Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение и применение моноклональных антител для диагностики гриппа лошадей

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛШСЙ ВЕТЕРИНАРИИ иы. Я. Р. Коваленко (ВИЭБ) РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЖЛЬСКОХОВЯЙСТБЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

БаЯтубаев Нургата Габдулдаевич

Получение и применений моноклонадьньп антител для диагностики гриппа лошадей

16.00.03 - ветеринарная кикробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветер;шаргаыг наук

Москва - 1992

Работа выполнена в отделе вирусологии Всероссийского научно- исследовательского института экспериментальной ветеринарии ш. Я. Р. Коваленко.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

профессор К.П.фхэв.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор В.Г.Орлянюш (ШЗВ).

2. Доктор биологических наук, профессор Е.С.Воронин (ИВА).

Ведущее учреждение - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификат! ветеринарных препаратов (г.Москва).

Завдта диссертации состоится ¿^¿г^ 1902г. в часов на заседании специализированного совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соисканвэ ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-последовательсксц институте 'зксперкдан-таль ной ветерийарш!. 109472. Уосква, Кузьшшт. ШЭВ.

С диссертацией ыокно ознаксштьса в бШштекэ Е133. :

Автореферат разослан " г.

Ученый секретарь специализированного совета канд. ветеринарных неук

ф.г.Тер©екоз

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Грипп логоздей - одна из на/более распространенных инфащии, имеющая широкое распространение ео многих странах мира и причиняющая серьезный урон коневодству вследствие поражения органов дыхания, снижения племенной и спортивной ценности лошадей.

Вирус гриппа А является уникальным среди возбудителей инфск-щюшшх заболевании вследствие своей способности столь сильно наменять антигенную структуру, что специфическая иммунитет, приобретенный в ответ на заражение одним штаммом, очень слабо либо совсем не ззяжает от другого пояеиееогося варианта вируса.

В связи с изменчивостью возбудителя эффективная специфическая профилактика гриппа невозможна без постоянного контроля за воз-матлым появлением новых антигенных и ишуногенных вариантов вируса.

Для выработки правильной стратегии профилактики заболевания крайне ватаа быстрая диагностика гриппа.

Одним из современных, и точных инструментов для анализа антигенной структуры вирусов являются моноклокальные антитела (№Л). Ии могут с успехом применяться в тест-системах, обеспечивая их высокую чувствительность и специфичность, при изучении процессов репродукции вирусов и для индикации или очистки вирусных белков. Использование МКА при изучении вирусов гриппа имеет особое значение в свя8и с его быстрой изменчивостью и трудностью получения вьюокоспецифнчкых поликлональйьге сэторотск к блиенеродственным штаммам. Вследствие высокой специфичности и возможности.получать антитела к отдельным эпотопам вкрусньх белков, МКА могут с успехом использоваться для целей молекулярной эпизоотологии.

Паль исследовании. Получить стабильные гибридные клеточные линии, продуцирующие монсклоналыше антитела к гемагглютинину нового эпи-оо^иеск^го стаучз вируса гриппа лошадей 2-го типа (ШгШ). Исследовать иммунобиологические свойства полученных антител и определить возможность их использования в диагностических и молекуляряо-эпизоотологичесютх исследованиях.

Осповныэ зядачн нсследшшки:

1. Отработать методы накопления, концентрирования и очистки эпизоотических и лабораторных штаммов вируса гриппа лошадей.

2. Отработать методу получения шункых спленоцитов и их гибридизации с миеломнымя клетками.

- г -

3. Отработать тест-системы на основе иммуноферментного анали-ва для скрининга гибридом - продуцентов антител заданной специфичности.

4. Получить стабильные линии гибридных клеток, синтезирующих антитела к гоыэгглютинину вируса гриппа лошадей.

5. Изучить основные иммунобиологические характеристики полученных моноклоналышх антител.

6. Выделить (при восможности) новые эпизоотические штаммы вируса гриппа лоиадей, провести их идентификацию и изучение с использованием моноклоналышх антител.

Научная новизна.

Получены стабильные линий гйСридоы. продуцирующих ыонокло-нальние антитела к новому эпизоотическому штамму вируса гриппа А/лошадь/Витца/85. Определены локализация антигенных детерминант гемагглзотинкна, с которыми реагируют антитела полученных гибридом. Полученные антитела позволяют "зафиксировать"' происшедшие антигенные изменения в составе гемагглютинина вируса гриппа лошадей 2-го типа, что мсикет в последующем быть использовано для определения направления антигенного дрейфа возбудителя.

Практическая значимость иссладсвгадаш.

