Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Питательные бактериологические среды из сухого белкового концентрата при производстве ветеринарных биологических препаратов

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ ІІЛУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ 1 КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

_

На права^с рукопису

ДОЦЕНКО ВІКТОР ВАСИЛЬОВИ

ЖИВИЛЬНІ БАКТЕРІОЛОГІЧНІ СЕРЕДОВИЩА ІЗ СУХОГО БІЛКОВОГО КОНЦЕНТРАТУ ПРИ ВИРОБНИЦТВІ ВЕТЕРИНАРНИХ БІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія та

імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Харків - 1996

Робота виконана в лабораторії кафедри інфекційної патології Полтавського сільськогосподарського інституту та Сумській біофабриці.

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук,

професор А. Ф. КАРИШЕВА

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук,

старший науковий співробітник К. Є. КОНАРЖЕВСЬКИЙ

кандидат біологічних наук, доцент М. М. КАЛАШНИК

Провідна організація - Національний аграрний

університет, Мінсільгосппрод України м. Київ

Захист відбудеться кь іти а _1996 року на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 02.32.01 при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН: 310023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини (м. Харків, вул. Пушкінська, 83).

Автореферат розісланий “•22" ИЮ7Р/01996 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої Ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність і ступінь дослідженості тематики дисертації. В даний час однією з гострих проблем становлення і розвитку біологічної промисловості на Україні являється пошук дешевих якісних живильних середовищ для глибинного вирощування в реакторах різноманітних мікроорганізмів при виробництві таких препаратів, як вакцини, діагностичні антигени та ін.

Існуюча практика використання м’ясних переварів Хоттінгера для накопичення бактеріальної культури виявилась малоефективною в зв’язку з великим дефіцитом і високою вартістю цього продукту, а також нераціональністю використання м'яса не за прямим призначенням для харчування людей.

Разом з тим, м’ясо не являється оптимальним продуктом для виготовлення бактеріологічних живильних середовищ. Коефіцієнт його використання в цьому випадку складає лише 20%, а тривалість підготовки затягується на 5-6 діб.

М’ясні середовища не взмозі забезпечити потребу в поживних речовинах цілого ряду мікроорганізмів, що викликає необхідність додаткового внесення до живильних середовищ таких інгредієнтів, як пептон, печінковий і дріжджевий екстракти та ін. До того ж м’ясні середовища не стандартні, не стійкі при зберіганні, незручні при транспортуванні.

Багаторазові спроби замінити м’ясо такими білковими' продуктами, як риба (В. М. Слесаревський, 1931 ;Т. В. Георгієв, В.І. Тріков, 1955; Н.В. Лихварь з співавт., 1964), казеїн (¡.Н. Виноградова, 1962), кров і кров’яні згустки (Р.В. Литвак, Н.В. Хол-чев, 1941; П.В. Рибалкін, Н.М. Потапов, 1987), м’ясо-кісткове, рибне і китове борошно (А. Саватаєв з співавт., 1941; Л.А. Мартене, 1964), соя, горох (Н.І. Розанов, 1932; К.Н. Бучнєв, 1952;

H.H. Гізітдінов, 1987), а також різноманітними відходами біо-виробництва (Н.Д. Скичко, 1978; О.П. Простяков, 1990) виявились недостатньо ефективними.

Тому питання пошуків якісного дешевого білкового продукту для живильних бактеріологічних середовищ і заміни ним м’ясних переварів Хоттінгера при виробництві біологічних препаратів являються надзвичайно актуальними.

Мета і основні завдання наукових досліджень. Основна мета досліджень - пошук нового економічного і якісного білкового

продукту для вирощування мікроорганізмів на біофабриках, а також розроблення і апробація промислової технології отримання з нього білкових основ і живильних середовищ при виробництві різних вакцин.

Для досягнення поставленої мети були визначені слідуючі завдання:

—- Дослідити _фізико-хімічні і економічні показники сухого білкового концентрату, що випускається Полтавським м’ясокомбінатом за патентом України № 2067, для визначення можливості використання його в якості азотвміщуючої основи виробничих живильних середовищ для мікроорганізмів.

- Розробити технологічні параметри отримання в виробничих умовах ферментативних гідролізатів сухого білкового концентрату для живильних бактеріологічних середовищ, що замінюють м’ясні перевари Хоттінгера.

