Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотология вирусных пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота и их специфическая профилактика

КЫРГЫЗСКАЯ АГРАРНАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

НУРГАЗИЕВ Рысбек Зарылдыкович

УДК 619:610.98-084:578.831.3.835.1:636.22|. 28-053.2

ЭПИЗООТОЛОГИЯ ВИРУСНЫХ ПНЕВМОЭНТЕРИТОВ МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ИХ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Специальность 16. 00 03. — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

БИШКЕК 1997

КЫРГЫЗСКАЯ АГРАРНАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

НУРГАЗИЕВ Рысбек Зарылдыкович

УДК 619:616.98-084:578.83! .3.835.1:636.22/.28-053.2

ЭПИЗООТОЛОГИЯ ВИРУСНЫХ ПНЕВМОЭНТЕРИТОВ МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ИХ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Специальность 16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

БИШКЕК 1997

Работа выполнена на кафедре инфекционных и инвазионных болезней Кыргызской аграрной академии, лаборатории вирусологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии, лаборатории вирусологии Гийсенского университета Германии.

Научные консультанты: доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусова Р.В.

доктор ветеринарных и доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Сюрин В.Н.

Официальные оппоненты:

Хандуев Ц.Ц. - почетный академик HAH Кыргызской Республики, член-корр. HAH, доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки Кыргызской Республики, лауреат Государственной премии в области науки и техники.

Галиев P.C. - доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки Кыргызской Республики.

Рыскулов K.P. - доктор ветеринарных наук.

Ведущая организация: Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт.

Защита диссертации состоится "/¿Г" ¡¿¿^lA 1997 г. в /¿jf часов на заседании специализированного совета^Д 16.94.18 по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология, ви^сология, эпизоотология, микология и иммунология в Кыргызском научно-исследовательском ветеринарном институте Кыргызской аграрной академии (720028,т. Бишкек, ул. Токтогула, 80 Кыргыз. НИВИ).

С диссертацией можно ознакомиться, в научной библиотеке Кыргыз. НИВИ.

Автореферат разослан " " Ш^иг^ 1997 г.

Ученый секретарь• специализированного совета

кандидат биологических наук, RA. Дуйшеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проводимая земельно-аграрная реформа в республике в корне изменила ситуацию в отрасли животноводства. Формирование многообразных форм собственности привело к изменению форм ветеринарного обслуживания и технологии- ведения животноводства. На современном этапе перед ветеринарной наукой и практикой стала проблема-диагностики, профилактики и лечения животных с учетом новых условий.

В ходе'приватизации колхозов, совхозов и других сельскохозяйственных предприятий возникли новые формы собственности, •Такие как фермерские, крестьянские хозяйства. В данное время в республике насчитывается более 30 тысяч таких хозяйств, которые нуждаются в квалифицированной ветеринарной помощи. Помимо этого в рыночных условиях сформированы многочисленные посреднические и торгово-закупочные субъекты, расширилась торговля скотом, продукцией и сырьем животного происхождения. Все эти факторы привели к изменению эпизоотической обстановки и форм проявления и течения инфекционных болезней животных.

Наиболее острой проблемой для фермерских, крестьянских хозяйств стали заболеваемость и падеж молодняка сельскохозяйственных животных. Среди них ведущее место занимают вирусные и бактериальные респираторно-кишечные инфекции, вызываемые аденовирусами, вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, хламидиями и пастереллами.

На фоне -неблагоприятных зоогигиенических и санитарных условий эти агенты, ассоциируясь в организме, вызывают пневмо-энтериты у молодняка крупного рогатого скота.

По данным ряда зарубежных авторов (Сизов И., Хараламбиев Х.Е., Aldasy P., Bartha A., Darbyshire J., Martin S.W., Mohanty S., Rondhuis P., Wizigmann G.) пневмоэнтериты гелят за последние 30 лет имеют наиболее широкое распространение и наносят значительнцй экономический ущерб скотоводству. Именно поэтому, наряду с соответствующими зоогигиеническими условиями в мировой практике

особое внимание уделяется специфической профилактике пневмоэ«-теритов.

Несмотря на широкий спектр исследований по разработке ас- . сортированных вакцин против аденовирусной, хламидиозной и пастереллезной инфекций телят, ясно одно, что такая вакцина должна обладать универсальными свойствами, присущими всем видам вакцин. Она должна быть безопасной и иммуногенной, обеспечивать формирование иммунитета не менее чем у 90% иммунизированных телят сроком до года и более.

Проблема комплексной специфической профилактики аденовирусной, хламидиозной и пастереллезной инфекций крупного рогатого скота в странах СНГ, в частности, в Кыргызстане находится на стадии научных разработок и производственных опытов.

Таким образом, проблема совершенствования диагностики и специфической профилактики пневмоэнтеритов телят, вызываемых . этими инфекционными агентами, является актуальной задачей ветеринарной науки.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является изучение этиологии пневмоэнтеритоа телят и разработка эффективных средств специфической профилактики для обеспечения стойкого эпизоотического благополучия скотоводства в отношении реснираторно-кншсчных инфекций.

Основными задачами наших исследований являлось:

- выяснение распространенности аденовирусной инфекции крупного рогатого скота по зонам республики;

- изучение распространенности хламидиозной, парагриппозной инфекции и инфекционного ринотрахеита;

-г выделение и изучение полевых изолятов аденовирусов, участвующие в формировании вирусных пневмоэнтеритов;

- определение этиологической роли ассоциации вирусов, хламидий и бактериальной флоры в инфекционной патологии пневмоэнтеритов телят;

- изучение антигенных свойств ассоциированной вакцины ка лабо-' рагорных и естественно-восприимчивых животных;

- изучение иммуногенных свойств моно и ассоциированной вакцин;

Научная иовшна работы. В условиях Кыргызской Республики впервые изучена эпизоотическая обстановка по вирусным респираторным болезням молодняка крупного рогатого скота.

Комплексными исследованиями показано, что респираторные заболевания возникают преимущественно в виде смешанных вирусных и бактериальных инфекций. В этиологии респираторных заболеваний телят в хозяйствах ведущую роль играют аденовирусы, возбудители парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидин.

Впервые установлена особенность эпизоотического проявления и распространения респираторных инфекций (ПГ-3, аденовирусы, хламидии, ИРТ), а также выделены и идентифицированы полевые изоляты аденовирусов крупного рогатого скота.

В экспериментальных и полевых условиях изучена антигенная активность и иммуногенность двух образцов ассоциированной вакцины ((адено - хламидии) и (адено + хламидии + пастергллы)) на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

Теоретическая н практическая значимость. Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными фактами теории особенности проявления и распространения респираторно-кишечных инфекций (ПГ-3, аденовирусы, хламидии, ИРТ), вносят определенный вклад в изучение проблемы пневмоэнтерита телят. Доказано участие вирусов ПГ-3, инфекционного ринотрахеита, аденовирусов и хламидии в возникновении респираторно-кишечных заболеваний телят, что важно при проведении специфических профилактических мероприятий.

Рекомендована для ветеринарной практики инактивированная моновалентная вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Отработана оптимальная доза двух образцов инактивирован-ной ассоциированной вакцины для стельных коров, а также для серопозитивных и серонегатнвных животных. Изданы две рекомендации по диагностике и профилактике аденовирусной и хламидиозной инфекций

Научные данные по материалам диссертации используются в учебном процессе на кафедре инфекционных и инвазионных болезней

животных Кыргызской аграрной академии и в вирусологических отделах ветеринарных лабораторий республики.

На защиту выносятся:

- материалы па изучению распространенности аденовирусной, хламнднозной, парагрипнозной инфекций и инфекционного ри-нотрахсита крупного рогатого скота в ряде хозяйств Кыргызской Республики;

- выделение, идентификация и изучение иммунобиологических свойств полевых штаммов аденовирусов крупного рогатого скота;

- результаты изучения антигенной и иммуногенной активности моно- и ассоциированной инактивированной вакцины на лабораторных и естественно-воспрнимчивых животных;

- результаты опыта по изучению межвидовой миграции аденовирусов среди крупного рогатого скота и овец.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научных конференциях Московской ветеринарной академии (1988-1990), IX Всесоюзной научной конференции (1990), межвузовской конференции молодых ученых (Бишкек, 1990), научно-практической конференции Семипалатинского зооветеринарного института (1991), конференции молодых ученых Кыргызского сельскохозяйственного института (1991), Московской научной конференции вирусологов (1992), научно-практической конференции Семипалатинского зооветеринарного института (1994), конференции посвященной 1000-летию Манаса (1995), научной конференции Ал-матинского зооветеринарного института (1996).

Данные экспериментальных исследований вошли в проект нормативно-технической документации по изготовлению и применению препарата.

Публикация - научных исследований. По материалам диссертации опубликованы 19 статей, 2 рекомендации и монография.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на .... страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов я методов, результатов собственных исследований, обсуждения, рекомендаций по использованию научных

выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 46 таблиц, 33 рисунка и 7 фотографий. Список литературы включает 308 источников, в том числе 170 на иностранном языке.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛ Ц МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 1985-1996 г.г. на кафедре инфекционных и инвазионных болезней Кыргызской аграрной академии, лаборатории вирусологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии, лаборатории вирусологии Гийсенского университета Германии, Республиканской ветеринарной лаборатории им. A.A. Волковой.

Для выяснения распространенности аденовирусов, вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-З и хламидий среди крупного рогатого скота были проведены серологические обследования животных в хозяйствах Чуйской, Нарынской и Иссык-кульской областей. Пробы крови для исследования брали от взрослых животных (коров-матерей) и телят. Для выяснения эпизоотической ситуации по этим инфекциям был проведен анализ статистических данных ветеринарного управления республики за последние шесть лет. При обработке и анализе статистических данных, касающихся распространенности болезней животных и особенностей эпизоотической ситуации, использовали методики, описанные в руководстве по общей эпизоотологии (под ред. И.А. Бакулова и А.Д. 'Третьякова, 1979) и методических указаниях ло эпизоотологическому исследованию (И.А. Бакулов и др., 1982).- , ' ' ' '

Для обнаружения антител сыворотки исследовали в РИГА и РН на аденовирусы и инфекционный ринотрахент, в РСК и ИФА на хла-мидии и в РТГА на ПГ-3.

В работе использовали аденовирусы крупного рогатого скота КЛБ, Русь 18/81 и КР-1. При изучении эпизоотологии выбран рчд регионов Кыргызской Республики, где обстановка по ргспираторно-

кишечным болезням крупного рогатого скота, особенно молодняка, считалась наиболее неблагополучной. Хозяйство считали неблагополучным при наличии 20-25 и более процентов положительно реагирующих животных на аденовирусы в РИГА.

В период вспышки заболевания среди телят с поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов у больных животных были взяты парные сыворотки крови с интервалом 10-15 дней. В результате исследования сывороток были определены хозяйства, где в дальнейшем проводились исследования по выделению вирусов. Предпосылкой для проведения работы по выделению аденовируса служили энзоотические вспышки пневмоэнтеритов молодняка в обследованных хозяйствах.

Материалом для выделения вируса служили носовые и глазные смывы, фекалии и кровь от больных телят 1-1,5-месячного возраста. От павших и вынужденно убитых животных брали кусочки лимфатических узлов, легких, слизистых трахеи и носа. Контроль на стерильность проводили путем посева надосадочной жидкости на среды МПА, МПБ, МППБ и Сабуро по общепринятой методике. Приготовленная и проверенная таким образом надосадочная жидкость являлась материалом для заражения культуры клеток тестикул бычка (ТБ) и легких эмбриона коровы (ЛЭК).

Для выделения и изучения свойств выделенных вирусов использовали первично-трипсшшзированную мсшослойную и перевиваемую культуры клеток, которые были приготовлены по общепринятой методике.