Синтезированы шмуноперокеидааные коныогаты на основе ЖА для выявления вируса гриппа в биологических образцах иммуиоферыонтным «шизой. На лр? лш»!п? ги^г'-'дсу коллекцией клеточных

культур в институте Цитологии АН СССР выданы свидетельства, о депонировании. На основе подученных моноклональных-антител к ге-магглютинину эпизоотически актуального вируса гриппа лошадей типа А/лотадь/НЗМ8 предложен иетод экспресс-диагностики инфекции путей обнаружения в ТФ-ИФА (в планшетах и на нитроцеллшозной иеыбране) вируса в носовой слизи Сольных лошадей на 1-2-ые сутки болезни. НКА испояьБованы для идентификаций вирулентного атаыш вируса Гриппа А/ловадь/2/ВДНХ/(НЗН8) выделенного в 1989 году.

Апробация. Основные результаты исследовании долокены на заседании Ученого совета ШШВ к ыеглабораторноы совещании сотрудников Ш38 (1992г.).

Пувяивгца». По теш диссертация опубликована одна научная отатья и одна находится в печати*

Обьем и ощктура диссертации, -Диссертация изложена на 116 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка

использованной литературы и приложения.Список.литературы включает 209 наименовании работ отечественных и зарубежных авторов.Материалы диссертации иллосгрироваш 17 таблицами, рисунками и фотографиями.

Собственные исследования Материалы и методы Работа выполнена в лаборатории вирусных болезней лошадей отдела вирусологии ВИЭВ, Вышневолоцком отделе ВИЭВ, Оисцентро Целиноградского сж

Вирусы. В работе использовали штаммы вируса гриппа лошадей' 1 и 2-го типов: референтные штаммы А/лошадь/1/Прага/5б (Н7Н7), А/лошадь/2/Майами/63 (НЗШ); эпизоотические - n8/2/69, Кирги-ЭИЯ/1/74. 0рел/2/70, Битца/2/85, ВДНХ/2/89.

Подопытные животные. Б экспериментах использовали жеребят 1-1,5 летнего возраста, мышей линии ваш/с.

Культивирование вирусов гриппа проводили в аллантоиеней полости развивающихся куриных эмбрионов.

Титр гемагглютининов определяли в реакции гемагглютинацки о 12-ной суспензией эритроцитов кур.

Реакцию торможения гешгглютинации (РГГА) проводили с 4 ГАВ вируса гриппа о учетом рекомендации ваз

Из аллаятоисной жидкости вирус гриппа преципитировали полиэ-тиленгликолем (8Х вес/объем) и осаждали центрифугированием 1чае при 10000 об/мин. Очистку концентрированного вируса гриппа от ал-лантоисных белков проводили йСнальнш центрифугированием в 10-602 градиенте концентрации Сахаровы 2 часа при 24000 об/мин.

Концентрацию белка^ (вирусного или 1мчуноглобулинов) определяли по методу Брэдфорда.

Мышей линии ВА 1В/о массой 10-12 г иммунизировали внутрибрю-иинно, б раз за 15 лней, очищенным вирусом гриппа по 30-50 ыкг белка на одно введение.

Слияние иммунных епленоцигов с клетками миеломы РЗ-Х.бЗ-Ад. 8. проводили в суспензии о помощью полиэтиленглико."ч-4000. Соотношение миеломных клеток и селезеночных лимфоцитов равнялось 1:7. В качестве фидерного слоя использовали мышиные макрофаги. Селекцию гибридных клеток проводили со дня слияния в среде с добавлением ГА? (гипоксангкн, амлнолтерин, ствддин). Миеломные и гибридные клетки выращивали в среде №Ш-1б40 с добавлением 10% сыворотки плода коров, 0,05 мг/мл пирувата натрия. 3,4 иклУл 2-ыеркалтоэта-

-л -

нола. 300 мг/л !.-глютаминз.

Скрининг с/пррнатаятов иэ растущих гибридомных культур проводили в тр*рдо1йэном ИФА. Панели 95-луноч!!их планшет сенсибилизировали высушиванием при 37 °С 50 мкл вируссодержащей (64 ГАЕ) и нормальной аллантоисной жидкостей. Связавшиеся с антигеном антитела выявляли антишшшых имкунопероксвдазным конъюгатом. Результаты учитывали визуально и б аппарате "ТЯеПек МиШзкап". Черев 3 дня положительно реагирующие клонн тестировали повторно.

Позитивные гибридомныэ клоны подвергали клонированию методш предельных разведении на никропланшетах с макрофагальныы слоеы, повторно тестировали, затем культивировали в 24-х луночных планшетах, матрасах,

Гибридоиные клетки суспендировали в среде, состоящей из 00% сыворотки плода коров и 101 диметндсульфоксида, охлаждали до-70°С и переносили в кидкии азот.

Изоткпы МКА определяли в РИД по Сухтерлони с помощью кроличьих аитимыгогных класс и подкласспецкфичных иммуноглобулинов.