- Розробити і запропонувати способи конструювання і використання виробничих живильних середовищ на основі гідролізатів сухого білкового концентрату для вирощування мікроорганізмів при виробництві біопрепаратів.

- Визначити ефективність глибинного культивування в

біореакторах виробничих штамів сальмонел, пастерел, ентерококів, кишкової палички і бактерій бешихи свиней на живильних середовищах з сухого білкового концентрату для отримання вакцин. -

- Приготувати експериментально-виробничі серії вакцин з різних штамів мікроорганізмів, вирощених на середовищах з сухого білкового концентрату, і провести оцінку їх якості.

Теоретична і практична цінність досліджень і їх наукова новизна. Вперше для культивування виробничих штамів мікроорганізмів при виготовленні вакцинних препаратів з високою ефективністю використані на біофабриці нові живильні білкові основи (ферментативні гідролізати) і живильні середовища з сухого білкового концентрату. Розроблений і апробований в умовах Сумської біофабрики оригінальний спосіб одержання ферментативних гідролізатів СБК за ускореною методикою, що забезпечує одержання повноцінних білкових основ за 4 години замість 5-6 діб при виготовленні м’ясних переварів Хоттінгера. Встановлено високу якість і економічність живильних білкових основ і живильних середовищ з сухого білкового концентрату,

що вміщує усі необхідні інгредієнти для життєдіяльності різноманітних фізіологічних груп мікроорганізмів, в тому числі 27 амінокислот в порівнянні з 18 амінокислотами в прототипних живильних м'ясних середовищах. Нові живильні середовища з сухого білкового концентрату забезпечують типовість росту, збереження культурально-біологічних властивостей і високу "урожайність” контрольних тест-штамів. При вирощуванні в біореакторах на живильних середовищах з сухого білкового концентрату накопичення бактеріальної маси виробничих штамів сальмонел, пастерел, ентерококів, кишкової палички, бацил емкару було в 1,5 рази більшим, ніж на м’ясних середовищах.

Вперше з виробничих штамів, вирощених на середовищах з ферментативного гідролізату сухого білкового концентрату, виготовлені експериментально-виробничі серії вакцини проти сальмонельозу свиней, пастерельозу птахів, бешихи свиней, а також асоційованої вакцини проти сальмонельозу, пастерельозу і ентерококової інфекції поросят, що за всіма контрольними тестами відповідали вимогам інструкцій і технічних умов.

Рівень реалізації, впровадження наукових розробок. Основні результати досліджень впроваджені в практику роботи Сумської біофабрики у вигляді “Временных наставлений по применению сухой универсальной белковой основы для питательных бактериологических сред”, “Временных наставлений по применению сухой универсальной белковой основы для получения пептонов” (Затверджені Головним Управлінням ветеринарної медицини з держветінспекцією МСГ та продовольства України 3 липня 1993 р.).

Апробація та публікація результатів наукових досліджень. Матеріали дисертації доповідались на І республіканській науковій конференції “Біотехнологічні дослідження і перспективи їх розвитку” (Львів, 1990), республіканській науково-практичній конференції “Наукове забезпечення агропромислового комплексу УРСР” (Біла Церква, 1990), І установчому з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993), Міжнародній науковій конференції “Загальна епізоотологія: імунологічні, екологічні і методологічні проблеми" (Харків, 1995).

За матеріалами досліджень опубліковано 8 наукових

робіт.

Структура та обсяг дисертаційної роботи. Дисертація викладена на 145 сторінках машинописного тексту, містить 32 таблиці, 12 малюнків і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків, практичних пропозицій та списку використаної літератури з 262 джерел, серед яких 27 іноземних.

Особистий внесок дисертанта в розробку наукових положень, що виносяться на захист:

На підставі аналізу результатів експериментів та спів-ставлення їх з даними літератури дисертантом сформульовані наступні положення, що виносяться на захист:

- технологічні параметри промислового отримання і контролю якості ферментативних гідролізатів сухого білкового концентрату як азотвміщуючої основи живильних бактеріологічних середовищ, замінюючих м’ясні перевари Хоттінгера;

- культивування в біореакторах виробничих штамів саль-

монел, пастерел, ентерококів, кишкової палички, бактерії бешихи свиней з метою накопичення бактеріальної маси при виготовленні вакцин; ’

- виготовлення в умовах біофабрики виробничо-експериментальних серій вакцини з різних штамів бактерій, вирощених на середовищах з сухого білкового концентрату, їх оцінка в відповідності з вимогами ГОСТу і Технічних умов;

- доповнення до інструктивних документів по виготовленню вакцин проти сальмонельозу свиней, пастерельозу птахів, бешихи свиней, асоційованої вакцини проти сальмонельозу, пастерельозу, ентерококової інфекції поросят з використанням для вирощування виробничих штамів мікроорганізмів різних живильних середовищ з гідролізатів сухого білкового концентрату.

