Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Распространение аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота в некоторых хозяйствах Республики Казахстан и их специфическая профилактика

I. ■■ МИНИСТЕРСТВО СЕЛКЖОГО ХОЗЯЙСТВА

Ко.-' он I .

..;"' РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ■ • .' МОСКОВСКАЯ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ им. К.И.СКРЯБИНА

■'. На правах рукописи

ЖУМАБАЕВ .ХОСМАРЗА 10ЛМАГАМБЕТШИЧ .

РАСПРОСТРАНЕНИЕ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ И ХЛАМИДЙОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО.СКОТА В НЕКОТОРЫХ ХОЗЯЙСТВАХ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН И ИХ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

16.00.01 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микологмя и имиунология

А В*Т ОРЕФЕР АТ:

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1994

ОШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тени. Массовые инфекционные болезни молодняке являются наиболее важной проблемой в рваной степени присущей различным видам сельскохозяйственных животных. Заболевания молодняке наносят неисчислимый ущерб животноводству, В настоящее время общеизвестно^ что в развитии респираторных и желудочно-кишечных болезней участвуют различные вирусные агента (вирусы ПГ-З, ИРТ, аденовирусы и другие) и несколько видов бактерии (пастереллы, сальмонеллы и другие) и хламидии.

. Ветеринарная наук«'в последние годы создала ряд препаратов для диагностики и специфической профилактики г заболеваний вирусной и бактериальной этиологии* Однако, ситуация по массовым болезням молодняка остается очень напряженной. Попытки профилакте-ровать респираторно-кииечные болезни вакцинами и» указанных вирусных агентов в, ряде случаев желаемого аффекта не дают, так как они не обеспечивают профилактики основных составлявших вирусно-бактериальной ассоциадаи...

Ряд. исследователей сообщают о значительной этиологической роли аденовирусов и хламидий в респираторно-кишечной патологии • теля* С^.СагЬуаЫгв виа!.', , 1964;?.А.А1аа8у е*,а1, , 1965; з. МоЬаг^у е!:1а1,/ 1965;р.йош331и1й , 1970; Х.Хараламбиев, Д.Огнянов и др., 1973; Н.Н.Крюков,'З.Ф.Зудилика, 197б;К.МаЗв*вка в-1.а1, , 1978;^.Евр1пав оъ.ах. ¿ 1980; В.Г.Гумеров с соавт., 1982; Л.В.По-гуляева и др., 1985; НД.Алиева, А.Г.Ахмедова, 1987; и др,). За, рубежом против этих инфекций применяет комбинированные вгжинны. В России и странах СНГ ассоциированных вакцин против адекеиифек-ции и хламидиоза крупного рогатого скота нет, '

Цель и задачи исследований. Изучить распространение аденовирусной и хламидийной инфекций в некоторых регионах страны и провеет» изучение' экспериментальных образцов инактивиревенной ассоциированной вакцины на* лабораторных и $отеотвекно восприимчивых 'животных. В соответствии с цельо былипоставлены следувдие задачи: ''' . ' •

I, Выяснить степепь'распрвстрлнения аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого окоти я некоторых хозяйствах Кует»-иайской и Целиноградской областей Республики Казахстан щ в некоторых хоеяйс7вах Российской Федерации, *

2. Вудс-.;:ть и идентифицировать полевые изъята аденовируса крупного рогетого окот«, . ' . ! , -

. 3. Йзучйть антигеннув активность образцов ассоциирований вакцины ке ЛЕоораторных (крысы) и естественно восприимчивых вотннх (телята)• • -Ч.-'■'' ■•','-' ; '" -;;

йь|Чйть эпизоотолоЬгаёскув эффективность образцов инакти-вированнгй гссовдированной вакцины прошв аденовирусное инфекции и хламидвкш крупного рогатого скота, в неблагополучных хозяйствах по дагтш инфекциям. Л.'/"'•.'.'

Научная новизна. I. Впервые в Казахстане-от больных телят -выделены и идентифицированы эпизоотические изоляты аденовирусов крупного рогатого скота, относящиеся к 1-й и II-й антигенным подгруппам. 2, Проведено генное титрование иволята аденовируса крупного рогатого' окота на основании анализа электроферетичееких профилей продуктов рестрикционного гидролиза его ДНК. 3. Рекомек-дована единая перевиваемая линия-клеток T-I для первичного выделения »деновирусов крупного рогатого скота как 1-й, так и П-й подгрупп, ,4. Впервые разработана <1 лабораторных условиях) инак-тивированная ассоциированная вакцина против аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота и показана ее эффективное», 5. Изучена динамика постяакционалышх антител в крови телят. ' ; : : V V , ' V 7 л - ■ _ ' : Ч. •'

Практическая значимость работы. Рекомендована единая nepesrt-ваемая линия клеток T-I для первичного выделения аденовирусов крупного рогатого скоте 1-Й и II-й подгрупп. Отработано оптимальное' соотношение аденовирусных антигенов; 1-й и II-й подгрупп СО, 5: I), что внесено в утвераденну» (1.06.90 г.) Нормативно-техническую документащиз "Вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота". На основании разработанной методики изготовления инактивированной ассоциированной вакцины против аденовирусной и хламидиоза.крупного рогатого скота.будет составлена НТД на этот препарат.