Идентификацию выделенных взолятов проводили по следующей схеме: -

1) электронно-микроскопическое; :

2) определение групповой принадлежности аденовирусов s РДП,

РИФ и методом флуорохромирования;

3) определение серотипа вируса в реакции нейтрализации;

4) определение типа нуклеиновой кислоты.

В опытах по изучению культуральных свойств использовали первично-трипсинизированную культуру клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), перевиваемую линию клеток почки эмбриона коровы (МДВК-США и ППЭК-Россия, Т-1, Т-2, Т-4 и ЛЭК).

Культуру клеток, выращенную в пробирках, заражали из расчета 0.223 ТЦД на клетку с адсорбцией вируса в течение 1 часа при 37DC, после чего вносили поддерживающую среду. Инкубирование зараженнойкультуры проводили в роллерном аппарате "Virutor" в течение 7-10 дней, ежедневно оценивая изменения клеток- методом микроскопии.

Для сравнительного изучения терморезистеитности полевого изолята аденовируса крупного рогатого скота использовали культу-ральную вируссодержашую жидкость: Чувствительность вирусов к действию различных температур (4°, 24° , 37°, 56° и 70°С) определяли методом "титрования их инфекционной активности, которую рассчитывали по методу Рида и Менча. Исследование инфекционных свойств вирусов, хранившихся при температуре 4°С, проводили ежемесячно в течение трех месяцев, при температуре 24°С - через 20, 40, 60 и 90 дней, при 37°С - через 20, 40 и 60 дней.

Изучение антигенной активности выделенных полевых изоля-тов аденовируса проводили на белых крысах. Материалом для иммунизации животных служили нативная вируссодержащая жидкость, инактивированный аденовирус и экспериментальная микросерня инактивированиой вакцины, изготовленная из полевого-изолята. Инактивирование вируса проводили димером этиленинимина в 0,1% конечной концентрации при 37 СС в течение 50 часов. Опытные серии вакцин готовили совместно с сотрудниками лаборатории вирусологии Московской государственной академии бетеринарной медицины и биотехнологии Р.В. Белоусовой и др. Образцы инактиви-рованных препаратов были проверены на стерильность, авирулентность и безвредность. -

Животные в опыте были разделены на 16 групп (по 6 крыс в •• каждой). Пять групп крыс прививали нативной вируссодержащей жидкостью (штаммы Bovine-10, Fukuroi, КЛБ, Русь 18/81 и КР-1). Для 6-10 групп применяли образцы инактивированного аденовируса, а для 11-15 групп - инактивированиой вакцины. Препараты вводили крысам по 1,0 мл внутримышечно двукратно с интервалом 28 дней. Крысы 16-й группы были оставлены в качестве контроля, им вводили культуральную жидкость, не содержащую вируса, в тех же объемах.

Для приготовления опытных образцов ассоциированной вакцины использовали инактивированные аденовирусы крупного рогатого скота 1-го н 7-го серотипов (I и II подгруппы) и инактивированную культуру хламидий, полученную по методу сотрудников ВИЭВ (Ю.Д. Караваев и И.А. Калугина). В качестве адьюванта применяли аэросил (в 2% конечной концентрации).

Антигенные свойства ассоциированной вакцины в отношении аденовирусов и хламидий испытывали на белых крысах. Различные образцы вакцины вводили -животным внутримышечно с интервалом 14 дней, двукратно. По истечении 14-и дней после второго введения препарата проводили полное обескровливание животных с целью получения от них сывороток, которые исследовали в реакциях нейтрализации (РН) и непрямой гемагглютинации (РНГА).

Для этой цели'белых крыс разделили на 4 группы. Крысам 1-ой и 2-ой групп вводили ассоциированную вакцину, содержащую 0,3 и 0,5 мл хламидинного компонента по 1,3 и 1,5 мл соответственно. Животным 3-й группы вводили моновакцину, содержащую только аденовирусный компонент в дозе 1 мл, а крысы 4-й группы служили контролем - им вводили культуральную жидкость.

Антигенную активность инактивированной ассоциированной вакцины изучали на стельных коровах и их потомстве в АО "Достук"

т

Кантского района, СК "Алга" Аламединского района, "Жаны Пахта" Сокулукского района и с-'зе "Тельман" Панфиловского района.

Животных содержали в типовом помещении для сухостойных коров. Об антигенной активности препарата судили по уроЪню алти-тея в крови и молозиве животных, который выявляла с помощью реакции нейтрализации, непрямой гемагглютннации и связывания комплемента. У всех коров перед вакцинацией исследовали сыворотки крови для определения исходного уровня вируснейтрализующих антител и антител, выявляемых в РНГА. и РСК. Коров 1-ой и 2-ой' групп прививали инактивированной вакциной непосредственно на ферме, подкожно в подгрудок в дозах 5 и 10 мл и ревакцинацию проводили в тех же дозах. После каждой прививки за животными пели клинические наблюдения. От всех короа исследовали пробы молозива и молока в день их отела, далее через 3 и 7 дней после него.

Для испытания образцов ассоциированной вакцины на телятах использовали животных в возрасте от 1,5 до 2-х месяцев местной породы. До начала опыта телята обследовались клинически в течение одной недели. Перед вакцинацией у телят исследовали сыворотку крови для определения исходного уровня специфических антител к аденовирусам (в РНГА) и к хламидиям (в РСК). Вакцинацию проводили внутримышечно, двукратно с интервалом 30 дней. Антигенную активность образцов вакцин определяли по титру антител в сыворотках крови телят к аденовирусам в реакции непрямой гемагглю-тинации и связывания комплемента к хламидиям через месяц после первого введения препарата и далее ежемесячно до шести месяцев.

Антигенные свойства экспериментальной серии инактивирован-ной ассоциированной вакцины против аденоинфекции, хламидиоза и пастереллеза крупного рогатого скота изучали на стельных коровах и их потомстве.

Перед вакцинацией у всех коров предварительно исследовали сыворотки крови для определения исходного уровня специфических антител. Коров первой группы прививали инактивнрованной ассоциированной вакциной непосредственно на ферме, подкожно, в подгрудок в дозе 5,0 мл и ревакцинировалй тем же методом и в том же объеме, вторая группа служила контролем.

Телята, полученные от вакцинированных и невакиинированных коров, были разделены на 4 группы: рожденные от вакцинированных на 7-ом месяце стельности коров составляли ¡-ю и 3-ю группы; от контрольных коров - 2-ю и 4-ю группы. Всех новорожденных телят до 10-ти дневного возраста содержали в индивидуальных клетках, затем переводили в телятник. Телята 1-й и 2-й групп были привиты инактивнрованной ассоциированной вакциной против аденоинфекции, хламидиоза и пастереллеза в дозе 5,0 мл, а телята 3-й и 4-й групп служили контролем.

Во втором опыте использовали 30 телят, которые 3<ыли разделены на 3 группы по принципу аналогов: 1-я группа - 10 голо'в в возрасте 10-15 дней, 2-я - 10 голов в возрасте 45-50 дней и 3-я гру'ййа - 10 голов.

Животных 1-ой и 2-ой групп двукратно прививали инактивиро-ванной ассоциированной вакциной е интервалом дней. Вакцину

вводили подкожно, в подгрудок в дозе по 5,0 мл на одну инъекцию. Телят 3-й группы не вакцинировали.

Для изучения иммуиогенных свойств моно- и ассоциированной вакцин было образовано 5 групп телят. Телят 1-й группы прививали, согласно Временному наставлению по применению инактивирован-ной вакцины против аденоинфскции крупного рогатого скота (от 11.04.86 г. N 13-3.5), двукратно в дозе по 10 мл на инъекцию. Для определения 50%-ной защитной дозы препарата телят 2-й, 3-й и 4-й групп прививали двукратно в дозе по 5,0 мл, 2,5. мл и 1,25 мл на инъекцию соответственно. Телят 5-й группы не вакцинировали (контроль). Животных всех групп иммунизировали подкожно в области подгрудка и ревакцинацию проводили тем же методом, в той же дозе через 30 дней.

Вакцина. Экспериментальная серия вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота изготовлена Покровским биокомбинатом.

Вирус. Для контрольного заражения были использованы аденовирусы крупного рогатого скота 1-го и 7-го серотипов с титром Ю3 0 -Ю6,0 ТЦД3о/ил. Животных брали серонегативных по отношению .к аденовирусам.

Опыт по экспериментальному заражению телят был поставлен на 15 телятах алатауской породы 2-2,5 месячного возраста с использованием двух штаммов аденовируса крупного рогатого скота КЛБ н Русь 18/81. Телят разделяли по принципу аналогов на 5 групп: животных 1-й - 4-й групп вакцинировали в различных дозах, а телят 5-й группы не прививали (контроль).

Заражение проводили вышеуказанными изолятами, прошедшими 10 пассажей в культуре клеток ТБ, в дозе 4x105,00 ТЦД5!)/МЛ . Вирус в виде вируссодержащей культуральной жидкости вводили различными методами, согласно схеме. После заражения в течение 15 дней за всеми животными вели клиническое наблюдение (двукратная термометрия, осмотр ротовой полости, носовых ходов).

Для вирусовыделения от всех животных как контрольных, так и вакцинированных, брали смывы со слизистой носа и дефибриниро-ванную кровь. Изучали титр антител в динамике перед заражением, затем на 5-й, 10-й и 14-й дни после заражения. Сыворотку получали

методом отстоя. Реакцию нейтрализации ставили общепринятым методом, используя двукратное разведение сывороток с постоянной дозой вируса (100 ТЦД5о/Мд). Идентификацию штаммов, выделенных от экспериментально зараженных животных, проводили с помощью реакции нейтрализации в культуре клеток.

Иммуногенную активность экспериментального образца вакцины проводили на телятах путем прямого заражения животных через 75, 120 и 190 дней после второй вакцинации (экспериментальное заражение проведено на базе Бел. НИВИ).

В качестве заражающего материала использовали: 1. Аденовирусы первой и второй полгруппы с титром не ниже 5,5 ТДЦя),,,,.' Заражение проводили двукратно с интервалом в 24 часа, интроназальио и на следующий день интратрахеально. За телятами вели наблюдение в течение 25-28 дней. При оценке защитных свойств вакцины учитывали:

- клиническую реакцию вакцинированных и контрольных животных;

- выделение вируса из смывов со слизистой оболочки носа, прямой кишки, конъюнктивы;

- из проб дефиориниропанной крови, взятых перед заражением и на 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30 дни после заражения.

2 Взвесь штамма Р. МиИоас1а 736 " (сер. А) с концентрацией 1.5x10^ м.к'мл вводили интратр^^льно, трехкрат)|р с интервалом в I день в суммарной дозе 30 мл. За животными вели клинические наблюдения в течение 10 дней. При оценке защитныхсвойств вак-'цины учитывали следующие показатели:

- клиническую реакцию у вакцинированных и контрольных животных;

- проявление патологоанатомически\ изменений в легких;

- результаты реизоляции пастерелл из легких у вакцинированных и-контрольных животных.