Методологія і методи досліджень предмета і об’єкту.

Для культивування різних виробничих штамів мікроорганізмів використовувались ферментативні гідролізати сухого білкового концентрату (СБК), який випускається на Полтавському м’ясокомбінаті по патенту України №2067. Дослідження СБК проводились за показниками, прийнятими для визначення якості білкових продуктів, що використовуються для отримання живильних бактеріологічних середовищ: вміст білка, загального та амінного азоту, пептонів, триптофану, різних неорганічних солей, тощо.

Всі біохімічні дослідження проводились згідно методів, викладених в ГОСТ 13805 “Пептон сухий ферментативний для бактеріологічних цілей”.

Крім того, в Обчислювальному центрі АН Молдови в 10 контрольних партіях СБК визначався на ЕОМ якісний і кількісний склад амінокислот.

З метою розщеплення СБК до пептонів і амінокислот, придатних для використання бактеріальною клітиною, використовувався ферментативний гідроліз. В 20 спеціальних дослідах на Сумській біофабриці в 200-1000-літрових реакторах відпрацьовувались оптимальні параметри співвідношення СБК, води і ферменту (панкреатин, підшлункова залоза), тривалість гідролізу, pH реагуючої суміші, температурний режим та ін. Визначення якості ферментативних гідролізатів СБК здійснювалось за показниками, що передбачені “Методичними рекомендаціями по фізико-хімічному і біологічному контролю білкових гідролізатів для бактеріологічних живильних середовищ” (М., 1983). Контролем служили прототипні м’ясні перевари Хоттінгера.

З ферментативних гідролізатів СБК були виготовлені різноманітні живильні середовища, які використовувались для вирощування контрольних тест-культур мікроорганізмів, виробничих штамів сальмонел, пастерел, ентерококів, кишкової палички, бактерії бешихи свиней та ін. Біологічна оцінка якості досліджуваних живильних середовищ із СБК проводилась згідно “Методичних рекомендацій до контролю живильних середовищ на основі параметрів росту мікроорганізмів в процесі їх культивування” (М., 1980). .

Протягом 1993-1995 рр. на Сумській біофабриці з виробничих штамів мікроорганізмів, вирощених на середовищах із СБК, виготовлено і досліджено 25 експериментальних серій вакцин проти сальмонельозу свиней із штаму Salmonella cholerae ТС-177,9 серій вакцин проти пастерельозу птахів, інактивованої сорбованої із штаму Pasteurella multocida 115, 7 серій вакцини сухої проти бешихи свиней із штаму Erysipelothrix insidiosa ВР-2 і ВДНКІ 6/24, 9 серій вакцини проти сальмонельозу, пастерельозу і ентерококової інфекції поросят асоційованої з штамів Salmonella cholerae suis 370, Pasteurella multocida 656, Streptococcusfaecalis 13; 345; “Соколова”, “Костянтинівський”.

Отримання живильних середовищ на основі СБК, культивування на них виробничих штамів різних мікроорганізмів у флаконах, матрах-бутилях і реакторах, виготовлення експериментально- виробничих серій вакцин проводилось з участю головних спеціалістів і ветеринарних лікарів Сумської біо-фабрики Євдокименка М.І., Жидченка Л.І., Крупського І.О., Мірошник С. П.

Виробництво експериментальних серій різних вакцин і їх контроль здійснювались згідно інструкцій по виготовленню і контролю відповідної вакцини, а також діючих Технічних умов під контролем начальника ВБК Сумської біофабрики Бондаренка В.О.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ Розробка і апробація технологічних параметрів промислового виробництва ферментативних гідролізатів із сухого білкового концентрату Загально відомо, що мікроорганізми можуть вживати білкові речовини лише після гідролізу їх до низькомолекулярних азотистих сполук, головним чином, пептонів та амінокислот. Методика ферментативного гідролізу м'яса, яка була вперше запропонована в 1913 р. Хоттінгером, в наш час широко застосовується для одержання білкових основ із різних продуктів і вважається неперевершеною. Однак в кожному конкретному випадку виникає необхідність розробки оптимальних параметрів гідролізу в залежності від особливостей білкового продукту.