Специфичность ЫМ определяли в ДОТ-ИФА на нитроцедладозкой ыембране с вирусами гриппа лошадей двух типов.

Асцнтные жидкости, с высокой концентрацией 1!КА, получалп культивированием гибргаошых клеток в бршной полости шлей линии ВАЬВ/с, предварительно обработанных приетано;.!. Иммуноглобулины из оовдтной дидкооти высаливали насыпе нны*! раствором сульфата агония.

Воньогат МКА с пероксидазой хргна получали периодатлым «этодсу.

Индикацию вирусов гриппа с помощью ША проводили в "сэндвич"-аариаите КФА на пол ¡¡стироловых планшетах и нитроцелямозных фияь-трах по схек:э: ША (подлежа) - нскогий вирус - перогандозпдЛ глаьгаг 11КЛ - проявление субстрата,! (01Щ шит диа\шкоОгн8Щзгя)

Результата ;;есдедоватт.

Г^онцйтттрнротттс п очксткд вируса гркгта.

Ссавденкэ вируса проводили с пскоцья ¡ШГ-бООО с дсОавлешкп морпда погряя до 2а. Генагг,^'К2глрус;.;гп иянвность походного пр-эпарата составят Б12 ГАЕ. Посго копшитрацян полиэтклоягляко-геи титр вадосадочной кидкосто ссатагшп; оглло 52 ГДЕ, то есаъ €няо прецгаш1>щ>овано Оодоо 00% г.лрускх-: часшщ. Тотр ¡здпц?нтрирэ-кшкого В5груса равнялся 26000 ГШ.

Котшурярозазний вирус ошщзяк Шгжьтп центрьфугпроваякон О Ю-ОЖ-по:! Свес на сбъоы) гродкэ'кте концентрации Сахаровы на

- Б -

ультрацентрифуге "Восшал". При этой было получено семь фракций, которые мы исследовали на гемагглптииируюцую активность и содержание белка (таблица 1).

Табл.1. Результата очистки концентрированного вируса гриппа в градиенте сахарозы.

1...... .... 1 Фракция N* 1 Титр ГАЕ i i 1 Содержание 1 1 белка, 1 1 мкг/мл 1 i i

1 i 1 1:256 i 1 1 100 1

1 2 i 1:2000 1 250 1

1 3 1 1:4000 1 600 i

! 4 1 1:256 1 too 1

1 б 1 1:128 1 250 1

1 б 1 1:32 i 100 1

1 7 (осадок) 1 i i 1:16 i 500 ' 1 1 1

Фракции N2 и N3 объединили и исследовали в ПААГ-ДСН - электрофорезе. Анализ электрофореграммы позволяет судить о возможности использования метода очистки вируса гриппа лошадей в градиенте плотности сахарозы. Две отчетливые полосы образованы субъединицей гемагглютияииа НА1 (около 49 кД) и NP-белком (около 60 кД). Кроме того видны следы в зоне расположения М-белка и субъединида НА2 (около 20 и 30 кД).

Отработка тест-системы на основе ТФ-йФА для скрининга нарядом Специфичность ИФА зависит от,чистоты используемого антигена и качества коньюгата. Отработку тест-системы для определения мышиных антител к вирусу гриппа проводили в ходе процесса ишуниза-ции швей до начала гибридизации. В качестве антигена адсорбируем кого на иолисгироловую подложку мы использовали препарат вируса гриппа лошадей А/лошадь/г/Бигца/85, очищенного в градиенте сахарозы, как было описано выше. Титрование этого препарата показало, что при концентрации 4-5 мкг/мл' (0,5-1 икг/луика) наблюдается максимальный хромофорный ответ тест-системы при внесении 10 нг мышиных антигриплозных иммуноглобулинов в одну лунку, и дальнейшее увеличение концентрации антигена не сопровождается повышением поглощения окрашенным продуктом реакции (рис.1). Поэтому данная

- е -

концентрация вируса была принята как оптимальная для сенсибилизации планшет. Лнтигркппознис антитела получали высаливанием сульфатом аммония из сыворотки крови таыунной мыши с титром антите; 1:32 в РТГА с вирусом АЛгогшдь/2/Битца/85.

О 2 4 б 8 10 ЫКГ/ЦЛ

Рис.2. Зависимость хромофорного ответа ишуноферыентно! тест-системы от концентрации белков вируса гриппа, сорбируемых ш полистирол. Концентрация антивирусных иммуноглобулинов ЮОнг/ия.

