Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммуногенные и протективные свойства эшерихиозного анатоксина

на правах рукописи

КАРАЕВ ЯН МИХАЙЛОВИЧ

ПРОТЕКТИВНЫЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ЭШЕРИХИОЗНОГО АНАТОКСИНА

16.00.03. - ветеринарная микробиология, внрусоло! ия, эпн-1(1оIоло! ия, микология с микотоксикологией и иммунология

Ашорсфсрж

диссертации па соискание ученой степени кандидата ветеринарных паук

0 5

Краснодар 2008

003455202

Paöoia выполнена на кафедре зпиюотло!ин и вирусолопш ФГОУ КПО «Кубанский государственный аграрный yiinucpciriei»

Научный руководи!ель:

доктор биологических наук, профессор Терехов Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор Beiеринарпых паук Басова На кип.я Юрьевна

доктор ветеринарных наук, профессор Кононов Анатолий Николаевич

Подущая организация: ФГОУ ВГ10 «Донской государственным аграрный университет»

Зашита состоится » QQP^yl__2008 г в уЮ.ОС» часов па sace-

даиии диссертационного совета Д 220.038.07 в Кубанском государа венном aipapnoM университет по адресу: 350044. г.Краснодар, ул. Калинина. 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университет.

Автореферат рашешен па официальном сайте университета но адресу: http: V www.kubagro.ru

Автореферат разослан « » Ц-РЯ

ijL*2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.А.Родни

I. Общая харакчсристнк-п работы

Актуальность работы. Согласно данным отечественных ученых желудочно-кишечные болезни являются основной причиной гибели молодняка сельскохозяйственных животных (Коробов А.В. и др., 2001: Субботин В.В. н др., 2001; Мищенко В.А. и др., 2002; Ьелов Л.Г. и др., 2002; Щербаков П.И. и др.. 2002; Xiirpcma А.Е. и др., 2006). Особое место в ряду болезней сопровождающихся поражением пищеварительного тракта, занимает )ше-рпхиоз, поскольку им могут поражаться до 50-100% новорожденных телят и поросят, при этом летальность доходит до 30-50% (Жосап Н.Н., 1989; Беднягин В.Е„ 2000; Ковальчук И.М. и др., 2000).

Предрасполагающими факторами появления и распространения эше-ри.хиоза служат не только нарушения вегерипарпо-санитарных правил и зоогигиеиичеекпх режимов содержания животных, но и биологические свойства возбудителя болезни - Escherichia coli. Являясь постоянным обитателем кишечника животных и человека, данный микроорганизм составляет его микробиоценоз. В норме кишечная палочка выполняет ряд полезных для хозяина функций - синтез витаминов и аминокислот, поддерживает колонизационную резистентность кишечника и обеспечивает антигенную стимуляцию местного иммунитета (Зсмеков В.М., 1984; Медицинская микробиоло! ия, 1999). Между тем, при нарушениях микроэкологического характера, Е. со I i способна резко наращивать не только свое количественное присутствие, но и проявлять патогенные свойства. Постоянный антигенный дрейф, маличие или приобретение различных факторов патогенно-сги (экзотоксины, гемолизины, некротизирующий и гемолитический фактор, сидерофоры) затрудняют проведение эффективной специфической профилактики эшерихиоза, что побуждает не только постоянно осуществлять эпизоотологический мониторинг данной инфекции, но изучать и кон-фолировать биологические свойства возбудителя (прежде всего его анти-биошкорезисгетность н наличие различных маркеров матогенпостп).

За более чем вековой промежуток времени со дня открытия кишечной палочки и установления ее эт иологической роли в развитии диарей у человека и животных подходы к разработке специфических средств профилактики эшерихиоза длительное время базировались исключительно на ис-нольювании соматических О-антигснов. Однако после установления отсутствия коррелятивной связи между О-антнгепным профилем Е. coli и се па-тогенноетыо, и, напротив, присутствием таковой между наличием специфических адгезипов и способностью вырабатывать экзотоксины, как в нашей стране, гак и за рубежом стали создавать компонентные вакцины, в состав которых помимо О-антигена, входят пилевый и гоксоидный антигены (Иманалиев М., 1990; Девришов Д.А. и др., 1998; Волков И.А., 2008;. lkcmori Y et al., 1993,. Alexa P et al., 1995). Между тем. ряд отечественных и зарубежных исследователей считает, что все же основополагающая роль в патогенезе эшерихиоза принадлежи! экзотоксинам, а поэтому их ннактивирован-ные формы, прежде всего, нужно использовать в качестве средств спетти-

фической профилактики ( Емсльяненко П.А. и др., 2000; Романов Е.А. и др., 2000; Бондаренко В.М., 2002; Фокнн А. А., 2005; Панькова С.Ю. и др., 2005; Dean-Nystrom Е.А. et al., 1993; Said A.M. et al., 1994 ; Alexa P. Etal, 1998).

В связи с этим получение специфического биопрепарата на основе токсинов Е. coli и изучение его влияния на организм животных является актуальным направлением ветеринарной медицины, так как может способствовать повышению эффективности профилактики эшерихиоза.

Цель и задачи исследований. Основной целью работы было получение эшерихиозного анатоксина и изучение его иммунногенных и протек-тивных свойств.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- разработать питательную среду и определить оптимальную продолжительность культивирования токсигенных штаммов Е. coli;

- изготовить эритроцитарный диагностикум для выявления антитоксических антител в сыворотке крови животных после иммунизации их эше-рихиозным анатоксином;

- изучить влияние эшерихиозного анатоксина на иммунобиологическую реактивность лабораторных животных;

- изучить протективные свойства эшерихиозного анатоксина.

Научная новизна. Были установлены оптимальные условия культивирования токсигенных штаммов Е. coli, при которых происходит максимальное накопление термолабильного, термостабильного и шиганодобно-го токсинов. Разработан эритроцитарный диагностикум для выявления специфических (антитоксических) антител в сыворотке крови животных после иммунизации эшерихиозным анатоксином. Установлены особенности изменения гематологических показателем, функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и образования специфических антител в ответ на введение животным различных доз эшерихиозного анатоксина. Выявлено влияние гидроокись алюминия и полиакриловой кислоты на иммупногенные свойства эшерихиозного анатоксина. Изучена протектив-ная активность эшерихиозного анатоксина при экспериментальной коли-эптеротоксимии.

Научная новизна работы подтверждена положительным решением на выдачу патента на изобретение по заявке № 20071 12764/13(013860).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили установить оптимальные условия культивирования экзотоксинпродуцирующих штаммов кишечной палочки. В ходе выполнения работы был разработан эритроцитарный диагностикум для выявления антитоксических антител в сыворотке крови у иммунизированных животных. Полученные данные позволили выявить особенность реагирования организма животных в ответ на введение инактивированных токсинов Е. coli, а также установить протективную активность полученного эшерихиозного анатоксина.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научных конференциях сотрудников факультета ветеринарной медицины К у-

байского ГЛУ (Краснодар, 2006, 2007, 2008); 1-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 2007). Результаты работы были отмечены дипломом 2-й степени.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в т. ч. в рецензируемом журнале рекомендованном ВАК.

Структура и обьем работы. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из «ведения, обзора литературы, материалов и методой исследования, результатов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, предложений и списка использованной литературы. Работа включает 32 таблицы и I I рисунков. Список литературы содержит 186 источников, из числа которых 78 иностранных.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Определение оптимальных условий культивирования энтеротокеи-генных эшерихий с контролем накопления токсинов и последующей их инактивацией;

- Особенности влияния различных доз анатоксина на гематологические показатели и функциональную активность нейгрофильных граиуло-цитов в динамике;

- Особенность антителообразования в ответ на введение эшерихиоз-ного анатоксина и его протективная активность.

2. Материалы и методы исследовании

Исследования проводили в 2005-2008 гг. на кафедре эпизоотологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины Кубанского ГАУ.

В ходе выполнения работы было проведено 50 бактериологических. 420 гематологических, 547 серологических и 980 иммунологических исследований. В опытах было использовано 485 белых крыс, 170 белых мышей и 80 кроликов породы советсткая шиншила.

Изоляты Е. coli выделяли из патологического материала от больных и павших телят и поросят из неблагополучных по эшерихиозу хозяйств Краснодарского края, при этом бактериологические исследования проводили общепринятыми методами, согласно «Методическим рекомендациям по бактериологической диагностике колибактериоза животных и птицы».

Принадлежность выделенных изолятов к Е. coli подтверждали исследованиями на биохимическую активность с использованием «ENTEROtest 24» фирмы PLIVA-Lachema Diagnostika (Чехия).

