Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Применение спектрофотометрии для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

од

Л •'1 тпо На правах рукописи

й-Я ¡320

БОЖКО СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Омск 1998

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и инфекционны; болезней сельскохозяйственных животных ИВМ ОмГАУ, в лабора тории физико-химических методов исследования ВНИИБТЖ и в ла боратории биофизики Биологического факультета МГУ

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ведущее учреждение: Институт экспериментальной ветерина рии Сибири и Дальнего Востока, Новосибирская обл. г. Краснообск

Защита диссертации состоится « 17 » декабря 1998 г. в 16 ч. н заседании диссертационного совета К 120. 48. 01 в институте вeтep^ нарной медицины Омского государственного аграрного университет по адресу: 664099 г. Омск, ул. Октябрьская, 92

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВМ ОмГАУ

В. Г. ОЩЕПКОВ

доктор ветеринарных наук В. И. ОКОЛЕЛОВ

А. Г. НЕЗАВИТИН

кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник И. В. КУЗЬМИН

Автореферат разослан « /¿> »

1998 г.

Ученый секретарь .

диссертационного совета, С^у /

кандидат ветеринарных наук /А- Королеве

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Лейкоз является одной из наиболее распространенных инфекционных болезней крупного рогатого скота. Изучению эпизоотической ситуации по данной болезни в разных регионах России, в том числе и в областях Западной Сибири, посвящено значительное число публикаций (А.Ф. Валихов, В.П. Шишков, Л.Г. Бурба 1980; В.М. Нахмансон, 1986; П.Н. Смирнов, 1989, 1991, 1996; А.Т. Левашов, 1994; А.Г. Незавитин, 1995; В.И. Околелов, Ю.С. Притужалов, 1995; B.C. Федоров, 1996 и др.).

С момента открытия вируса лейкоза крупного рогатого ско-га (Miller J. et al., 1969) и до настоящего времени получено довольно много данных, касающихся характеристики возбудителя: по морфологии, биохимии, контагиозности и другим свойствам (Л.Г. Бурба, 1977; В.Г. Шишков, 1979; В.А. Бусол, 1982; В.М. Нахмансон, 1986; П.Н. Смирнов, 1987; Г.Ф. Коромыслов, 1989; В.В. Смирнова, 1992 и цр.). Разработаны и апробированы клинико-морфологические и иммунологические методы диагностики, в том числе реакция иммуно-циффузии (РИД) в агаровом геле, которая включена в методические рекомендации по диагностики лейкоза крупного рогатого скота [1985), радиоиммунный (РИА) и иммунофлюоресцентный (МФА) анализ (K.M. Jacobson et ah, 1985; 1988; В.Г. Арутюнян, 1992; A.B. Киселев 1992; D.R. Monkeetah, 1992).

В настоящее время широко применяется гематологический метод диагностики лейкоза, включающий в себя несколько этапов: подсчет лейкоцитов в камере Горяева, изготовление мазков крови, их окраска и дифференциальный подсчет лимфоцитов, выведение лей-коформулы по «лейкозному ключу». Данный метод диагностики лейкоза крупного рогатого скота требует от врача - гематолога определенных знаний и навыков, все манипуляции довольно продолжительны. К этому следует добавить, что пока еще недостаточно полно изучены вопросы, касающиеся качественного изменения в составе крови крупного рогатого скота при развитии лейкоза и их оценки. Поэтому возникает необходимость в накоплении информации об изменениях как морфологического, так и химического, иммунобиологического статуса клеток под влиянием патогенных факторов (Г.Ф. Коромыслов, 1976; A.B. Чучунов, 1993; А.Г. Незавитин, 1994; И.М. Донник, 1995, 1997 и др.).

Данные последних лет показали, что в патогенезе лейкоза существует стадия, когда комплекс антиген + антитело сорбируется на поверхности эритроцита и затем разносится в кроветворные органы (красный костный мозг, печень), где происходит воздействие на

стволовые клетки, В - лимфоциты. Имеются также публикации, е которых раскрывается природа и прочность связей в гемопротеиде. зависящих от действия ряда факторов: гомеостаза, температуры, давления, pH среды, интенсивности солнечного света и УФ излучение (М. Петуц, 1966; Б.Ф. Сухомлинов, 1972; О.М. Полторак, Е.С. Чухрай, 1971; M.F. Pezutz, 1976; JI.A. Блюменфельд, 1977; Г.А. Харбури Р.Г. Маркс, 1978; Д.М. Рифкинд, 1978).

