Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Протективные свойства инактивированного бактерина при респираторном микоплазмозе птиц

А

ГРУЗИНСКИЙ ЭООТЕХНУШЯЮ-ВЕТЕРШАРНЫЙ УЧЕШО-ИСОВДОМТЕЛЬСКШ ШСТИГУТ

На нравах рукописи

ЛОМСАДЗЕ ЛИАНА. ИСАКОВНА

ПРОТЕКТИБННЕ СЕОЛСТЕА ШШВДРОВЛННОГО ЕАКТЕРВДА ПРИ РЕСПИРАТОРНОМ МИНОПМЯМОЗЕ ПТИЦ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Тбилиси - 1992

Работа выполнена в отделе по изучению болезнчй птиц Грузинского зооветеринарного учебно-исследовательского института е секторе эпизоотологии, диагностики и профилактики болез ней пт.щ Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им, Я.Р.Коваленко.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор

ТРОШЕВА Г.А.

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук

БАРДЕВЛЯГОВ А.Б доктор ветеринарных наук ШРЦВ/ШИЯ Б.В.

Ведущее учреждение - Московсгая ветеринарная акаде»ия

игл. К.И. Скрябина

Зашила диссертации состоится *[[)" С'1 П!}} Л Л 1991 г. часов на заседании специализированного Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата ве-терпшрныг: наук при Грузинском зоогехническо-ветериларном У1е5но-исслэдовательском институте.

Адрес: ЗоО 107, Тг лиси-Ю?, Крцаниси, ГрузЗВУИЙ.

С диссертацией уоено ознакомиться в библиотеке института,

Автореферат разослан

, профессор , профессор

Ученый секретар1. слецщ- ■ лизиропя'^чго с.'Чоп, кандидат Л I I нетсршарниг н .ук '/,'

чг

Г.А.Цквэтин/дое

""Ttt

• . ■/

i - г -

i I, ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

i

- J J I.I. Актуальность проблемы

В птицеводческих хозяйствах промышленного типа респираторный микоплазмоз приобрел значение важной экономической проблемы.

Значительное распространение болезни существенно снижает зохранность и продуктивность птиц в условиях индустрии И'зации этрасли, которая должна обеспечить население b-jcokoкачественными диетическими продуктами, ловысить благосостояние народа.

Несмотря на использование ускоренных способов диагностики, зклюЧаицих иммуниферментный анализ /Третья научно-методическая «онференция по микоплазменным инфекциям сельскохозяйственных жи-ютных, 1984, г.Йена/, потери остаются весьма существешья-и.

Применение лекарственных средств не всегда обеспечивает ^лжний эффект.

Отсутствие системы мероприятий по профилактика респираторно-•о микоплазмоза, включающей применение специфических средств за-1иты, не позволяет добиться оздоровления ферм и снижения потерь Прокофьева М.Т., 1971,1972; Байдевлятов A.B., 1970,1972; [др., 1987/,

1.2. Цель настоящей работы - изучить протективные свойст-а инактивированного бактерина, изготовленного из культур воз-удителя респираторного микропЛазчоза (РМ) птиц.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи; .

- изучить свойства г.-икс плазм, изолированных от птиц, с при-наками поражения органов дыхания;

- изготовить анактивированный бакторин из культур возбуди-еля РМ;

- выяснить антигенные свойства шактивированного бактерина;

- изучить иммуногеннке свойства - характер показателей гумс-1льного и™унитета и розеткообразования;

- з -

- определить влияние иммунизации бактерином на содержание общего белка в сыворотке крови и белковый спектр;

- выяснить воздействие : :ммуностимулирующего комплекса (ЖК),

1.3, Научная нозизна. Впервые изучена сравнительная эффективность янактииированного бактерина, изготовленного из культур М-уа/Мщр'&шт ^ои аэрозольном и внутримышечном пргчененик.

Установлена динамика образования специфических антител и ро-зоткоооразугацих клеток, изучено содержание оощего белка в сыворотке крови и белковый спектр.

Выявлена прямая корреляция между количеством розеткообразую-шж меток в тимусе л крови с титром специфических антител в сыворотка крови птиц.

Выяснена протективная активность бактерина и влияние ИСК-псмиоксидония на иммунологическую реактивность организма» Материалы включены в заявку, на которую получена приоритетная справка ВНИИГПЭ за № 492764С/15 23556 от 19„03.1991 г.

1Т4, Практическая значимость. Материалы исследований включены в "Рекомендации по диагностике мишплазмозов сельскохозяйственных птиц"» одобрзны Методической комиссией /протокол № 19 от 25„06.87/ и ученым советом ВИЗВ /протокол № 26 от 13.07.87/, ВНКВШ /1987/. ЦВЛ Госагролрома СССР /1987/, представлены в ГУВ

Гесагропрсма СССР; в "Временны'; методические указания по примена-

■

1Г.1У полисксидония при пуллорозе-^ифе птиц. Одобрены методической комиссией 12.03,90 /протокол 5/ и ученым советом ВИЭВ 27.11.90' /протокол № 16/, представлены в ГУВ Госкомиссии по продогольсг-пга и закупкам СМ СССР 10,12.90; б методические указания "Респираторный микоплазмоз птиц и борьба с ним", одобрен:: Методической комиссией Грузсоветинститута 10,12.90 г.

