к аденовирусам 1-й подгруппы оставался на этом уровне. У животных третьей группы наблюдали увеличение титра антител на 2,6 5-му месяцу, он оставался на этом уровне (14,0до конца срока наблюдения (6 месяцев). Следует отметить," что динамика титров антител'к аденовирусам 11-й подгруппы.отличалась от таковой к 1-й подгруппе. Так, начиная со второго меряца после ревакцинации титр антител снижался значительно (на 1,3-2,3«*О к 3-му месяцу, а затем реако возрастал (на 1,9-3,8Й^ь) месяцу (Р4 0.05), сохранялась

на высоком уровне (И,8-13,4»-з<ь), у всох вакцинированных животных (групп 1,2 « 3), до шести месяцев (срок наблюдения). Необходимо отметить, что у животных контрольной группы 0 4) чара» 3 месяца после ревакцинации опытных телят-отоечали появление антител. уровень нх постепенно повышался и к 5'месяцу достигал 4,2-4,зХс»1,к обеим подгруппам аденовирусов. У этих животных наблюдали признаки респиратарко-кишечного заболевания в течение 6-10 дие{ Среди вакцинированных телят отклонений от физиологической нормы не наблюдали. Титр антител в №$А у телят I, 2 групп через I месяц после ревакцинации бил на уровне 1:1200т1:1600 в течение всего срока наблюдения, у животных 3-й группы он был несколько ниже -1:800. У невакцикироваикых телят начинав с Э иесяца выявляли антитела в И$А, тигр которых достигал к 4 месяцу 1:400 с повышением до 1:600 ка 5-6 месяцах.

У телят, привитых вакциной в дозе .7,0 и 2,0 мл, титр антител к хлаыидиям практически был на одном уровне в течакие всего срока наблюдения (б месяцев). Перед ревакцнкацкай титр антл'ыя у этих

животных был в пределах 2,8 и через месяц после ревакци-

нации оп возрос до максимального уровня (6,5. и 6,6^0. Затем через 3 мегяца снизился на 2,5&дги в дальнейшем до б месяцев сохранялся нзуровне Ь,3-5,Титр антител у телят второй группы (доза 3,5 мл) в течение дзух первых месяцев после ревакцинации был вуте на 1,2-1,6по сравнении с животными первой и третьей групп-(Р< 0,05)/Важно отметить, что у контрольных животных (невакциниро-ванных) через 2 месяца после начала опыта наблюдали повышение титра антител до 5,0^1, спустя 30 дней он снизился до в течение 4-х месяцев был на уровне 2,8-3,5?^. У этих животных наблюдали заболевание с признаками поражения респираторно-кишечного тракта. Падеж и вынужденный убой среди невакцинированних животных соста-■ вил 16,1%. .

Анплиз результатов клинических и серологических исследований показывает, что в комплексе, через 1,5-2 месяца после завоза теля* из хозяйств-поставщиков, наблвдяля вспышку хламидиоэа, а позднее, : спустя 2-2,5 месяца, аденовирусную инфекцию крупного рогатого скота.

Таким образом, испытуемые нами образцы ассоциированной вакцины против аденои'нфекции и хлямидиоза крупного рогатого скота обладали зыраженной антигенной активностью, индуцируя образование высокого .гровия гуморальная антител к аденовирусам и. хлаиидиям у привитых животных.

Зпизоотологическая эффективность вакцины. На основании положительных результат^-) проверки опытных образцов ассоциированной вакцины мы приготовили один из образцов препарата (с соотношзнием аденовирусного и хлашдийного компонентов 2,5:1) и испытали в 3 неблагополучных хозяйствах (2-х- в Казахстане, Г - в России). Всего было привито 270 голол в возрасте 1,5—Ц месяца-(доза 3,0 мл). Среди вакцинированных. телят заметных клянических признаков не наблюдали. У невакцинированних телят наблодали симптомы поражения респираторного и ки-зечного тракта в течение 2-3 недель. Симптоматическое лечение проводили в течение 6-10 дней. Падея и вынужденный убой составлял от 15 до 21$. Разница среднемесячных привесов составляла 1-1,2 кг.

Таккм образом, испытание препаратов в неблагополучных хозяйствах показало, что они. безвредны, антиганно активны и предохраняли животных от заболевания. Применение вакцин в хояяйстзах позволяет предотвратить отход, санитарный брак, вынужденный убой и недополучение привесов телят. _ ' .

Сравнительное изучение антигенной акттаноста образцов ассоцииро-

- 16 - "•■';•-':-- / ч

ванной лакцины против аденовирусной и хламкдийной инфекций и моно-вакцииы против хламидиоза крупного рогатого скота, проводили сотрудники ВИЭВа: доктор ветеринарных наук Ю.Д.Караваеэ и кандидат биологических наук И.А.Калугина. Результаты их исследований показали,, что аденовирусный компонент в составе ассоциированной вакцины, не сникал антигенную активность хламидийного компонента.