Серологический профиль выделенных Е. coli устанавливали с помощью типоспецифических О-агглютинирующих колисывороток (Армавирская биофабрика) и адгезивных колисывороток (ВНИИ прикладной микробиологии. г. Оболенск).

Наличие генов натогенносги эшерихий определяли с помощью ПЦР-диагиостики в ООО «Европейские Технологии» (г. Краснодар), Цетральном НИИ эпидемиологии (Москва) и НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

11.Ф. Гамалея (Москва). Для выявления специфических участков ДНК генов шнгатоксииа I типа (STXI), шиготоксина II типа (STX2) энтерогеморрагичс-ски\ Е. coli, термостабильного (ST) и термолабильного (LT) эптеротоксииов этеротоксигенных Е. coli были использованы тест-системы «АмплиСенс Е. Coli-tox» ЦМИИ Эпидемиологии МЗ РФ.

Амплификация специфических участков ДНК осуществлялась на ам-илификагоре с активным ре[улированием «Терцик» (ДНК-технология) по следующей программе: инициализация: ! цикл - 5 мин при температуре 95"С, затем 40 циклов по следующей последовательности каждого из них: 10 сек 95"С, 10 сек 65°С и 10 сек 72"С. Анализ продуктов амплификации проводился разделением фрагментов ДНК в агарозном геле. Длина амплифициро-ваиных специфических фрагментов Е. coli: VT-I - 730, VT-2 - 310, ST - 170, LT - 700 иуклеотидных пар.

Оценку токсинообразования Е. coli проводили методом биотестирования с использованием инфузорий рода стилонихиа (Терехов В.И., 2003). Для этого в среду с простейшими вносили бульонную культуру кишечной палочки в соотношении 3:1. Для исключения погрешности, связанной с влиянием различных факторов окружающей среды исследования осуществляли в 5 по-вторностях, после чего подсчитывали средний процент выживания микроорганизмов.

Для изучения влияния на иммунную систему инактивированных токсинов использовали белых крыс с массой 180±10 г. Для этого было сформировано 5 групп по 70 животных в каждой: I группа - интактные животные (отрицательный контроль): 2 группа - животным инъецировали стерильный питательный бульон (положительный контроль); 3 группа - животным инъецировали 0,15 мл эшерихиозного анатоксина; 4 группа - животным инъецировали 0,3 мл эшерихиозного анатоксина; 5 группа - животным инъецировали 0,6 мл эшерихиозного анатоксина. Через 1, 3, 6, 12, 24, 72 и 168 ч у 10 животных из каждой группы отбирали кровь, отсекая кончик хвоста. В крови, используя автоматический гематологический анализатор MEDONIC CA 400, определяли количество эритроцитов, лейкоцитов к гемоглобина. Отдельно выводили лейкоформулу, по которой для установления оценки выраженности ciericiiii эндогоксикоза и уровня воспалительной реакции рассчитывали лейкоишоксикацнониый индекс (ЛИИ=Ми+Ю^ ГЫ С+П /' Э+Б-+Л+М, где Ми - мнел оциты, Ю - юные, Пл - плазматические клегки, 11 - папочкоядерные, С - сегментоядерные, Э - эозинофилы, Б - базофилы, Л - лимфоциты, М -моноциты) (A.B. Караулов, 1999). Величина ЛИИ от I до 2 свидетельствует о лсич'ой степени интоксикации, 2,1-7 - средней степени, 7,1-12 - тяжелой, а свыше 12,1 - о терминальном состоянии организма.

Фагоцитарное звено иммунитета оценивали по показателям фагоцитарной активности нейтрофилов (ФА), фагоцитарному числу (ФЧ), фагоци-1арому индексу (ФИ). Оценку завершености фагоцитарой реакции и процесса переваривания оценивали по индексу завершенного фагоцитоза (ИЗФ) и процент) переваривания (% перевар.). Состояние мобилизационной способности и микробицидной активности нейтрофильных гранулощпов определяли, не-

пользуя НСТ-тест и цитохимические индексы - индекс уровня активации миелопероксидазы (СЦИ МП) (по Sato в модификации Нестеровой И. В. с соаит., 1993), индекс уровня активации эсгераз (СЦИ ХА) (по Нестеровой И. В. с соавт., 1993), индекс уровня активации катионных белков (СЦИ КБ) (по Пигаревскому В. М. в модификации Нестеровой И.В. с соавт., 1993) (Нестерова И.В. и др., 1993). В качестве объекта фагоцитоза использовали S. aureus 209Р.

Определение в сыворотке крови животных специфических антитоксических антител осуществляли методом диффузной преципитации в агаровом геле (РДП) по Ухтерлони (Пирожков М.К., 2002) и в реакции непрямой ге-магглютииации (РНГА) с разработанным нами эритроцитарным диагности-кумом. При этом эритроциты барана получали общепринятым методом путем дефибринирования свежеполученной крови с последующим отмыванием забуференным физраствором (рН 7,2). Часть отмытых эритроцитов хранили в ЗФР при температуре 2-6°С, а остальные формапинизировали по Weinbach (Каральпик Б.В. и др., 1973). Приготовление эритроцитарного диагностикума подробно описано в разделе 3.3 диссертации.

Изучение антигенных свойств анатоксина проводили на белых крысах массой 180±10 г. Для этого поставили 3 серии опытов. В первой серии опытов определяли уровень специфических антител в сыворотке крови после однократного введения анатоксина. Для этого было сформировано 3 группы животных по 10 голов в каждой. Животным I группы инъецировали 0,15 мл анатоксина, 2 группы - 0,3 мл, 3 группы - 0,6 мл. Через 7, 14 и 21 день у крыс проводили взятие крови, в сыворотке которой в РНГА определяли уровень титров специфических антител.

Во второй серии опытов исследовали уровень специфических антител в сыворотке крови при двукратном введении анатоксина. Для этого сформировали 4 групп животных по 10 голов в каждой. Животным 1 группы анатоксин инъецировали дважды с интервалом 7 дней по 0,15 мл; 2 группы - первый раз 0,15 мл, а второй - 0,3мл; 3 группы - дважды по 0,3 мл; 4 группы - первый раз 0,3 мл, а второй - 0,6 мл. Сыворотку крови получали через 7, 14 и 21 день после второй инъекции препарата.

В третьей серии опытов исследовали уровень титров специфических антител в сыворотке крови при иммунизации животных дозой анатоксина 0,15 мл в комплексе с различными адыовантами при одно- и двукратном введении. В качестве адъювантов использовали полиакриловую кислоту (ПАК) и гидроокись алюминия (ГОА). Объем введения ГОА в анатоксин - 20%, а ПАК - 0,3%. Для проведения опыта сформировали 6 групп животных по 10 голов в каждой. Животным 1 группы однократно инъецировали комплекс анатоксина с ПАК в дозе 0,15 мл; 2 группы - двукратно с интервалом 7 дней комплекс анатоксина с ПАК в дозе 0,15 мл; 3 группы - однократно комплекс анатоксина с ГОА в дозе 0,15 мл; 4 группы - двукратно с интервалом 7 дней комплекс анатоксина с ГОА в дозе 0,15 мл; 5 группы (контроль) - однократно инъецировали вакцину Коли-Вак в дозе 0,15 мл; 6 группы (контроль') -двукратно с интервалом 7 дней вакцину Коли-Вак в дозе 0,15 мл. Сыворотку

крови исследовали в РИГА на 7. 14, 21. 2S и 32 день после последней ипьек-ции препаратов.

Отбор крови для получения сыворотки проводили через 14 дней после последнего введения анатоксина. Кровь брали из поверхностной вены латеральной поверхности тазовой конечное! и в пробирки VENOJECT® II (Бельгия) с гелем

Протективные свойства анатоксина изучали на I-месячных кроликах. Для этого сформировали 11 групп по 5 голов в каждой. Животным 1-5 группы однократно внутримышечно инъецировали анатоксин в дозах 0,07-0,150,3-0,6-1,2 мл соответственно. Животным 6-10 группы однократно внутримышечно инъецировали вакцину Коли-Вак в дозах 0,07-0,15-0,3 -0,6- 1,2 мл соответственно. Животные I 1-й группы служили контролем, им ничего не вводили. Через 7 дней после введения препаратов животному каждой группы ректально на глубину 7-8 см с помощью уретрального катетера вводили смесь токсинсодержащей безмикробной культуры E.coli штаммов №44, 533 и 546. Смесь токсинов получали путем объединения бульонных культур соответствующих штаммов выращенных на авторской питательной среде в течение 6-7 дней с последующим центрифугированием в течение I ч при 10 тыс. об/мин. В предварительных опытах было установлено, что доза, обуславливающая у 1-1,5-месячных крольчат острую диарею, завершающуюся спустя 2-3 дня легальным исходом, составляет 3,0 мл (Коткова Н.В., 2007). Перед заражением кролики в течение 12 ч выдерживались на голодной диете со свободным доступом к воде. После заражения за животными вели наблюдение в течение 10 дней, учитывая при этом количество заболевших п павших. По результатам полученных данных высчитали ИД50, используя метод Кер-бера(Ашмарин И.П. и др., 1962).