По оси ординат - оптическая плотность при 490 нм, по оси абсцисс - концентрация вируса (в ыкг/ил). '

Лаже высокоочиивнный вирус, выращенный в аллантоисной полости, содержит антиген, присутствующий в нормальной - адлантоионо! кидкости CLaver W.G., Webster R.G, 1966]. Антиген клетки хозяин! состоит главный образом из углеводов и ковалентно связан о полипептидами субъедилкц НА и НА. В связи с зтну тест-систем, в которой для сенсибилизации планвет используется даже 100%-но чистьй вируо, будет выявлять не только антивирусные антитела, но и антитела к антигенам клетки-хозяина.

Пбвторное тестирование положительных клонов (реагирушнх га очиЕзенный нами вирус) показало что боле© половины реагирует нг аллантоиснуо жидкость. Для отсева лсотсишшнтельных клонов был; отработана тест-оистеиа (Шк) о кспояьаовшшеи в качестве антигена иативной внруссодеркадэй аллантоконой лндкости. Для сокснбшш-ваши было достаточно титра вируса 1:64 в РТА. Клоны продуцирующие антитела к аавактоиояш болкам выявляюсь в параллельной реакции ка плангагах сенсибилизированных нормальной аялангоксно!

шдкостью.

Скрининг гибридом проводился наш одновременно в двух рест-системах с использованием вируссодержащей и нормальной ал-шнтоисной жидкостей. Это позволило нам уже при первичном тестировании отсеять клоны продуцирующие антитела к аллантоиенш антигенам.

Получение гибридом, продуцирующих мзиекдональные антитела к вирусу гриппа А/лоеадь/2/Битца/85

Иммунизацию шлей линии ВАЬВ/с проводили по двум схемам ис-юльэуя препарат вируса очицениого центрифугированием п градиенте глотности сахароза. По пергой схеме антиген вводился однократно, ^окулированием 50 мкл препарата, с концентрацией вируса 0,25 пг/мл, в селезенку, посредством операции на брюшной полости. По • другой схеме мышей иммунизировали в течение 15 дней, внутрийрю-Ш1НО 6 раз. Однако при пнутрибрюшинном введении эффективность гибридизации была вше и в последующем мы использовали этот способ. .

Табл.2. Результаты опытов по гибридизации иммунных спленоци-гов мшгей линии ВМВ/с и миеломных клеток Р3-Х53-Аг8-653

|-1-1-г-:-г

Соотно- Посевная Кол-во клонов Еффек-ть Специ-

Способ шение концен-я ( гибриди- фкч-я

иммунизации мнелома: миелом-х ПОЛО- зации эфф-ТЬ

сплено- клеток^ Всего ЖИТ" X ( г ) гибрид.

цитн на лунку ( % )

в селезенку 1:7 Ютыс. 18 1 9,3 5,5

-/-/-/- 1:8 ЗОтыс. . 44 3 ' 24,1 6.8

внутрибршинно 1:7 Ютыс. 13 2 7 Л 16,4

-/V-/-/- 1:8 ЗОтыс. 162 27 89,0 16,6

1:8 15тыс. 92 16 50,6 17,3

1_I_!_I-1-1-1

Эффективность слияния оценивали как процент лунок, в которых появились гибридомные колонии. Доля положительных, специфически реагируэдих клонов от общего их количества отражает специфичес-<ую эффективность слияния.

Количество образуемых гибридом широко вяриировало и как видно тз таблицы 2 в основном зависало от посевной концэнтращк клеток.

- s -

a доля клонов продуцируют;« моиоклоналыше антигриппозкые антитела - or способа и длительности иммунизации.

Клонирование гибридом Большинство гибридных клеток теряет способность синтезировать антитела на ранней этапе, это объясняется потерей части xpouocou, полученных от В-лимфоцитов, являвадахся "лишними" для миеломной клетки. Процесс стабилизации хромосомного набора гибридом продол-«ае.тся 1-2 месяца, в свяаи с этим возникает необходимость селекции клеток продолжающих синтез специфичных иммуноглобулинов. Ш подвергали клонировании даже одиночные клоны для отсева кепроду-цирующюс клеток. Взрослые культуры (ыассовыэ) ре клонировались pas в 2-3 месяца иди в случае снижения продуктивности (по результатам контроля уровня антител в супернатантах).

Табл.3. Результаты первичного клонирования ыетодои предельных разведений .

Количество одиночных X Титр спецнф-х антител в

Назв. клонов полежит-х срернатантах, выявля-

клона клонов емых в ТФ - ИФА

Всего Положит. Исходные После клонир-а

2Е4 10 10 100,0 1:40 1:40-1:60

1 m 15 11 73,3 1:10 ■ 1:80

2F3 9 7 77,7 1:160 1:320

2ЕЗ 11 Q 81,8 1:60 . 1:160

204 23 • 16 65.2 1:10 1:20-1:40

SF5 7 2 28.6 1:10 1:20

1В8 12 7 68.3 1:40 1:320 .