Заражение телят штаммом Р. Ми1Юс!с1а 216 (тип В) проводили внутримышечно в дозе 10 ЛД50 (дозу предварительно подтитровыва-ли). Результаты учитывали по выживаемости вакцинированных. и контрольных телят.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

РАСПРОСТРАНЕНИЕ »»ПРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРЛХЕНТА, ПАРАГРИНПА-З, АДЕНОВИРУСОВ И ХЛАМИДИП В ХОЗЯЙСТВАХ КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

Анализ данных ветеринарной отчетности по респирг. горно-кишечным болезням молодняка крупного рогатого скота в хозяйствах республики

I

Анализ эпизоотологической обстановки по данным ветеринарной отчетности показал, что в различных зонах республики заболеваемость и смертность молодняка крупного рогатого скота остается значительно высокой. Причем уровень падежа и вынужденного убоя телят от заболеваний органов дыхания очень высок и имеет тенденцию к увеличению. В результате проведенных нами эпизоо-тологических исследований (1989-1996 гг.) было установлено, что в хозяйствах Чуйской долины в респираторно-кишечной патологии молодняка ведущую роль «грают аденовирусы, вирусы парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита. По данным лабораторных исследований аденовирусная инфекция регистрировалась в течение шести лет с небольшими колебаниями в процентах, причем процент серопозитив-ных проб составлял от 44 до 60-ти в различных зонах Чуйской долины, в основном в осенне-весенние периоды года (фев{К1Ль-март). По нашим наблюдениям в феврале-марте главным образом болеет молодняк до 1 года, а также телята текущего года рождения, и в связи с этим количество больных животных достигает максимального уровня.

' Лабораторные исследования на парзгриппозвую инфекцию позволили выявить значительную распространенность ее в обследованных хозяйствах. Всего с 1989 по 1994 годы обследовано 179 голов крупного рогатого скота, из них серопознтивными оказались 140 голов, что составляет 78,2% от общего количества.

Из анатиза данных ветеринарной отчетности было установлено, что в хозяйствах Чуйской долины £о.™ьшое место в респираторно-

кишечной патологии телят занимает инфекционный ринотрахеит, который был зарегистрирован в 38 хозяйствах.

Кроме того, было установлено, что падеж животных от инфекционных заболеваний по годам варьировался от 6,5% до 30%. Причем, наибольший процент падежа и вынужденного убоя среди молодняка приходится на болезни органов дыхания и пищеварения. Наряду с этим следует также отметить, что в некоторых хозяйствах имеет место значительное количество абортированных и мертворожденных телят невыясненной этиологии Эти факты дают нам основание предположить, что в патологии желудочно-кишечных заболеваний молодняка участвуют вирусные агенты и хламидии.

Таким образом, анализ данных ветеринаркой отчетности и результатов лабораторных исследований свидетельствуют о циркуляции аденовирусов, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита среди крупного рогатого скота в обследованных хозяйствах. Вероятно, ведущей причиной отхода молодняка являются респираторные и желудочно-кишечные заболевания, которые имеют вирусную природу.

Результаты серологического я клинического исследовании крупного и мелкого рогатого скота на аденовирусную инфекцию

В результате серологических исследований нам удалось выяснить довольно широкое распространение аденовирусной инфекции в обследованных хозяйствах. В отдельных хозяйствах число серопозн-тивных животных достигало до 100%. Из 4262 исследованных проб сывороток крови диагностические титры к аденовирусам обнаружены в 2092 пробах, относящихся к I подгруппе и 2326 - к II подгруппе, . соответственно 49,1% и 54,6% от общего количества обследованных животных.

Антитела к аденовирусам крупного рогатого скота были выявлены практически во всех обследованных нами хозяйствах как ' у взрослых животных, так н у молодняка (табл. 1).

При клиническом осмотре взрослого поголовья признаки заболевания не регистрировали.

Количество и процент серопозитивных животных, несмотр* на широту распространения аденоинфекции, в разных хозяйствах колебались от .7 до 100%. В серологических исследованиях процент обнаруженных антител I подгруппы колебался от 15 до 100%; а II подгруппы - от 15,7 до 100%. При этом титры антител I подгруппы были 1:64 и 1:128 и выше в 20% случаев; II подгруппы - 18% серопозитивных проб. При сопоставлении результатов выявления серопозитивных животных по районам наибольший процент наблюдали *

в хозяйствах Панфиловского и Кантского районов. При этом в хозяйствах этих районов доминировали антитела II подгруппы. Преобладание антител II подгруппы наблюдалось также в хозяйствах Аламединского, Калининского и Сокулукского районов. В хозяйствах Московского района процент серопозитивных животных к обеим подгруппам вируса был примерно одинаков.

Таблица 1

Результаты исследований крупного рогатого скота _в хозяйствах республики на аденовирусы_

№ Наименование: Наименование Кол-во Кал-Б0 Кил-го к процент 0ф0ш»ти».ыхж>1штьк

о&всти района обслсюв часлежт 1 подгрта П подгруппа

яоэийст в проб Кол-во % Кол-во %

1 Ч^йсквс Панфизовсогй 3 79 34 43 74 93,5

Мазовский 6 258 143 ' 57 175 68

Дааияашй, 3 90 55 61 65 72

Аявйсойквш 7 346 173 50 223 69

Соку.ргксыш . 5 341 175 -61 199 5&

Катшй 4 382 209 .55 255 67

йгого по области: 28 1496 794 53 992 66,3 1

2 Иссык-Кудъсгая Ак-С»йсня1 7 ¡056 444- 43 5Св 43

Тюгсжяй 3 228 «8 36 ¡30 57 1

Жегы-Огузаши 5 260 90 35 124 49 |

Итого по области: 13 1544- 622 40.3 762 49 :

! з Нзрьгнекая Тянь-Шаньашй 5 341 110 32 75 22 !

п Ак-'Гашнский 3 76Х 515 68 452 ■ 52 |

Ах-Баипй!сг;й 2 119 * 43 45 39 |

Итого по области: 1 ю ¡222 676 55 572 49 !

ВСЕГО ПО РЕСПУБЛИКЕ: 51 4262 2092 49 2326 54,6 1

При обследовании крупного рогатого скота в хозяйствах Нарын-скон области титр антител 1:128 и выше наблюдался в 44% случаев. Антитела выявлялись к вирусам обеих подгрупп. Наибольший процент положительно реагирующих животных обнаружен среди телят, поступающих из хозяйств Ак-Тал«нского района. Диагностические исследования в комплексе "Пионер" были проведены в 1986-1992 г.г. За этот период было исследовано 54 пробы, из них внруснейтрали-зуюшие антитела выявлены в 59.7% случаях, а в РНГА - у 80% животных.

Как видно из приведенной выше таблицы чаще всего сыворотки содержали антитела второй антигенной подгруппы, что следует учитывать при создании средств специфической профилактики. При этом антитела к аденовирусам были обнаружены во всех обследованных нами хозяйствах (51)

В Иссык-Кульской области исследовали на аденовирусы пробы сывороток крови от животных в возрасте от 15 дней до 6-8 лет. В итоге было установлено наличие антител в сыворотке крови у 41% животных. Всего по области исследовано 1544 пробы сывороток крови. В совхозах "Иссык-Куль", "Дзержинский", "Заря Коммунизма" процент серопозитивных животных был высоким как среди взрослых животных,так и среди молодняка

Выше указывалось, что во всех обследованных хозяйствах выявлены антитела в разных титрах. Как известно, наличие антител в одноразовых пробах сывороток крови не дает полного основания считать хозяйства неблагополучными в отношении аденоинфекции. Поэтому для выяснения циркуляции вирусов среди телят и участия данной инфекции во вспышках пневмоэнтеритов- мы провели серологическое исследование проб парных сывороток в реакциях нейтрализации и непрямой гемагглютинаиии. Сыворотки брали в хозяйствах Иссык-Кульской, Нарынской и Чуйской областей, неблагополучных по респираторным заболеваниям.

Сравнительные результаты титров антител в пробах крови 1-го и 2-го взятия оказались весьма контрастными. Для изучения динамики возрастания антител в крови животных, зараженных аденовирусами, наблюдение вели в двух хозяйствах (Алга, Достук) в течение трех месяцев. Пробы быля взяты от больных телят 4 раза': 1-ое взятке - в

момент заболевания, 2-ое взятие - через 15 дней после заболевания, 3-е взятие - через один месяц после заболевания и 4-ое взятие - через три месяца после заболевания, когда клинических проявлений болезни уже не наблюдалось.

В результате серологических исследований в РНГА установлено, что при первом взятии крови титр антител колебался от 1:4 до 1:16. При втором взятии он достигал от 1:64 до 1:128 и при третьем и четвертом взятии титры антител оставались стабильными.

Кроме того, были изучены сравнительные данные по распределению антител среди возрастных групп скота в хозяйствах республики. При этом наибольший процент серопозитивных проб установлен у взрослых короа, наименьший - у телят до 4-х месяцев. У животных в возрасте от 5-6 до 8 месяцев антитела к аденовирусу выявлялись в титрах 1:8 и выше (44%).

Таким образом, результаты серологических исследований показали, что аденовирусная инфекция крупного рогатого скота имеет довольно широкое распространение в хозяйствах республики. Сыворотки крови содержали гуморальные вируснейтрализующие антитела как к аденовирусам I подгруппы, так и II подгруппы.

Мегквпдоная -тиранив аденовирусов среди крупного рогатого скота и овец

Аденовирусная инфекция широко распространена не только среди крупного рогатого скота, но и среди овец. По данным Мурза-лиева И. (1989) в овцеводческих хозяйствах республики получила широкое распространение аденовирусная инфекция среди овец. В результате серологических исследований были выявлены антитела к аденовирусной инфекции в 44-х хозяйствах двадцати районов республики. Наиболее неблагополучными по аденовирусной инфекции овец являются хозяйства Калининского, Панфиловского, Московского, Аламединского н Кантского районов. Соответственно в этих районах количество серопозитивных животных среди крупного рогатого скота достигало 50-66%, 43-93%, 36-59%, 43-69%, 44-56%.

В республике в настоящее время содержится более 400 тысяч голов крупного рогатого скота, которые постоянно контактируют с овцепоголовьем в хозяйствах, на трассах перегона и пастбищах. Поэтому для нас представлял интерес установить пути передачи в распространении аденовирусной инфекции. Задача наших исследований заключалась в проведении клинических наблюдений за ягнятами и телятами в условиях тесного контакта ягнят с коровами, а телят с овцематками и их приплодом.

В период наблюдения у подопытных ягнят на 12-й день появлялось незначительнее слезотечение и чихание, на 14-15 дни клинические признаки усиливались, кашель становился более выраженным, слизистые истечения из иоса и слезотечение увеличивалось, пульс и дыхание были учащенными. Общее состояние организма было вялое, животные постепенно теряли упитанность, температура тела ягнят попыталась от обычной нормы на 0,4-0,6° С. У телят, находившихся в кошаре среди овец и ягнят, клинических изменений не наблюдали, но к концу эксперимента у них появилось незначительное слезотечение и истечение из носа. В сыворотке крови ягнят антитела против аденовирусов на 5-Л день были в титре 1-2 log;, на 12-й день -

3 log: " к концу эксперимента, на 18-20 дни их уровень составил

4 log;. Но по-иному выявлялись антитела у телят Их уровень на 10-й день составил !-2 log2, на 15-й день - 4 log; и на 20-й день антитела выявлялись стабильно в значениях 4-5 log;.

В результате эксперимента выявлена обоюдная патогенность аденовирусов крупного и мелкого рогатого скота. На основании этих исследований мы считаем, что ягнята и телята могут быть взаимно инфицированы близкородственными аденовирусами.

Таким образом, по итогам проведенных серологических иссле-• дований сывороток крови овец и крупного рогатого скота, а также после полевого межвидового эпизоотологического наблюдения было установлено, что аденовирусная инфекция имеет достаточно широкое распространение между этими видами животных в хозяйствах республики. Клиническое проявление инфекции у ягнят и телят может наблюдаться в любое время года и зависит от эпизоотической ситуации по этой инфекции в хозяйствах.

Появление аденовирусных антител, которые выявляются на фоне клинически выраженных респираторных и желудочно-кишечных заболеваний телят после исчезчовения у них молозивного иммунитета, говорит о непосредственном участии вирусов в патологии инфекционного процесса.