На'аадиту выносятся: материалы цо изучению распространения . аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота, в том числе выделение и идентификация;полевых изолятов аденовирусов, результаты разработки и изучения в экспериментальных условиях' ассоциированной вакцины для специфической профилактики аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота.

Реализация результатов исследований. Результата работа внедрены в.учебный процесс учении советом ветеринарно-биологаческого факультета МВА (протокол )§3 от 21.12.93). ,

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на.2-ой научно-практической и к^учно-методк-ческой конференции молодых ученых с участием деятелей науки стран СНГ и Зарубежья в Москве (1993); на расширенном меукафедральном совещании"на кафедре; вирусологии, микробиологии и биотехнологии Московской ветеринарной академии нм.К,И.Скрябина в 1993.г.

Публикация научных исследований. По материалам диссертации опубликовано А статьи и I находится в печати.

Объем" и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текстаи состоит ия введения, . обзора литературы,, материалов и методов, результате» собственных исследований, обсуждения, выводов, рекомендаций гпо использование > научных выводов,' списка;литературы и приложения. Рабата содержит 35 таблиц, ТО фотографии. Список литературы включаят 265 истачки-. ков, в том числе 139 иностранных авторов.

_ СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Работа выполнена в 19911993 гг., на кафедре вирусологии, микробиологии и биотехнологии, лаборатории вирусологии МВА, хозяйствах, лаборатортях, облзетот-делах Кустанайской и Целиноградской областей Республккк Казахстан, в Акционерном обществ» "Лива", Белгородской области, ¡ьрагмен-ш работа выполнены в ВГНКИ, ВН|ШБП, ВНИИ с/х биотехнологии и ВИЗВв.

Для выяснения опизоотаческой ситуации-в отношении аденовирусной инфекции и *л«иидиоаа крупного рогатого скота нами был проведен анализ за 5 лет статистических данных ветуправления двух областей, (отчета за I98X-I99I. гг.), а также результатов лабораторных исследований на аденовирусную инфекции и хламидиоз крупного "рогатого скота в хозяйствах Кустанайской и Целиноградокой областей. Распространение аденовирусной инфекции, хламидиоза и парагриппа-3 среди крупного рогатого окота изучали по разовым сывороткам, которые получали из лабораторий и хозяйств этих областей. Пробы сывороток крови для исследования брали в основном от коров, я также от быков-производителей н телочек 4-5 месячного возраст«,'

; :; :•■ -л - - ' v '

не менее 10% от стад*. Все сыворотки крови исследовал я в ЕрГА на аденовирусную инфекцию, в FCK на хламидиоз и в РТГА на парагрипп-3, rio общепринятым методикам. ■;.■'<■,

£зя вирусовуделения/ ясподьаомли смывы с коньгнктивы глаз, со слизистой оболочки носовой полости, прямой кишки и kpolb от больних телят из двух хозяйств. Исследовано 20 проб, от 5 животных, в возрасте 4-5 месяце». Изолирование вируса проводили впер» вичн*>-трипсиии8нровакной культуре клеток тестикул бычка (ТБ) и nf ревиваемой культуре клеток почки теленка (T-I), В этик системах проведи й "слепых" пассажа с интервалом 10-12 дией. Пробы с выраженный ЦПД до начала идентификации хранили при -20°С. Изучение и золягов проводили * сравнении с эталонными штаммами аденовируса крупного рогатого скота I и 7 серотапо». : -

Параллельно с вирусовыделением от этих же больных телят были исследованы в РНГА (на адеиоинфекцию) и в FCK (на хламидиоз) парные сыворотки крови. ' /Л /,

Индикацию вируса биотаниллированным ДНК-зондом в пробах оо сроком хранения около 2-х лет осуществляли по модифицированной схеме (v.Mana et.ai, 1989; В.В.Светличкия, Т.М. Гончарова, 1993)i Работу проводили бовмеотно о сотруднике»», институте биологического приборостроенияАНСветличкиныи В.В. и/дипломницей ветбиофака Гончаровой Т.Н.); - í '- !>:-?л-'

Электронно-микроскопическое исследование полевых изодятов бы ло проведено в ВГНКИ, в лаборатории инструментальных методов исследований, под руководством старшего научного сотрудника Могильного С.И. - методом негативного контрастирования.

Характер ядерных изменений изучали методом фдуорохрамирова-ния при окраске акридиновым оранжевым. Также групповую принадлежность выделенных вирусов-изолятов определяли в реакции имыунофлуа ресценции'(Ш), которую ставили в прямом вариант« с фитц-конъю-гатани сывороток I и II-ой подгрупп из диагностического набора биофабричного изготовления.

Для серотипирования полевых изолятов использовали реакцию . нейтрализации в культуре клеток T-I, кокору», оценивали по индексу нейтрализации (использовали эталонные сыворотки 1,2,3,5,7,8 я пев). Для более точного типирования выделенного изолята провели рестрккционный анализ его;ДНК, предварительно проведя клонирование вируса методом предельных раяведений.. j, -

:; рестрикционный анализ. Очистку м концентрирование аденваиру-

- 5 г

сов проводили.по методу ( .т.р.Апаегеоп в1:.а1, 1971), состоящему на 2-х .этапов: I) концентрирование вирионов осаждением; 2) очистке вирус«, Виделение вирусной ДНК осуществляли по мегоду ( А.Н.ЕЪ-?ац ааге1;.а1| 1969). Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами проводили по методике (Т.С.Денисова и др,., 1979), Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза проводили по методу (С. ИиХаег ,'» 1970. Работа проводилась под руководством Т.С.Денисовой и С.А.Ненашевой,, в ВНИИ с/х биотехнологии.