1Е7 В а 100,0 1:160 1:160-1:320

ЗС7 18 5 33,3 1:20 к»

Как ещно иэ тгШл.З ]«оотрошн:э uozosuz пйридол поаваггло в пзкоторш: случаях са.:этпо повысите продуктивность культур. Ваяв-чэетво кепродущфукза тонов, шшляеюа прл это:.», mipoico вархпг-' роп&ло. Рекжйтроваикз t^acoiia яудьтур псяозало однородность шток и лсь киогда mmzsim istoi:.™; ¡шредущфуккй спадйащцз ыгеотзла гкОридоу.

Ру.Еьтав№оват:э гвЗридш m vitro. .

Куяишщхжшга клеш: в штраагн noiîasara, что kos#;iiu:ôk

разведения при.пассировании был равным С1:3 - 1:5) для каждой линии гибридом. Монослой формировался за 2-4 дня. Количество клеток при этой достигало 1-1.5млн./мл среды. Продуктивность гибридомных линий, синтезирующих специфичные антигриппозные моноклональныв антитела определяли в непрямом твердофазном ИФА. Супернатанты гибридомных клеток, высеянных в равной концентрации, собирали ежедневно в течение недели и получили ряд проб культуратсьной жидкости разных гибридомных линий с 1 по 7 день. Результаты исследований по определению продуктивности гибридных линий отражены в таблице.4.

Табл.4. Количество секреткруемого гибридомами иммуноглобулина, определенного в ТФ-ИФА.

Название клона Концентрация иммуноглобулина в разные дни, 1 день | 2 день ( 3 день | 4 день | Б день 1 г 1 1 в ыгк/мл б день i

2Е4 3 i | 10- 1 26 1 25 i 1 30 i | 26

1D7 8 I 16 1 20 I 20 1 25 | 20

2F3 2 1 16 1 20 j 16 1 20 | 20

2ЕЗ б | 16 1 60 | 50 1 15 | 60

2D4 3 1 10 1 16 I 25 1 20 | 25

3FS 5 1 10. 1 1 20 | » • 25 1 30 1 26 , i .

Культивирование гибридом in vivo ^яьтнвировавив гябрвдса ln vivo осуществляли в бршной полости J522Sft ЛИНИИ BALB/C.

Веблщетот эа низами показало, что первый пассат гнбрвдоы вы-mmc.01 образование ссшдшя и асвдгая опухолей, Аощггнш опухай! отаповгстеь эаиетвшя на 10-12 день, при этой количество пзгдкостн Сто нэ значительна (1,5-2,6 шг). При последующих дассазш'еощя-гпя'ггбрпдсшпя ¡слота: есщшш опухоли определялись па-7-9 допь, готяество сояпдпых узелга'а в бртезшой полости yi:o грызлось, обгон сецптяческйЛ гэтдкоотн угэлнчтпшсл до -1-6 ил.

Лянпя ггбрлдсм по теряли cscGñ. способности даре икаться Oí rt-ra к па в точат"* поскоаыотх проведетш полш пасса-^й. Титры ипрусспзцг^гесгспх аппггод в ТСНЯЛ п РТГЛ пззкачзтгэльно ».йгййпоь пв-ва раэлпчпоЯ тепгоптрашш глупсглсбулпюз э--шщтшйс лщссо-тях.Результаты пультйрсшалгя' теоридсу-Ш vivo щядставлони в, таблице 5. " '

Анализ данных приведенных в таблице 5 показывает, что в первом пассаже легче получались солидные опухоли, объем асоптических жидкостей был небольшим. Второй и последующие пассата гибридом в мышах давали преимущественно аецитные формы опухоли и в более ранние сроки.

Табл.б. Культивирование гибридомных клеток в брюшной полости мышей линии ВАЦЗ/с.

, ------ Назв.|Кол-во кол-во мышей о Бремя Объем Титр антител в

(МЫИСЙ R опухолью оорзг. асцитн.

клона|опыте асцита жидкос-

1 i

1 1 солид. |асцитн. сутки ти, мл ИФА РТГА

1 1 пассак ц

1D7 Г 6 3 1 з 10-12 3-4,5 1,5-10 -

2ЕЗ i 5 3 1 2 11-12 2,5-3,5 1,0X10* 1:512

2D4 | 6 2 1 з 9-11 3-5 2x10* 1:16

.3F5 | 4 э 1 i 13 2 Zx\Qu 1:8

2 пассаж

1D7 | 4 - 1 4 8-10 4-4,5 2x101* -

2E3-I 4 - 1 з 7-9 5-7 О.ЗхЮ* 1:1280

2D4 | 4 . 1 1 з 8-10 З-б 0,2x10* 1:32-1:64

3F5 | > 4 1 1 з 1 _______ 9-11 3-5 0,3x10* 1:16-1:32 ------ -----------

Асцигные гибридомные кдетки хорошо выдерживали 8амораживание в жидком азоте и сохраняли способность к пассированию in vivo..