1.5. Аггеобацил работы. Основные положения работы рлссмот-Р"»::! и получили положительную оценку нг\: конференциях молодчх

еных В.' ЗБ /1985,1986,1967,1936/; 1У Республиканской конферен-:и молодых ученых и специалистов в области животноводства, зе-ринарии и экономики сельского хозяйства /1989/; ХХХХШ студен-ской научной конференции /Тбилиси,1989/; ч годовых отчетах о полнении тематического плана НИР сектора эпизоотологии, диаг-стики и профилактики болезней птиц ВИ^В /1988,1989,1990/; на жлабораторном научно-производственном совещании сотру дни,юв ктора эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней птиц, бораторий-иммунологии и биотехнологии, бактериологии, эпизоо-логии, диагностики и профилактики туберкулеза и- паратуберку-за животных, эпизоотологии, диагностики и профилактики пато-гии воспроизводства ВИЭВ /31,01.91/,

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 учные статьи.

1.7. На защиту выносятся результаты исследований по изуче-о протективных свойств инактивированного бактерина при респи-торном микоплазкозе птиц. .Материалы по экспериментальному обое-ванию его специфического защитного воздействия.

1.8. Структура диссертации. Диссертация изложена на 127

раницах машинописного текста и включает введение, обзор лите-

гуры, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы

[фактические предложения. Работа иллюстрирована 29 таблицами

рисунками. Список использованной литературы состоит из 248 нас>

энований работ, н том числе 100 отечественных и 148 зарубежных горов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ХСЛ^ЦОВАНКР 2.1. Материал и методы

Работа виполнена в 1983-1Э87 гг. в отдело по изучению болеэ-Я птиц Грузинского зооветеринарного учебно-исследов?тельсксго :титута, секторе эпизоотологии, диагностики и профилактики Со-

лезней птиц Всесоюгного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им, Я.Р.Коваленко, Институте биологии Карельского филиала АН СССР /проф.ИД.Болотников, с.н.с., к.б.н. БоКоОдейн :к/ и 3-х птицеводческих хозяйствах промышленного типа Республики Грузия.

Обследование пу.ктов проводили в соответствии с Методическими указаниями по эпиэоотологическому исследовании, утверждеьна-ми ГУВ МСХ СССР /1982 г./.

2.1.1. Таксонов, .ческие признаки уикоплазм. Для миноплазмо-лсгического исследования использоЕали ткяни носовой стенки, трахеи, легких, воздухоносных мешков, головной мозг птиц.

Исследуемый материал освобождали от сопутствующих микроорганизмов добавлением ПШЮ-селекционируицих препаратов- уксуснокислого таялия в коне-тной концентрации 1:2000 и натриевой соли пенициллина в дозе тыс. ВД/мл0 Интенсивность роста устанавливали подсчетом колониообраэующих единиц (КОЕ 1/мл) на плотных питательных средах.

С целью исключения посторонних бактерий, Л -форм и грибов призаняли ЫПАр МПБ, среда Кигт-Тароцци, Сабуро0 Посевы выдерживай* в термостате в течение 3-5 суток при температуре 38°С$ на среде Сабуро при комнатной температуре. - '

Структуру колоний иг 'или в препаратах, окрашенных по способу ,"0инс., морфологические признаки в лазках из концентрированных культур на жидкой питательной среде, окрашенных по Граму и.Рома-новскому-Гимза, х900,

Сахаролитикзские свойства определяли по отношению к углеводам и многоатомным спиртам, протеолитические по общепринятым метода» -.

Фосфетыьную активность устанавливали на плотной среде »Эдварде, содержащей сыворотку крови и дрокжевой экстракт. На 100 мл

:реды до аьляли I мл 1% раствора натрия фенолфталеин дифосфгта? »тнсшение к аргинину - на жедкой питательной среде г фенохрстом I конечной концентрации 0,002$, к которой добавляли: 1% аргинина„

Способность восстанавливать солн хлористого ?етразояя выяс-[яли на плотной среде, содержащей 0,5» 2, 3„ 5% трифенил хлорьс-•ого теразолия«, Посевы инкубировали в течение 5 суток. Реакцию ¡читали положительной при окрашивании среды н теасный mt'>..

Редукцию метиленовой сини устанавливали на среде Эдварда, одержащей краску в концентрации I; 50000»

Антигенные свойства культуры изучали в РА ш CRPA с стандарт-ш антигеном, изготорленным Ставропольской биофабрикой и фирмой эллкок,е /Великобритания/,

Патогенные свойства выделенных культур выясняли при эараже-ии цыплят культурой JU■yolf.'MptliU-iyv о концентрация 2 млрд/мл, оза 0,3 мл. Метод интраназальный.