Результаты серологического исследования жипотных на хламидии, парагршш-З и инфекционный ринотрахеит в хозяйствах республики

В ходе наших исследований было выяснено, что в ряде хозяйств нашей республики имеют место широкое распространение респира-торно-кишечные заболевания телят, иногда с большим отходом, достигающим до 30-60%. Как правило, при исследовании материала от павших телят на бактериальную инфекцию диагноз не всегда подтверждался. Клинически заболевание характеризовалось острым течением, поражением органов дыхания, пищеварения и конъюнктивитом. Совокупность вышеприведенных данных не оставляет сомнений в том, что этиологический фактор рсспираторно-кишечных заболеваний телят имеет'инфекционную природу.

Мы предполагали наличие смешанной инфекции, в частности аденовирусной, хламидиозной, респираторно-сиицитиальной, пара-гриппозной и инфекционного ринотрахеита в обследованных хозяйствах. «

При серологических исследованиях были обнаружены антитела в пределах от 9 до 56% к хламид»ям в РСК, от 14 до 63% в ИФА, от 23 до 68% к парагриппу-3 в РТГА, от 8 до 58% к инфекционному ри-нотрахеиту в РИГА.

.Как говорилось выше, наличие титра антител в одноразовых пробах сывороток не дает основания считать хозяйства неблагополучными в отношении исследуемой инфекции. Поэтому ' для

г*

выяснения их этиологической роли и участия в возникновении пнев-моэнтеритов телят нами проведены серологические исследования парных сывороток. При сравнении результатов титров антител 1-го и 2-го взятий наблюдалась значительная контрастность. Так, титр ан-

тител к хламидчям в АО "Доступ" возрастал от 2,5 Iog2 (1-ое взятие) до 4,5 log: (2-ое взятие), к парагриппу - от 2,5 до 5,8 log?, к инфекционному ринотрахеиту - от 3 до 7 log; в РНГА. Такая же картина наблюдалась и в других обследованных хозяйствах ("Алга",* "Жаны Пахта", "Тельмана"). Это указывает на широкую циркуляцию в обследованных хозяйствах вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий.

Таким образом, данные, полученные в результате серологических исследований парных сывороток, позволяют полагать о распространенности среди животных хламидиозной, парагриппозной инфекции и инфекционного рикотрагеита, а также судить об их этиологической роли в респирзторно-кишечных заболеваниях телят, в частности, пневмоэнтеритах.

Анализ статистических данных лабораторных исследований, ветеринарной отчетности, а также результаты наших исследований свидетельствуют о широкой распространенности в хозяйствах нашей республики аденовирусов, вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, хламидий и пастерелл.

ВЫДЕЛЕНИЕ АДЕНОВИРУСОВ, ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

3.2Л. Выделение полевых нзолитов аденовирусов крупного рогатого скота в условиях естественного течения инфекции

Острые вспышки пневмоэнтеритов у телят в обследуемых хозяйствах (АО "Достук", СК "Алга", "Жаны-Пахта") регистрировали на " протяжении ряда лет поздней осенью, зимой и весной. Телята болели в возрасте от 20 дней до 1,5 месяцев и, как правило, заболевали через 5-7 дней после завоза их в хозяйство. Болезнь характеризовалась повышением температуры тела до 40-41,5°С, угнетением общего состояния, кашлем, затрудненным дыханием и потерей аппетита. У некоторых животных наблюдали истечение из носа катарального характера, слезотечение, диарею. Болезнь, как правило, протекала

остро и продолжалась в пределах 3-4 дней, в течение которых наблюдался наибольший отход телят. Оставшиеся телята внешне казались здоровыми, но через 7-10 дней у них наступало обострение болезни, затем ее угасание и появлений вновь. Итак, у многих животных такая рецидивирующая клиническая форма проявлялась однотипно. Переболевшие животные отставали в росте, развитии и теряли живую массу.

При патологоанатомическом вскрытии телят отмечали гиперплазию бронхиальных и средостенных лимфатических узлов, скопление пенистой жидкости в трахее и бронхах. Легкие содержали очаги уплотнения лобарного характера, на разрезе были сочные, с поверхности ра!рсза стекала мутная жидкость. При исследовании парных сывороток крови телят в период заболевания и реконвадес-ценции установлена аденовирусная инфекция как в моноинфекции, так и в ассоциации с па{ гриппозной и респираторно-синтициальными инфекциями и хламидиозами.

Для лабораторных исследований был взят патологический .материал от больных (50), павших (5), вынужденно убитых (5) теля г.

Вирусы удалось выделить из носовых, глазных, ректальных смывов и крови от больных животных, а также из слизистой носовой перегородки, легких, трахеи, лимфатических узлов, взятых от вынужденно убитых телят. Наибольший процент выделения цитопатогенных агентов наблюдался в носовых смывах (до 50%), а наименьший в фекалиях (до 10%).

Характер цитопатических изменений в зараженной культуре клеток, вызванных выделенными изолятами, был сходен с изменениями, которые наблюдаются после заражения культур клеток эталонным аденовирусом. По краям монослоя наблюдалась дегенерация клеток, которая характеризовалась единичными скоплениями округлившихся клеток по всему монослою. Цитоплазма становилась зернистой, клетки укрупнялись и затем группировались в виде гроздьев винограда. Одни изоляты оказывали цитопатогенное действие во втором пассаже, другие - в 3-4-м пассажах.

Инднкаипя полевого изолята аденовирусов крупного рогатого скота морфологическими и мол скул ярио-бнол отчески мн методами

Наличие цитопатических изменений в культуре клеток является недостаточным для доказательства типа вируса, поэтому нами проводилась работа по его идентификации.

Полученные изоляты были идентифицированы по следующей схеме:

а) электронно-микроскопическое исследование выделенных изолятов;

б) определение групповой принадлежности в РДП, РИФ и методом флуорохромирования.

Электронно-микроскопическое изучение показало, что выделенные полевые изоляты имели икосаедрическую симметрию, диаметр составлял 75-S0 им., капсид состоял из 252 капсомеров, т. е. имели морфологию, характерную для аденовирусов.

При определении групповой принадлежности выделенных изолятов методом люминисцентной микроскопии путем флуорохромирования акридином оранжевым нам удалось обнаружить, что через 48-74 часов после инфицирования формировались включения светло-зеленого цвета, характерные как для аденовирусов I подгруппы, так и для аденовирусов II подгруппы. Для подтверждения полученных данных нами были проведены исследования вирусов-нзолятов в РИФ.

При окрашивании зараженных клеток флуоресцирующей сывороткой 1-й подгруппы через 2-3 суток после их инфицирования можно было обнаружить единичные клетки с внутриядерным свечением. В препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой II-й подгруппы, наблюдалось скопление нескольких клеток (3-4). с характерным ядерным свечением. В результате анализа проведенных исследований можно судить о наличии аденовирусов 1-й и II-й подгрупп в выделенных изолятах. В контроле свечений не наблюдали.

На основании полученных результатов можно предположить, что вирусы-изоляты, выделенные от больных животных, в своей популяции содержат аденовирусы 1-й и II-й подгрупп, и при их

пассировании в культуре клеток количество аденовирусов I подгруппы в популяции увеличивается. Об этом можно было судить по резкому увеличению числа клеток, в ядрах которых формировались включения, характерные для аденовирусов I подгруппы.

Серологическая идентификация полевого изолята в реакциях диффузионной преципитации и нейтрализации

Исследования по типированию изолятов в РДП показали, что выделенные нзоляты давали четкие линии преципитации с сыворотками 1-й и Н-н подгрупп аденовируса крупного рогатого скота. По результатам РИО и РДП можно судить о наличии аденовирусов 1-й и И-й подгрупп в выделенных изолятах.

Для серотипировакия выделенных изолятов в реакции нейтрализации были использованы эталонные сыворотки к 1, 2, 3, 5, 7 и 8 типам аденовирусов крупного рогатого скота. Изолят КР1, выделенный в результате серологических, кссдедованай, был идентичен аденовирусу 3-го серотипа. При этом индекс нейтрализации с сывороткой 1-го типа - 0 ig, 2-го - 0 ig, 3-го - 5,1 lg, 5-го - 0,5 !g, 7-го - 1,0 lg, 8-го - 0 lg. Эти данные позволяют отнести выделенный изолят к 3-му серотипу аденовирусов крупного рогатого скота.

Сравнительная терморезастса мюгть полевых изолятов

' Результаты сравнительного изучения инфекционной активности выделенных нами полевых изолятов аденовируса крупного рогатого скота после воздействия на них различных температурных режимов были весьма различными. Инфекционность штамма КЛБ (1-й серо-тип), при 4°С оставалась без изменений в течение трех месяцев хранения (срок наблюдения). Изоляты Русь 18/81 и КР-1 снизили" свою инфекционную активность на 0,5 lg через три месяца хранения.

При температуре 24° С в течение 60 дней происходило постепенное снижение титров всех исследуемы* вирусов на 1,0-2,1 lg. К 90-му дню инфекционная активность изолята КЛБ уменьшилась на 4.0 lg, а изолятов КР1 и Русь 18/81 - на 3.5 lg.

При 37°С наблюдали постепенное снижение титра исследованных изолятов. Так, изолят КЛБ, спустя 60 дней (срок наблюдения), имел активность 3,5 lg, другие изоляты - КР1 и Русь IS/81 - резко снижали свою инфекционную активность (на 3,0-3,5 lg) и через 60 дней их титр не превышал 1,5 lg. При действии более высокими температурами на изоляты аденовируса крупного рогатого скота установлено, что инфекционный титр изолята КЛБ через 60 минут при 56°С соответствовал 3,5 lg, через 90 минут - 2,5 lg, а через 120 минут происходила полная потеря инфекционной активности. Аналогично вели себя и другие изучаемые изоляты. Температура 70°С на изолят КЛБ оказала губительное действие через 45 минут, а на изоляты Русь 18^81 и КР1 через 30 минут.

Таким образом, путем воздействия на изоляты различными температурами (37°, 56° и 70°С) была установлена высокая терморезистентность свежевыделенных изолятов.

Культуралышс свойства толнгоз аденовируса

Проявление ЦПД изолятов КЛБ, Русь 18/81 и КР1 в первичной культуре клеток ТБ наблюдали через 72-96 часов. Для полной деструкции клеточного монослоя эталонными штаммами аденовирусов требовалось 7-9 дней. Ни один из изучаемых вирусов не репродуцировался в первично-трипсинизированной - культуре клеток ПЭК. Перевиваемая линия клеток Т-1 оказалась чувствительной к штамму Bovine-Ю (1-го серотипа) и изоляту КЛБ. Цитопатическнй эффект наблюдали в первом пассаже (появление на монослое круглых клеток, собирание пораженных клеток в' конгломераты, напоминающие "гроздья винограда" и последующее отторжение их от стекла).

Полевой изолят КР1, в отличие от эталонных штаммов, уже с первого пассажа вызывал характерные для аденовирусов цитопа-тические изменения в культуре клеток. Оя хорошо репродуцировался в перевиваемой культуре клеток Т-1, в которой титр достигал 5,5 lg ТЦД so/« •

Таким образом, полученные данные по изучению и подбору перевиваемых линий клеток для аденовирусов крупного рогатого скота

(некоторым эталонным шта.ммам и полевым изолятам) показали неоднозначные результаты. Так, штамм Bovine-10 и изолят КЛБ репродуцировались в первом пассаже ка МДВК, с низким титром репродуцировались в культуре Т-1 и более интенсивно в перевиваемой культуре клеток ППЭК и ЛЭК. Свежевыделенные изоляты КР1 и Русь 18/81 хорошо репродуцировались в перевиваемой культуре клеток Т-1, МДВК, ЛЭК (табл. 2).