Моноклональные антитела из асцитических жидкостей высаливали насыщенным раствором сульфата аммония по общепринятой методике. Концентрация иммуноглобулинов определялась в реакции БрядФорда и составила 5-8 иг/мл.

определение изотипа моноклонэдышх антител ' Изотил антител продуцируемых гибридомами может быть различным у разных линий и гависиг от того, какой изогил иммуноглобулинов сокретировался В-лифоцитом слившимся о миеломной клеткой. Аецитные препараты моноклональных антител содержат.примеси иммуноглобулинов мыши-реципиента, в связи с этим изотип моноклональных антител мы определяли в культуралькой жидкости, концентрированной в 16-20 раз. Идентификацию-проводили в реакции двойной иммунодиф-Фузии по Сухтгрлопи с кроличьими аптисыворотками к различным под-

классам иммуноглобулинов шли.

Асцитные препараты ионоклоналышх антител давали две или три полосы преципитации.

Результаты исследований приведены в таблице б.

Более половины гибридных линии секретируют иммуноглобулины класса И и только две продуцируют антитела класса 1е(3. Эти результаты подтверждают данные других авторов ССапсго М.Р., (ЗегИагс! У. 19783 о том, что величина интервала времени после стимуляции и длительность иммунизации не оказывают, вопреки ожиданию, существенного влияния на изотип получаемых гибридом. Основным фактором является источник лимфоцитов, используемых для слияния: селезе-» ночные лимфоциты вызывают образование гибридом продуцирующих антитела преимущественно класса 1гМ, а лимфоциты лимфатических узлов - изотяпа 1гб.

Табл. 6 Результаты реакции ншунодиффувии по определения иэотипа моноклонзльных антител.

Клон Специфическая ярещтитируюшая сыворотка анти: Рез-ты

М 1ВА 1ем !в01 1еЙ2а 1803 РИД

2 - + - - - - -

3 - ♦ - - - -

б - - - - -

7 - + - - - т

16 - - - - + - 12<32Ь

16 • - 1в01

Определение специфичности цсно1сдоиадьных антитбл Взаимодействие полученных ».юноклопальных антител о различными птезлмшя вируса гриппа лошадей определяли в ДОТ-ИФА и РТГЛ. определение специфичности шгокяоналышх антител является необходюли

ртЛОВ 15611 ЯХ ЕСПОЯЬВОВаШШ ДЛЯ ДИаГНОСТШШ ПЛИ ОЧИСТКИ в1фуссв

гриппа.

спещфтаость получзпшх препаратов ША последовали в отнозэ-ппп семи та^оа вируса гршпа лспадей 1-го « 2-го типов. Изучение перекрестной специфичности ютскдопагышх "ттпай удоОкао того проводить та шггроаэлгадоэкя фиьтраз анализом а точках. ■ . ' " '

На полоски нитроцеллшозной мембраны наносили точки вируссо-держащей аллантоисной жидкости и одну контрольную точку (адланто-нсная жидкость). Фильтры последовательно инкубировали в растворах моноклональных антител, коныогата, субстрата. Реакция монокдо-нальных антител со специфичными им вирусами проявлялась окрааен-ными пятнами в соответствующих точках. Результаты кммунофермент-ного анализа в точках представлены в таблице 7.

Табл.7. Специфичность моноклональных антител по отнопюшпэ к различным штаммам вируса гриппа лошади в ДОТ-ИФА.

Название ттачма Название клона

Ш 2ЕЗ 204 ЗГ5

А/лошадь/2/Битца/85() + + +

А/лошадь /1 /Прага/5б С №N7) - - - -

А/лошадь/г/Майами/бЗ (НЗШ) + + +

А/лошадь/2/ВДИХ/89(НЗМ8) + + + +

А/лошадь/2/0реЛ/70(ЗНЫЗ) + + +

А/лошадь/1/Киргизия/74(Н7№) - - - -

А/лошадь/2/ N8 /69 + + + +

Аялантоисная жидкость(стр.контр.) .....1.... — —

Как видно из таблицы 7 моноклональные антитела 4-х исследованных клонов реагируют только с вирусами гриппа лошадей 2-го подтипа о антигенной формулой нзиа.

Исследования показали, что моноклональные антитела продуцируемые 3-мя клонами обладают свойствами тормозить гемагглютннация вирусов гриппа лошадей 2-го типа.