2.1.2. Инактивирочанный бактерии. Культуры микоплазм для зготовления бактерина подвергали трехкр&тному клонированию* Поле третьего пассажа клонирования в дозе переносили в 2-литро-ыо колбы с жвдкой средой Эдварда, содержащей яндикатор; инкуби-овали до изменения окраски, проверяли на чистоту м.чхросхспией азков, окрашенных по Граму, добавляли 0,2$ формалина и кнкубиро-1ЛИ в течение 6 час при температуре 38°С.

Микоплазменную массу центрифугировали при 1000-1?00<^ на вфрижераторной центрифуге Т-23. Полученный осадок двукратно от-авали физиологическим раствором A/olC^- , содержащим 0,2% формата. Концентрации бактерина в млрд/мл устанавливали по оптичес-зму стандарту мутности.

2.1.3. Видоспецифическая сыворотка. Гипериммунизапию кроли-)в проводили по методу 5ИЭВ или модифицированному методу Плесчиа.

2.1.4. Специфичность итоктивиросанного бактеринп определили

с полугенной гипериммунной и коммерческими позитивными сыворотками к референтным штаммам M.^frí&iep'tUufin, М- jinooicw . JÜ■s^c¡JM.t№XtUi.iy¡ Pq/4%; A¡mc(exufóti(¿i CVb изготовленными в Великс британии (фирма w^O ) и Нидерландах (^frisb&as&C, Qoxn

Одновременно использовал:! специфические сыворотки к вирусу инфекцюнного бронх тае вакцинным штаммам ныокаслской болезни, стандартные 0-агглютинирующие сыворотки к различным серовариг_.1-там E.coIL, а также сальмонеллезную поливалентную сыворотку.

Отрицательную контрольную сыворотку получали от птиц, свободных от возбудителей инфекционных болезней.

Активность устанавливали э реакции агглютинации (РА), торможения гемагглютинации (РТГА).

2.1.5. Содержание общего белка в сыворотке крови птиц опре деляли на рефрактометра НР2-22, белковых фракций - электрофорезом на бумаге марки J? 4M с использованием веронал-мед-иналового буфере !рН-8,6) по прописи Малахова А„Г. /19о7/.

На основании величины и числа наблюдений по таблице распро страненной по Сгьюденту определяли вероятность различия (Р).

2.1.6. Определение розеткообрязутощих клеток (РОК). Исследо вания проводили в реакции непрямого розетгообрезования по методу Болотникова И.А„ /1982/. В качестве оритроцитарного маркера использовали эритроциты "чрана, сенсибилизированные антигеном JiiyaC&iipt¿ív-W /Виноходов О .В., Новикова А.Ф., 1977/.

Суспензию клеток лимфовдных органов птиц, иммунизированных инактивированным микоплазменным бактериком, готовили суспендиро ванием ткани в среде Иг ла в стеклянном гомогенизаторе. Полученную взвесь фильтровали через капроновую сетку, трижды отмывали срегой Игла с 5 мин интервалом, при 1500 o6A¡hh. Осадок доводили до концентрации 10 млн/мл.

2f1.7. Выделение л^фоцитоо из периферической крови и ткму

- d -

ca.. Использовали метод градиентного центрифугирования, рекомендованный Болотниковым И.А., Олейник К.К. /1980/, Градиентом служила стандартная спесь Ficott - Распил* с плотностью 1,077 г/смэ.

Для определения количества и жизнеспособности лимфоцитов проводили окрашивание 0,1% раствором трипановой сини. В камере Горя-ева подсчитывали количество ли^оцитов в 10 больших квадратах, учитывая при этом количество окрашенных и неокрашенных /живых/ лимфоцитов.

В центрифужных пробирках смеяигали 0,5 мл эритроцитов барана и 0,5 мл взвеси лимфоцитов. Пробирки помещали в термостат для инкубации, затем в рефрижератор (*5°С) на 18-20 час* Клетки фиксировали глутаровым альдегидом, Осадок клеток в пробирке ресусленди-ровали. Для определения числа РОК от общего числа лимфоздчых клеток в камере Горяева подсчитывали количество лимфовдных клеток, связавших 3 и более эритроцита. Число РОК рыражали в процентах от общего числа клеток лимфоидного органа /Бэм Э., 1969; Ильин H.A.. 1978/.

Стабильные препараты готовили на предметных стеклах из осажденных центрифугированием в течение 10 мин 1000 об/мин лимфоцитов, или выдерживали в течение 13-20 час фиксированием клеток глутаровым альдегидом, окрашивали краской Ромаковского-4Гимза (1:10), pH 5,8-7,0. Метахромазио клеток дифференцировали промыванием в подкисленной HCl дистиллированной воде, pH 2,0-3,0. Кислсту и избыток краски удаляли дистиллированной водой.

Результаты реакции учитывали по количеству и соотношению розеткообразующих и свободннх лимфоцитам в све^-овом микроскопе юд водной иммерсией? определяли относительное содерглние розет-■сообразующих лимфоцитов.