Математическую и биометрическую обработку полученных результатов с определением степени достоверности по распределению Стыодента осуществляли с помощью компьютерной программы Exse! 2003 (Гельман В.Я., 2001).

3. Результаты собавенных исследований

Проанализировав и обобщив результаты исследований ранее проведенных на кафедре эпизоотологии и вирусологии Кубанского ГАУ (П.В. Коткова, 2007) было установлено, что среди эпизоотических штаммов выделенных от больных колибактериозом теля! и поросят в Краснодарском крае 50,4% изолятов обладали генами экзотоксинов. Среди которых наиболее часто встречались штаммы с генами LT (25,2%) и STX2 (11,8%). Около 8% щученных штаммов содержали сразу 2-3 маркера экзотоксинов (STX + ST. S I X 4 LT и STX + ST f LT), а это значить, что они могли продуцировать сразу 23 вида токсинов. Следовательно, установленный факт широкой циркуляции токсигенныч вариантов кишечной палочки на фермах края предопределяет необходимость разработки вакцинного препарата, содержащего в своем со-

славе ннактивироваиные формы тсрмолабилыюго гермостабильного и шша-подобного токсинов.

3.1. Получение эшеримюшого анатоксина 3.1.1. Характеристика штаммов продуцентов

В процессе многократ ных ДНК-исследоваииП осуществляемых на протяжении 3 лет нами отобраны штаммы Е. coli, которые не только прочно сохраняли наличие генов гермолабилыюго, термостабплыюто и шигаподобно-го токсинов, но и продуцировали данные токсины, что было установлено с помощью тестирования на инфузориях, в тесте отека лапки у белых мышей и в тссте на мышатах-сосунах.

Штамм E.coli №44 был выделен в 1991 г. от 1,5 месячного теленка. Данный штамм имеет антигенную формулу 0157:117. Является продуцентом шнгаиодобного токсина шна I и 2. На кровяном агаре с эритроцитами барана oopasyer а - гемолиз. ЛД,« для белых мышей при внутрибрюшинном введении составляет 1,2х 10 микробных тел. По биохимической активности типичен для данного вида эшерихий.

Штамм E.coli №533 был выделен в 2000 г. от 10-дневного поросенка. Данный штамм имеет антигенную формулу 0141 :К99. Является продуцентом термостабильного токсина. На кровяном агаре с эритроцитами барана образует ß - гемолиз. -ПДзд для белых мышей при внутрибрюшинном введении составляет 3,0х108 микробных тел. По биохимической активности типичен для данного вида эшерихий.

Штамм № 546 выделен в 2000 г. от 2-дневного поросенка. Имеет антигенную структуру Ol 1 l:F41. Является продуцентом термолабильного токсина. IIa кровяном агаре с эритроцитами барана дает ß - гемолиз. ЛДх: для белых мышей при внутрибрюшинном введении составляет 5,0* Ю8 микробных тел. По биохимической активности типичен для данного вида эшерихий.

3.1.2. Подбор оптимальной среды и режима культивировании дли продукции эшерихнями экзотоксинов

Для получения экзотоксинов E.coli нами была разработана жидкая питательная среда, которая представляет собой прозрачную светло-коричневого цвета жидкость с легким хлебным запахом, pl I 7,2-7,6. В качестве источника амииного азота и микроэлементов использовали кислотный гидролига г крови, дополнительного азотного питания - ферментативный пептон, стимуля-Iopa роста - ауголизат пекарских дрожжей. Для обеспечения оптимальных осмотических условий в среду добавляли натрия хлорид, калия хлорид и двузамещенный фосфорнокислый натрий. На данной среде рост кишечной палочки характеризовался интенсивным помутнением и образованием черет 24-36 ч на поверхности бульона пленки и обильного придонного осадка.

При сравнительном изучении токсичности 24-часовых культур в биотесте на инфузориях было установлено, что центрифутaiы культур №№44. 533 и

546, полученных на авторской питательной среде в большей степени токсичны для стилонихий, чем полученные на МПБ и бульоне Хоттингера.

Кроме того, установлено, что процессы токсиообразования зависят не только от среды культивирования, но и от продолжительности культивирования. Максимальная гибель инфузорий была отмечена после добавления к ним 6-дневных культур штаммов №533 и №546 и 7-дневной культуры штамма №44, когда установили гибель соответственно 92,8±7,3, 83.5±8,4 и 89,4±6,1% клеток инфузорий. Увеличение сроков инкубирования не привело к повышению токсичности бульонов, напротив, было отмечено, что каждый последующий день культивирования сопровождался снижением токсичности бульонных культур. В связи с этим, наиболее оптимальным сроком инкубирования Е.соП для получения экзотоксинов следует считать 6-7 дней.

3.1.3. Получение анатоксина

Для получения эшерихиозного анатоксина, отобранные штаммы по отдельности засевали в пробирки с 10 мл питательного бульона, после чего их помещали в термостат, где культивировали при 37°С в течение 6-8 ч до появления легкой мути, свидетельствующей о росте микроорганизмов. Затем полученные культуры переносили в колбы с 200-300 мл питательного бульона и инкубировали при 37°С штаммы №533 и №546 в течение 6 суток, а штамм №44 - 7 суток. Ежедневно 2 раза в сутки колбы встряхивали. По окончании инкубирования из каждой колбы отобрали по 10 мл культураль-ной жидкости и использовали ее после центрифугирования при 10 тыс об/мин в течении 30 мин для определения наличия токсинов. В оставшиеся культуры добавили формалин до концентрации 0,3-0,4%. Инактивацию культур проводили в течение 14 суток при температуре 37°С с ежедневным двукратным перемешиванием.

В отобранных образцах определяли наличие токсинов. Для чего воспользовались любезно предоставлеными нам НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея (г. Москва) и Московской медицинской академии им. Сеченова анти ЬТ-, анти БТ-сы вороткам и и набором для определения шига-токспнов методом реакции Ко-агглготинации. Результаты этой работы свидетельствовали, что при культивировании штаммов-продуцентов в питательной среде действительно идет накопление токсинов, а, следовательно, данные бульонные культуры можно использовать для получения анатоксина. В связи с этим, по истечении 14 дней провели определение полноты инактивации токсинов в бульонной культуре, для чего осуществили посев каждой на МПБ, МГ1А и агар Эндо, а также ввели внутрибрюшинно по 0,3 мл 5 белым мышам. Учет результатов осуществили через 10 дней. При этом было установлено полное отсутствие бактериального роста и сохранности всех мышей.

После этого объединили равные объемы инактивированных культур, получив, таким образом, комплексный препарат, содержащий вида 3 антигенов. С помощью стерилизующей фильтрации отделили микробную массу от среды культивирования. Готовый препарат представлял собой прозрачную,

еветло-же.1 юго цвета жидкость, icoiopyio в acern ическпх условиях разлили но стерильным флаконам обьемом 10 50 мл с последующей их укупоркой стерильными резиновыми пробками и обкаткой алюминиевыми колпачками.

Расфасованный анатоксин вновь проверили па асрильносгь с использованием MI Iii. среды Кшт-Таропци. Сабуро, ')ндо, а также на бе ¡вредность па 5 белых мышах, которым внуфибрюшиппо ввели препарат в дозе 0,3 мл.

Данные исследования показали, что полученный анатоксин был стерильным. iai< как на средах отсутствовал рост бактериальной и грибной флоры и безвредным, поскольку ни одна из 5 белых мышей в течении 10 дней наблюдения не пала.

Таким образом, нами был получен стерильный и безвредный препарат, который содержит ннакшвпрованные формы термолабнлыюго, термостабильного и шнганодобпого токсинов и может быть использован для дальнейших исследований его антигенных и пммуногенных скопив.