Анализ дапных таблицу 8 позволяет утверждать, что моноклональные антитела направлены против детерминант гемагглютинина вируса гриппа лошадей 2-го типа. Перекрестные реакции с вирусами 1-го подтипа полностью отсутствуют, что дает возможность данные моноклональные антитела применять для типирования вирусов гриппа лошадей. Различия в вирусах 2-го серотипа от прототипного штамма Ыайами/бЗ до штамма ВДНХ/89, обнаруживаемые в РТГА с ША, отмечают антигенный дрейф геыагглотинина этих вирусов.

- 4Э -

Табл.8. Результаты исследований аецитных препаратов монокло-нальных антител в РТГА с вирусами гриппа лошадей двух серотипов.

Штамм вируса Тигры антител в РТГА

МКА 2ЕЗ МКА гм МКА ЗГб

А/лошадь/2/Майами/63 320-640 16 4

А/лотадь/1/11рага/5б 0 0 0

А/лошадь/1/Киргизия/74 0 0 0

А/лошадь/?/0рел/70 640 16 8

д/тц-^оп*. /? /р^ггтгд /р5 12?0 •32 16

А/лопгздь/Я/ВДНХ/89 1280 64 8

Алооадь/2/ N8 /69 640 32 8

Апробация ыоноклонздьных антител в качестве иммунодиагностических реагентов Для индикации антигенов вируса гриппа лошадей с помощью полученных моноклоналышх антител мы использовали "сэндвич" - вариант твердофазного ИЗД. В качестве иммуноеорбента ш испытывали препараты ноноклональиых антител разных клопов и сыворотку лошади К вирусу гриппа лошадей А/лошадь/2/Битца/85. Предварительная титра-пня моноклоналышх антител и сыворотки показала, что сенсибшшзи-руюиая концентрация составляет 10-30 мкг/нл.

В качестве дапытываеыых препаратов, для определеттл чувствительности диагностики, пспольаовага очинённый вирус гриппа я вп-руссодергсазуп аллантонсяую етдкостъ. Для индикации Б!5руса, овя-гаветгсся с аггпгтелга.ш адеорбирогеппкал па твердой фэизз, прггягяг-"! поротеидазные кряьвгагн на сспово мошшшалышх антител.

По результатам исследований бызп спрэделэгш сочетать шгя-глльнь'э по чувствительности : ' • -

*!3?л 2ЕЗ (пг-:муносорбент) - зге (коньюга?); .

ММ 2Ш (галчгносорбент) - 333 (коньвгаг). Порог чувствительности в первом случае составил 4-3 пг/нд п.тл 0,1-0,5 ГАЕ, а во второй пара 2-4 пгЛа нот 0,6-1 глз.

^¿упсфзрмонж'э тест-сшттаи па основе мошшональпых -апти-тэл ?>н апробировали па воэтхнеегь пндтсашш вируса гриппа в' олл-оп посовей полости логэюй. На опытной ОаеэШШВ ото тгрсвэдопо искусственно« варайзтз -грая годовалых гярооя? питракавазсьпой.

аппликацией вируссодержащей аллантоиеной жидкостью. Для заражения использовали смесь штаммов А/лошадь/2/Битца/85 и А/до-шадь/2/ВДНХ/89. На 2 и 3 день у жеребят были взяты пробы носовой сливи.Роо/льтаты опытов по индикации вируса гриппа в слизи носовой полости лошадей представлены о таблице 9.

Табл.0. Вывление антигенов вируса гриппа в слизи носовой полости лошадей методом ТФ-ИФА.

Бремя после заражения Коныогат 2ЕЗ Конъюгат ЗГ5

Подлож. МКАЗЯ'5 Подлож. МКЛ2ЕЗ

Носовая слизь жеребенка N1 Носовая слизь жеребенка N2 Носовая слизь жеребенка НЗ 48 ч 72 Ч 48 -Ч 72 Ч 48 ч 72 ч 1.283 0.385 1.443 0.709 1.179 0.645 1.612 1.254 1.696 0.794 1.387 0.856

Носовая слизь здорового жеребенка 0.503 0.463

Лллантоисная жидкость 0.335 0.307

Положительный контроль:

Вирус гриппа 4ГАЕ 2.030 2.107

Вирус гриппа 2ГАЕ 1.959 1.981

Вирус гриппа 1ГАЕ 1.473 1.526

Вирус гриппа 1/2ГАЕ 0.809 0.831

Вирус гриппа 1/4ГАЕ 0.609 0.633

Вирус гриппа 1/8ГАЕ 0.534 0.577

Вирус гриппа 1/16ГАЕ 0.432 0.491

Примечание: результаты реакции представлены в единицах оптической плотности при длине волны 490.