выводы .''.

1. В результате серологических и вирусолоточеоких исследований в хозяйства» Республики Казахстан и Российской Федерации, установлены ширбкоа вирусоносительотвв и участие аденовирусов I и II антигенных ггодгрупп и хламидий в возникновении респираторио-кишечных ". заболеваний телят. . .*,

2. От телят if-5 месячного.возраста с клиническими признаками , поражения респираторного и кишечного тракта выделены цитсгктетенные' агенты, которые по морфологйи вирионо», типу нуклеиновой кислот, характеру цитопатичаского действия, мерфедогия внутриядерных вклр-чаний и отнесены к аденовирусам крупного рогатогс -л<ота'1-» к II-B подгрупп; И» популяции вирусов-изслятов. выделен-е.¿o&spyo 3-го серотипа; генный тип- которого отличается от эталонного втамыа; • / 3-го nina. '/ . . "г-

3. Перевиваемая линия клеток почки теленка (T-I) более чувствительна и универсальна для первичного выделения аденовирусов I и II подгрупп, чем первичная культура„клеток тестикул.бычка. '

Опытные образцы экспериментальной инактивированной ессоции-роваиной вакцины против аденоин^екцчи. и,хламндиоза крупного рогатого скота при испытании на лабораторных и естественно восприимчивых животных оказались безвредными и анткгенно актилными. Антитела сохранялись на высоком уровне до 6 месяцев (9,2-I4w<\tк аденовирусам и »>5,оЦк хламидиям).

5, Снгаение в составе вакцины адековируоного антигена I-fl подгруппы в два раза не вед«7 к понижению активности ее к обеих подгруппам аденовирусов. , . -,

6. Наличи» хламидийногс компонента в ¡экспериментальных образцах инактивированной ассоциированной ракцины ив снижало антигенной активности препарата в отношении аденовирусов,

1. Аденовирусный компонент в состав* ассоциированной вакцины не оказывал отрицательного влияния на антигенную активность *л аыи-дийиого компоненту,.

8. Образцы иивктммровакиой ассоциированной вакцины сохраняли.

антигенную активность в течение 24 месяцев при хранении в условиях 4-6°С.

9.Опытные образцы инактивированной ассоциированной вакцины обладали выраженной антигенной актавностью и предохраняли вакцинированных животных от аденовирусной и хламидийной инфекций. Применение вакцин» в хозяйствах вело к снижении заболеваемости, отхода . и увеличении привесов телят..

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЖПОЛЬЗШАШНШШХ вшодов

1. Рекомендована единая перевиваемая линия клеток T-I для первичного выделения аденовирусов крупного рогатого скота 1-й и П-Й подгрупп.

2. Данные по оптимальному соетиоиекип аденовирусных антигенов 1-й и 11-й подгрупп (0,5:1) будут внесена в утвержденную (1.06.9&Г.) Нормативно-техническую документацию ''Вакцина против аденовирусной -инфекции крупного рогатого скота".

3. На основании разработанной методиш изготовления инактивированной ассоциированной эакцишл против еденовирусной и хлетидпоза крупного рогатого скота будет составлена ЮТ на этот препарат.

4. Результаты диссертационной работа внедрены в учебный процесс па кафедре вирусологии, инкробиологаи и биотехнология Московской ветеринарной академии ин.К.Й.Скрябина.

• СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Вумабаев X.S., Белоуоова PvB. Наличие антител в сыворотке крови животных к возбудители хлададиоза и вирусу парагрштпв-3 // Вопросы ветеринарной биологин: Сб.науч.тр. /[{оск.вет.акад.им.К.И.Скрябина., 1992.- С. 68-69. 7 -. 2. Жумабаев X.S. Наличие антител а сыворотке крови живог.шх квиру-сам адено, ПГ-3 и к возбудителю хламидиоза крупного рогатого скота в некоторых хозяйствах Республики Казахстан Ц Человек-Обаество-Нау-ка: Тез.докл. 2-ой научно-практичеокой и научно-методической конференции молоднх ученах с участием деятелей науки стран СНГ и Зарубежья.-Москва., 1993 С. 106-108.

3. Белоусова Р^В., Копенкин А.Е.,: Жум^баев Х.Е., Корольков В.И." Испытание ассоциированной вакцина против аденовирусной инфекции и па-стереллеза крупного рогатого окота // Вопросы ветеринарной биологии: Сб.науч.тр. /:Моск,вет.акад.иА.Н.И.Скрябина., 1993.- С. 54-56. г ,4. ЖумабаевХ.1., Белоусова Р.В., Думабаев ВД. Циркуляция аденовиру- . сов крупного рогатого скота в некоторых хозяйствах Казахстана // Вопросы ветеринарной биологии: Сб. науч. тр,/МВД иы.К.И.Скрябина.I993.C.57.