Проведенные в последующем исследования зараженных аденовирусами перечисленных культур клеток методом окраски акридиновым оранжевым дали несколько отличные результаты от полученных при титровании по ЦПЭ. Большое количество инфицированных клеток с центроядерным включением отмечали в клетках культуры Т1, зараженных изолятом КЛБ. В то же время, в перевиваемой культуре клеток Т1, инфицированной полевыми изоля-тами Русь 18/81 и КР1, включений не было обнаружено. На перевиваемой культуре МДВК только одни изолят Русь 18/81 индуцировал единичные инфицированные клетки с мелкими включениями в ядрах. Более чувствительной оказалась перевиваемая линия клетки Т1. Так, большинство клеток, зараженных изолятом КЛБ, были на различных стадиях формирования включений: в ядрах мелкие гранулы; в ядрах центроядерное включение. Изолят KPI включений не формировал, в то же время изолят Русь 18/81 инфицировал клетки ППЭК, ядра этих клеток были увеличены н нафаршированы мелкими и крупными зелеными гранулами. Множественная ннфицированность клеток была отмечена также в перевиваемой культуре клеток Т1 при заражении изолята.ми Русь 18/81 и КР1. Включения в ядрах были двух видов: мелкие густо расположенные зеленые гранулы или крупные в центре ядра. Клетки этой культуры, зараженной изолятом КЛБ, в отдельных ядрах имели единичные крупные включения.

В итоге было установлено, что из перевиваемых клеток только клетки Т1 оказались чувствительными к аденовирусам как 1-й, так и II-8 подгрупп. Все изоляты более активно размножались в культуре клеток Т1, ЦПД проявлялось на 2-3 дня раньше чем у эталонных штаммов, а инфекционный титр стабильно удерживался в пределах 5,0-6,5 lg ТЦД 50/ыл.

Таблица 2

Инфекционный титр аденовирусов крупного рогатого скота при культивировании их в различных культурах клеток (ТЦД 50/мл)

Аити- Культура клеток

Штамм геннаа Первичная Перевиваемая

группа ТБ TR ПМ- 80 мдвк ппэк Т-! Т-2 Т-4

В-10 4,0 4,0 4,5 4,5 4,0 6,0 4,5 -

КЛБ I 5,25 5,0 5,5 5,5 5,5 6,5 5,0

КР-1 5,0 5,1 5,25 5,20 5ч0 6,1 5,0 -

Fukuroi II 3,75 0 0 0 0 5,0 0 3,0

Русь 18/81 5,5 0 0 0 0 7.0 0 5,5

Таким образом, нами впервые была подобрана единая перевиваемая линия клеток /Т1/, чувствительная для аденовирусов I и II подгрупп крупного рогатого скота. Опытные образцы инактивиро-ванного препарата, изготовленные с использованием этой культуры клеток, при испытании на белых крысах оказались антигенными /титр антител в РН через 14 дней после ревакцинации составлял 7,08,0 1о§з/. На основании указанных данных мы рекомендовали перевиваемую линию клеток Т1 для биофабричного производства вакцины и днагностикумов.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ АДЕНОВИРУСНОЙ И ХЛАМИДИО'ШОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

4.2.1. Исвытанн« вакцины на лабораторных животных

Антигенные свойства ассоциированной вакцины изучали на лабораторных животных. С этой целью мы использовали белых крыс, поскольку это наиболее реактивные в иммунологическом отношении аивотные. На них успешно изучалась антигенная активность инакти-зированной вакцины против аденовирусной инфекции, (Литвинов O.E., Белоусова Р.В., 1985; Нургазиев Р.3., 1988). Сыворотки, полу-

ченные от белыл крыс, как правило, были высокоактивиыми, титр антител в РН и РИГА достигая 7,2-12,5 logj, соответственно.

Сравнительное изучение антигенной активности двух образцов вакцин против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, содержащих различные соотношения аденовирусов 1-й и 11-й подгрупп (0,5:3 и 1:1 соответственно),.показало, что образец препарата, содержащий вирусный антиген.'аденовируса 1-й подгруппы в два раза меньше, обладал достаточно высокой антигенной активностью к обеим подгруппам аденовирусов. Видимо, это связано с иммунобиологическими особенностями вируса.

При изучении антигенной активности двух образцов ассоциированной вакцины против аденовирусной инфекции и хламидиоза крупного рогатого скота, которые различались по содержанию аденовирусов и хламидий, было установлено, что наличие хламидийного компонента не снижало антигенной активности аденовирусного антигена. В сравнительном аспекте антигенная активность образцов вакцины, которые отличались как соотношением входящих в них компонентов, так и дозой препарата, вводимого белым крысам, практически мало отличалась (7,3 log: и log; в РН).

При хранении образцов вакцины в течение 24-х месяцев при температуре 4-6°С антигенная активность их снижалась незначительно (на 0,8-1 log;). Результаты серологических исследований сывороток подопытных крыс в двух реакциях (РН и РИГА) показали, что образцы вакцин, как моновакцины, так и ассоциированной вакцины, были активны при данном режиме хранения в течение двух лет. "Полученные результаты позволили продолжить работы по изучению антигенной активности образцов вакцин на естественно восприимчивых животных.

Испытание вакцины на стельных коровах

В предыдущих исследованиях, проведенных совместно с сотрудниками лаборатории вирусологии МГАВМиБ по испытанию инактивированной моновакцины против аденовирусной инфекции на гдубокостедьыых короках. было установлено, что наивысшего уровня

вяруснейтралйзующие антитела достигают через: 28-30 дней после двукратного введения данного препарата, Однако, несмотря на эти ценные практические результаты испытания вакцины, некоторые вопросы оставались мало изученными. Поэтому в наших исследованиях мы пытались шире решить эти вопросы, испытывая ассоциированную вакцину против аденовирусов и хламидий на стельных коровах.

В неблагополучных по аленоинфекшш и хламиднозу хозяйствах мы прививали коров ассоциированной вакциной за 55-60 дней до предполагаемого отела и ревакцинацию проводили через 30 дней в дозах 10 и 5 мл соответственно для животных 1-й и 2-й групп. Одновременно сравнивали уровень гуморальных антител у вакцинированных животных з зависимости от дозы препарата.

В итоге проведенных исследований нами была показана полная безвредность и высокая антигенная активность испытуемого препарата для глубокостельных короа ко дню отела, который обеспечивал образование антител з высоких титрах как в сыворотке крови (5,546,4 1од2 з РН; 6,88-8,08 в-РНГА; 5-6 1ог2 в РСК), так и в молозиве (7,5-9,61од2 з РИГА). ' ;

Показана также прямая зависимость титра гуморальных антител от дозы препарата, так, с уменьшением её в два раза, титр антител снижался на 0,7-1,0

После отела титр гуморальных вируснейтралнзующих антител у вакцинированных коров медленнр снижался, одинаково у животных 1-й и 2-й групп. Через 6 месяцев прсле отела антитела у вакцинированных коров сохранялись в довольно высоких титрах (3,5-4,2 в РН н 3,4-4,0 в РСК) ¿оответственно к 1-й и И-й подгруппам аденовирусов.

Сравнительная антигенная активность моно- а ассоциированной аакпаиы

При испытании образцов инактивированной ассоциированной закцины на телятах у некоторые вакцинированных животных после каждой вздашнации наблюдалось повышение температуры телй на

0,1-0,4°С и припухлость на месте введения препарата, исчезающая в течение 4-6 дней.

При сравнительном изучении антигенной активности двух образцов моновакцины против аденовирусной инфекции на телятах была выявлена, как и на белых крысах, высокая активность моновакцины, содержащей в своем составе в два раза меньше антигена I подгруппы (0,5:1) 9,5-11 log2.

Данные, полученные по результатам испытания ассоциированной вакцины против аденоинфекции и хламидиоза, позволяют судить о высокой активности препарата как в отношении аденовирусного (титр антител 11,25-7,9 log;), так и хламидийного компонентов (титр антител 6,41-4,3 log:). Так, иммунизация телят инактивированной ассоциированной вакциной дважды приводила к образованию довольно высокого уровня антител как к аденовирусам, так и к хламидиям, который сохранялся после ревакцинации до 3-х месяцев, а затем незначительно снижался (до 0,5-1 log;) и оставался на стабильном уровне в течение 6-и месяцев. К шестому месяцу титр антител к аде-яовирусам составлял 9,01 log2 и 8,23 log2 к 1 и 11 подгруппам соответственно к хламидиям от 4,3 до 4,5 log; . При исследовании хламидийного компонента не наблюдали существенного различия в уровнях антител у животных (группы 1 и 2), привитых ассоциированной вакциной аденовируса в соотношении 0,5:1 и 1:1. Это свидетельствовало о том, что наличие хламидийного компонента в образцах ассоциированной вакцины не снижало антигенной активности аденовирусных компонентов.

У контрольных животных (группа 4) через 2 месяца после начала опыта наблюдали появление антител (4,0-3,2 log;), затем титр их снизился и в течение 4-х месяцев был на уровне 2,0-3,0 log;. У этиху животных наблюдали заболевания респираторного и кишечного трак- х та. Это говорит о том, что контрольные животные, естественно заражаясь, приобретали в течение 3-х месяцев определенную защитную реакцию. При этом аденовирусы являлись одним из этиологических факторов заболевания телят. Таким образом, на основании полученных данных исследований на телятах следует отметить, что наиболее выраженной антигенной активностью к обеим подгруппам аденовирусов обладали образцы вакцины 1, содержащие

в своем составе аденовирусные антигены t и II подгруппы в соотношении 0,5:1.

Вакцинация телят ассоииироваиной вакциной вызвала образование высокого уровня комплементсвязывающих антител, что говорит об антигенной активности ассоциированной вакцины как в отношении адеиоинфекции, так и в отношении хламидий.

Влияние дозы вакцины на антигенный ответ привитых животных

Сравнивая антигенную активность двух препаратов, мы изучали зависимость уровня антител в сыворотке крови у вакцинированных животных от дозы препарзта. В результате этих исследований существенных различии в уровне антител между группами животных в зависимости от дозы и образцов инактивированной вакцины не обнаружено. Титр антител в сыворотке крови привитых животных, независимо от дозы введения, был высоким (8,5-12,5 Iog¿ на I подгруппу аденовирусов, 7,1-12,3 log2 на ÍI подгруппу аденовирусов, 2,5-6,9 log> к хламидиям).

У невакцинпрованных телят через 1,5-2 месяца после формирования в группы наблюдали • острую инфекцию респираторно-кишечного характера. Эти данные позволяют отметить, что вакцинация опытных телят позволила надежно защитить их от аденовирусной инфекции и хламндиоза крупного рогатого скота, индуцируя у них образование гуморальных антител в течение шести месяцев (11-12 log, в РИГА и 4,6-5,5 log2 в PGK).' ' ■ >

Полученные-результаты широкого производственного испытания образцов инактивированной ассоциированной вакцины против адеиоинфекции и хламидиоза крупного. рогатого скота свидетельствуют о высокой активности, испытанных препаратов, которые надежно предохраняли телят от заражения аденовирусной и хлами-дийной инфекциями, вырабатывая высокий уровень гуморальных антител против этих инфекций.