Изучение антигенной активности образцов инактивированной ассоциированной вакцины,- Для опытных образцов ассоциированной вакцины использовали инактивированные димерэтиленимином аденовирусы крупного рогатого скота 1-го и 7-го серотипов (I и II подгруппы соот-вегетвенн6), .и инактивированнув культуру хламидий, полученную по 'методу сотрудников ВЙЗВ Ю.Д.Караваева и И.А.Калугиной, В качестве адызванта применяли азросил, :

Изучение антигенной активности вакцины на 'лабораторныхживотных. Работу' проводили на белых крысах с массой тела :>50-'Х)0 г. Различные образцы вакцины вводили животным внутримышечно дважды с интервалом дней, полное" обескровливание проводили через 14 дней после второго введения препарата. Сыворотки на наличие антител к аденовирусам исследовали в двух серологических реакциях (микрометодами): в. реакции нейтрализации (РН) и реакции непрямой гем-агглвтинации (РИГА).

В первом опыте сравнивали антигенную активность двух образцов вак- . цины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, со-, держащих различное соотношение аденовирусов I и II подгруппы (0,5: I и 1:1 соответственно). Для,этой цели использовали 15 белых крыс, которые были разделены на 3 группы. Вакцину вводили животным 1-й и 2-й группы в дозе' где I мл внутримышечно. Ревакцинацию проводали через 11« дней тем же методом и в такой же дове. Крыс 9-ей группы не вакцинировали (контроль), им вводили культуралькув жидкость, не содержащую вируса, в тех же объемах.

В'опыте У 2 изучали антигенную активность 2-х образцов ассоциированной вакцины против аденовирусной инфекции и хламидиоза крупно- ' го рогатого скота, которйе различаливь по содержанию хламидийного компонента в их составе, квотные этого опыта (20 голов) были разделены, на 4 группы, соответственно испытуемым образцам вакцины. Крысам 1-й и 2-й групп вводили ассоциированную вакцину по 1,3 кл •

- б -

и 1,5 ил, содержащей 0,3 мл и 0,5 ил хлдайдийко/,о компонент* соответственно. Животным 3-ей группы вводили вакцину, содержала только аденовирусный компонентов дозе 1,0 мл, а крис 4-й группы оставили в качестве контроля^ им вводили культуральную жидкость. ' В опыте 'У 3 изучали я сравнительном аспекте антигенную активность образцов закцины, которые отличались как соотношением входящих в них компонентов, так и до?ой препарата вводимого белим крысам. В . опыте использовали 7 групп животных (по 5 голов в каждой). Крысам 1-й и 2-й групп вводили моновакцину против; аденовирусной инфекций (образец * I) в дозе 1,0 и 0,5 мл соответственно. Для 3-й и 4-й групп животных применяли ассоциированную вакцину (образец # 2) * дозе 1,3 и 0,65 мл соответственно. Животных 5 и 6-ой.групп вакцинировали образцом * 3 в- дозе 1,5 и 0,75.мл и 7 группа-была оставлена в качестве контроля. .

Опыт > 4 проводили с целью определения сроков и режима хранения инактивированных вакцин; изготовленных аналогично опыту * 2. Препараты ^расфасовывали и хранили при температуре 4-6° в течение 2-х лет. Через б, 12 и 24 месяца хранения пробы препарата вводили внутримышечно крысам (пе 5 голов) в дозах: 1,0 мл,-моновакцину-(образец К I)? 1,3 млг - образец2; ¿Г ,5. и* - образец * 3,. двукратно с интервалом 14 дней. .0 сохранении антигенных сво^тв вакцины судили по, степени сохранения способности «е индуцирозать образование специфических антител у привитых «инертных. Убой крыс проводили через 14 дней после 2-ой вакцинации, •/■': " '.

Изучение антигенной активности вакцины на телятах. Опытные образцы ассоциированной инактивярованной вакцины проверяли на стерильность на питательных-средах: МПБ, МПА, МППБ нагаре Чапека общепринятыми методами. Безвредность каждого образца вакцины устанавливали на 10 белых мышах массой 15-20 г, которым вводили по 0,2 мл препарата в мышцу бедра, и на 5-ти белых крыосх прианало-гичиой инокуляции по 1,0 мл вакцикн. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. Полноту инактивации вирусе в испытуемых образцах вакцины определяли в перевизаемой'культура клеток Т-1 на про-; тяжении 5-и последовательных "слепых" йаосажей. Пассажи в культуре клеток проводили разведенной вакциной 1:10 с интервалом в:12-14 дней, предварительно подвергая йнокулированную культуру клеток трехкратному замораживанию (-70°) й оттаиванию. Исследования по хламидийноиу компоненту проводили сотрудники ВИЗВа|(Ю,Д.Караваев, И.А.Калугмна), Отсутствие не инактивированных Цладщдкй ,в обраэдах ,

вакцины проверяли я перевиваемой культуре клеток почки сайги до •5-и пассажей. Антигенную активность хламидийного комглнента изучали на морских свинках. ,