Молекулы гемопротеидов служат удобными модельными системами для биофизических исследований: в области фотофизики v фотохимии гемоглобина, изменений энергии между гемом и глобином, взаимовлияний изменений структурного, электронного состояния, а так же фотозащитных и фотосенсибилизирующих эффекто! гемопротеидов (Ю.А. Владимиров, 1965; К. Смит, Ф. Хонсуолт, 1972 O.A. Азизова, 1975; И.Д. Волотовский, 1979; K.M. Львов, 1979; Д.И Дошулкин, 1979; И.И. Сапежский, 1988; H.J1. Векшин, 1988; Ю.А Владимиров, А .Я. Потапенко, 1989; В.Г. Артюхов, 1995).

Одним из важных вопросов, связанным с выяснением механизмов повреждений Q-связывательных способностей гемосодержащи? белков в условиях развития острых и хронических инфекционны> заболеваний, ведущих к изменению в составе крови, является качественное и количественное взаимодействие иммунных и ферментны> комплексов с эритроцитами. В связи с этим возникает необходимост£ установления достоверной закономерности конформационых изменений, возникающих в структурах гемоглобина при развитии лейкозг у крупного рогатого скота. Осуществление таких исследований воз можно при наличии современных спектрофотометрических приборов.

Тема диссертационной работы вошла самостоятельным разделом в комплексную тему Института ветеринарной медицины ОмГА\ и имеет номер государственной регистрации 01. 83. 0057603.

Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалас! в разработке методологических подходов использования спектрофо тометрии для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели необходимо было решил следующие задачи:

- определить оптимальные условия подготовки гемолизата длi проведении спектрофотометрических исследований;

выявить зависимость между коэффициентами поглощенш интенсивности излучения световых волн длинной от 264 до 610 нм i гемолизате РИД - позитивных и больных лейкозом коров;

- изучить влияние сроков исследования и разных температур на показатели крови животных при спектрофотометрии;

- провести сравнительную оценку эффективности спектрофо-тометрического и традиционного гематологического методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области.

Научная новизна. На базе спектрофотометрических исследований гемолизата крупного рогатого скота разработаны методологические подходы к новому гематологическому методу диагностики лейкоза животных. Выявлена положительная корреляция между коэффициентами поглощения светового излучения в гемолизате крови от РИД - позитивных и больных лейкозом коров. Проведена сравнительная оценка традиционного и предлагаемого методов по выявлению больных лейкозом крупного рогатого скота в экспериментальных и производственных условиях. За счет изменения объекта исследования - гемолизата вместо клеток крови, стало возможным проводить исследования в течение 96 часов при хранении проб крови в интервале температур от +10 °С до + 20 °С и до 3 месяцев при температуре от - 6 °С до - 18°С.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая ценность работы заключается в том, что расшифрованы молекулярно-клеточные механизмы изменений, происходящие в эритроцитах РИД-позитивного и больного лейкозом крупного рогатого скота. Выявлены различия коэффициентов поглощения световых волн гемолизатов в спектрах при фотометрии с учетом влияния температуры и срока хранения проб крови на физико-химические свойства водных растворов гемоглобина.

Практическая значимость работы состоит в том, что изысканы методологические подходы использования спектрофотометрии, позволившие предложить новый метод экспресс - диагностики лейкоза крупного рогатого скота, который дает возможность качественно, с высокой достоверностью за счет автоматизации процесса исследований с помощью ПЭВМ ставить диагноз на данное заболевание.

На защиту выносится:

1. Экспериментальное обоснование нового гематологического метода (спектрофотометрический) диагностики лейкоза.