Проведені нами фізико-хімічні дослідження 27 партій сухого білкового концентрату свідчать проте, що по своїм властивостям він повністю відповідає вимогам до якості білкових продуктів для живильних бактеріологічних середовищ. Сухий білковий концентрат являє собою розсипчатий порошок, що легко розчиняється в теплій воді. На відміну від таких прототипних продуктів як м’ясо та риба може тривалий час зберігатися в звичайних умовах приміщень, легко транспортується, а при використанні не потребує будь-якої попередньої обробки.

Сухий білковий концентрат набагато перевищує інші білкові продукти по наявності живильних речовин. В ньому міститься (% на абсолютно суху речовину): 94,5±0,24 білка, 0,21+0,004 фосфору, 0,63+0,006 кальцію, 0,85±0,11 хлористого натрію,

19,2 ± 0,5 пептонів, 1750 ± 0,67 мг% загального азоту, 1200 ± ±0,31 мг% амінного азоту, а також 27 амінокислот (табл. 1).

В той же час в м’ясі встановлено тільки 21,6 % білка та 18 амінокислот (А.Е. Шарпанек, 1946), в рибі - 18% білка та 14 амінокислот (М.Ф. Чанпалов, 1956), казеїні - 40% та 16 амінокислот (і.Н. Виноградова, 1962).

Таблиця 1

Хімічний склад сухого білкового концентрату

(процент до абсол. сухої речовини)

Хімічні показники X ± т

Абсолютно суха речовина 93,0 ± 0,03

Білок . 94,5 ± 0,24

Фосфор 0,21 ± 0,0004

Кальцій 0,63 ± 0,006

Хлористий натрій 0,85 ± 0,011

Зольні речовини 0,49 ± 0,1

Загальний азот (мг%) 1750,0 ± 0,67

Амінний азот (мг%) 1200 ± 0,31

Пептони 19,2 ± 0,5

На підставі багаторазових експериментів було визначено, що для одержання із СБК високоякісних білкових основ для живильних бактеріологічних середовищ, гідроліз в реакторах необхідно проводити при слідуючих технологічних показниках: концентрація порошку в водному розчині - 5-10%, вміст підшлункової залози - 25%, рН реагуючої суміші - 7,9-8,1, температура - 49°С, тривалість гідролізу - 4 години.

В таких умовах через 4 години в гідролізатах СБК накопичується до 1752 мг% загального азоту, 690 мг% амінного азоту, 5,5% пептонів та 27 амінокислот, сума яких складає 8,874 мг%. В гідролізатах СБК утримуються такі надзвичайно необхідні для мікроорганізмів амінокислоти, як треонін, метионін, орнітин, ізолейцин, етаноламін, а - р - у - аміномасляні амінокислоти, які відсутні в м’ясних переварах Хоттінгера, або визначаються в недостатній кількості.

В контрольних м’ясних переварах Хоттінгера потрібні показники амінного азоту визначаються лише після гідролізу м’яса протягом 6 діб (табл. 2), а вміст в них пептонів становить лише 1,4%. В гідролізатах м’яса знаходиться 18 амінокислот, їх сума складає 3,704 мг%.

Таблиця 2

Порівняльні показники азотистих сполук в ферментативних гідролізатах сухого білкового концентрату і м’яса

Показники Ферментативні іідролізати СБК (4-годинного гідролізу) Ферментативні гідролізати м’яса (гідроліз протягом 6 діб)

Загальний азот, мг % 1250 1170,0

Амінний азот, мг% 698 613

Пептони 5,5 1,4

Кількість амінокислот 27 18

Сума амінокислот, мг% 8, 874 3,704

Приведені дані переконливо свідчать про те, що гідролізати СБК значно перевищують по якості контрольні м’ясні перевари Хоттінгера.

Про високу ефективність використання сухого білкового концентрату для бактеріологічних живильних середовищ переконливо свідчать дані, представлені в таблиці 3.