2.1.8. Иммуностимулирующий комплекс (ИСК) полною идонип -это новый отечественный препарат, изготовленный синтетическим спо-

- 9 -

собом в Институте иммунологии МЗ СССР.

По вкешнену вицу представляет собой аморфный порошок, не имеющий запаха г растворителей полиокседояия (ПО) служит стерильный физиологический раствор натрия хлорода, рК 7,2-7,4.

В лкофилиэиро'мнном состоянии препарат хранят в холодильни-

г О 1

ке лрк температуре •■ ■> в В растворенном веде сохраняют г.ри указанной температуре не более 48 час.

В.1.9, Статистическую обработку результатов исследований проводили методом, вариационной статистики« Уровень достоверности реэяичий определяли по таблице Стъюдента (Рокитский П.Ф., 1973).

Экономическую объективность разработанных мероприятий устанавливали в соответствии с Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исеяедовательск»**. и опчтно-кояструкторскиу. работ, новой техники* изобретений и рационализаторских предложений, утвержденной1 МСХ СССР 26 февраля 1979 г.

Б опытах мспопьзовано около 950 птице в том иисле петухи доноры в возрасте 210-360 дней - 9, кролики порода шиншилла весом 390-30б кг - Х29 белые мыши - 80, морские свинки весом 350~400 г - 50, баран-донор - I,

6 производственных условиях клиническому осмотру и патоло-гсанато^ическому вскрытию подвергнуто болев 1600 птиц различного возраста породы белый леггорнь серологическому исследования -1200 гол» 0 микоояазматическочу и бактериологическому исследованиям - 320 кур и цыплят, иммунизации - 1500 гол.

2.2. Результаты исследований

2,2.1. Эпязоотологические данные. Для изучения эпизоотической ситуации по респираторному киколлазмозу (РМ) проведено обследование трех птицеводческих хозяйств.

Болезнь наблюцалтеь нлт.;и е различные сезоны года; острую

форму 41'"g отмечали в зиуние и весенние меоявд» Заболевание ?с?ое~ чалось у молодняка 2-3 мес. возраста и кур в левкод качала яйцекладки. Распространение инфекции в стаде достигало 10-13%, смертность находилась в пределах 5-15%, Выбраковка кур-молодок составляла 40~56?7. Источником возбудителя, как правило, служил": куры -уикоголзмоносители и снесенные ими яйца.

В обследованных пунктах установлено отсутствие ч^ррелчции между интенсивностью паталогоанатомическк;.' изменений, двойственных РМ, и количеством птиц позитивно реагирующих в СКРА с чико-плазменным антигеном.

Наибольшее число птиц с латогномоничными признаками РС1 с возрастом увеличивалось и достигало максимума к 60-IC3 дня» {30.?%). В партиях взрослых птиц ЦШ-240 дн.) количество их унижалось в связи с эыбраковкой (11,1%).

2.2.2. Клинические признаки и патологоанатомческке изменения. При осмотре больных птиц наблюдали признаки расстройств со стороны органов дыхания, снккение привесов у молодняка до T.5-I6'?

и яйценоскости кур (ЗО-ЗЕЙК Нами проведен осмотр I7Q тутаек зыкуж-денно убитых птиц. У 9ö (59$) установлены истощение и патологические изменения в органах дыхания - отечность слизистой носовой полости, трахеи, наличие серозно-фибринозного или фибринозного экссудата, уплотнение легочной ткани. Ведущим признаком являлось юспаленмв грудных воздухоносных мешков, скопление в их полости :ерозно-фибрмно;зного или фибринозного экссудата,

2.2.3. Изоляция и идентификация микоплчзм. Дчя выделения ткоплазм использовали 101 пробу па-материала от птиц SQ-I60-девногс возраста, из которых изолировали 32 культуры.

Установлено, что контаминация организма микоплазь-амп явля-тся значительной. Из легких возбудитель РМ изолкфорлн б лучаев, трахеи - 50,0$, воздухскосных '.«етков - з носоеь;-

инусов - 27,7?. Обмпружение возбудителя в головном мозге

и селэзенке (II,1%) свидетельствует о септической форме болезни,

Б целях изготовления инактивированного бактерина были подвергнуты изучен:® таксономические признаки 6 культур миколлазм /неблагополучные пункты Г и Т./.

На основании исследований культурально-биохимических, антигенных, корфологических признаков и структуры колоний, изоляты отнесены к семейству лАхор&МггкьЬассяе роду ЛХуярОшмц веду ^.(^аМЦерЫочту. Таксономическая принадлежность штампов указанному аиту подтверждены результатом позитивной РА с видоспецифичэс-кой стандартной сьшороткой к М цаХОлерисикп и отрицательной к

М-Л^е^ч^оис 1а53, М уаЯНп&ким,'

2.2.4. Изготовление инактивированного бактерина. Для изготовления инактивирозакного бактерина использовали культуры штамма ГЛ, изолированного из легких птиц. Вырацигзние производили на среде Эдварда.