Анализ результатов, представленных в табл. 9 показывает, что интенсивная реакция отмечается с пробами слизи носовой полости взятыми у жеребят на 2-ой день после заражения гриппом. Концентрация вирусных белков,- выявляемых в пробах зараженных жеребят, сопоставима с количеством вируса в вируссодержащей аллантоиеной

жидкости о титром 0,5-1 ГАЕ. На проведение реакции было затрачено около 2,5 часа. Высокая чувствительность и специфичность, а также быстрота реакции позволяют использовать данный метод (на основе ЫКА) для экспресс-диагностики гриппа у лошадей, а также для индикации вирусов гриппа лошадей 2-го типа в биологических жидкостях.

Выделенный наш в 1989 году вирус гриппа от больных лошадей, игами ВДНХ, был исследован в РТГА со специфической сывороткой и ыоноклональными антителами к штамму Битца/85, а также поликло-нальной сывороткой к штамму Ыайами/63. РТГА с поликлональными антителами позволило типировать новый пггамм, как вирус гриппа лошадей 2-го типа. Использование моноклональных антител к штамму Битца/85 показам его отличие от референтного штамма Майами/63 и практически полную идентичность штамму ВДНХ/89. Таким образом, на основании данных литературы к полученных нами результатов, можно сделать заключение . о том что с конца 70-х и начала 80-х годов в активной циркуляции находятся антигонпио варианты вируса гриппа лошадей 2-го типа, типичными представителями которого являются штаммы А/лошадь/ССопгенОло/70, А/ловадь/Кентукки/81 и А/ло-вадь/Битца/85.

ВЫВОДЫ. .

1. Получена стабильные линии гибридомных культур, секретирующие моноклональные антитела к вирусу гриппа лошадей 2-го типа - новому эпизоотическому штамму А/лояадь/2/Витца/85 (НЗШ).

2. Ноноклональные антитела четырех линии относятся к иммуноглобулинам шлей класса М, а двух линии- 1гШ и 1е(32Ь, соответственно.

3. Данные имыунофериектного анализа показывают что моноклональные антитела гибридомных линии 1С?, 2ЕЗ, 204, ЗР5 специфичны к вирусу гриппа яовадей 2-го типа, и не реагируют о вирусом гриппа лошадей 1-го типа.

4. доцитше препарата шжоклояальных антител 3-х клонов (2Е3.204, ЗРЪ) подавляют в РТГА геыагглютинацио вируса гриппа лошадей -2 типа в равйвденюг до 1:1280,

5. Ноноклоналыяь» антитела к штамму А/лошадь/г/Витцэ/85, активные в РТГА, направлены в детерминантам тяжелой оубъединицы гекагг-лотинина КЗ вируса гриппа лошадей 2- го' етша и- аоевояа*» диКй-рвнтшрлвать референтный тш А/лоиадь/2/Шйами/бЗ о? - нового эпизоотического оташа А/лотадь/2/Бзггца/8й, .гитр гомологичных

- 1Ь -

антител в 4 раза превышает показатели РГГА с эпизоотическим ггаммом Л/лосвдь/2/Битца'25 в сравнении с референтным штаммом А/лошада/Й/Макамп/бЗ.

6. Продуктивность подученных гибридомных линии составляет 15-30 мет монога.эиашш: антител на мл ¡змьгур&льной среды.

7. Отработана тест-система из оспозо твердофазного М>А для скрининга гибридом, оекретирущих антитела к вирусу гриппа лошадей.

8. Отработана тест-система на основе полученных нами моноклональных антител для индикации вируса гриппа лошадей 2 типа в биоло-

, гичест: образцах шлупоформонтным способом, что позволяет про, водить ¡вдшсащпо Еируса в материале от больных лошадей.

■ 9. Выделен новый эпиаоотичеекки штамм вируса гриппа лошадей А/лошадь /2/ВДНХ/89 и ■ проведена его идентификация и сравнительное исследование с помощью моноклональных антител. Показано, что выделенный штамм отличается от референтного А/лошадь/2/Майа-ми/63 и идентичен птаиму изолированному в 1985 году (А/ло-щадь/г/Битца/85).

Практические предложения

1. Линия гибридомы Н1У-2-16 депонирована в связи с подачей заявки на изобретение в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 19.12.91., под номером ВСКК/П/ 576 Д.

2. Линия гибридомы НIV-2-7 депонирована в связи с подачей ваявки на изобретение в Специализированной коллекции перевиваемых соматических меток позвоночных. Всесоюзной коллекции клеточных культур 19.12.91. под номером ВСКК/П/ 577 Д.

Список опубликованных работ

1. Байтубаев Н.Г.,Юров К.И. Получение и свойства моноклональных антител к вирусу гриппа А/лошадь/2/Битца/85 (НЗШ) // - реферат опубликован в реферативном журнале серии "Ветеринария" N4,1992, с.7.

Подписано в печать 27.05.92, Заказ 608 Формат 60x84/16 Тираж 100

Москва. Типография РАСХН