Антигенные свойства образцов вакцины изучали на телятах 1,52 месячного возраста, черно-пестрой и красно-стёпной породи. Опыты проводили в откормочном комплексе акционерного общества "Нива", Белгородской области. Ло начала опытов телят обследояали клинически в течение: 10 дней. Группы животных подбирали по принципу аналогов. .У всех телят перед вакцинацией исследовали сыворотки крови для определения исходного уровня специфических антител к аденовирусам (в РИГА) и к хламйдиям (в РСК). Вакцину вводили внутримышечно, с интервалом 30 дней дважды. Антигенную активность образцов вакцины определяли по титру антител в сыворотках крою телят к 'аденовирусам''в (РИГА); иммуно^ерментного анализа (№А) и в РСК к хламйдиям .через месяц после первого введения препарата к далее .ежемесячно (До б.месяцев).' ; :. .

; Результаты серологического исследования проб симроток крови обработаны статистически» ;.

В первом, опыте оравгавали антигенную активность двух образцов вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота (анало-гичнб 1-му опыту, на крысах). В Опыте использовали 30 телят. Все от йыди нумерованы и разделены на 3 группы. Препарат вводили дваж-ды:по 5 мл.,,г"*;; А'.'",'"

В опыте * 2 изучали в сравнительном аспекте антигенную активность 3-х образцов вакцины (аналогично 2-му опыту на крысах)» Ассоциированную вакцину вводили двукратно о интервалом 30 дне-« по 7,0 мл (образец »1, > 2)/ Моновакцину - по 5,0 мл (образец ¿г 3). В третьем опыте изучали антигенную активно&ть образцов ассоциированной вакцины, которое отличались соотношением входящих в них аденовирусного и хламидийного компонентов и дозой препарата вводимого' телятам. В опыте использовали 3? теленка, которые были разделены на Ц группы (три опытных и одна контрольная - по 8 го^ов). 'Животным первой и второй групп вводили образец вакцины * I (соогно-иение аденовирусного и хламидийного компонентов 2,5:1 соответст- ' венно) в дозе; первой группе по 7,0 «л, второй а? 3,5 мл; телят третьей группы прививали вакциной (образец » 2), в которой соотношение аденовирусного и хламидийного компонентов было 1:1, в дозе по ¿,0 мл, Швотных четвертой группы не вакцинировали (конт- -рель). ' ■ . ' , • ■

- з ~ ;.'

, ' результата исследований ; ' v :

Анализ статистических данных по заболеваемости и падежу крупного рогатого скота й результатов исследований на ..аденовируо-ную инфекцию и хлаиидиоз. ! / v •

Анал»а статистических данных показал, чтоза 4 года в Куста-найской области было зарегистрировано больных - 1655332 голов крупного рогатого скота, |'т(и числе 916386 телят (69,8£), пало 98672, голов, в том числе 64261 молодняка (65^), причем гибель молодняка имела тенденцию к повышение (от 62 до 71)0. В Целиноградской области за 5 лет зарегистрировано больных - 889841 голов, в том числе 380021 телят (42,750. Птбель молодняке в течение этих лет колебалась в пределах 35,7-44,3j£. Падеж животных от инфекционных заболеваний составлял , от 8,8 до 20,5, а от незаразных - 79,591,2%. Причем, наибольший процентпадеиаи вынужденного убоя среди можушяка приходит на болезни органов дыхания и пищеварения (94,9-95,I/O. В хозяйствах этого региона за1987-1991 годи зарегистрировано значительное количество (76270 голов) абортирован- . них и мертворожденных телят невыясненной этиологии.

Изучение роли аденовирусов и хламидий в респираторно-кишеч-но8 патологии практически только начинается; Так, sc 5 лет не адс-неинфекцию крупного рогатого скота было исследовано хзего яиоь . 218 проб сыворотки крови, на которых Iii? имели анти«ла г диагностических титрах. На хламидиоз исследовано 1287 проб первично (преимущественно из племстанций), Выявлено б,7£ серопо?итивннх • .животных. : '■"•'.'■

Таким образом, статистические,данные и результата лабораторных исследований свидетельствуют о циркуляции аденовирусов я хламидий среди крупного рогатого скота в хозяйствах Казахстана. В связи с этим, мы провели работу по выяснению широта распространения этих агентов среди животных данного региона и их этиолог»-, ческой роли в реепираторно-яшечных заболеваниях крупного рогатого скота, .;

Распространение аденовирусной и хламидиозной инфекций в неко-! торых хозяйствах Республики Казахстан и России. При серологическом исследований 676 проб сывароток крови крупного рогатого скота из 19 хозяйств Казахстана, процент сероцози-

тивных гивотных в хозяйствах колебался от 19,5 ДО IOO не адеиоин-фекцию, от 3,6 до 60 на хламидйоз и от 70 до. IOOÍÍ на ПГ^З. Антитела обнаруживали к аденовирусам обеих антигенных подгрупп. Так; в Кустапгйской области, в двух районах процент серопозитивных тавотных колебался к аденовирусам I п/гр. - 80-89,3; ко П-й п/гр.-76,2-91,8; к хламидийм - 15-19,5 и ПР-3 - 81,75-98,1. В Целиноградской области - к I-п/гр»-57,2; Ц-й - 79,2; к хламидиям -31,6 я ПГ-3 - 94,5. Серологические исследования, проведенные в хозяйствах России, также свидетельствовали о широкой циркуляции этих агентов среди животных. Процент серопозитивных животных составил 73,7 и 63,4 (к I и II.п/гр. соответственно) и к хламидиям -40,5?.