При получении инактивированного препарата важное ¿качение придавали определении содержания формалина, необходимого для инактивации микоплазм. В серии опытов изучали влияние 0,005^, 0,05$, 0,К и 0,е.% концентрации /содержание формальдегида 38,05$ и 33,1%/, Рас л до."и формалина производили по методу Николаева А„В.

Установлено, что оптимальной концентрацией, обеспечивающей . с^ерилььость различных серий препарата, является 0,2%.

Оормаликизированную ..ультуру центрифугировали в течение 30 мин. Нг-досадочную жидкость сливали. Осадок промывали формалинизи-рованным физиологическим раствором (£■ дважды на рефри-

жераторной центрифуге Т-23 при 1000 обЛ'Кн - 30 мин, затем суспензировали фосфатно-буферным разбавителем до концентрации 20 млрд/ по оптическому стандарту мутности. При аэрозольном применении к бакторину добавляли глицерин в дозе 0,1 мл/мэ.

С целью пролонгирования воздействия, к инактивированному бак терину добавляли 10,2 гидроокись плаг.тня или полный адь'овант Фрей

нда, в условиях стерильности расфасовывали по JG мл и хранили лри температуре +4°о. Полуденный бактерии представляет сооой непрозрачную беловатую жидкости, з которой при стоянии образуется лег-I ■> разбивающийся осадок.

2.2.4,1. Контроли инактивировакного бактерина.

2.2.4.1.1. Бактерии проверяла на чистсту. Из каждой колбы готовили по 3 мазка, которые окрашивали пэ Граму и Романовскс;.-у-Гимза. D препаратах обнаруживали мельчайшие множественные грамяе-гативные или окрашенние в синий, сине-фиолетовый дает корковидны? и полиморфные микроорганизмы.

2.2.4.1.2. Стерильность проверяли посевами на ЧПА, МПБ, ере-цу Китт-Тароцци, а также Сабуро, которые выдерживали а термостате три 38°С или комнатной температуре (соответственно). Результаты показали, что при указанном режиме изготовления посевы остаются :терильными.

2.2.4.1.3. Активность бактерина проверяли з реакции агглютинации или сывсроточно-капельной реакции агглютинации с зидсслецк-[:ической и нормальной сывороткой крови. В СКРА и РА с позитивной зпецифической сывороткой к JU получен положитэль-шй результат, с нормальной - отрицательный,

2.2.4.1.4. Специфичность инактивированного бактерина, ГТрепа-ит является специфичным. Он обусловливает положительную РА с гомологичной видоспешйической сызоротгой и гипериммунной к штамму,^,

РА с позитивной сывороткой к другим референтным вцдам мико-глазм, стандартной агглютинирующей 0.сывороткой к наиболее расггро-гракенным сероварам E.colí гипериммунной к вирусу ИЗ, антисыворот-;ой к вакцинному вирусу SH, сальмонеллезной поливалентной сыворо-•кой, нормальной сывороткой крови характеризуется отрштельныл;-|и показателями.

2.2.4.1.5. Безвредность. Сравнительные исследспаяиг. тлюли1---

лиоь и различные сроки на .-20 цыплятах 3- и 20-суточного возрасте породи белиП леггорн. доставленных из хозяйств, благополучных по инфекционные болезням, Наблюдение за птицей пpoдoлжaлo¿ь в течение о недель.

Результаты исследований по:газ&лн, что при аэрозольном и ьну'1 ршмаечном применении в дозе 0,25-2,0 мл/м3 и 0,25-2,0 мл/гол. (соответственно^ инактидированксго бакторина отклонения от нормы не обнаружено.

Иумуногенныг свойства ^нактивировакного бактериня. И«:,биогенные свойства бектерина изучали на сероногативной птице ¿-'¿¡¡¡-суточного возраста. Цыплята в количестве 1Ш гол. были разделены 4 группы по 45 в каждой.

Сун"ч серн'\ опытов. Птиц I и II групп иммунизировали внутри-миыочнкь ;1 аорозольны'/ мотодлми /соответственно/ в дозе 0,2Ь мл и мл/мй •!омел!зяия5 ¡¡I группа, не вакцинировалась, 1У - служила контролем вирулентности штамма.

По цыплят иапдой группы через 15 дней для выявления фор-\!1!роеания невосприимчивости заражали интратрахеально вирулентной культурой Л-1 фьЩн-рИыт в д03е о,3 мл /2 млрд/мл/.

Н? 4 ¿?.г1&»20. .48 -^О дня после иммунизации инактивированным '1нт'.тен0>" убиннлн по 7 птиц для изучения антителообраэова.чия и показателей клеточного и^укитета. Б 1У группе птиц инфицировали ;< вышеуказанной дозе и подвергали убою через 12 дньй.

От иммунизированных и контрольных птиц в указанные сроки брали кровь для серологического исследования в РА, после убоя ис-следотали на наличие роззткообразующих клеток.