Таблиця З

Ефективність використання сухого білкового концентрату для живильних бактеріологічних середовищ

Перелік білкових продуктів Вміст білка, % Ступінь розщеплення білка Коефіцієнт викори- стання Кратність заміни СБК інших білкових продуктів

СБК 94,5 0,80 0,76 1

М'ясо 20,0 0,40 0,08 9,4

Риба

(кілька) 18,0 0,40 0,07 10,3

Казеїн 60,0 0,36 0,02 3,4

Виготовлення живильних середовищ із сухого білкового концентрату і контроль їх якості шляхом культивування тест-штамів мікроорганізмів

Із ферментативних гідролізатів СБК були виготовлені та досліджені 149 серій живильних середовищ загального призначення (поживний бульйон, поживний агар, поживний желатин), елективні живильні середовища для відповідних

мікробів, середовища для контролю стерильності медичних та ветеринарних біопрепаратів, а також 52 серії виробничих живильних середовищ для вирощування вакцинних штамів мікроорганізмів в біореакторах. При цьому ферментативні гідролізати СБК використовувались не у вигляді добавок, а як азотвміщуюча основа, яка повністю замінювала м'ясні перевари Хоттінгера.

Конструювання різних середовищ проводилось з урахуванням кількісних показників загального та амінного азоту, пептонів, амінокислот, тощо, необхідних для вирощування конкретних мікроорганізмів. При виготовленні елективних середовищ додатково вносились різні інгредієнти (кров, гліцерин, глюкоза, тощо), які передбачаються відповідними офіційними прописами.

Контроль експериментальних середовищ із СБК, який проводився згідно ГОСТу 13805 “Пептон сухий ферментативний для бактеріологічних середовищ" по параметрах росту тєст-штамів мікроорганізмів і по наслідках титрування, свідчить про їх високу якість. Ріст тест-штамів E. coli 675. Staph, aureus Lossmanow,Str. faecalis 6783 на досліджуваних середовищах був типовим, відповідав всім вимогам ГОСТу, хоча визначався більшою інтенсивністю. Живильні середовища із гідролізатів СБК забезпечували також ріст тест-культур Cl. diphteroides 1911, Str. scarlatinae Дік-1, С1. oedematiens 198 в крайніх допустимих розведеннях вихідної розплодки, що являється одним із провідних показників визначення якості живильних середовищ.

Морфологічні, культурально-біохімічні і антигенні харак- ' теристики всіх тест-культур залишались незмінними на протязі всього 1,5-річного вирощування їх на середовищах із СБК.

Виробничо-експериментальні дослідження по використанню живильних середовищ

із ферментативного гідролізату сухого білкового концентрату при виготовленні вакцин

Суха жива вакцина проти сальмонельозу (паратифу) свиней із штаму Salmonella cholerae suis ТС-177

Експериментальні серії вакцини проти самонельозу свиней одержували із штаму ТС-177, який культивувався в 200-літрових біореакторах при 37-38°С протягом 9-12 годин на

досліджуваному живильному середовищі із ферментативного гідролізату СБК. В цьому середовищі містилось 220 мг% амінного азоту, 2°/о пептону та 0,1% стерильного розчину глюкози, що при безперервному перемішуванні та аерації повністю забезпечувало вимоги вакцинного штаму сальмонел до ростових живильних середовищ.

В контролі культивування вакцинного штаму сальмонел проводилось на живильному середовищі із м’ясного перевару Хоттінгера з добавкою 0,4% пептону та 10% екстракту печінки.

Регулювання рН-7.6-7,8 середовища, рівню окислювально-відновлювального потенціалу та аерації здійснювалось автоматично.

Перевірка чистоти і типовості росту, дослідження культурально-морфологічних та аглютинаційних властивостей культури сальмонел, вирощеної на випробованому середовищі, свідчили, що вона не відрізнялась від контрольної культури.

Культура сальмонел, вирощена на живильному середовищі із СБК, відповідала усім вимогам діючих інструктивних документів. Разом з тим концентрація мікробних клітин, вирощених на живильному середовищі із СБК, дорівнювала 2527 млрд/мл, в той час як на контрольному середовищі лише 1822 млрд/мл.