2. Сравнительная оценка эффективности традиционного и разработанного гематологического метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на научно-практической конференции в ОмГАУ (г. Омск 1997);

на научно-практической конференции, посвященной 80-летию ОмГАУ (г. Омск. 1998); на заседании кафедры эпизоотологии инфекционных болезней с-х. животных ИВМ ОмГАУ (1998); на ученом совете ВНИИБТЖ (г. Омск 1998).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 3 научные работы и подана заявка на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 8-ю таблицами, 7-ю рисунками и одной схемой. Список литературы включает 176 источников, в том числе 50 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Спектрофотометрические исследования проб крови крупного рогатого скота проводили в лаборатории физико-химических методов исследований ВНИИБТЖ (г. Омск) на приборе "SPECORD. М-400"; для сопоставления получаемых результатов использовали аналогичный спектрофотометр "HITACHI - 557'' в лаборатории биофизических методов исследований биологического факультета МГУ..

Приборы оснащены стандартными программами для вывода на печать, накопления информации на гибких дисках (около 500 спектров), индикации и вывода накопленной информации, циклического повторения измерений, статистической оценки, распечатки максимумов пиков, операций над файлами (копирование, перемещение, стирание).

В процессе работы исследовали кровь от крупного рогатого скота с антикоагулянтом (трилон - Б).

В стеклянные флаконы разливали по 16 мл дистиллированной воды. Стеклянным капилляром отбирали перемешанную кровь до метки 0,04 мл. Марлевой салфеткой протирали капилляр от крови и выпускали кровь на дно флакона. Содержимое флакона перемешивали путем взбалтывания.

В кювету (4 мл) переливали из флакона приготовленный гемо-лизат крови. Фотометрирование гемолизата цельной крови животных проводили на длинах волн 264 - 610 нм, при спектральном шаге 1,00 нм, скорости интегрирования 2,00 нм/с, с временем интегрирования 0.5 с, шириной поглощения монохроматора 2,0 нм.

По окончании измерений, пробы извлекали из кюветодержате-ля, содержимое переливали во флаконы. Кюветы тщательно

промывали дистиллированной водой, протирали от капель специальной фильтровальной бумагой фирмы GALUS. В приготовленные кюветы переливали следующие пробы из флаконов.

В целом, на подготовку одной пробы и работу на спектрофотометре затрачивали 10 минут.

Измерение показателей коэффициентов поглощения гемоли-затов проб крови, проводили в течение 96 часов при хранении проб крови в температуре от +10 до + 20 °С и до 3 месяцев при хранении проб в температуре от - 6 °С до - 18°С. Параллельно пробы крови исследовали с помощью существующего гематологического метода фазового контраста (по методике С. С. Бирбина) в модификации представленной П. Н. Смирновым и соав. (1990). Антикоагулирован-ная кровь исследовалась нами при комнатной температуре в течение 36 часов с момента взятия. По истечении этого времени пробирки Флоринского с кровью закрытые резиновой пробкой, помещали в морозильную камеру (t - 18°С). Через 48, 96 часов, 1 и 3 месяца пробы крови размораживали при комнатной температуре и исследовали. Изменения в спектре крови регистрировали путем спектрофотомет-рии на длинах волн 284, 358, 422, 546, 581 нм.

Сравнительное испытание разработанного и традиционного методов гематологической диагностики лейкоза проводили в 12 хозяйствах Омской области. В этих хозяйствах подвергали обследованию РИД - позитивных и больных лейкозом животных черно-пестрой и красно-степной пород в количестве 23058 голов. При проведении исследований от животных получали кровь и сыворотку для серологических и гематологических исследований.

Для достоверной оценки предлагаемого метода провели контрольный убой 13 коров, давших положительный результат при спек-трофотометрии.

Биометрическую проверку результатов спектрофотометриче-ского, гематологического и серологического исследований проводили на кафедре эпизоотологии ИВМ ОмГАУ, данные обрабатывали с помощью адаптированных программ персональных компьютеров на базе процессора пентиум с учетом критерия Стьюдента.

Результаты исследований

Разработка методологических подходов использования спектрофотометрии для диагностики лейкоза

Определение оптимальных условий для подготовки гемолизата при проведении спектрофотометрических исследований проводили следующим образом. В работе использовали разведение гемолизата из расчета стандартного титра разведения, применяемого в гематологическом методе диагностики (0.02 мл стабилизированной трилоном Б крови и 0.4 мл жидкости Тюрка 1 : 20).