Полученные данные свидетельствуют о широкой циркуляции ере- • дя животных аденовирусов, вируса ПГ-3 и хламидий и позволяют предполагать, что в респираторно-кишечной патологии телят принимают . участие не менее трех агентов: аденовирусы, хламида и и вирус ПГ-3.

Выделение и идентификация вируса от Сольных животных. • - . Выделение вируса от больных животных. При вирусологическом исследовании 20 проб от 5-ти болышх телят о ярко выраженными признаками поражения респираторио-кипечного тракта было выделено 4 • цитопатпческих агента кв перевяваемой культуре клеток T-I. Характер цитопатическй*; изменений бчл сходен с изменениями, наблюдаемыми при инфицировании клеток эталонными аденовирусами 1-го и 7. го серотипов. На ггрвичиой -ультуре клеток ТБ ЦПД стало проявляться только после 6-го пассажа. Всю дальнейшую работу мы проводили на T-I, так как она оказалась более чувствительной и мы стабильно могли ее иметь для проведения исследований.

Наряду с внрусовыделением, мы провели индикацию вируса в полевом материале с использованием Ьиотинйллированного ДНК-зонда. .У всех больных животных, от которых бил взят материал, выявлена ДНК аденовирусов крупного рогатого скота. Наиболее четкую картину гиб-, ридиэации наблюдали в пробах смывов.глаз и носовой полости. Не обнаружена вирусная ДНК i пробах крови. Видимо, количество ее в крова было ниже.порога чувствительности используемого метода.

. Таким образом^ метод биотиииллирманного ДНК-зонда-высокочувствителен и выявляет вирусную ДНК после длительного хранения исследуемого материала (до 2-х лет - срок наблюдения).

. Злектронно-мйкрсскопическое исследование вирусев-иэолятов-показали, что; выделенные вирусы имеют аналопмную для аденовирусов« морфология (диаметр 80- íw»- форма икосаэдра, капсид имеет 252 кап-.

Ю - .. _ .

сомера; кубический тип симметрии). ' ;.••'•'•'

Метод фдуорохромирования. При окрашивании акридином оранжевым кцток через 48-72 часа после их заражения обнаруживали, клетки ;со светящимися зеленим цветом включениямихарактерными как для аденовирусов 1-й и П-й подгрупп. • ' .■ ^

Определение групповой принадлежности в РИФ. При окрашивании , инфицированных клеток, флуоресцирующей сывороткой" Г-й подгруппы обнаруживали единичные клетки, в ядрах которых" наблюдали интенсив-?: ное зеленое свечение. В препаратах, окрашенных флуоресцирующей'сы-вороткой.'Ц-й подгруппы, большинство клеток, имели характерные светящиеся гранулы в ядрах. : -.; /

Серотипирование в РН. По результатам реакции нейтрализации ,; (РН) выделенные изоляты были отнесены к Э-му серотипу.(индекс нейтрализации - 5,0lg). . Г Г ' , : '

Рестрикционный анализ.. Данный метод основан не сравнивании электрофоретических подвижностей и молекулярных меос:фрагментов, гидролиза ДНК различными ре(<триктазаии. Нами было использовано 5 рвстриктаз (Есод I, B*n HI,; Xho I, Нра I/:Psl-I), Сходство изоля-: та "Бм с' различными аденовирусами крупного^ рогатого скота (типы I; Э,Кб,7) определялось-ца, основании степени комиграции-фрагментов, рестрикции, которая определяется как отношение чи«ла фрагментов с одинаковыми молекулярными массами к общему числу фрагоентов ДНК сравниваемых вирусов; Наибольшее сходство изолята "Б" по степени : коииграции фрагментов отмечается ö вирусоыЗ-готипа(25,7?!)и наименьшее с 1-м типом (7£). Однако, генный тип его отличался от ота-лонного штамма 3-го типа. : - \ . " i • " : -

Этиологическая роль выделенных вирусов.в заболевании телят была доказана при исследовании, парных сывороток крови, взятых от больных животных о интервалом 2 недели. Во вторых пробах сыворотки крови титр антител к аденовирусам 1-й, и 11-й подгрупп увеличился в Ц-8 раз и .к хламидням у 3-х швотных из пяти татр антител увеличился в 2 раза. Полученные данная свидетельствуют о' довольно широком но-сителютве аденовирусов и хламидий среди крупного рогатого скота и участие их в этиологии узспираторно-киаечных заболеваний телят»

Таким" образом, результаты наших исследований, показали; что от телят 4-5-ти месячного возраста с клиническими признаками поражения респираторного к, кишечного тракта выделены цитопатогенные агенты, которые по морфологиивириоыо», типу нуклеииовой кнолоты, .характеру ЦПД, морфологии внутриядерных включений и Р16 отассени к ад«-

- # -

■ новируса» 1-й и 11-й подгрупп. Из популяции вирусов-изолятов выделен аденовирус 3-го серотипа, генный тип которого отличается от эталон» г о штамма 3-го типа.