3.2. Разработка эртпроцп тарного дпапшешкумн

Для обнаружения специфических антшел к растворимым антигенам чаще всего используют реакцию диффузной преципитации в агаровом геле но Ухтерлопи. Однако в предварительных опытах нами было усыновлено, что данный серологический метод имеет ряд недостатков, основными из которых являются низкая чувствительность и длительный промежуток времени получения результатов. Поэтому нами был разработан диагностикум для выявления специфических антител в реакции непрямой гемагглюгинации.

Использование пативных эритроцитов барана в качестве носителей антигенов показало эффективность данного метода для визуального выявления специфических антител. При этом чувствительность метода оказалась в 1020 раз большей, а время получения результата во столько же раз короче, чем в РДП. Однако использование пативных эритроцитов имело одни недостаток - непродолжительность хранения, а, следовательно, короткое время использование такого диагпостикума. Срок годности эрнтронигарного диагностику ма можно увеличить за счо оабилизации эритроцитов, для чего чаще всего использую! фарамалинизацию и таннзацию. Испытав оба них метода, нами установлено, что для получения диагпостикума по обнаружению специфических ли I и токсических антител лучше использовать 1,5% формалин при соотношении фиксатора и эритроциюв 0.375:1 с продолжительность фиксации 18-20 ч при температуре 37 °С. Полученные таким образом формалиии-зированные эритроциты не теряли рецепторы к экзотоксинам Е. coli, длительно хранились в условиях холодильника, давали четкую реакцию агглютинации при внесении иммунной сыворотки в разведении 1:64 - 1:128.

Таким образом, нами разработан простой, дешевым и чувствительный диагностикум, позволяющий в течение 2 ч проводить обнаружение специфических антител после иммунизации животных эшерихиозным анатоксином.

3.3. Влияние эшсрнхиозпого анатоксина на иммуно-бполо! пческую реактивность лабораторных животных 3.3.1. Влияние эшерихиозного анаюксина на картину кропи

После введения крысам, как анатоксина, так и стерильного бульона (положительный контроль) у них картина красной крови во все временные отрезки исследования оставалась стабильной, в то время как картина белой крови претерпевала существенные изменения (рис.1, 2 и 3)

Уже через I ч после введения анатоксина и питательного бульона у животных опытных групп наблюдалось снижение общего количества лейкоцитов относительно интактных животных (отрицательный контроль). При этом было установлено, что у интактных крыс на долю лимфоцитов приходилось 85,0% всех лейкоцитов, а нейтрофилов- 14,3%. У животных, которым ввели анатоксин в дозах 0,15-0,3-0,6 мл, количество этих клеток стало 64,7; 67,0; 66,0 и 29,7; 29,3; 30,6% соответственно. Между тем, аналогичное изменение, но в меньшей степени, было установлено и у животных, которым ввели стерильный бульон.

*К0111|>0 II. П111Л.1

Ж коIII[1« 11.0 ' ПЬ

О ohi.ii «М )\

о оиьгг (1 * ")А

«Сь тош.п Ы> )\

1ч Зч 6ч 12ч 24ч 72ч 168ч

Рисунок 1 - Изменение общего числа лейкоцитов в крови у крыс опытных и контрольных групп (10 /л)

Спустя 3 ч после введения анатоксина установлено, что различные его дозы по разному оказали влияние на лейкоцитарные клетки. Так если у животных в группе №3 (доза анатоксина 0,15 мл) их общее количество еще снизилось на 0,7-10%, то у животных группы № 4 и 5, напротив, увеличилось на 4.4 и 7,4-10% соответственно. У крыс группы №2 (положительный контроль) эгог показатель не изменился. В лейкоформуле животных данных групп по-прежнему присутствовала тенденция уменьшения относительного количества лимфоидных клеток, и увеличение нейтрофильных гранулоцитов. При этом количество сегментоядерных нейтрофилов у крыс 2-й группы достигло 31.311,1%, 3-ей - 44,3±0,8, 4-ой - 43.0±1,1 и 5-й - 65.7±0,6%. Изменений в крови, свидетельствующих об аллергизирующем или раздражающем действии введенных субстратов, не установлено. При этом отчетливо видно, чем выше вводимая доза, тем в большей степени уменьшается количество лимфоцитов и увеличивается зрелых нейтрофилов.

.мши

Ж кНИЦКН! 1) 11II.

• О НИ,41 ()|

О ОНИ 1 О! ')Л

«■"О-олЫ! [И. И

Рисунок 2 - Изменение процентного содержания нейтрофилов в крови у крыс опытных и контрольных групп (%)

Через б и 12 ч после введения бульона и анатоксина у крыс группы положительного контроля и опытных групп, содержание в крови общего количества лейкоцитов достоверно не различалось от такового у животных группы №1. Однако у крыс 2-5 групп в лейкоформуле количество лимфоцитов все ещё оставалось значительно более низким, чем у крыс 1-й группы. Так у животных 2 группы эта разница составляла 10,2-12,7%, 3 группы - 26,628,0%, 4 группы - 20,6-30,0%, 5 группы - 30-42,0%. Количество нейтрофилов, напротив, было адекватно более высоким. Если у животных I группы данная популяция лейкоцитов составляла 13,7-15,3%, то у животных 2-5 групп соответственно 24,3-26,7%, 41,3-43.3%, 33,0-41,6% и 44,0-54,7%.

Ш1ГЛк~1

'К Кинфо) 0 5 111.

о „мыт 0 1

Ф ОПЫ10 '

"О-ишп 'П

Рисунок 3— Изменение процентного содержания лимфоцитов в крови у крыс опытных и контрольных урупп (%)

Спустя 24 ч у животных контрольных и опытных групп содержание в крови лейкоцитов было практически одинаковым и достоверно не различалось. Кроме того, у крыс 2-й группы параметры лейкограммы также сравнялись с таковыми у животных 1 группы, что является свидетельством прекращения действия введенного бульона. Между тем у животных 3-5 группы по-прежнему установили достоверно более низкое, чем у интактных крыс содержание лимфоцитов и более высокое - нейтрофилов. Наиболее выраженная разница была у животных 5-й группы, которым анатоксин ввели в дозе 0,6 мл. У них относительное количество лимфоцитов было на 27,0% ниже, а количество нейтрофилов на 22,0% выше, чем у интактных особей.

Спустя 72 ч после начала опыта было установлено, что у всех полоны i пых животных резко и практически одинаково во ¡росло общее количество лейкоцитов. 'Гак если у крыс контрольных групп она была на уровне 7. КО,98 7.3±0,13'10"/л, то крыс опытных групп - I 1,3 10,29-11,9:1-0,37-10%. Изучение лейкограммы позволило установить, что наблюдаемый лсйкоцшоз произошел за счет увеличения количества лимфонитарныч клеток. Это хорошо видно на примере группы №3, у животных которой относительное количество и лимфоцитов и пейтрофилов стало равным показателям животных контрольных групп, у которых общее количество клеток белой крови оставалось аабильиым и одинаковым.

Через 168 ч после введения анатоксина гематологические показатели у животных всех групп достоверно не отличаются друг от друга, что может свидетельствовать о прекращении дейст вия антигенного раздражения и формировании гуморального ответа.

Полученные результаты могут свидетельствовать и том, что на введение рае торимого антигена клеточные реакции развиваются достаточно быстро н протекают непродолжительно, поскольку уже ciiyci» 7 дней картина крови у подопытных животных практически ничем не отличалась от картины крови у нитактных животных.

3.3.2. Bjiiisiiiiic эшорихноíiioi о aun токсина па систему фагоцитоза

3.3.2.1. Влпяписэшерихиозного анатоксина на захватывающую и перепаривающую способность псГирофпльпмх гранулоцпгок

Проведенными исследованиями установлено (рис.4). что через 1ч после введения крысам прспаршов (анатоксина и питательного бульона) происходило незначительное увеличение количества фа1 оптирующих нейгро-фнльиых граиулоцитои. При этом количество захваченных микроорганизмов одним активным нейтрофплом (рис.5) в i руинах № 3, 4, 5 пс превышало таковой в группе № 2 и незначительно отличалось от показателей у иптактных жнвошых. Иесмофя на то, что введение субстратов не ока ¡ало достаточно выраженного стимулирующего воздействия на захватывающую способное!ь пеГпрофнлов, однако их переваривающая активность (рнс.6) значительно возросла. Отчетливее всею это видно rio группе № 2, где активность переваривания увеличились на 20,7% по сравнению с группой № I. Между тем активация захватывающей и переваривающей способности в группах № 2 и 5 orpiiiiaiejibiio повлияли па индекс завершения акта фагоцитирования, гак как этот ноказатель в данных группах оказался ниже, чем у ингактных животных.