Кровь гемолизировали дистиллированной водой: к 0.04 мл крови добавляли соответственно 4 мл воды и с помощью титрования получали разведения в титрах 1 : 100, 1 : 200, 1 : 300, 1 : 400, 1 : 500, имеющие различные биофизические характеристики (рис. 1).

В ходе спектрофотометрии гемолизатов, взятых для исследования в разных разведениях (1 : 100, 1 : 200, 1 : 300, 1 : 400, 1 : 500), было определено, что разведение 1:400 является оптимальным, так как дает возможность регистрировать коэффициенты поглощения световых волн в наиболее удобных для обработки значениях от 1,6636 ± 0,14 до 2,1584 ± 0,11. Показатели разведения 1:100, 1:200 находились выше предела максимальных возможностей спектрофотометра. Разведения 1:500, напротив, давали возможность регистрировать показатели лишь в очень низких значениях, что тоже затрудняло регистра-

4

I И

О

О 3

О 2,5

л 2

| 1.5 | '

f «У

284 им 358 нм 422

□ Титр разведения 1:100

□ Тшр разведшим 1.200

□ Гпгр разведения 1.300 О Титр разведения 1 '400 В Титр разведения 1:500

НМ 546 нм 581 нм

Рис. 1. Интенсивность поглощения световых волн гемолиза гам крупного рогатого скота

цию различий в показателях гемолизата РИД - позитивных и больных животных. При разведении гемолизата 1 : 300 необходим

слишком малый объемом крови или большое количество дистиллированной воды, что дает большую погрешность измерений.

В опытах установлено, что спектр гемолизата крупного рогатого скота (рис. 2) на длинах волн от 264 до 610 нм имеет пять пиков

1,8

1,6

£ 1,4

3 1 1,2

г;

и 1

\ 0.8

1 0,6

ъ 0.4

0,2

0

Длины волн

Рис. 2. Сиеь-ф гемолизата РИД - помпшшого к-рмшо рогатого скота н области 246 -(ПО нм

поглощения: 284; 358; 422; 546 и 581 нм. Пики (максимумы поглощения) спектра гемолизата вызваны структурными комплексами гемо-

0,21

0

264нм

Длины волн 3 18™

О Спекгр гемолизата крови | РИД- позитивного иатотного

О Спектр гемолизата крови больною лепшюм животного

Рис. 3. Область систра ароматических аминокислот в интервале от 246 до 318 им

глобина. Морфологические изменения конформационного характера в данных структурах выражаются изменениями интенсивности поглощения, что отражается на спектре. В соответствии с данными В. Г. Артюхова и соав. (1995) мы считаем, что пик поглощения в области 284 нм обусловлен структурами ароматических аминокислот

гемопротеида эритроцитов. Область пика 358 нм отражает структурное состояние порфириновой части оксигемоглобина, длины волн с максимумами полос 422 и 546 нм выражают порфириновую структу-

□ Спектр гемолизата крови РИД - позитивного животного

Q Спектр гемолизата крови ООЛЫРОГО Ж'ИКОЮМ жиюшого

Длины волн 37>;il\i

! 1 'iiе. -(. Область спектра порфнрнповая часть оксигемоглобина

. I в интервале от 323 до 378 нм г

ру дезоксигемоглобина. Коэффициенты поглощения в области 581 нм отражают изменения нелигандированных форм глобина.

ш/шМММ

□ Спектр гемолизата крови РИД - позитивного животного

□ Спектр гемолизата крови болмюго леПкоюм животного

Длины волн

Рис. 5. Область спектра дезокенгемоглобиновой структуры порфнрппа в интервале от 323 до 561 нм

В. Г. Артюхов и соав. (1995) в работах, касающихся спектро-фотометрии гемоглобина, описали влияние различных патогенных факторов (микроокружение) на эритроциты, которые ведут к изменениям в структурах гемоглобина. Ими показано, что изменения кон-формационного и тем более денатуративного характера выражаются

в увеличении интенсивности поглощения на длинах волн спектра гемоглобина.