Аь^генные свойства экспериментальной' инактивированной ассо-•.'. циированной вакцины против аденоинфекции и хламидиоза круп-■•;'•'. ного рогатого скота на лабораторных животных.

Антигенная активность яоновакцины, содержащей различное соотношение аденовируоного компонента. Оба образца обладали выраженной антигенной активностью,'однако уровень антател в крови животных к аденовирусам 1-й II подгрупп резко.отличался, так у крыс, которым вводили вакцину (образец £ I -соотношение аденовирусов I и II п/гр. IЛ), титр антител к вирусу И-й подгруппи был значительно, ниже ("на 4,3 и 5,3^^8 РН и РИГА соответственно), чем вирусу 1-й подгруппы (Р4. 0,05). Высокой антигенной активностью обладал и образец * 2 (соотношение аденовирусов I и II п/гр.0,5:1). Уровень антител был в пределах 9,57-10,21 (в РН и РИГА), при этом разница нбжду титрами антител к аденовирусам I к II подгрупп была меньше

I ^г(р>о,С5).

Тамм образс,<, образец вакцины, содёржг!щий вирусного аитигейа аденовируса I подгруппы в два раза меньше, обладал достаточно высокой антигенной ак-явностью к обеим подгруппам аденовирусов.

' В Дальнейших опытах мы использовали образцы вакции, содержащие в своей состаи антигены аденовирусов 1-й и II-й подгруппы в соотношении 0,5:1. : • •

Сравнительная антигенная активность ассоциированной вакцины и моновакцины. При сравнительном изучении антигенной активности 2-х образцов ассоциированной' вакцины (образцы £ I, * 2 - о различным со-отношенигм аденовирусного я хламидкйного компонентов -1:0,3 и 1:0,5 соответственно) п моновакцины (образец 3, содержащий только аденовирусный компонент) установлена их высокая антигенная активность. Титр антител к аденовирусам был в пределах 8,4-10,1 ^о^.в РН и 11,2-12,5^4в РИГА. Антигесгая активность испытуемых образцов оказаяаоь практически одинаковой; хотя у животных, привитых моновакциной (образец 3) в РН татр антител был незначительно выше (на 0,7-1,2Мг). Разница недостоверна (Р>0,05). .

Таким образом, наличие хдамидийного компонента в экспериментальных, образцах ассоциированной вакцины не ^снижало антигенной ак-тавности аденовирусного антигена. . •

: - i2>':- C-'-'J:^:' .: л'--

Влияние дозы ассоциированной вакцины на'антигенный ответ жи-' вотных. У крыс всех групп титр антител к аденовирусам I и II под-гцпп бил достаточно высоким (от 6,79 до 10,4 р РН и 0,42 до II,51 в РИГА). Наивысший антигенный ответ на ассоциированную вакцину наблюдали у животных группы 5, привитых образцом 3 (соотношение компонентов 1:0,5, доза 1,5 мл) ,'титр антател составил ,в'РК . 9,5-10,в РИГА 10,6-11,5 йо^*. Самый низкий уровень антител отмечали у крыс группы вакцинированных обрвзцрм 2 (соотношение компонентов 1:0,3, доза 0,65 мл), титр антител был в пределах 6,7-9,l2o2¿B РН и 8,^10,72^^1 РИГА. В наших исследованию на удалось отатистически установить существенных различий в иммуном ответе животных на введение им различных доз (от 0,75 до 1,5 мл) ассоциированных вакцин, . '.

Таким образом, подученные в опытах на белых крысах результаты показали, что снижение в составе вакцины аденовирусного антигена 1-й подгруппы в два раза не ведет к понижении антигенной активности ее к обеим подгруппам, наличие хламйдийного компонента не снижала антигенной активности препарата в отношении аденовирусов/ Влияние сроков хранения препарата на его антигенную активность. При хранении трех образцов вакцины в условиях 4-6° в течение б месяцев антигенная активность ее снижалась незначительно (в пределах 0,3-0,4 РН и 0,1-0,7в РИГА). Далее, до 12 месяцев, эти покааатели сохранялись практически на таком же.уровне. Через 24 месяца хранения татр антител к- аденовирусам 1-й подгруппы составлял 9,5-10,8u^j, ico второй -8,35-9,20Коч4в РН и РИГА соответственно. Активность .образцов вакцины снизилась, по сравнению с не-ходной. иа 0,6-1,0Цгв РН и ;0,6-I,0-?ú4ta'РИГА.

Таким образом, "при хранении образцов вакцины i течение 24 не-1 сяцев при температуре 4-6° антигенная активность их снижалась незначительно. Они, как в гиде moho-, так и ассоциированной вакцины, оказались активны при данном режиме хранения в течение'2-х лет.