Н,2.5Л.г Антигенные свойства инактивироваьнего бактеркка.

Полученные ?'а те риалы свидетельствуют о том, что у птиц 3-•'.уто'чсого ьэзрастч интрамускулярная инт>ексиу илакти,1ированнсго ' '.нт-ргит вызывает иммунологическую перестройку, характеризую-

- 14 -

у юс я образованием специфических уикогдазменннх агглютининов.

Гуморальные антитела первоначально обнаружены через 7 дней >сле введена бактеоина в разведении 1:8 у II,Не Через îfc и ) дней наличие их установлено в разведениях 1:128 у 11,1 и 1,2%} через 45 и 60 дней в разведении 1:128 у 4,44 - 22,2:."; "нц. Серопозитивннх птиц в контрольной группе не обнар.ттсмо.

Установлено, что аэрозольное применение инантипирорр.чного ктерина также вызывает иммунолопгческую ре-'хцто организма, со-орождэгсщуюся янтителообрязовзнием.

Активный иммунологический ответ обнаружен vepea ° дней юс-вакцинации э разведении 1,64 у 22,2% птиц, Через lb я 20 лнэй «ич'иэ антител установлено в разведениях сыворотки Х;12й у Ь,6-,2?, особей, В последующие 45-60 дней /срок наблюдения/ титр щкфических антител достигает максимальной величины 1:256 у 5-28,8цыплят.

Таким образом, введение икакткзиров^нного бчктеритт лэро-ьньго методом обуславливает проявление иммунологической реэк-в более ранние сроки.

Схема экспериментов на птице 25-*:уточного гозрасгс была античной.

Установлено, что при аэрозольном лъименекн-: стадия

жогенеза характеризуется выязлрнием янтител на 4 сутягу Через 'Т->к позитивная обнаруживается в разведениях сыворртяи от

1:32 у 26,6-4,4л птиц /соотзетотземнэ/.

К 15-20 дням практически все птицы, получившие бл>терин, tv— уют ¡узитирно со стя>:д':р'.'ны-.' чнт'теноч. Максимальны;! гигр -ô„ Положительная ?А в титре 1;64 сохпмкотсл кп 4Ь '* •-•>

к наблюдения/, 1:256 число яортт'о речгирг - ■:•<■_ л?vu с г° ч-

4,4-15,5'/-.

В сравнительных иссл^дос-гниях тг-'':. >"-

ним бактерином, на наличие агглютининов и антигемагглютининов наблюдалась пряг/ак корреляция результатов.

2.2,6, Антнренспецифкческие клетки крови и лимфоидных органов у птиц, иммунизированных инактипирсванным бяктепином. С учетом активной деятельности фабрициеЕой сумки и тимуса в формировании иммунитета у птиц лроьедены опыты но "руппе цыплят 30-60-;'не-гоюго розраста0

Одновременно оффективность ¡иммунизации испытана на молодняка 90-суточного возраста, что обусловлено более активным функционированием центральных лимфоидных органов. Птиц иммунизировали аэрозольные методом в дозе 1,5 мл/м3. Экспозиция 45 мин при давлении 3,5-4,0 атм.

для определения динамики специфических розеткообразующих клеток (РОК) в периферической крови исследование проводили на 47,15,30 дни.

Наблюдения показали, что в крови иммунизированных птиц РОК ' регистрируются не 4 сутки. Число их возрастает к 15 дню и с незначительные колебаниям'.! сохраняется в течение всего срока набл дения. Относительное количество РОК {%) составляет 2С,ЗЙ),5 -20,5-0,5. У птиц контрольной группы концентрация их является незначительной и не достигает нижнего порога, наблюдаемого у иммунизированных птиц (4,5^1,5 и 5^5^3,1).

Выяснение механизма иммунитета показало, что максимальное количество РОК регистрируется у птиц 60-дневного возраста на 10 день после жч-унизэции. В крови оно достигает 10,94),1, в тимусе 12,1^0,1, у 90-дневных - 14,3^0,1 и 14,2^0,2,соответственно.

Установлено, что количество клеток, участвующих в розеткоо< разэв/шии находится в прямой корреляции с титром специфических антител.

Так, у цыплят 60-дневного возраста в период обнаружения ро.

зеткообразования на 4 сутки /тимус 11,1^0,3 и кровь 10,330,1/ титр антител в РТГА. составляет 3,0±0,4 Логд, на 10 сутки /тимус 12,120,1 и кровь 10,9-0,1/ - 4,0±0,1 Лог2.

Корреляция мр.жду относительным числом розеткообраоувщих клеток и титром антигемагглютининов является свидетельством того, что з специфическом розеткообразовании при РМ принимают участие Б-лим-фоциты.

2.2.7. Общий белок и белковый спектр сыворотки крови иммунизированных птиц. Эксперименты проведены на 30 цыплятах 30-суточного возраста« разделенных на три группы: I - иммунизированные инактивированным бактерином внутримышечным методом, доза 0,25 мл, П - иммунизированные азрозольно, доза 1,5 мл/м°, Ш •• контрольные птицы-аналоги.