□ Спектр гемолизата крови ; | РИД - позитивного

| животного 11

□ Спектр гемолизата крови больного лейкозом

( животного

Дтины волн

Рис. 6. Область спектра нслнганднрованной формы глобина в интервале от 571 до 610 нчп

В результате исследования спектров гемолизата РИД - позитивных и больных коров нами было обнаружено, что показатели коэффициентов поглощения первого пика 284 нм, в области от 264 до 318 нм находятся у РИД - позитивных в интервале 0.8081 - 0.8996, а у больных животных 0.9306 - 0.9659 (рис. 3.).

Изменение интенсивности в данной области зависит от кон-формаций структур ароматических аминокислот гемопротеида эритроцита.

Далее мы сравнивали изменения на длинах волн в области второго пика 358 нм, в интервале от 323 до 378 нм. Спектры гемолизата РИД - позитивных и больных коров отличаются (рис. 4). коэффициенты поглощения в этой области различаются. Наиболее высокие показатели коэффициенты поглощения в спектре имеет кровь больных лейкозом животных 0.5601 - 0.5969, здоровым животным в спектре соответствуют более низкие показатели 0.4885 - 0.5364.

Третий и четвертые пики (422 нм и 546 нм, в интервале от 383 до 561 нм) отражают структурные изменения в порфирине, структуре дезоксигемоглобина. Нами было выявлено, что коэффициенты поглощения в области 422 нм (полоса Соре), у РИД - позитивных животных имеют интенсивность 1,5352 - 1,7308, а у больных лейкозом 1,8380 - 2,3838. В области 546 нм коэффициенты поглощения у РИД -позитивных 0,4884 - 0,5364, у больных лейкозом интенсивность поглощения находилась в пределах 0,5601 - 0,5969 (рис. 5).

Коэффициенты поглощения полосы пятого пика 581 нм, в интервале от 571 до 610 нм следующие: у РИД - позитивных животных 0.2183 - 0.2535, у больных лейкозом 0.2993 - 0.3279. Для наглядности полученные результаты показаны на рисунке 6.

При изучении спектров гемолизатов крови больных лейкозом и РИД - позитивных животных было установлено, что наибольшее различие в спектре регистрируется в области 422 нм (полоса Соре).

Сравнивая полученные нами результаты спектрофотометриче-ских исследований гемолизата РИД - позитивных и больных лейкозом коров и данные Г. В. Максимова, С. Н. Орлова (1992 г.) можно отметить следующее: выявленная авторами зависимость конформа-ционных изменений в структурах гемоглобина при малярии человека сходна со структурными изменениями копформационного характера в структурах гемоглобина при лейкозе крупного рогатого скота.

Проанализировав спектры гемолизата животных в области (264 -610 нм) пришли к заключению, что в результате проникновения вируса лейкоза в организм животного (органы иммунной системы, клетки В - лимфоцитов и др.) и взаимодействия специфических комплексов антиген + антитело на поверхности эритроцита вызывают конформационные изменения в структурах гемоглобина.

Конформации в структурах гемоглобина увеличиваются во время гематологической стадии лейкозного процесса (в крови значительно повышается число лимфоцитов), в данную стадию регистрируются конформационные изменения структур гемоглобина выражающиеся повышением коэффициентов поглощения в спектрах при фотометрии.

Возникают конформационные изменения в ароматических аминокислотах гемопротеида эритроцита (полоса 284 нм), аналогичные изменения в порфирине, структуре дезоксигемоглобина (полоса 358 нм); изменение конформации глобина приводит к изменению упорядочности фиксации 02 в макропорфериновом цикле гемоглобина, что согласуется с данными В. Г. Артюхова и соав. (1995), конформационные изменения в структуре порфириновой части оксиге-моглобина, происходят при делокализация к - связей макро цикла гемоглобина (полоса Соре - 422 нм); максимум интенсивности 581 нм и незначительное смещение в длинноволновую область полосы с максимумом 546 нм свидетельствует о том, что при лейкозе конформационные изменения обусловлены нелигандированными формами глобина.

Таким образом, спектрофотометр™ гемолизата позволяет выявить молекулярные изменения в гемоглобине больных лейкозом крупного рогатого скота животных, что является важным моментом для диагностики.