Всі 25 експериментальних серій вакцини проти сальмонельозу свиней, які були виготовлені на Сумській біофабриці, пройшли перевірку якості згідно Технічним вимогам цієї вакцини. Результати досліджень (табл. 4) свідчать про те, що по зовнішньому вигляду, кольору, розчинності, вмісту вологи, концентрації мікробних клітин, кількості живих клітин в одній дозі вакцини, а також нешкідливості та імуногенності експериментальні серії вакцини відповідають діючим інструктивним документам.

Вакцина проти пастерельозу птахів інактивована сорбована

При виготовленні експериментальної вакцини проти пастерельозу птахів використовувався штам Pasteurella multocida 115, вирощений на живильному середовищі із ферментативного гідролізату СБК. В ньому містилось 210 мг% амінного азоту та 2-3% пептонів, що є аналогічно вмісту цих речовин в контрольному середовищі на основі м’ясного перевару Хоттінгера. Культивування вакцинного штаму пастерел проводилось в 200-літрових реакторах при 37°С протягом 12-

14 годин.

Таблиця 4

Характеристика якості експериментально-виробничих серій сухої живої вакцини проти сальмонельозу свиней зі штаму ТС-177, вирощеного на досліджуваному середовищі із ферментативного

гідролізату СБК

■ Показники якості Характеристика вакцини із штаму ТС-177, який культивувався на середовищі із СБК Нормативні показники вакцини, передбачені технічними вимогами

Зовнішній вигляд Дрібнопориста маса світло-жовтого кольору без запаху Дрібнопориста маса білого чи світло-жовтого кольору без запаху

Наявність в пляшках вакууму Обов’язкова Обов’язкова

Розчинність вакцини Легко розчиняється Легко розчиняється

Масова частка вологи 1 -3% 1-3%

Чистота і типовість росту вакцинного штаму ТС-177 Ріст на МПА і МПБ типовий. В мазках однорідні грамне-гативні палички Ріст на МПА і МПБ типовий. В мазках однорідні грамнє-гативні палички

Концентрація мікробних клітин в 1 мл вакцини 25-27 млрд/мл 18-22 млрд/мл

Кількість живих клітин в одній дозі вакцини 450-500 млн 450 млн

Нешкідливість Вакцина нешкідлива Вакцина нешкідлива

імуногенність Вакцина імуногенна Вакцина імуногенна

Для більшого накопичення бактеріальної маси проводилось постійне перемішування середовища, подача стерильного повітря та 0,3 % глюкози. Контроль біологічних показників вирощеної культури на чистоту, типовість росту, ферментативну активність та вірулентні якості свідчив, що вони відповідають

и

вимогам діючих інструктивних документів. Проте концентрація мікробних клітин на досліджуваному середовищі із СБК досягала 22-28 млрд/мл, тоді як на контрольному м’ясному середовищі тільки 15-18 млрд/мл.

Дослідження якості 9 експериментальних серій вакцини проти пастерельозу птахів показали, що по всіх показниках вони відповідають вимогам Технічних умов (табл. 5). По зовнішньому вигляду, кольору, нешкідливості та імуногенній активності для курей випробовувані серії були аналогічні контрольним препаратам. '

Таблиця 5

Якісні показники експериментально-виробничих серій вакцини проти пастерельозу птиці інактивованої сорбованої із штаму Pastcurclla multocida 115, вирощеного на випробовуваному середовищі із СБК

Показник якості вакцини Дані досліджень експериментальної вакцини Відповідність нормам, передбаченим ТУ 10. 19.30.86.

Зовнішній вигляд Білувато-сіра суспензія з білим осадом, що легко розбивається в гомогенну суміш Відповідає

Наявність стороннії домішок, плісені Не допускається Відповідає

Концентрація мікробних клітин в 1 мл вакцини 22 - 28 млрд/мл Відповідає

Стерильність В посівах на МПА, МПБ, МППБ під вазеліновим маслом, на агарі Сабуро росту мікроорганізмів не спостерігається Відповідає

Концентрація водородних йонів (рН) 12-7,6 Відповідає

Нешкідливість Вакцина нешкідлива. Після підшкірного введення вакцини загибелі білих мишей не відбувається. Після внутрішньом’язового введення вакцини курям захворювання і загибелі не спостерігалось Відповідає

Імуногенність Вакцина імуногенна. При внутріш-ньом 'язовому зараженні гомологічним штамом пастсрел в дозі 5ЛД/0,5мл запобігає загибелі8із 10 вакцинованих курей Відповідає