Антигенные свойства экспериментальной и«активированной ассоциированной вакцин* против адсиоиифекц'т и хламидиоза крупно-• го рогатого скота на естественно восприимчивых животных,

В начале мы изучили антигенную активность моновакцины, родер-жацей, различие« соотношение аденовирусного антигена 1-й и II-й под. групп. Высокий аишгаикый ответ после ревакцинации отмечали у животных, привитых образцом *1 (соотношение аденовирусах антагеко» 6,5:1) к обеим антигенным подгруппам .аденовирусов (II,0-12,2^*)

в тзчекяе Двух месяцев. Затем тит;р антител у них постепенно снижался через 4 месяца он составлял 10,5-11,0^t" удерживался на этом уровне, с незначительной тенденцией я снижению до 6 месяцев (срок на.; блюдепия). Среднее значение титров антител i W к аденовирусам обеих подгрупп после ревакцинации составляло 1:1600. 7 телят, вакцинированных ббразцом Jf 2 (соотношение аденовирусных антигенов 1:1), динамика уровня антител к 1-й подгруппе аденовирусов практически была аналогичной. Однако, титр антител.ко II-й подгруппе аденовирусов был значительно ниже, чем к 1-й, и не превышал 5,8 Разница достоверна (Р4 0,05). Результаты в РИГА коррелировали с данными Шк. Так, татр антител к 1-й подгруппе был на уровне 1:1600, а ; ко И-й - 1:800.

Таким образом, вакцина, содержащая в своем составе соотноше-: ние аденовирусных антигенов 1-й и II-й подгрупп - 0,5:1, оказалась более антигенно активной к аденовирусам обеих подгрупп.

Сравнительная антигенная активность ассоциированной вакцины и моновакцииы.Титр антител у животных 1-й группы, привитых образцом * I (содержащий в своем составе хламидийный компонент и соотношение . аденовирусных антигенов 0,5:1) и 3-ей группы, вакцинированных об-; разцом * 3 (бчз хламидийного компонента, соотношение аденовирусных антигенов 0,5:1) через 30 дней после первого введения'препарата был в пределt- 10,0-10,2 и 8,0-8,8 к аденовирусам I и II подгруппы соответственно/ После второй вакцинации происходило увеличение титров англтел, их максимальный уровень (11,0-12,5 наблюдали через 1-2 месяца. Затем он постепенно снижался (на 0,5 в месяц) и г, 180 дню составил 10,0-10,и 10,0-9,5 к I и И подгруппам соответственно. Представленные данные свидетельствуют, что у животных, привитых образцами вакцин как о хлекчдийкым, так и без хламидийного компонента, титр антител к обеим подгруппам аденовирусов практически был одинаков в течение 6 месяцев (Р>0,05). Титр антител у телят 1-й и 3-й групп в Ш>А был на одинаковом уровне (1:1600) к аденовирусам I и II подгрупп. Однако, у телят второй .. группа, вакцинированных образцом К 2(содержащий хламидийный компонент и соотношение аденовирусных антигенов I и II подгрупп - 1:1) уровень антител к обеим подгруппам аденовирусов резко отличалсй в течение всего опыта (6 месяцев)., Титр антител к аденовирусам 'II подгруппы был значительно нижаГ (на чем к аденовирусам

S 1-ой подгруппы (Р< 0,001). В ®А титр антител ко II-Й подгруппе v ' 4 ' такте был ниже (1:800), чем к 1-й (1:1600)'. Эти данные согласуются

с результатами опытов на крысах и первого опыта на телятах.

В отношении хламидийного компонента в результате йоследова ний не было обнаружено существенного различия в уровне антител животных, привитых образцами ассоциированной вакцины с различны; соотношением аденовирусных антигенов (0*5:1 и 1:1)., Ревакцинаци сопровождалась повышением титра антител'более чем в 2 раза до б и 7,28^<ц. Затем он постепенно снижался и к б месяцам был в пр делах 4,6-5,0 Ьь.

Влияние доза ассоциированной вакцины на антигенный ответ т< лят. Титр антител к аденовирусам обеих подгрупп у животных всех групп (* 1,2 и 3, доеа препарата 7,0, 3,5 и 2,0 кл соответствен! был достаточно высок (9,СЙ9,8 I подгруппе и 7,6-9,0 ко П i группе). Спустя месяц после ревакцинации животных он был в пред« лах 10,6-12,5 дальнейшем, титр антител к аденовирусам I-f

подгруппы оставался на этом уровне. У животных третьей группы н> <5людали увеличение титра антител на 2,6 £cgtK 5-му месяцу, он ост вался на этом уровне (14,0&>О до конца срока наблюдения (б месяцев). Следует отметить, чтй динамика тцтров актател к аденовирусам 11-й подгруппы.отличалась от таковой к 1-Я подгруппе. Tait, начиная со второго меряца после ревакцинации титр антител снижался значительно (на i,3-2,3u^t) к 3-му месяцу, а затем резко воврастал (на I,9-3,8^t) к 5-му месяцу (Р4 0,05) . сохранялась на высоком уровне (11,8-13,4 wô, у всех вакцинированных животных (групп 1,2 и 3), до шести месяцев (срок наблюдения). Необходимо отметить, что у животных контрольной группы (£ 4) через 3 месяца поело ревакцинации опытных телят-отмечали появление антител. уровень их постепенно повышался и к 5" месяцу достигал 4,2-обеим подгруппам аденовирусов. У этих животных наблюдали признаки респироторко-кииечного заболевания в течение 6-10 дн Среди вакцинированных телят отклонений от физиологической нормы не наблюдали. Титр аитиггд в ША у телят I, 2 групп через I меся, после рёвакцинации был не уровне 1:1200-1:1600 в течение всего срока наблюдения, у животных 3-й группы он был несколько ниже -1:800. У невакцииированкых телят начиная с 3 .месяца выявляли антитела в ИФА, титр которых достигал к 4 месяцу 1:400 о повышением до 1:600 на 5-6 месяцах.