Для проведения лабораторного испытания существующего и предлагаемого методов диагностики лейкоза были отобраны 380 животных. Традиционным методом, путем подсчета лейкоцитов в камере Горяева и выведения лейкоформулы по лейкозному ключу, были выявлены 89 проб крови, в которых количество лимфоцитов соответствовало показателям крови больного животного.

Спектофотометрическими измерениями гемолизата этих животных выявили 102 позитивные пробы крови. Следовательно, сравнительные исследования проб крови показали, что спектрофотометри-ческий метод диагностики позволяет на 3,5 % больше выявить больных животных, чем традиционный. Математическая обработка экспериментальных данных выявила достоверность различий. У больных животных коэффициенты поглощения в области 422 нм (полоса Соре): М - 2.1584. т ± 0.0561; \ РИД - позитивных животных: М - 1.6636, т ± 0,0713. Значение вероятности Р по критерию Стыодента < 0,05.

Кроме того, проведенный контрольный убой 13 коров на мясокомбинате, дополнительно выявленных новым методом, полностью подтвердил спектрофотометрическую диагностику лейкоза крупного рогатого скота.

Влияние сроков исследования и разных температур

на показатели крови животных Рассматривая вопросы связанные с временем, в течение которого можно установить по картине крови признаки лейкозного процесса, необходимо отметить следующее. Существующий гематологический метод диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет поставить диагноз по наличию повышенного содержания лимфоцитов (свыше 8000 - 10000) при микроскопии мазков крови. Вне кровяного русла лимфоциты сохраняют свою целостность в течение 36 часов. При комнатной температуре (+20 ± 3 °С), механических воздействиях во время транспортировки проб крови процесс разрушения клеток ускоряется. Это является существенным недостатком метода. В предлагаемом методе диагностики, полученная от животных кровь пригодна для исследования в течение 96 часов при хранение проб в температурных режимах + 20 ± 3 °С (вместо 36 часов при использовании традиционного метода), в течение 1 - 3 месяцев (срок наблюдения) при температуре хранение проб крови - 18 °С, с последующим оттаиванием и исследованием при комнатной температуре.

Это происходит за счет использования другого подхода (механизма действия), традиционным методом диагноз ставили на основании подсчета клеток крови при микроскопии, предлагаемым - на основании полученных спектров гемолизатов пробы крови по величинам оптической плотности при 284, 358, 422 (полоса Соре), 546, 581 нм (максимумы поглощения гемолизата крупного рогатого скота).

Таблица 1

Изменения интенсивности коэффициентов поглощения полосы 422 _нм при г - 18 °С в течение 18 часов, 3 месяцев_

Время исследования Коэффициенты поглощения проб крови М ± m, п = 6

Здоровое Больное Р

18 час. 1,6079+0,0613 1,9866+0,0514 Р < 0,05

36 час. 1,6081 ±0,0485 1,9904+0,0502 Р < 0,05

48 час. 1,609310,0523 2,0234±0,0426 Р < 0,05

96 час. 1,6072+0,0415 2,0859±0,0637 Р < 0,05

1 мес. 1,7332+0,0319 2,1439+0,0601 Р < 0,05

3 мес. 1,6981±0,0537 2,0381 ±0,0583 Р < 0.05

В таблице 1 показаны изменения интенсивности коэффициентов поглощения области 422 нм в течение времени хранения проб крови от 18 часов до 3 месяцев при I - 18 °С и исследовании при комнатной температуре.

Указанную в этой таблице зависимость изменения оптической плотности гемолизатов крови от температуры и времени можно объяснить следующим: непрямое воздействие солнечного света, окисление 02 воздуха, действие низких температур, вызывают структурную перестройку как гемопротеидов гемоглобина и ароматических аминокислот, так и цитохромов в частности. Эти изменения имеют кон-формационный характер, сопровождающийся раскрытием белковой глобулы и экспонированием хромофорных групп. Понижение температуры проб крови снижает скорость течения данных процессов, но при этом происходят скрытые повреждения структур гемопорфири-нов. При оттаивании конформационные процессы усиливаются. Данные изменения регистрируются в спектре гемолизата в виде увеличения интенсивности поглощения. Изменения в спектрах гемолизатов крови позволяют зарегистрировать наличие патологии картины крови, вызванной вирусом лейкоза.