Вакцина суха проти бешихи свиней із штаму ВР-2

Виготовлення експериментальних серій вакцини проти бешихи свиней проводилось із штаму Erysipelothrix insidiosa ВР-2, який вирощувався на живильному середовищі із СБК. Для його виготовлення ферментативний гідролізат СБК розводився демінералізованою водою до одержання бульйону з вмістом 160-180 мг% амінного азоту та 2-3% пептонів. Контролем було середовище на основі м’ясного перевару Хоттінгера, в яке додатково вносилось 0,5% пептону, 0,5% екстракту дріжджів, 5% екстракту печінки, 0,05% Твину-80. *

Культуру штаму ВР-2 вирощували при 37°С на протязі 14 годин, перевіряли відповідно вимогам інструктивнихдокументів. При цьому було встановлено, що по чистоті і типовості росту, ферментативній активності та імуногенним властивостям вакцини штам, вирощенний на досліджуваних і контрольних середовищах, не відрізняється.

Наслідки випробування якості 7 експериментальних серій вакцини проти бешихи, виготовленої із штаму ВР-2, і вирощеного на досліджуваному живильному середовищі, приведені в табл. 6. Вони свідчать про те, що по зовнішньому вигляду, розчинності, вмісту вологи, концентрації живих мікробних кліток, а також по нешкідливості та імуногенності, ці вакцини не відрізнялись від контрольних препаратів і відповідали вимогам діючих технічних умов.

Асоційована вакцина проти сальмонельозу, пастерельозу та ентерококової інфекції поросят

Для виготовлення експериментальних серій асоційованої вакцини використовувались виробничі штами Salm. cholerae suis 370, Past. multocida 656, Str. faecalis 13, “Соколова", “Костянтинівський”, які вирощувались на живильному середовищі із гідролізатів СБК. Культивування всіх виробничих штамів проводилось окремо. При цьому вакцинні штами сальмонел та пастерел вирощувались по методиках, які раніше були описані в розділах по виготовленню із них моновалентних вакцин. Стрептококи культивувались в реакторі при 37°С на протязі 12-18 годин при безперервній аерації та перемішуванні.

Таблиця 6

Якісні показники експериментально-виробничих серій сухої вакцини проти бешихи свиней з штаму ВР-2, вирощеного на випробовуваному середовищі із ферментативного гідролізату СБК

Показники якості - вакцини Дані досліджень експериментальної вакцини Відповідність нормам, передбаченим ТУ 10.09. 132.91.

Зовнішній вигляд, колір Дрібнопориста суха маса жовто-коричневого кольору Відповідає

Наявність сторонніх домішок, плісені Не допускається Відповідає

Розчинність Розчиняється 1-2 хв. 3 утворенням гомогенної суміші без пластівців і осаду Відповідає

Масова доля вологи, в межах 2,8-3,3% Відповідає (межі 1,6 - 4%)

Контамінація сторонньою мікрофлорою Не допускається Відповідає

Типовість росту МПА - через 24 години дрібні гладенькі, голубі колонії; МПБ - рівномірна каламуть Відповідає

Концентрація живих мікробних клітин, не менше 0,9-2 млрд/мл Відповідає

Кількість живих мікробних клітин в одній дозі 50 млн м.к. Відповідає

Нешкідливість на білих мишах Вакцина нешкідлива при введенні білим мишам в дозі 100 млн. м. к. Відповідає

імуногенна активність Вакцина імуногенна. Запобігає загибелі 9 із 10 щеплених мишей при зараженні 100 ЛД50 в об’ємі 0,1 мл Відповідає

При вивченні біологічних характеристик стрептококів, вирощених на живильному середовищі із СБК і контрольному м’ясному переварі Хоттінгера, була встановлена повна ідентичність їх морфологічних, культуральних, ферментативних, вірулентних та преципітаційних властивостей. Проте концентрація мікробних клітин на живильному середовищі із СБК була більшою і становила 12-13 млрд/мл, в той час як на контрольному м’ясо-пептонному бульйоні всього лише 9-10 млрд/мл.

Всі 9 експериментальних серій асоційованої вакцини пройшли перевірку згідно інструктивних документів. В результаті цих досліджень було встановлено, що по зовнішньому вигляду, нешкідливості і імуногенній активності досліджувані препарати відповідали всім вимогам Технічних умов.