Поствакшшальная реактивность иммунизированных животных в зависимости от уровня молознвных антител

Телята, рожденные от вакцинированных коров, на протяжении первой недели жизни рыли защищены от этой инфекции благодаря высокому уровню гуморальных антител, полученных трофогенным путем с молозивом матери,'?а,счет временной зашиты слизистых оболочек желудочно-кишечного'• тракта. В связи с- этим вопросы правильного своевременного, кормления молодняка иммунным молозивом- приобретают , важнейшее значение в профилактике новорожденных телят. Мы также изучали влияние иммунологического статуса двукратно вакцинированных стельных коров на динамику колостралькых антител. В результате установлена зависимость между уровнем антител в молозиве коров и сывороток крови их потомства при условии, что новорожденные телята своевременно получали иммунное молозиво. Это вполне согласуется с данными других исследователей, которые также наблюдали,' что более высокая концентрация антител в молозиве коров обеспечивает накопление более высокого титра гуморальных антител в сыворотке крови телят.

В наших опытах через 3 дня у всех новорожденных телят, полученных от вакцинированных коров, после выпойки молозивом титр антител в крови достигал 5,5-6,9 ^2 в РНГА и 4,8-5,2 1о§2 в РСК (соответственно на аденовирусы и хламидии).

В литературе отмечалось, что иммунный ответ новорожденных теляг ниже, чем у животных старшего возраста, поскольку колост-ральные антитела препятствовали развитию активной поствакцинальной иммунологической реакции. Видимо, повышенная концентрация кортикостероидных гормонов у новорожденных телят' оказывает иммунодепрессивное действие, а более интенсивный метаболизму молодых ¿сивотных обуславливает более короткий период полураспада антител. Учитывая этот факт, мы в своих исследованиях прививали телят с колостральиым иммунитетом в возрасте 25-30 дней.

Полученные нами результаты показали, что иммунизация серо-позитивных телят с высоким уровнем материнских aнтиíeл (4,3 1о£2 в

РИГА на аденовирусы и 3,8 logi в PC К на хламидии) инактивирован-нои ассоциированной вакциной вела к небольшому снижению постьакцнональных гуморальных антител (7,3 Iog2 в РИГА). Однако ревакцинация их через 30 дней сопровождалась увеличением титра гуморальных антител. Снижение, уровня колостральных антител одновременно устанавливалось на группе невакцинированных телят. При этом уровень-поствакцинальных гуморальных антител оказывался выше у гелят» вакцинированных на серонегативном фоне по сравнению с серопозитивным (7,8-8,18 logz в РСК и 7,6-7,7 lcgj в РИГА соответственно).

Но вторая прививка стимулировала дальнейшее увеличение титра антител в обеих группах животных, и через 30 дней после ревакцинации он достигал 7,8 logj в РНГА и 6,0 logi в РСК (соответственно на аденовирусы и хламидии). Напротив, пассивные антителу у невакцинированных животных через 85-90 дней после отела снижались от 5,8 log2 до 3,0 log; в РНГА и от 5,0 log2 до 2,0 logz а РСК. • :

При изучении динамики антител у вакцинированных телят отмечалось длительное их'сохранение на протяжении шести месяцев па высоком уровне к аденовирусам и хламидиям, а именно 5,0 logz в РНГА и 3,5-4,0 log2 в РСК.

Таким образом, гуморальные антитела при вакцинации серопо-зитивных и серонегативных животных сохранялись на более высоком уровне до шести месяцев по сравнению с телятами, имеющими только колостральные антитела.

АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ИШКТИВИРОВАННОЙ

ТРЕХВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ АДЕНО! ШФЕКЦШ1, ХЛА1УШДИОЗА И ПАСГЕРЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

5.2.1. Опыты па лабораторных животных

Результаты работ, проведенных по Ж?пытанию трехвале^ной вакцины на белых крысах, были также обнадеживающими н свиде-

тельствовали об их выраженной антигенной активности на лабораторных животных. Изучение антигенной активности трехвалентной вакцины проводили в сравнительном аспекте с изучением антигенной активности моно- и двухвалентной вакцины.

Результаты наших исследований показали, что все образцы вакцин обладали выраженной антигенной активностью, причем наличие аденовирусного, хламидийного компонентов и пастерелл не вызывало интерференции между антигенами и не снижало антигенной активности аденовирусного компонента, (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная антигенная активность образцов бивалентной и трехвалентной вакцин на белых крысах

№№ образно» Соотношение компонентов (доза, мл) 1 подгруппа 11 подгруппа

РН РНГА РН РНГА

I Аденовирусы-1,0 хламидии-0,3 9,5±0,20 10,1 ±0,34 8,51±0,40 9,2±0,58

2 Аденовирусы-1,0 хламидии-0,5 10,5±0,32 11,4±0,82 9,5±0,50 Ю,3±0,11

3 Аденовирусы-1,0 хламидии-0,3 пастереллы-0,3 8,3±р,30 12,0x0,50 9,0=0,40 10,8±0,84

4 Аденовирусы-1,0 хламидии-0,5 пастереллы-0,3 8,1±0,84 9V0±0,20 7,5±0,40 I 9,3±0,10 ¡ i .

Как видно из таблицы, животные, привитые как трехвалентной, так и бивалентной вакциной, имели достаточно высокий уровень антител как И-й подгруппы, так и 1-й подгруппы аденовирусов. Эти результаты показали высокую антигенную активность ассоциированной бивалентной н трехвалентной вакцин на лабораторных животных.

Опыты на стельных коров

Изучение антигенной активности ассоциированной вакцины против аденовируса, хламидий и пастерелл вели в сравнительном аспекте с изучением антигенной активности двухвалентной вакцины (против адено+хламидий). ^

Полученные результаты исследований показали, что все образцы вакцин обладали выраженной антигенной активностью, причем, как было отмечено в опытах на лабораторных животных, наличие аденовирусного и хламидийного компонентов и пастерелл не вызывало интерференции между антигенами и ие снижало антигенной активности аденовирусного компонента.

Серологическое исследование коров, привитых ассоциированной вакциной против аденовирусов, хламидий и пастерелл, показало, что титры гуморальных антител у них повышались после вакцинации и достоверно отличались от естественного иммунного фона и достигали 3,0-3,5 log2 в РСК и 4,6-5,0 log2 в ИФА на хламидии, 5,8 log2 в РН и 7,0-7,5 log: в РИГА на аденовирусы.

Перед отелом у вакцинированных короз после ревакцинации также наблюдали повышение титра гуморальных антител, которые достигали 5,45-6,0 log¿ в РСК и 8,5-9,4 log2 в ИФА.на хламидии, 8,5 log2 б РН и 10,5-10,7 Iog2 в РИГА на аденовирусы. ,

Итак, двукратная вакцинация коров инактивированной ассоциированной вакциной против аденовирусной инфекции, хламидиоза и пастереллеза крупного рогатого скота на поздней стадии стельности ко дню отеяа вызывала образование высокого уровня как впруснейтраллзуюших, так и антител выявляемых в PHFÁ, РСК н ИФА в сыворотке крови и молозиве (10,7 log:, 6,0 log2 и 11,9 log2 соответственно): При этом обнаружены существенные различия в титрах антител у коров, привитых на 7гм месяце стельности, и контрольных животных. Также следует отметить^ что имеет место корреляция между уровнем антител в крови и молозиве иммунных коров. Специфические антитела в сыворотке крови вакцинированных коров сохранялись на высоком уровне на протяжении шести месяцев после отела, что обеспечивает защиту от хламидиоза и аденовирусов.

Влияние молозывных аятател пз поствакцппальиую реактивность привитых животных

В дальнейшем мы в своих исследованиях изучали возможность а№шной иммунизации телят ассоциированной вакциной против аде-

новирусов, хламидий и пастерелл с пассивными антителами в возрасте 10-15 дней. Критерием оценки служило сравнительное изучение титра гуморальных антител у телят с разным иммунным фоном (серопозитивные и серонегативные).

Результаты наших исследований показали, что иммунизация серопозитивных телят ассоциированной вакциной вначале вызывала снижение титра специфических антител. Видимо, имела место интерференция между колостральными антителами и вакцинным антигеном, так как идентичная схема вакцинации серонегативных телят вела к увеличению у них титра сывороточных антител. Однако, временная депрессия антителогенеза на первую вакцинацию была непродолжительной, так как ревакцинация таких телят вела к возрастанию титра гуморальных антител у всех вакцинированных животных на фоне снижения колостральных антител у интактных телят.

Дальнейший анализ гуморальных антител показал, что по-ствакиинальные антитела у привитых животных сохраняются на высоком уровне (5,3 logj в РИГА и 4,0 log, в РСК) значительно дольше. Напротив, антитела у невакцннированны.х животных снизились до 3,0 log; в РНГА и 2,0 logr в РСК через два месяца после отела.

Сравнительная антигенная активность ни активирован ной вакцины для телят различного возраста и иммунобиологического состояния

-В дальнейшем нам представилась возможность сравнить антигенную активность ассоциированной вакцины против аденовирусов, хламидий и пастерелл на серонегативных телятах в возрасте 10-15 и 45-50 дней. На введение ассоциированной вакцины телята обеих' групп отвечали выработкой антител и к моменту ревакцинации (через 28 дней после первой вакцинации) титр их достигал до 3,5 log, в РН и 4,7-5,6 log2 в РНГА на аденовирусы и 2,6-3,0 loga в РСК, 4,8-6,0 log2 в ИФА на аденовирусы и хламидии

При ревакцинации через три недели наблюдали увеличение уровня антител у животных обеих групп, тогда как у контрольных телят он оставался на прежнем уровне. Максимальный подъем титра

гуморальных антител происходил после вакцинации на 15-й день, достигая 7,0-8.2 log: в РН и 8,2-9,1 log; в РИГА на аденоинфекцию и 5,2-5,6 iogj в РСК и 8,5-9,3 log2 в ИФА на хламидиозную инфекцию соответственно для животных 1-й и 2-й групп.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что двухкратная вакцинация телят ассоциированной вакциной против чденовирусрв, хламидий и пастерелл как в возрасте 10-15 дней, так и 45-50 дней.стимулирует образование высокого уровня гуморальных антител. Однако иммунизация телят на 45-50-й день жизни вызывала образование антител в более высоком титре по сравнению с их уровнем у животных вривитых на 10-15 день после отела (на 0,5-1,0 logí). Антитела как на аденовирусы (4,7 - 5,6 logz ), так и на хламидии сохраняются на высоком уровне в течение 13 недель после ревакцинации (срок наблюдения).

СРАВНИ ТЕЛЬНАЯ ИММУИОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ MOHO- Н АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ

Сравнительная клиническая реакция животпых на контрольное заражение

Степень проявления экспериментальной инфекции оценивали по температурной реакции организма н клиническим признакам. У телят всех подопытных групп температура тела до заражения была в пределах нормы (38,8-39,4°С). В ответ на'введепйе вируса почти все животные реагировали повышением температуры тела. Однако у всех телят 1-й и 2-й групп, а также у одного теленка 3-й группы, имевших специфические антитела е высоких титрах, приобретенные в результате вакцинации на серонегативном фоне, температурная реакция была гораздо слабее по сравнению с контрольными и животными 4-й группы (где доза вакцины была 1,25 мл). У животных í-й и 2-й групп отмечали однократное повышение температуры тела до 39,5-39,7°С, причем различие по сравнению с первоначальными показателями оказалось несущественным.

У двух телят из третьей группы в течение опыта температура иосила волнообразный характер. У контрольных животных и животных 4-й группы, которые были вакцинированы в дозе 1.25 мл, повышение температуры было Затяжным, двухволновым и иногда держалось несколько часов. Из приведенных данных видно, что температурная реакция в 1-й и 2-й группах была весьма контрастной по сравнению с животными 5-й и 4-й групп. По нашим данным наивысший индекс заболеваемости имели контрольные телята 5-й группы, причем у них наблюдали клинические признаки экспериментальной инфехиии различной интенсивности, и у телят 4-й группы была отмечена двухволновая температурная реакция. На фоне телят 4-й и 5-й групп клинические признаки у 1-й и 2-й групп были почти незаметными, что свидетельствует о защитном действии препарата против прямого заражения патогенным вирусом при наличии у этих телят вируснейтрализующих антител в высоких титрах.