При этом, исследования выявили, что с помощью предлагаемого гематологического метода изменения, характерные для больного животного, можно зарегистрировать, начиная с 18 часов и до 3 месяцев (срок наблюдений), тогда как существующим методом,

основанным на визуальном подсчете клеток крови в камере Горяе-ва, лишь в течении 18-36 часов (табл 2).

Таблица 2

Сроки гематологической диагностики лейкоза при экспозиции температур от + 18 до - 18°С

Методы диагностики Время исследования

1В час. 36 час. 48 час. 96 час. 3 мес.

Существующий + + - - -

Предлагаемый + + + + +

Примечание: (+) - время, в течение которого возможно или (-)

- невозможно определить статус животного.

Сравнительная оценка эффективности традиционного н предлагаемого ¡метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области

Для того, чтобы провести сравнительное испытание существующего и предлагаемого гематологического метода вначале был исследован серологическим методом (РИД) крупный рогатый скот (14256 голов) в 12-ти акционерных обществах Омской области. При этом было установлено, что эпизоотическая ситуация по лейкозу в них различна.

Наименьший показатель носительства вируса лейкоза был у крупного рогатого скота в АО «Заря» Марьяновского района - 0,6 %. Наибольшее число животных, в пробах сыворотки крови которых были обнаружены антитела к ВЛКРС, было в АО «Элита» Москален-ского района - 84,8 %. В среднем количество инфицированных животных составило 31,0 %.

Серологические исследования молодняка крупного рогатого скота (бычков и телочек) в акционерных обществах показали, что процент вирусоносительства телок несколько ниже (от 0,18 % до 45,5 %, в среднем - 22,84 %), чем у коров и быков (от 6,9 % до 66,6 %, в среднем - 36,75).

Результаты сравнительного испытания, проведенные в 9-ти из 12-ти предварительно обследованных АО, свидетельствуют, что применение предлагаемого спектрофотометрического метода позволяет эффективнее выявлять больных животных. Существующим гематологическим методом было выявлено 115 положительно реагирующих проб крови, предлагаемым методом 148, что соответственно составило 1,30 и 1,68 % от 8798 исследованных проб. Наибольшее число больных животных предлагаемым методом было выявлено

в АО «Пришиб» Азовского района - 8 из 168, что составило 4,79 % Наименьшее число больных лейкозом крупного рогатого скота животных было обнаружено в АО «Звонарево-Кутское» Азовского района - 4 из 1511, что соответствовало 0,26 % (табл. 3).

Таблица 3

Результаты гематологических исследований крови крупного рогатого скота, предлагаемым и существующим методами в хозяйствах

Омской области

Иссле- Выявлено больных

№ Наименование хозяйства довано Существую- Предлагае-

п/п живот- щим методом мым методом

ных гол % гол %

1 «Звонарево-Кутское» (Азовский р-н) 1511 1 0,06 4 0,26

2 «Комсомольское» (Одесский р-н) 571 4 0,70 7 1.22

3 «Ермак» (Нововаршавский р-н) 310 2 0,64 5 1,61

4 «Пришиб» (Азовский р-н) 167 4 2,39 8 4,79

5 «Цветнополье» (Азовский р-н) 829 9 1,08 12 1,44

6 «Пушкинское» (Омский р-н) 1887 21 1.11 26 1,37

7 «Элита» (Москаленский р-н) 2341 . 69 2.94 75 3.20

8 «Петровское» (Омский р-н) 560 2 0.35 7 1.25

9 «Екатеринославское» (Щербакульский р-н) 626 3 0,47 4 0,64

Всего 8798 115 1.30 148 1.68

Сравнивая применяемый в практике и предлагаемый метод диагностики лейкоза крупного рогатого скота следует отметить, что время, затраченное на одно гематологическое исследование, составило: существующим методом от 43 до 68 минут, предлагаемым методом 10 минут. Применение предлагаемого метода снижает трудоемкость, повышает достоверность, благодаря высокой чувствительности метода, основанного на компьютерной технологии индикации получаемых спектров от гемолизатов. Увеличивается время, до 3 месяцев, в течение которого можно определить изменения в составе крови, вызванные лейкозом.