Сыворотку крови исследовали через 4-7-14 ч 25 суток. Из результатов следует, что через 4 суток после иммунизации в сыворотке крови птиц происходят изменения в содержании белковых фракций, наиболее выраженные увеличением гамма-глобулинов. Они наблюдаются в I и П группах птиц и достигают 40,6^1,3, 41,522,1? (соответственно), в Ш - 38,9±1,е$,

Через 7 и 14 суток такзз отмечается гипергяммаглобулинемия при использовании внутримышечного и аэрозольного методов иммунизации, что служит доминирующим показателем белкового спектра сыворотки крови птиц I и П групп 41,1±1,7, 42,9+2,1 и 43,1±1.8, 43,0* 1,1$ при 36,5^1,2 и 35,6^0,9 у контрольных птиц (Ш группа).

Отмечается незначительное снижение содержания в сыворотке крови альбуминов, что очевидно связано с количественны"« изменениями глобулиновой фракции сыворотки крови, Прг статистической об-« работке полученных результатов уровень достоверности р 0,Г)5.

2.2.8. Протективные свойства инактивированьо^о бдктеринп, Остановлено, что культуры ит1г^оа Г Л и ГТ, пригенчечые для вь^рле-

ния лро?ективных свойств итактивированиого бактерина, являаттся ьирулентнкми и при искусственном заражении вызывают гибаль 66,6-Ь0,0£ птиц /соответственно/.

2.2.вЛ. Изучение устойчивости иммунизированных птиц к искусственному заражение розбудителем РМ. Проведена серия опытов на 230 цылляупх 20-дневного возраста.

Поело иммунизации инактивированным бактерином аэрозольным и шт^имускулярным методом в дозе 1,5 мл/м3 и 0,25 мл/гол (соответственно) через 15, 30, 45 и 60 суток их подвергали интратрахеаль-кому заражению вирулентной культурой.

Установлено, что в результате применения бактерина количество иммунных цыплят составляет 60,0-73,4^. Око является максимальным при аэрозольном методе (73,4$),

Через 30 суток поело вакцинации применение инакгивированио-го бактерина обусловливает формирование иммунитета к И.о. при аэрозольном и внутримышечном введении в 75,0-70,03, гибель конт-рольнчх птиц составляла 90,0$, через 45 сутон протективные свойсч на инэктивирояанного бактерина являются выраженными и практически они соответствуют иммунологическим показателям у птиц 30-су-точного возраста.

Наблюдения о продолжительности иммунитета были проведены и на птице более старшего возраста. Через 60 суток после иммунизации количество птиц, восприимчивых к возбудителю РМ возрастает д 9-65,0%, Соответственно о'.ому, число иммунных птиц составляет 40,0-35,0:3.

Через 60 суток после введения инактивированного бактерина проведена серия опытов по ревакцинации. Установлено, что реваку нация обеспечивает формирование иммунитета при аэрозольной и вн! трданшечной аппликации у 80,0-76,7% птиц /соответственно/. Гиба) контрольных аналогов, зараженных, но но подвергавшихся го-мункза-

ции, составляла 90,0%,

Установлено о что при добавлении гидроокиси элючтеия иммунологическая реактивность повышается менее, чем при использовании бактерина с полны?/ адъюЕантом Фрейяда.

2.2.8.2. Влияние полиоксидония на формирование ии/унитета I; возбудителю РМ. Препарат применяли азрозольно одновременно, с инактивированным бактеринсм, в рчо^воро 0,3* концентрации, доза 1,5 мл/м3. Опыты проведены на 40 цыплятах 20-суточного возраста, которых заражали интратрахеально культурой М ^^-¿ерЫлит через 30 и 45 суток посла вакцинации.

В результате установлено5 что применение НО обеспочивает по-зкление иммунологической реактивности организма» Количество птиц, невосприимчивых к заражению возбудителем РЧ, возрастает до 15;*.

Установлена активизация антитеясобраэования и увеличение ко-[ичества розеткообразущих клеток в тимусе к крови. Данные мате— ятической обработки достоверны /Р^ 0505/„

2.2.8.3. Испытание инактивированного бактерина в произподсг-енных условиях. На птицефабриках "5я и КТ" аэрозольной об(пбот-е подвергнуто 1500 ятиц 60-90-суточного возраста (1группа). В онтсолъной группе (П) находилось 1500 птиц-аналогов. В резуль-атр наблюдения в I группе клинических признаков заболевания не стаюзлеяо, сохранность составила 86„0%. Патологоандтсмичесеие зменения обнаружен у 20 (1,3%) птиц.

Во П группе при сохранности 72,5$ признаки респирагср^Ы* йсстройств наблюдались у 6Ь птиц {4,3«)е глтолагочнзтои^ческие !мбк5ння в органах дыхания у НО (7,3%).,

Среднесуточный призэс з^мунизированных птиц превышал привес •иц контрольной грунта ка 5,0-8,0 г.