Ï телят, привитых вакциной в дозе .7,0 и 2,0 мд, титр антитед к хламкдиям практически был на одном уровне в течение всеге срок« наблюдения (6 месяцев). Перед ревакцинацией титр аити^л у этих

вотных был I пределах 2,8 и через месяц после ревакци-

ции ои возрос до максимального уровня (6,5. и 6,6^0. Затем че-з 3 месяца снизился на 2,5&^ги в дальнейшем до б месяцев сохра-лся н* уровне 3-5,0Титр антител у телят второй группы оза 3,5 мл) в течение двух первых месяцев после ревакцинации был ше на 1,2-1,6 2о<^по сравнению с животными первой и третьей группой,05). Важно отметить, что у контрольных животных (невакцкниро-нных) через 2 месяца после начала опыта наблюдали повышение тит-антител до 5,0 Хо^» спустя 30 дней он снизился до 3,5^ги в те-ние ^х месяцев был на уровне 2,8-3,У этих животных наблюли заболевание с признаками поражения респираторно-кишечного трак. Падеж и вынужденный убой среди невакцинированных животных соста-л 16,12. . '

Анализ результатов клинических и серологических исследований-казывает, что в комплексе, через 1,5-2 месяца после завоза теля* хозяйств-поставщиков, наблюдали вспышку хламидиоза, а позднее, устя 2-2,5 месяца, аденовирусную инфекцию крупного рогатого скота.

Таким образом, испытуемые нами образцы ассоциированной вакцины отив аденоикфекции и хламидиоза крупного рогатого скота обладали раженной антигенной активностью, индуцируя образование высокого овия гуморальных антител к аденовирусам и уламидиям у привитых житных .

Эпизоотологическая эффективность вакцины. На основании положи-льных результате? проверки опытных образцов ассоциированной вакци-мы приготовили один из образцов препарата (с соотношением адено-русного и хламидийного компонентов 2,5:1) и испытали в 3 неблаго-лучных хозяйствах (2-х в Казахстане, I - в России). Всего было «вито 270 голов в возрасте 1,5-Н месяца (доза 3,0 мл). Среди вак-нированных. телят заметных клинических признаков не наблюдали. У вакцинированных телят наблюдали симптомы поражения респираторного кишечного тракта в течение 2-3 недель. Симптоматическое лечение сводили в течение 6-10 дней. Падеж и вынужденный убой составлял ' 15 до 21?. Разница среднемесячных привесов составляла 1-1,2 кг.

Таким образом, испытание препаратов в неблагополучных хоаяйст-х показало, что они. безвредны, антигеино активны и предохраняли вотных от заболевания. Применение вакцин в хозяйствах позволяет едотвратить отход, санитарный брак, вынужденный убой и недополу-ние привесов телят. ' .

Сравнительное изучение антигенной активности образцов ассоцииро-

ванной лакцииы против аденовирусной и хламидийной инфекций и моно-вакцииы против хламидиоза крупного рогатого скота проводили сотрудники ВИЭВа: доктор ветеринарных наук Ю.Д.Караваев и кандидат биологических наук И.А.Калугина. Результаты их исследований показали,, что аденовирусный компонент в составе ассоциированной вакцины не снижал антигенную активность хламидийного компонента.

• ■ ВЫВОДИ

1. В результате серологических и вирусологических исследований в хозяйствах Республики Казахстан и Роосийской федерации, установлены ширЬкое вирусоносительотве'и участие аденовирусов I и II анти^ генных П°ДГРУПП и хламидий в возникновении респираторно-кншечних заболеваний теля*.

2. От телят 4-5 месячного.возраста с клиническими' признаками поражения респираторного и кишечного тракта выделены . цит^и.чценные' агенты, которые по морфологии вирионов, типу нуклеиновой кислоты, характеру цитопатического действия, морфологии вну.триядерныг включений и №, отнесены к аденовирусам крупного рогатого -готл 1-й и II-й подгрупп: Из популяции вирусов-и?олятов выделен. ко вирус 3-' го серотипа, генный тип которого отличается от эталонного штамма Л 3-го тЫпа. -" ' ■

3. Перевиваемая линия клеток почки теленка (1-1) более чувств вительна и универсальна для первичного выделения аденовирусов I и II подгрупп, чем первичная культура ..клеток тестикул . бычка.

4. Опытные образцы экспериментальной инактивированной ессоции-рованной вакцины против аденоинфекции.и,хламидиоза крупного рогатого скота при испытании на лабораторныхи естественно восприимчивых животных оказались безвредными и антнгенно активными. Антитела сохранялись на высоком уровне до 6 месяцев (9,2-14к аденовирусам и хламидиям).

5. Снгаение в составе вакцины аденовирусного антигена 1-й подгруппы в два раза не ведет к понижение активности ее к обеим подгруппам аденовирусов. , ' . \

6. Наличие хламидийного компонент» в экспериментальных образцах инактилированной ассоциированной ракцииы на снижало антигенной активиости препарата а отношении аденовирусов.

7. Аденовирусный компонент в состав« ассоциированной вакцины не оказывал отрицательного влияния на а'нткгенную актнвнооть хлами-днйного компонента,,

8. Образцы иицмивмроваиной ассоциирование* вакцины сохраняли.