Через 3 ч после введения субстратов количество активных пейтрофилов в опытных ipynriax продолжало увеличивайся, однако фагоцитарное число оставалось на таком же уровне, как и у животных из группы № 1. Переваривающая способность клеюк в опытных группах несколько снизилась относительно показателен первою часа, но превышала, тем пс менее,

Рисунок 4 - Динамика изменения фагоцитарной активности нейтрофилов у крыс опытных и контрольных групп

данный показатель у иитактных животных. Аналогичную тенденцию наблюдали и в группе положительного контроля, но показатель завершения акта фагоцитоза у этих животных был ниже, чем у животных первой группы.

Спустя 6 ч после введения анатоксина и бульона у животных группы № 2 -5 количество активных нейтрофилов снизилось по сравнению с предыдущими данными и сравнялось с таковым у крыс из 1-й группы. Число захваченных микроорганизмов одним нейтрофилом достоверно не различалось у животных всех пяти групп и находилось в пределах 1,2-2,2 клеток. В данный промежуток времени вновь зарегистрировали возрастание переваривающей способности нейтрофилов у животных опытных групп. При этом, чем большей была доза анатоксина, тем большим был показатель процента переваривания у нейтрофилов. Чего нельзя было сказать относительно показателя завершенности фагоцитоза, который напротив был наиболее низким (0,7-10,06) у животных из 5-й группы.

"■"О""» кои фи н 1Ш1.1К 1

Ж кон фи н. п.; III»

О ohi.ii 0.1 )Д

о ,жыю..; )Д

"""О^Чии.!! (!.(, )А

Рисунок' 5 -Динамика изменения фагоцитарного числа (количество микробных клеток) нейтрофилов у крыс опытных и контрольных групп

Через 12 ч изменились показатели количества активных нейтрофилов в опытных группах. Так у животных из 3-й группы этот показатель был выше (13,3±0,52%), а из 4-й и 5-й групп напротив ниже (6,610.60 и 5,7-1.1,53% соответственно) относительно такового (7,0±0,61%) у иитактных животных. Количество захваченных бактерий одним активным нейтрофилом во всех группах было примерно одинаковым и достоверно не различалось от показателя и

1(1

группе отрицательного контроля. Хотя количество захваченных микроорганизмов одним нейтрофилом было незначительным, их переваривающая способность у животных в опытных группах снизилась, за исключением группы положительного контроля, где процент переваривания напротив увеличился и составил 71,3±3,1%. Несмотря на более высокую переваривающую способность нейтрофилов у животных в группах № 2-5, индекс завершенности фагоцитоза у них был меньшим, чем в первой группе.

KOinpo.ii. шплкт

Ж контроль О.л I П>

• о otH.il 0.15 >.\

о опыт ()..> )А

«»о»» оиыrO.fr )А

---

12ч 24ч 72ч 168ч

Рисунок 6-Динамика изменения переваривающей способности (%) нейтрофилов у крыс опытных и контрольных групп

Спустя 24 ч отметили резкое увеличение количества фагоцитирующих клеток и количества захваченных ими стафилококков. Так если у интактиых крыс количество активных нейтрофилов было в пределах 8,8±0,9%, то у крыс 2-й группы их количество возросло до 25,0±0,43%, 3-й группы - до 65,0±6,7%, 4-й группы - 81,6±7,7%, 5-й группы - 63,4±6,5%. Вслед за резким увеличением численности активных нейтрофилов. увеличилась и их захватывающая способность. У животных всех опытных групп показатель фагоцитарного числа был практически в 5 раз большим, чем у животных группы отрицательного контроля. В группе положительного контроля этот показатель также изменился, увеличившись до 2,7±0,23. Вместе с тем установлено, что с увеличением фагоцитарного числа произошло снижение процента переваривания, но при этом индекс завершенности фагоцитоза в опытных группах и группе положительного контроля был выше, чем в группе отрицательного контроля.

Спустя 72 ч после инъекции субстратов, количество активных нейтрофилов у подопытных животных уменьшилось в 1,5-2 раза по сравнению с предыдущими данными, но все же оставалось достоверно большим, чем у интактиых крыс. В группе положительного контроля, наоборот, показатель фагоцитарной активности нейтрофилов увеличился почти в 2 раза. Количество захваченных фагоцитами бактерий у крыс групп № 2-5 находилось в диапазоне от 2,5±0,22 до 3,5±0,23, и было достоверно выше, чем в 1-й группе. Переваривающая способность нейтрофилов в группе положительного контроля и опытных группах увеличилась по сравнению со значением предыдущего исследования, но достоверно не различалась от данного показателя в группе отрицательного контроля. Отсутствовали достоверные различия между 1-й и 2-5 группами и со стороны показателя индекса завершенности фаго-

I7

цигоза, что свидетельствует о снижении стимулирующего влияния введенных крысам субстраюв.

Через 168 ч показатели фагоцитарной активности нейтрофильных гра-нулоцигов у крыс во всех группах практически сравнялись и не имели достоверной разницы, что говорит о полном прекращении какого-либо влияния питательного бульона и анатоксина па организм животных.

Таким образом, проведенные исследования показали, что введение животным анатоксина сопровождается активацией фагоцитарного звена иммунитета. Однако в течение первых 12 ч ответная реакция организма выражалась в основном повышением переваривающей способности нейтрофильных гранулоцптов, а через 24 ч происходило резкое увеличение количества фагоцитирующих клеток, при этом их поглотительная способность повышалась в 5 раз по сравнению с интакгыми животными и в 2.5 раза по сравнению с животными. которым вводили питательный бульон. Затем на протяжении 48 ч у подопытных крыс наблюдали плавное снижение функционал!.ной активности нейтрофильных гранулоцптов.

3.3.2.2. Влиинис эшернмюшого анатоксина на микробнцидные свойства нейтрофильных гранулоцптов

Функциональная активность нейтрофильных гранулоцптов во многом зависит от состояния их микробицидной системы и мобилизационной способности (КМ). Оценку микробицидной системы нейтрофилов мы осуществляли по активности миелопероксидазы (МП), катиопных белков (КБ) и хлор-ацетат-АБ-Э-эстеразы (ХА).

Исследования показали (рис.7-11), что через 1 ч после введения эшери-хиошого анатоксина и питательного бульона у животных 2-5 групп произошло повышение активности кислородзависимой микробицидной системы нейтрофилов. Особенно это было выражено со стороны миелопероксидазы, уровень которой в нейгрофилах у животных 3-й и 5-й групп был в 1,6 раза более высоким, чем в 1-й группе - 1,12, 1,16 и 0,69 ед. соответственно. Следует отметить, что, нссмофя на стимуляцию кислородзависимых факторов, мобилизационная способность нейтрофильных гранулоцптов у животных в опытных и 2-й контрольной группах оставалась таковой, как и у интакгных животных. Активность кислороднезависимых систем (катионные белки) и ХА во всех группах оставалась примерно на одном уровне.

Через 3 ч активность кислородзависимых систем нейтрофилов у крыс, которым были введены субстраты, ещё увеличилась по сравнению с животными группы отрицательного контроля. Так в опытных группах показатель цитохимического индекса спонтанный был в 2 раза большим, чем в 1-й контрольной группе. Одновременно с этим установили повышение КМ у крыс 2-й и 4-й, который в 1,3-1,5 раза был более высоким, чем у иитакиых крыс. У всех крыс, которым инъецировали анатоксин и бульон отметили достоверное повышение активности МП и ХА, что может свидетельствовать о

X

X щ_

X

«х»* А™...,,«-*" А

!

"КОНТРОЛЬ 60 ■

интакт. 50

контропь

0 3 ГШ 40

а опыт 0 15

ЭА 30 -

X опыт 0,3 20

ЭА

> * "опыт 0 6 10

ЭА

/Ч

/ \

/ Л

„и.«»*«

/ 0

1ч

Зч

24ч

72ч

168ч

Рисунок 7 - Изменение П !,Исп под воздействием па организм различных доз анатоксина

стимуляции переваривающей способности нейтрофилов. Изменений со стороны активности КБ отмечено не было, их уровень во всех группах был примерно одинаков и составлял 1,25±0,0') 1,62±0,06 ед.

Исследования, проведенные через б ч показали, что у крыс групп №2 и 3 показатель активации кислород зависимых микробицидных систем хотя и увеличился, тем не менее, не так выражено как у животных из групп №4 и 5, у которых СЦИеп был равен 4,69±0,58 и 3,14±0,93 ед. соответственно. В этих же группах наибольшим был коэффициент мобилизации и активность МП. Со стороны кислороднезавиеимых систем достоверных изменений отмечено не было.