30 В Ы 3 О д ы

3.1. Респираторный микоплазмоз причиняет значительные окоио-

- 19 -

мическке потери птицеводческим хозяйствам промышленного типа Реслублжм ¿'руакя.

3,2« Изолированные нами эпизоотические штаммы микоплазм, использованные для изготовления инактивировакного бактерина» по антигенным свойствам идентичны штамму аЬиьсрЫои т и отличаются от референтных штатов М ^а-С&пани.^ М. йупоиСае. /¿Д. и, еЛе о о -о^ С V Ь

3.3. Оптимальной концентрацией формалина для инактивации микоплазм ири изготовлении бактерина служит 0,2% раствор /содержание формальдегида не нкне 38%/ при задерживании культуры при температуре 38сС в течение 43 час.

3.4. Умактизировашый бактерии является активным и специфичным. Он обусловливает выраженную ГА с позитивной сывороткой к Л*.уа,££4!>срисимЯь отрицательную со специфической сывороткой к Л/ <

различным серовариантам Е.СоИ*, антисывороткам к вирусу инфекционного бронхита, вакцинным штаммам вируса ныокаслской болезни, поливалентной сальмонеллезной и нормальной сыворотками.

3.5. Введение ^активированного бактерина с полным адыован-том Фрейндя приводит к формированию специфических микоплазменных антител. При интрамуокулярном введении они обнаружены на 7 сутки в титре 1:8, 16 и 20 - 1:12В, 45 к 60 сутки - 1:128, при аэрозольном 1:64, 1:12а, 45 и 60 - 1:255 /соответственно/.

3.6. Установлена прямая корреляция между относительным количеством роэеткообраэуюцгас клеток в №,1усе и крови и титром специфических микоплазменных антител в сыворотке крови птиц.

Через 4 и ТО дней после иммунизации инактивированным бакте-уилом у птиц 60~днеэного возраста число РОК в тимусе составляет П ,1*0,3 - 12,1*0,1%, в крови 13,-3*0,1 - 10,9*0,К; у контрольных '»,:>*] ,5 и 2,1*0,и, /соответственно/; через 15, 20 дней в тимусе

0,8±0,1 - Ю,8±0,04^, в крови 10,4^,04 - Ю,2±0,04Й; у контрольна 5,0-2,0 - 2,1-0,04% /соответственно/.

3.7. При иммунизации птиц инактивированным бактерином нчблю-.нотся изменения в белково» спектре сыворотки крови наиболеэ зыра-знные в содержании фракции гамма-глобулинов.

На 4,7 714 и 25 сутки количество их при внутримышечном и ээро-)лыюм введении составляет 40,6^4Т,9; 41,1^42,9; 43,1243,0; 45,1± 5,1%; у контрольных - 38,9£33,5; 35,6; 35,1% /соответственно/.

3.8. Инактивированный бактерии обусловливает формирование ?мунитета при аэрозольном и внутримышечном введении п организм. >рез 15 суток количество незоспркишизых лтиц составляет 73,4 и >,7; через 30-45 суток - 75,0 и 70,0: через 60 суток - 60,0 и

1,0% /соответственно/, После реиммуниэации птиц через 60 сугок поместив иммунных птиц составляет 80,0-76,7% птиц /соответственно/.

Применение ИСК полиоксидония способствует повышению числа иц, устойчивых к искусственному заражения возбудителем РМ до ,0%. Сумма экономического эффекта от применения И!!актнвирозпнно~ бактерина в производственных условиях составляет 2,4-3,2 тыс. С. на 1000 птиц.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

4.1. Результаты проведенных исследований включены в 'Рексен-ции по диагностике микоплазмоэов с.-х„ птиц", Наряду с другими }ораторными тестами, они применяются для дифйеренииацга; раздич-с видов микоплазм, иэолироэгнкъг/. от птиц.

4.2. Полученные данные могут быть использозаны для изготог-гкя и Гд^оизЕодственного испытания опытно-промьгпленнэй серии [ктивиросанного бат'терина претив ррпшгрзторного микоплазг/озч 1Ц.

- 21 -

Слисок работ, опубеликованных по теме диссертации

1. Некоторые особенности культивирования микроорганизмов класса JUeikcuicb //Груда ВИЭВ, М., 1985, т.62, с.97-102 /соавтор Грошсва Г.Д., Фролова B.C., Марченко Е.В./.

2. Показатели гуморального иммунитета у птиц, вакцинированных претив респираторного микоала.змоня инактивированным антиге-ном//Бплл.ВИЭВ, 1988, в.65, с.85-87.

3. Респираторный микоплазмоз. - М.Сакартвелос соплис меурнеоба,

1988, К' 5, с.25 /соавторы Мачавариани А.Т., Бакурадзе М.Д./.

4. Серологические показатели иммунитета у спонтанно больных респираторным микоплазмозом птиц/ Инфекционные болезни с.х. животных, методы диагностики, лечения и профилактики. Тбилиси,

1989, с.65.