Выводы

1. Разработаны методологические подходы для внедрения в ветеринарную практику нового, эффективного экспресс-метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота, основанного на спектрофо-тометрии гемолизата.

2. При развитии лейкозного процесса происходят конформаци-онные изменения в гемоглобине, что позволяет с помощью спектрофо-тометрии проводить их автоматическую регистрацию в пробах крови

крупного рогатого скота, получать спектры (коэффициенты поглощения) и по ним оценивать инфекционный статус животных.

3. При исследовании гемолизата на спектрофотометре установлено 5 пиков поглощения: 284; 385; 422; 546 и 581 нм. Выявлена закономерность, что в гемолизате крови у РИД - позитивных животных спектр полосы Соре (422 нм) имеет коэффициент поглощения -1,6636 ±0,14; а у больных -2,1584 ± 0,11. Разница статистически достоверна. Для выявления этих различий разведение гемолизата 1:400 является наиболее оптимальным.

4. Использование предлагаемого метода диагностики лейкоза дает возможность увеличения сроков хранения исследуемой крови с 36 до 96 часов при температуре от +10 до + 20°С и до 3 месяцев при замораживании проб крови.

5. Основу возникающих молекулярных изменений в гемоглобине больного лейкозом крупного рогатого скота составляет механизм воздействия специфического комплекса антиген + антитело на структуру и функции эритроцита.

6. Обнаружено различие между спектрами гемолизата РИД -позитивных и больных лейкозом животных при интенсивности поглощения 581 нм, что указывает на конформационные изменения нелигандированных форм тема. Выявленные изменения в коэффициентах поглощения в области полосы 358 нм в спектре гемолизатов крови РИД - позитивных и больных лейкозом коров свидетельствуют о разнице в составе ароматических аминокислот гемопротеида эритроцитов. Наиболее демонстративными различия в спектре гемолизата РИД - позитивных и больных лейкозом животных регистрировались при 422 нм.

7. Проведение сравнительной диагностики лейкоза коров традиционным гематологическим методом и с помощью спектрофото-метрии показало преимущество последней благодаря высокой чувствительности, использования математической обработки получаемых спектров на ПЭВМ и сокращения времени исследования в 3 раза.

Практические предложения

1. Материалы диссертации доложены на ученом совете ВНИ-ИБТЖ. Рекомендованы к производственному испытанию. Протокол совета № 5, от 28.10.98.

2. На основании результатов проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по использованию спектро-фотометрии для диагностики больных лейкозом коров», рассмотренные и одобренные на заседании Ученого совета ВНИИБТЖ

от 11.11.98., протокол № 7. Документы направлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ и ПРФ № 201 - 01 от 12.11.98.

3. Подготовлен видеофильм «Применение спектрофотомет-рии в диагностики лейкоза крупного рогатого скота» для использования в учебном процессе на ветеринарных и биологических факультетах высших учебных заведений.

Список опубликованных работ

1. Околелов В.И., Божко С.П. Использование спектрофото-метрии для определения заболеваемости коров лейкозом // Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных / Материалы научно-практической конференции посвященной 65-ти летию Иркутской НИВС, 22-23 октября 1997 г., г. Иркутск. - г. Новосибирск, 1998. - С. 120-121.

2. Божко С.П. Спектрофотометрия в диагностике лейкоза крупного рогатого скота // Актуальные проблемы инвазионных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними / Материалы юбилейной научно-практической конференции студентов и аспирантов ИВМ ОмГАУ (80-летие института) г. Омск, 1998.-С. 56.

3. Божко С.П. Применение спектрофотометрии для диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Вестник Омского государственного аграрного университета.- г. Омск, 1998. - № 2. С. 61

Подано в печать 05.11.98. Формат 60x120/10 Усл. п. л. 2,0. Уч.-изд. л. 1,8. Способ печати оперативный. Тираж 100 экз. Заказ 98075

Издательство ОмГПУ: 644099, Омск, наб. Тухачевского, 14.