* контроль ишак-г

Ж KUinpO.ll' 11.3 11«

О опыт и. I ">Л

0 и 111,1 г 0 Л н

««о«- "опьп и.О

Рисунок 8 - Изменение КМ под воздействием на организм различных доз анатоксина

Через 12 ч регистрировали продолжающееся увеличение среднего ци-тохимимического индекса нейтрофилов в группах № 2-5. Причем в группе №4 (доза анатоксина 0.3 мл) данный показатель и показатель мобилизации нейтрофилов был самым высоким (5,83±0,51 и 4,30±0,19 ед. соот ветст венно). Среди других выраженных изменений обратило на себя внимание повышение активности миелопероксидазы в 3-й группе, в то время как в группах № 4 и 5 активность данного фермента даже несколько снизилась, но достоверно не различалась от показателя у животных из 1-й группы. Некоторое повышение активности ХА произошло у животных из 2-й. 4-й и 5-й групп.

1,8 1

1ч Зч бч 12ч 24ч 72ч 168ч

Рисунок 9 - Изменение СЦИ МП пол воздействием на организм различных доз анатоксина

у животных из 3-й группы данный показатель был примерно равным таковому у интактных животных. А вот активность катионны.х белков у крыс, которым ввели питательный бульон и эшерихиозный анатоксин, к этому промежутку времени понизилась относительно отрицательного контроля.

1,8

1,6

0,2 о

1ч Зч 6ч 12ч 24ч 72ч 168ч

Рисунок 10 - Изменение СЦИ ХА под воздействием на организм различных доз анатоксина

Наиболее выраженные изменения в ферментной системе нейтрофиль-ных гранулоцитов наблюдали через 24 ч после инъекции препаратов крысам. Активация кислородных систем нейтрофила в опытных группах (№ 3, 4, 5) относительно отрицательного контроля достигла своего апогея и могла характеризоваться как «кислородный взрыв», поскольку показатель СЦИсн увеличился в 14,4. 30,5 и 30.9 раз соответственно. В группе положительного контроля также произошло повышение активности кислородзависимых механизмов в 5,8 раз. Между тем одновременно было установлено, что такое резкое увеличение показателя активации сопровождается понижением мобилизационной способности фагоцитов. Особенно это ярко выражено у животных из 4-й и 5-й групп, где КМ стал даже меньшим, чем у интактных крыс. Между тем мобилизационные резервы у нейтрофилов крыс из 3-й группы напротив повысились, что свидетельствует о сохранении резервных возможностей их микробицидной системы.

Следует отметить, что при повышении активности кислородзависимых микробицидных систем происходило одновременное снижение уровня акти-

2(1

ваий и катионных оелков. что может свидетельствовать о их доминировании в процессах киллиига в это)' период времени.

2,5 -,

1ч Зч 6ч 12ч 24ч 72ч 168ч

Рисунок 11 - Изменение СЦИ КБ под воздействием на организм различных доз анатоксина

Через 72 ч у крыс, которым инъецировали бульон и анатоксин еще регистрировалась повышенная активность фагоцитов, т.к. показатель СЦИсп у них был в 5-18 раз большим, чем у интактных животных. Однако мобилизационные резервы у нейтрофилов животных из 4-й и 5-й групп практически были истощены, поскольку величина КМ у них в 2 раза меньшей (1,55±0,!2 и 1.22±0,21 соответственно), чем у животных всех остальных групп. Миелопе-роксидазная кислородзависимая микробицидная система более активна у животных из 3-й и 4-й групп, у животных из 2-й и 5-й групп она была такой же как и у интактных крыс. Кроме того, у животных из 5-й группы зарегистрировали снижение ХА относительно контроля в 1,3 раза, у животных из 2-й и 4-й группы активность данного фермента была практически одинаковой с интактиыми животными, а из 3-й группы в 1,1 раза выше. К данному временному отрезку исследований было установлено понижение активности КБ у крыс из групп № 2-5. При этом просматривалась четкая закономерность в снижении значения данного показателя в зависимости от введенного субстрата и дозы анатоксина. Если у крыс из 2-й группы снижение активности КБ произошло в 1.4 раза, то у животных из 3, 4 и 5 групп в 1,5, 1,8 и 2,5 раза соответственно.

Через 168 ч показатели, характеризующие состояние микробицидной системы нейтрофильных гранулоцитов в опытных и контрольных группах по большинству значений уравниваются.

Таким образом, проведенные исследования показали, что после введения как эшерихиозного анатоксина, так и питательного бульона происходит достаточно сильная активация кислородзависимых ферментных систем ней-трофилов с пиком возбуждения через 24 ч. При этом величина активации зависит не только от дозы вводимого субстрата, но и качественного его состава. Кроме того, результаты проведенных исследований показали, что в случае стимуляции растворимыми антигенами ответная реакция нейтрофильных гранулоцитов связана с активизацией в основном кислородзависимой микробицидной системы, кислороднезавнеимая система, представленная в данном

случае К1> при лом иаходшся в псзадейавованном или слабоактивном состоянии.

3.3.3. Влншшс эшсрпхио того пня юксинл па гуморальное шепо

иммунитета

3.3.3.1. Пммуио! сниые сноиста ошсрпхиошого лнамжспна

На первом этапе изучения нммунногениой активности эшерихиозпот анаюксина нас интересовало, насколько выраженным булет иммунный огвс1 организма при однократном введении различных доз аптшепа.

Результатами исследований было установлено, что через 7 дней после введения препарата у всех животных формируется специфический иммунный ответ, однако уровень накопления титров антител был не одинаков. Как оказалось, наибольшая концентрация антитоксических антител была отмечена у животных из первой группы, которым анатоксин ввели в дозе 0.15 мл. В данной группе средние титры антител составили 1:17,618,7. У животных из второй и третьей групп титры специфических антител были меньшими -1:8,0±4,9 и 1:4,4±2,2 соответственно.

Через 14 дней количество антител в сыворотке крови практически уменьшилось вдвое от первоначального значения, а через 21 день их количество у животных из первой и второй групп было минимальным, а третьей группы - обще не определялись.

На втором этапе исследований провели изучение иммуногенности эше-рихиозпого анатоксина при двукратном введении. Для этого крысам анатоксин вводили дважды с интервалом 7 дней по следующей схеме: 1-ой группе животных - по 0,15 мл; 2-й группе - 0,15 и 0,3 мл; 3-й группе - по 0.3 мл; 4-й группе - 0,3 и 0,6 мл. Сыворотку крови исследовали черс! 7, 14 и 21 день после последнего введения анатоксина. Полученные результаты показали, что повторное введение анатоксина способствует существенному увеличению титров антител по сравнению с однократным введением. Так, если после однократного введения максимальное количество антител было в пределах 1:17,618,7. то при двукратном введении анатоксина в дозе 0.15 мл титры возрастали до значения 1:48.0±22,6, а при увеличении дозы второй инъекции вдвое - до 1:57,6±14,3. У животных других групп также ошешли появление специфических антител, в частности у крыс из 3 группы количество антител, было таким же как и у животных из 1-й группы. После двукратно!о введения анаюксина антитела в сыворотке крови крыс циркулировали в течение 21 дня. однако их концентрация была не высокой.

Па третьем этапе опытов провели изучение влияния различных адыо-вантов на иммунно! еппые свойства эшерихиозного анатоксина. При этом в качестве адыовантов использовали полиакриловую кислоту (ПАК) и гидроокись алюминия (ГОА). ГОА является широко распространенным адыоваи-том, который используется для приготовления различных вакцин (Р.В. Г1е1-ров и др., 1988; II.В. Медупицып, 1999). ПАК, по мнению ряда авторов, Iак

же можно с успехом использовать как адъюваит или как иммуностимулятор (Клюкина П. Д., 2007; Староселов М.А., 2008).

Для этого сформировали 4 опытные группы белых крыс которых иммунизировали .анатоксином с ГОА и ПАК и 2 контрольные группы животных, которых иммунизировали вакциной Коли-Вак (см. раздел «Материалы и методы исследований. Сыворотку крови исследовали спустя 7, 14, 21, 28 и 32 дня после последней иммунизации животных.