При сравнении показателей температуры тела и клинического проявления экспериментальной аденовирусной инфекции у вакцинированных и контрольных телят Было установлено, что изучаемая серия бивалентной вакцины в дозах 5 и 10 мл защищает животных от прямого заражения вирулентным материалом.

Сравнительный антигенный ответ вакцинированных и контрольных животных на экспериментальное заражение

В результате серий проведенных исследований удалось выяснить, что вакцина в дозе по 10 и 5 мл вызывала у привитых животных образование высокого уровня антител. В этих группах животных (1-й в 2-й) при серологическом исследовании установлено, что антигенна/ активность вакцины в обеих группах существенно не отличалась. При четырехкратном снижении дозы вакцины (3 группа) только у 63,7% телят отмечено образование высокого уровня антител (4 1о£,2 и выше в РН). Высокий уровень антител у телят 4-й группы, привитых по 1,25 мл на инъекцию, обнаружили только у 14,5% животных, причем титры антител были невысокими (4,0-3,9 1ое2 в РН и 5,7-5,85 1о£2 в РИГА).

Все контрольные телята до экспериментального заражения были серонегативиыми. На 5-й и 10-й дни после чаражения у телят всех rpytifi отмечали повышение уровня зируснейтрализуюших антител и ангнтел, выявляемых в РИГА. Титры антител к этому сроку в РН возросли на 0,3; 0,5 и 0.2S; 0,27 log2 соответственно для 1-й и 2-й групп телят: У животных третьей группы, где доза вакцины составляла 2,5 мл. титры вируснейтрзлизуюших антител были сравнительно невысокими, лишь у одного теленка из этой группы на 10-й день наблюдалось повышение титра »а 3,35; 4.75 log: з РН. В целом по группе они не превышали 2,25; 1,9 log2 в РН соответственно 1-й и И-й подгрупп аденовирусов.

Более активный антигенный ответ на экспериментальное заражение был выявлен у животных 4-й и 5-й групп, вакцинированных дважды с интервалом 30 дней по 1,25 мл и у контрольных телят. У телят этих групп в РН и РНГА обнаружен достоверный прирост гуморальных антител, на 10-й день он был выше у телят 4-й группы на 2,25; 3,30 log2 в РН и 3,28; 3,21 log2 в РНГА, а пятой (контрольной) -на 3,37; 4,23 log2 в РН и 4,0; 4,15 log2 в РНГА (Р<0,001). Спустя 14 дней после контрольного заражения титры гуморальных антител у первой и второй групп животных не отличались от исходных, у телят 3-й группы гитры антител увеличились на 2,45; 2,26 log2 в РН по сравнению с моментом заражения. У животных 4-й и 5-й групп отмечали увеличение уровня антител на 3,29-4,50 log2 в РН и на 3,47-4,40 Iog2 в РНГА. Таким образом, у животных первой и второй групп, где доза вакцины была 10 и 5 мл (соответственно).. в первые дни после контрольного заражения наблюдалось небольшое увеличение титра вируснейтрализуюшнх антител, уровень которых через 11 дней после заражения не отличался от исходного титра. Результаты, полученные в РНГА, были различными, но у животных, привитых в дозе 10 и 5»мл, остались практически без изменений.

Таким образом, на фоне возрастающего после контрольного заражения уровня антител у контрольных и вакцинированных в дозе 1,25 мл животных практически не наблюдали повышения титра антител у телят, вакцинированных в дозе 10-5 мл. С незначительными колебаниями он сохранялся на постоянном Уровне в течение 2-х не-

Р

дель после заражения. У животных 3-й группы антигенный ответ был

весьма контрастным, у одного теленка (№ 2004) наблюдалось значительное повышение уровня антител, по сравнению с остальными телятами этой же группы.

Выделение вируса от вакцинированных и вевакцннированных животных после контрольного заражения

Для выделения вируса получали смывы носоглотки и дифибри-нированную кровь от вакцинированных и контрольных животных.

Результаты вирусовыделения на 5, 10 и 14-й дни после заражения телят после второй вакцинации показывают, что вирус удавалось выделять у животных 4-й и 5-й групп из дифибринированной кроен, смывов с носоглотки на 5, 10 и 14 дни после заражения. От животных первой группы, которые были привиты по 10 мл, и из второй группы телят, вакцинированных по 5 мл, после заражения вирус не выделили. В третьей группе, где животные были привиты в дозе 2,5 мл препарата, от теленка № 2004 вирус был выделен из смывов и дифиб-ринированной крови на все сроки исследования. У остальных телят этой группы на 5-й и 10-й дии вирус изолировали только из носовых смывов. От всех животных 1-й и 2-й групп в течение всего срока наблюдения вирус не был выделен.

. Таким образом, результаты выделения аденовируса после заражения контрольных и вакцинированных животных свидетельствуют о том, что испытуемая серия вакцины для производственного опыта в хозяйствах в дозах 5 и 10 мл надежно защищает животных от прямого заражения патогенным вирусом. Однако вакцина в дозе 2,5 мл только частично защищала животных от прямого заражения, а вакцина в дозе 1,25 мл почти не защищала животных от прямого заражения.

На основе клинической картины заболевания, выдел.ения вируса и серологических исследований нами выявлена корреляция между уровнем гуморальных антител и напряженностью иммунитета. Животные, имевшие антитела к аденовирусу в титре 4,0 log; и выше, были защищены от заражения.

Таким образом, исходя из полученных результатов, высчитали, что 50% ЭД равна 1,95 мл на инъекцию.

Результаты опытов по инактивации пастерелл п аденовирусов

При проведении опытов по инактивации пастерелл (третьего компонента) для приготовления трехвалентной ассоциированной вакцины было установлено, что при температуре 37®С и концентрации димерэтиленимина (ДЭН) 0,1 и 0,05% инактивация штамма Р. Мико-с1с1з (тип А) в взвеси наступала в течение 10-12 час., а Р. Микос1<1а (тип В) - 8-10 час. Уменьшение концентрации ДЭИ до 0,01% не приводило к инактивации взвеси пастерелл обоих типов в течение 12 часов.

Опытные образцы пастереллезных антигенов, инактивирован-ных ДЭИ в 0,1- а 0,05%-ной концентрации, при проверке на лабораторных животных оказались безвредными. Вирусные же компоненты инактивирозались 0,1%-ным ДЭИ.

Установлено, что полная сорбция вирусных-и бактериальных антигенов обеспечивалась азросилом в 2%-ной концентрации. Полученные препараты при испытании на мышах и кроликах были безвредны и не вызывали гибель животных в течение 10 дней наблюдения.

Реактогсниые и пммуногснные свойства ассоциированной вакшшы

Изучение антигенной и иммуногеиной активности противоаде-иовирусной вакцины проводили на 20 привитых тзтятах, за которыми в течение месяца велось-, клиническое наблюдение, и затем был взят материал для серологических исследований и вирусовыделения. У привитых телят, зараженных аденовирусами, отмечали кратковременное повышение температуры тела на (0,2-0,4°С) в первые двое суток после заражения, слабые признаки серозного ракита и конъюнктивита (з течении первых 10 дней).

У невакцинированных (контрольных) телят подъем температуры отмечали на 2-3 день после заражения, затем температура снижалась и вновь поднималась (до 40°С) на 6-7 день после заражений. Из клинических признаков характерным был кашель, сеоозный

ринит, слезотечение, конъюнктивит, а у телят, зараженных аденовирусом 11 подгруппы, наблюдалась легкая диарея.

От не привитых телят (контроль) вирус выделяли на 3, 5, 7, 10-й дни после контрольного заражения из смывов носа, глаз, прямой кишки и дефибринированной крови. V вакцинированных животных вирус не выделяли

При заражении P. Mahocida (сер. А) реакция контрольных животных была оценена как сильная и проявлялась в потере аппетита до 90%, обильным постоянным катарадьно-гнойным истечением из носовой полости, тяжелой одышкой, кашлем, обезвоживанием, повышением температуры до 40"С и выше.

Исходная культура P. Muliocida (сер А) выделена из легких контрольных телят. При заражении P. Multocida (сер. В) у контрольных телят проявлялись клинические признаки острого пастереллеза, и они пали в течение 24 часов. Из паренхиматозных органов и сердца павших телят была выделена исходная культура P. Multocida (сер. В).

Анализируя результаты серологических исследований, нам следует отметить, что у всех контрольных телят, отобранных для опыта, после заражения достоверный прирост антител к 1 и II подгруппам аденовирусов наблюдали в пределах 5,0 log; в РН и 8,0 log} в РИГА к 1 подгруппе и 5,8 log2 в РН и 8,3 log: в РНГА ко И подгруппе.

При зтом телята прореагировали на заражение аденовирусами снижением титра антител на 0,5-1.0 .log?, который затем поднялся до первоначального уровняй сохранялся до конца опыта

У.-коитрольных телят была воспроизведена аденовирусная инфекция, которая характеризовалась 2-х волновым подъемом температуры и проявлением характерных клинических признаков. Серологически результаты подтверждены вирусовыделением.

Исходный вирус был выделен из проб носовых смывов, дефибринированной крови на 3-й, 7-й и 10-й дни.

Из вышеописанного можно сделать заключение, что изготовленная и изученная нами вакцина обеспечивает устойчивость вакцинированных животных к аденовирусам и пастереллам крупного рогатого скота в течении 6 месяцев (срок наблюдения), что свидетельствует о высокой иммуногеиности препарата и может быть

рекомендована для комиссионном проверки на предмет ее испытания

в широком производственном опыте.

ВЫВОДЫ:

1. Результаты наших исследований и данные ветеринарной отчетности свидетельствуют о широкой распространенности аденовирусов, вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, хлами-дий и пастереллеза в разных зонах Кыргызской Республики.

2. Проведенным эпизоотологическим экспериментом установлена межвидовая миграция аденовирусов среди крупного рогатого скота и овец.

3. От телят с клиническими признаками поражения респираторного и желудочно-кишечного тракта выделено 19 цитопатогешшх агентов, отнесенных к аденовирусам крупного рогатого скота. Иммунобиологические свойства выделенного изолята КР-1 спидеГельствуют о его принадлежности к трётьему серотипу аденовирусов крупного рогатого скота.

4. Двукратная вакцинация коров на седьмом месяце стельности ассоциированной вакциной против аденовирусов и хламиднй в дозах 5 и 10 мл обеспечивает образование ко дню отела зысоког-» уровня гуморальных антител в титрах 5,5-6,4 !og2 в РН, 6,9-8,08 log2 в РИГА, 6,2 Iog2 в РСК и их сохранение в течение шести месяцев после отела в титрах 3,8-4,1 log2 8 РН, 6,2-6,8 log2 в РНГА и 4,0 log: з РСК. ' .

5. Телята, полученные or вакцинированных коров, после выпойки молозива имеют высокий уровень колостральных антител: 4,5-5,5 log, в РНГА на аденовирусы и 5,0 logi в РСК на хламядии.

6. Опыты по испытанию инактивипозаниой ассоциированной вакцины

. пробив аденовирусной и хламидиознон инфекгиц крупного рогатого скота и моновакшшы на телятах различного возраста с разным имтдунныгд фоном показали высокую антигенную активность и эффективность ассоцикро'ланной закцины з борьбе с аденоинфекцией и хламидиозом.