Исследования показали, что через 7 дней после однократного введения эшерихиозного анатоксина с ПАК уровень специфических антител составил 1:57,6± 14,3, а через 14 дней он увеличился вдвое, после чего начал снижаться и к концу срока наблюдения составлял 1:12,8±4,4. Двукратное введение анатоксина с ПАК еще в большей степени стимулировало ангителообразование. При этом уровень специфических антител составил через 7 дней после последнего введения 1:96,0±45,3, 14 дней - 1 ;204,8±70, а 32 дня - 57,6±14,3.

При использовании в качестве адью ванта ГОА также зафиксировали увеличение иммунногенной активности эшерихиозного анатоксина, но все же не в такой степени, как при использовании ПАК. Максимальный иммунный ответ наблюдали на 14 день после второй иммунизации, когда титры антител достигали значения 1:108,8±42,9. В последующие дни также зафиксировали снижение их уровня. Спустя 32 дня титры специфических антител составляли 1:11,2±4,4, т.е. были практически в 5 раз более низкими, чем у животных 2-й группы, которых дважды иммунизировали эшерихиозным анатоксином с ПАК.

После введения вакцины Коли-Вак формирование антитоксического иммунитета происходило не так интенсивно, как у животных опытных групп. При этом уровень специфических антител был большим у животных, которым вакцина вводилась дважды. Однако максимальные титры антитоксических антител составили всего 1:57,6±14,3, при этом к 32-му дню после последнего введения их уровень был в пределах 1:7,2±1,8.

Таким образом, результаты проведенных опытов показали, что эшери-хиозный анатоксин обладает выраженными антигенными и иммунногепыми свойствами, однако продолжительность антитоксического противоэшерихи-озиого иммунитета не велика и заканчивается в течение первых 2-3 недель после его введения. Иммунногенные свойства анатоксина можно улучшить с помощью адыовантов, в этом случае интенсивность иммунного ответа повышается в 5-15 раз, но самое главное продолжительность циркуляции антител также увеличивается в 2-3 раза.

3.3.3.2. Протскшвные свойства эшерихиозного анатоксина

Исследования проводили на месячных крольчатах, поскольку у них можно с успехом воспроизводить экспериментальную колиэнтеротоксемию, обусловленную экзотоксинами возбудителя (Коткова Н.В., 2007). Подопытным животным однократно внутримышечно инъецировали эшерихиозпый анатоксин и вакцину Коли-Вак, животным контрольной группы ничего не

вводили (схема oin.iia изложена в разделе «Материалы и медоды исследований»), Через 7 дней после введения препарат» провели ¡аражсние животных комплексом токсинов. За животными наблюдали в ючении 10 дней, учшы-вая количество заболевших, павших и выживших в каждой группе.

Наблюдения показали, что через несколько часов после введения тк-еннов у большей части животных развивался iokchkos, характеризовавшийся общим угнетением, отказом от корма, одышкой, жаждой. Через 7- 9 ч у заболевших животных, особенно в группах №1, 2. 6, 7, 8, 9, 11, наблюдали про-фузный понос. При этом характер каловых масс вначале был серозно-катаральным, а затем катарально-геммора! нческнм. У крольчат с выраженными признаками интоксикации к концу первых и начале вторых суток стали проявляться нейрогоксические симптомы: возбуждение, нарушение координации движения, судороги, ослабление рефлексов и кожной чувствительности. Данные животные [шли в течение 2 суток.

Из числа заболевших крольчат, коюрых иммунизировали анатоксином пали все те, которым препарат вводили в дозе 0,07 мл. В остальных группах живыми осталось от 40 до 80% животных. Польше всего выживших было среди тех. которых иммунизировали анатоксином в дозе 0,6 мл. Расчетами установлено, что у анатоксина показатель иммунизирующей дозы, обеспечивающей выживание 50% зараженных животных (ИД5(!) составил 0,27 мл.

В группах, где крольчат иммунизировали вакциной Коли-Вак, результаты были значительно худшими, т.к. в ipex из них погибли все живоihi.ic, а в двух остальных, где использовали дозы 0.6 и 1,2 мл, выжило соответственно 40 и 60% живо ни,ix. Показатель ИД5„ вакцины Коли-Вак составил 0,45 мл, т.е. был в 1,7 раза большим, чем у эшерпхиозиот анатоксина.

В контрольной группе все животные погибли.

Таким образом, результаты проведенного опыта показали, что эшери-хиозный анатоксин обладает протектпвнымп свойствами, поскольку при однократном применении в дозе 0,15-1,5 мл обеспечивает выживание 40-80% зараженных живопгых, в то время как не иммунизированные животные погибли в 100% случаев.

Выводы

1. Для производства анатоксина предпочтительнее использовать au юрскую среду, содержащую кислотный гидролиза) крови, ауголизат пекраекпч дрожжей и ферментативный пешон, так как она обеспечивает'лучшие условия для продуцирования токсигенными E.coli выработку термолабильного, термосгабилыюго и шнгаподбного токсинов. При этом время инкубирования для получения ST- п LT-токсипов должно быть не менее 6 дней, STX-гоксипа - не менее 7 дней.

2. Для выявления титров специфических антител у иммунизированных лперичиозиым анатоксином животных разработан эритронитарпый дшн ио-сгикум для РИГА, коюрый в 16 раз является более чувемзигельпым, чем

2-1

РДП. В качестве носителей антигенного материала предпочтительней использовать формалипизированные эритроциты барана.

3. В ответ на введение эшерихиозного анатоксина в течение первых 24 ч у животных на 10,0-40,8% увеличивается количество нейтрофилов и снижается количество лимфоцитов. Максимальное увеличение количества нсй-трофильных гранулоцитов (до 65%) происходило у крыс, которым ввели анатоксин в дозе 0,6 мл. Последующие 48 ч характеризовались выраженным лейкоцитозом при снижении в составе клеток белой крови пула нейтрофилов и повышении лимфоцитов. Спустя 168 ч картина крови подопытных животных не отличалась от таковой у интактных животных.

4. В течение первых 12 ч после введения животным эшерихиозного анатоксина изменение функциональной способности нейгрофильных гранулоцитов характеризовалось повышением их переваривающей активности (до 68-81%), через 24 ч - увеличением количества фагоцитирующих клеток (до 63,4-81,6%) и их захватывающей способности (до 5,3-5,7 клеток стафилококка), а через 72 ч функциональная активность фагоцитов снижалась и спустя ¡68 ч ничем не отличалась от животных контрольных групп.

5. Повышение фагоцитарной активности нейтрофилов в течение первых 24 ч после введения эшерихиозного анатоксина связано с активизацией их кислородзависнмых микробицидных систем и хлорацетатэстеразы с сохранением мобилизационной способности. Высокая доза (0,6 мл) анатоксина инициировала наибольшую активность, но это сопровождалось гипервозбуждением кислородных систем фагоцитов и приводило к истощению их мобилизационных способностей, а также изменению активности МП, ХА и КБ.

6. Через 7 дней после однократного введения эшерихиозного анатоксина в сыворотке крови животных появляются специфические антитоксические антитела, уровень которых был выше у тех из них. которым антиген вводился в меньшей дозе (0,15 мл). При двукратном введении анатоксина уровень антител повышается в 2-3 раза, но продолжительность их нахождения в организме не превышает 3 недель. Использование эшерихиозного анатоксина с ПАК и Г'ОА в качестве адъювантов способствует усилению в 4-5 раз гуморального иммунного ответа и увеличению продолжительности циркуляции специфических антител. Лучшие адъюваитные свойства были получены при использовании анатоксина с ПАК.

7. Эшерихиозный анатоксин обладает выраженными протективными свойствами, т.к. предохраняет до 80% животных от гибели в остром опыте при экспериментальном заражении экзотоксинами кишечной палочки. Его показатель ИД5Ц в 1,7 раза меньший (0,27 мл), чем у вакцины Коли-Вак (0,45 мл).

Практические предложения

I. Для получения экзотоксинов кишечной палочки лучше использовать жидкую питательную среду, содержащую в качестве основных компонентов гидролизат крови животных, аутолизат пекарских дрожжей и фермен-

тативный neuron.

2. Для выявления в сыворотке крови иммунизированных животных специфических ашитокснческих аитигел можно применять реакцию непрямой гемагглютинацни с использованием формалипшироиаппых эритроцитов барана сенсибилизированных ипактивированными токсинами эшерихпй.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Терехов В.И. Эшерихиоз поросят и его профилактика / В.И. Терехов, Н.В. Колесникова, Я.М. Караев // Ветеринария Кубани, 2006. -№1. - С. 12-13,-№2. -С. 2-3.