7. Двукратная вакцинация глубокостельных коров ассоциированной вакциной против аденоинфекции, хламидиоза и иастереллеза в дозе 10 мл обеспечивает высокий уровень гуморальных антител ко дню отела (8,4 log2 в РН и 10,7 \og2 в РНГА к аденовирусам, 6,0 log2 в РСК и 2,8 log2 в ИФА ic хламйдиям) и их сохраняемость в течение шести месяцев.(6,5 log2 в РН и 7,95 logj в РНГА, 4,6 log2 в РСК и 2,5 logj в ИФА).

8. В результате клинических,сероЛогнческих и вирусологических исследований вакцинированных, телят после контрольного заражения установлены высокие иммуногенные потенции моно- и ассоциированной вакцины.

9. Наличие аденовирусного, яастереллезного и хламидийного компонентов не вызываю^ интерференцию антигенов и тем самым не снижают антигенной активности в ассоциированных препаратах.

10. Установлено, что полная .сорбция вирусных и бактериальных антигенов обеспечивалась аэросилом в 2%-ной концентрации. Полученные препараты при испытании на лабораторных животных были безвредными, поскольку не вызывали гибель животных в течение 10 дней.

11.Образцы инактивированной вакцины сохраняли антигенную активность в течение 24-х месяцев при хранении в условиях 4-б°С.

12. Инактивированная ассоциированная вакцина обеспечивает устойчивость привитых животных к аденовирусам, хламидиям и пастереллам крупного рогатого скота в течение 6 месяцев, что свидетельствует о высокой иммуногенности препарата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Изданы:

а) Методические рекомендации по диагностике и профилактике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Кыргызской Республике, утвержденной научно-техническим советом НПО по ветеринарии КАА, 28 февраля 1997 г.

б) Хламидийная бронхопневмония телят (рекомендации), утвержденной научно-техническим советом НПО по ветеринарии КАА, 28 февраля 1997 г.

2. Данные по оптимальному соотношению аденовирусных антигенов 1-й и И-й подгрупп (0,5:1) будут внесены в качестве дополнения в утвержденную (01.06.90 г.) Нормативно-техническую документацию "Вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота

3. Разработаны и предложены для практики оптимальные сроки и дозы вакцинации для глубокостельных коров и их потомства в целях профилактики аденовирусной инфекции, хламидиоза и пастерелле-за крупного рогатого скота.

4. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах вирусологии МГАВМиБ и инфекционных и инвазионных болезней Кыргызской аграрной академии и используются в практической работе ветеринарных лабораторий республики.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белоусова Р. В., Нургазиев Р. 3. Профилактика аденовирусной инфекций молодняка крупного рогатого скота // Инф. листок №413-88 - Москва, 1588, 4 ^

2. Нургазиев Р. 3. Изучение степени распространения аденовирусной инфекции в Кыргызской' ССР .// Вопросы ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. / Моск. вет. акад. им. К.И. Скрябина. - М., 1988. - С. 103-105. !

3. Белоусова Р. В., Нургазиев Р. 3., Третьякова И. В., Лобова Т. И., Хилько О. Н. Получение гипериммунной сыворотки к некоторым гексонам аденовирусов крупного рогатого скота // Достижения науки и техники АПК / М., 1989. - № 1. - С. 45-46.

4.Белоусова Р. В., Нургазиев Р. 3. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота // Ветеринария. - 1989. - № I. - С,. 29-30.

5. Нургазиев -Р. 3., Белоусова Р. В. Инмуногенная активность инактивированной вакцины против аденоинфехции крупного рогатого скота //Ветеринария - 1989. - № 2. - С. 2^-26.

6.Нургазиев Р. 3. Серодиагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота 7/ Тез. докл. IX Всесоюзн. научи, конф. -М. -1990. - С. 54-55. -

7.Нургазиев Р. 3 ^ Влияние вакцинации стельных коров на уровне колострального иммунитета у потомства 1> Тез. докл. межвузовской конф. - Фрунзе.-1990.-С. 57-58.

8. Нургазиев Р. 3.\ Результаты исследования проб парных сывороток в РН и РНГА на аденовирусную инфекцию // Тезисы докл. республ. научи -цракт. конф. молодых ученых. - Семипалатинск. -

1991.

9.Нургазиев Р. 3. Методическая разработка темы: "Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота". И Метод, разр. Кырг. СХИ им. К. И. Скрябина. - Бишкек. - 1992. -.20 с

10. Нургазиев Р. 3., Биримкулова А. Т. Распространение некоторых пневмоэнтеритов в хозяйствах Республики Кыргызстан // Тезисы докл.. межрег. научн.-прагг. конф. / Кырг. СХИ им. К. И. Скрябина. - Бишкек. - 1992. - С. 184-185,

11. Нургазиев Р. 3., Биримкулова А. Т. Серодиагностика вирусных пневмоэнтеритов // Тез: докл, научн. конф., посвяш. 60-летию образования Кырг. СХИ им. К. И. Скрябина / Кырг. СХИ. - Бишкек. -

1992. --С. 146

12. Нургазиев Р. 3., Биримкулова А. Т. Распространение пара-гриппа-3 в некоторых хозяйствах Чуйской долины // Вклад науки в изучение и лечение распространенных болезней животных: Сб.-на^ учн. тр. / Кырг. СХИ им. К. И. Скрябина. - Бишкек. - 1993.С. 123.

13. Нургазиев Р. 3., Биримкулова А. Т. Распространение антител к вирусу ринотрахеита у телят // Вклад науки в изучение и лечение распространенных болезней животных: Сб. научн. тр. / Кырг. СХИ им. К. И. Скрябина.:- Бишкек. - 1993. - С. 125.

14. Белоусова Р. В., Нургазиев Р. 3., Биримкулова А. Т. Антигенные свойства бивалентной инактивированной вакцины I!

Совершенствование мер борьбы с болезнями с.-х. животных: Сб. науч. тр. / Кырг. СХИ им. К. И. Скрябина. - Бишкек. - 1994. - С. 37.

15. Нургазиев Р. 3. Изучение динамики эпизоотологического процесса при респираторно-кишечных заболеваниях и схема их защиты // Совершенствование мер борьбы с болезнями с.-х. животных: Сб. научн. тр. / Кырг. СХИ им. К.И. Скрябина. - Бишкек. - 1994 г. -С. 38.

16. Нургазиев Р. 3. Распространение парагриппа-3 в хозяйствах -республики // Актуальные проблемы вирусологии: Тезисы докл. научн. хонф. 18-20 мая 1994. - п. Гвардейский. - ч. II. - С. 86-87.

17. Белоусова Р. В., Нургазнев Р. 3., Биримкулова А. Т. Испытание поливалентной вакцины (пастереллез + хламидии + аденовирусы) на телятах // Актуальные проблемы вирусологии: Тезисы докл. научн. кэнф. 18-20 мая 1994 г. - п. Гвардейский. - 1994. -ч. II. - С. 87-88.

18. Нургазиев Р. 3. Испытание антигенных свойств поливалентной вакцины на телятах // Совершенствование диагностики^ терапии и профилактики болезней животных в Казахстане / Тезисы докладов. - Семипалатинск. - 1994. - С. 109-113.

19. Нургазиев Р. 3. Какой быть вакцине против вирусных пневмоэнтеритов: проблемы и перспективы- Н Сб. науч. тр. научн.-практ. конф., посвящ. 1000-летию эпоса "Манас". - Бишкек. - 1995. - С. 38-43.

20.Нургазиев Р. 3. Методические рекомендации по диагностике и профилактике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в Кыргызской Республике // Бишкек. - 1997. - 17 с.

21. Нургазиев Р. 3. Хламидийная бронхопневмония телят (рекомендации) // Бишкек. - 1997. - 12 с.

22. Нургазиев Р. 3. Аденовирусная инфекция животных / Монография / Бишкек. - 1996. - 120 с.

Нургазиев Р. 3.

Музоолордун вирустук пневмоэнтерит ыланынын элизоотологиясы жана алардын спецификалык профилактикасы

Кыскача мазмуну

Диссертация аденовирус, хламидиоз жана пзстереллез ыландарынын таралышын изилдееге жана бул ыландарга каршы спецификалык прелараттарды иштеп чыгууга арналган.

- Аденовирустар бмздин Реслубликада 80-жылдардан баштал аныктала башталды. Серологиялык изилдовлврдун натыйжасында Республиканын 51 чарбасында аденовирус, ал Эми 25 чарбасында хламидиоз ылацдарынын кенири таралышы белгиленди. Кандын сары суусунда бир эле мезгилде аденовирустарга, хламидийлерге, инфекциялуу ринотрахеиттерге каршы антителолор табылды. Кепчулук учурда аденовирустар табылган улгУлеРДе- хламидиоз ыпаны кездешээри аныкталды. Аденозирус жана хламидиоз ыландары ассоциативдуу формасында кездеошп, музоолорду ете катуу жабыркатышат.

Жургузулген байкоолордун жана изилделердун негизинде бодо малдардын аденовирустары козуларга тарам тургандыгы кергезулду.

Эпквсунен сезгенген музоолордон альжган патологиялык материалдардан. клетканын встурмвсунде аденовирустар бар экиндиги табылды. Бепунген вирустарды иммунобиологиялык, электрондук микроскоптун жана серологиялык ыкмалар менен изилдеенун негизинде. алар аденовирустардын учунчу серологиялык хруппасына кире тургандыгы далилденди. Табылган вирустардын культуралдык жана терморезистенттуулук касиеттери изилденди.

Москвадагы мамлекеттик ветеринардык медицина жана биотехнология академиясыньш профессору Белоусованын Р.В.< жетекчилиги менен аденовирус, хламидиоз жана пастерелпез ыландзрьша каршы ассоцияланган вакцина жазылды. Жаны вакцина Республиканын чарбаларында кецири сыноодон етуп, ете жогорку антигендуулугу далилденди. Вакцинацикдан вткен музо-олорго патогендуу эпиэоотологиялык штзммды жугузганда, алар ыланга чалдыккан жок. Ошол эле мезгилде ыланга каршы эмдел-беген музоолордо ыландын клиникалык белгилери даана байкалды. Бул иштер вакцинанын ете жогорку иммундуулук каси-етке ээ эк.ендигин керсетту.

Жургузулгэн илимий-иштердин нептзинде ветеринардык практикага аденовирус, хламидисз жана пастереллез ыландарына каршы жаны вакцина сунуш кылынцы.

Nurgaziev R. Z.

Epizootology of virus pheumoenterytes of calves and their specific prophylactics

Thesis is devoted problems of spreading and specific prophylactics of adenosis, clamydes and pastereiles infections.

In our Republic these adenovirus infections were registered at the beginning of 1980.

As a result of serology researches was discovered wide-spread of adenovirus in 51 farms and 25 farms clamydes infections in our Republic.

At the same time we discovered antibodys to adenovirus, ciamydes and infection of rhinotrachites in serum of blood. In the most cases adenovirus is discovered in the association with clamydes. There association infection hurt calves. As a result of researches is established migration of adenovirus among cattle and sheeps. From the pathologic materials which were taken from sick calves, we revealed virus on cell culture. After investigation of immunobiolcgic properties taken virus is concerned to the 3d serotype of adenovirus.

Besides it them investigated cultural and thenhcresistant properties of taken virus. '

Under direction of professor of Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology Belousova R.V. was made up an associated vaccine against adenovirus, clamydes and pastereiles infections.

A new vaccine had passed a successful test in the farrtis'cf our Republic and showed the high antigen activity. For investigating immunogen properties vaccines. Vaccinated and non-vaccinated calves were suffered epizootology strains.

Vaccinated calves were not ill, but among the control animals we observed clear clinic pictpie of disease. These results of investigation proved us the highest immunogen tested preparation.

In vertue of research in veterinary practice is offered a new associated vaccine against adenovirus, clamydes and. pastereiles.

As a result of research elaborated recomandsXbn for treatment and prophylactics virus pnemnoenieryts.