2. Терехов В.И. Влияние среды и продолжительности культивирования на токсинообразование у ESCHERICHIA COLI / В.И. Терехов, Н.В. Колесникова, Я.М Караев // Сборник научных трудов Кубан. гос. аграр. ун-т. «Профилактика и лечение болезней животных».- Краснодар, 2007- С. 80-83.

3. Караев Я.М. Влияние эшерихиозного анатоксина па функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов / Я.М. Караев, В.И. Терехов // Материалы I Всероссийской паучно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». - Краснодар, 2007.-С 256-257.

4. Караев Я.М. Динамика антителообразования у животных в ответ на введение эшерихиозного анатоксина / Я.М. Караев // Научный журнал Куб-ГАУ [электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2008. - №41(7). -6с.-Режим доступа: http://ej.kubagio.ru/2008/07/pdf/15.pclf.

5. Терехов В.И. Влияние эшерихиозного анатоксина на пейтрофильные гранулоциты / В.И. Терехов, Я.М. Караев, М.В. Уманская // Труды КубГАУ. -2008. -Вып.№4(12).-С. 146-150.

Подписано в печать 18.11.2008 г Бумага офсетная Печ. л. 1 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13

• Формат 60x84

Офсетная печать Заказ №758

Актуальность работы. Согласно данным отечественных ученых желудочно-кишечные болезни являются основной причиной гибели молодняка сельскохозяйственных животных [6, 41, 54, 88, 103, 107]. Особое место в ряду болезней сопровождающихся поражением пищеварительного тракта, занимает эшерихиоз, поскольку им могут поражаться до 50100% новорожденных телят и поросят, при этом летальность доходит до 30-50% [5, 26, 39].

Предрасполагающими факторами появления и распространения эше-рихиоза служат не только нарушения ветеринарно-санитарных правил и зоогигиенических режимов содержания животных, но и биологические свойства возбудителя болезни - Escherichia coli. Являясь постоянным обитателем кишечника животных и человека, данный микроорганизм составляет его микробиоценоз. В норме кишечная палочка выполняет ряд полезных для хозяина функций - синтез витаминов и аминокислот, поддерживает колонизационную резистентность кишечника и обеспечивает антигенную стимуляцию местного иммунитета [28, 51]. Между тем, при нарушениях микроэкологического характера, Е. coli способна резко наращивать не только свое количественное присутствие, но и проявлять патогенные свойства. Постоянный антигенный дрейф, наличие или приобретение различных факторов патогенности (экзотоксины, гемолизины, некротизирующий и гемолитический фактор, сидерофоры) затрудняют проведение эффективной специфической профилактики эшерихиоза, что побуждает не только постоянно осуществлять эпизоотологический мониторинг данной инфекции, но изучать и контролировать биологические свойства возбудителя (прежде всего его антибиотикорезистентность и наличие различных маркеров патогенности).

За более чем вековой промежуток времени со дня открытия кишечной палочки и установления ее этиологической роли в развитии диарей у человирования токсигенных штаммов Е. coli, при которых происходит максимальное накопление термолабильного, термостабильного и шигаподобно-го токсинов. Разработан эритроцитарный диагностикум для выявления специфических (антитоксических) антител в сыворотке крови животных после иммунизации эшерихиозным анатоксином. Установлены особенности изменения гематологических показателей, функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и образования специфических антител в ответ на введение животным различных доз эшерихиозного анатоксина. Выявлено влияние гидроокись алюминия и полиакриловой кислоты на иммунногенные свойства эшерихиозного анатоксина. Изучена протектив-ная активность эшерихиозного анатоксина при экспериментальной коли-энтеротоксимии.

Научная новизна работы подтверждена положительным решением на выдачу патента на изобретение по заявке № 2007112764/13(013860).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили установить оптимальные условия культивирования экзотоксинпродуцирующих штаммов кишечной палочки. В ходе выполнения работы был разработан эритроцитарный диагностикум для выявления антитоксических антител в сыворотке крови у иммунизированных животных. Полученные данные позволили выявить особенность реагирования организма животных в ответ на введение инактивированных токсинов Е. coli, а также установить протективную активность полученного эшерихиозного анатоксина.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научных конференциях сотрудников факультета ветеринарной медицины Кубанского ГАУ (Краснодар, 2006, 2007, 2008); 1-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 2007). Результаты работы были отмечены дипломом 2-й степени.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в т. ч. в рецензируемом журнале рекомендованном ВАК.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Определение оптимальных условий культивирования энтеротокси-генных эшерихий с контролем накопления токсинов и последующей их инактивацией;

- Особенности влияния различных доз анатоксина на гематологические показатели и функциональную активность нейтрофильных грануло-цитов в динамике;

- Особенность антителообразования в ответ на введение эшерихиоз-ного анатоксина и его протективная активность.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, предложений и списка использованной литературы. Работа включает 32 таблицы и 11 рисунков. Список литературы содержит 186источников, из числа которых 78 иностранных.

Выводы

1. Для производства анатоксина предпочтительнее использовать авторскую среду, содержащую кислотный гидролизат крови, аутолизат пекраских дрожжей и ферментативный пептон, так как она обеспечивает лучшие условия для продуцирования токсигенными Е.соН выработку термолабильного, термостабильного и шигаподбного токсинов. При этом время инкубирования для получения БТ- и ЬТ-токсинов должно быть не менее 6 дней, БТХ-токсина - не менее 7 дней.

2. Для выявления титров специфических антител у иммунизированных эшерихиозным анатоксином животных разработан эритроцитарный диагно-стикум для РИГА, который в 16 раз является более чувствительным, чем РДП. В качестве носителей антигенного материала предпочтительней использовать формалинизированные эритроциты барана.

3. В ответ на введение эшерихиозного анатоксина в течение первых 24 ч у животных на 10,0-40,8% увеличивается количество нейтрофилов и снижается количество лимфоцитов. Максимальное увеличение количества ней-трофильных гранулоцитов (до 65%) происходило у крыс, которым ввели анатоксин в дозе 0,6 мл. Последующие 48 ч характеризовались выраженным лейкоцитозом при снижении в составе клеток белой крови пула нейтрофилов и повышении лимфоцитов. Спустя 168 ч картина крови подопытных животных не отличалась от таковой у интактных животных.

4. В течение первых 12 ч после введения животным эшерихиозного анатоксина изменение функциональной способности нейтрофильных гранулоцитов характеризовалось повышением их переваривающей активности (до 68-81%), через 24 ч - увеличением количества фагоцитирующих клеток (до 63,4-81,6%) и их захватывающей способности (до 5,3-5,7 клеток стафилококка), а через 72 ч функциональная активность фагоцитов снижалась и спустя 168 ч ничем не отличалась от животных контрольных групп.

5. Повышение фагоцитарной активности нейтрофилов в течение первых 24 ч после введения эшерихиозного анатоксина связано с активизацией их кислородзависимых микробицидных систем и хлорацетатэстеразы с сохранением мобилизационной способности. Высокая доза (0,6 мл) анатоксина инициировала наибольшую активность, но это сопровождалось гипервозбуждением кислородных систем фагоцитов и приводило к истощению их мобилизационных способностей, а также изменению активности МП, ХА и КБ.

6. Через 7 дней после однократного введения эшерихиозного анатоксина в сыворотке крови животных появляются специфические антитоксические антитела, уровень которых был выше у тех из них, которым антиген вводился в меньшей дозе (0,15 мл). При двукратном введении анатоксина уровень антител повышается в 2-3 раза, но продолжительность их нахождения в организме не превышает 3 недель. Использование эшерихиозного анатоксина с ПАК и ГОА в качестве адъювантов способствует усилению в 4-5 раз гуморального иммунного ответа и увеличению продолжительности циркуляции специфических антител. Лучшие адъювантные свойства были получены при использовании анатоксина с ПАК.

7. Эшерихиозный анатоксин обладает выраженными протективными свойствами, т.к. предохраняет до 80% животных от гибели в остром опыте при экспериментальном заражении экзотоксинами кишечной палочки. Его показатель ИД50 в 1,7 раза меньший (0,27 мл), чем у вакцины Коли-Вак (0,45 мл).

Практические предложения

1. Для получения экзотоксинов кишечной палочки лучше использовать жидкую питательную среду, содержащую в качестве основных компонентов гидролизат крови животных, аутолизат пекарских дрожжей и ферментативный пептон.

2. Для выявления в сыворотке крови иммунизированных животных специфических антитоксических антител можно применять реакцию непрямой гемагглютинации с использованием формалинизированных эритроцитов барана сенсибилизированных инактивированными токсинами эшери-хий.