ВИСНОВКИ

1. Сухий білковий концентрат, будучи побічною сировиною м’ясоперероблюючої промисловості, виявився високоякісною азотвміщуючою основою для живильних середовищ при виробництві ветеринарних біологічних препаратів.

В ньому встановлено 94,5±0,84 % білка, 1750 мг% загального азоту, 1200+0,31 мг% амінного азоту, 19,2±0,5% пептонів.

0,21+0,0004% фосфору, 0,63+0,006% кальцію, 0,85+0,011% хлористого натрію і ін. В сухому білковому концентраті міститься 27 амінокислот, в т. ч. цистин, цистатіонін, лізин, аргінін, гліцин, серин, аспарагін, аспарагінова кислота, глутамін, глутамінова кислота, гідроксіпролін, треонін, аланін, пролін, тирозин, валін, метіонін, фенілаланін, лейцин, орнітін, ізолейцин, гістідін, етаноламін, тріптофан, а- (3- у- аміномасляні кислоти.

2. Розроблений і апробований нами високотехнологічний спосіб ферментативного гідролізу сухого білкового концентрату дозволяє отримати в реакторах через 3-4 години білкові основи для живильних бактеріологічних середовищ, що за якісним складом перевищують контрольні м’ясні перевари Хоттінгера, на виготовлення яких необхідно не менш 5 діб.

3. Ферментативні гідролізати сухого білкового концентрату являють собою високоякісні білкові основи, в яких міститься 1250 мг% загального азоту, 698 мг% амінного азоту, 5,5 %

пептонів, 27 амінокислот. В прототипних м’ясних переварах Хоттінгера міститься тільки 18 амінокислот, при чому в значно менших кількостях.

4. З ферментативних гідролізатів сухого білкового концентрату за розробленою нами технологією просто і швидко виготовляються живильні середовища для вирощування в біореакторах вакцинних штамів різних мікроорганізмів.

Повноцінний якісний склад живильних середовищ з гідролізату сухого білкового концентрату виключає необхідність додавання до них таких обов’язкових для м’ясних середовищ інгредієнтів, як пептон, печінковий і дріжджевий екстракти, різноманітні мінеральні солі та ін.

5. Перевірка якості живильних середовищ з сухого білкового концентрату безпосереднім культивуванням тест-штамів мікроорганізмів Esherichia coli 675, Staphylococcus aureus Lass-manow, Streptococcus faecalis 6783, отриманих з Державного науково-контрольного інституту ветпрепаратів МСГ Росії, а також тест-культур Cl. Diphteroides 1911, Streptococcus scarlatinae Дік-1, Cl. aedematiens 198, рекомендованих Державним інститутом стандартизації і контролю медичних біологічних препаратів, показала повну відповідність всіх показників, передбачених вимогами ГОСТ 13805-76 “Пептон сухий ферментативний для бактеріологічних цілей”, а також ГОСТ 20730-75 “Поживні середовища. Бульйон м’ясо-пептонний для ветеринарних цілей”.

6. Ріст тест-культур на досліджуваних живильних середовищах з ферментативного гідролізату сухого білкового концентрату.був типовим, культурально-біохімічні і антигенні властивості залишались незмінними на протязі 6 місяців терміну спостереження. При цьому рістзабезпечуюча здатність живильних середовищ з сухого білкового концентрату виявилась в 1,5 - 2 рази вище ніж на контрольних м’ясних середовищах.

7. Виробничо-експериментальні дослідження живильних середовищ з ферментативного гідролізату сухого білкового концентрату для вирощування вакцинних штамів Salmonella cholerae suis ТС-177, Pasteurella multocida 115, Salmonella cholerae suis 370, Pasteurella multocida 686, Streptococcus faecalis 13, 345, “Соколова”, “Костянтинівський”, Erysipelothrix insidiosa BP-2 і ВДНКІ 6/246 в біореакторах показали їх повну

здатність замінити м’ясні середовища. Дослідження біологічних показників вакцинних штамів на чистоту росту, біохімічну активність, антигенні особливості, здійснювані за тестами діючих інструкцій і технічних умов, свідчать про відповідність всім передбаченим вимогам.

8. Концентрація мікробних клітин на досліджуваних живильних середовищах з ферментативного гідролізату сухого білкового концентрату була значно вищою, ніж на контрольних м’ясних середовищах і складала: сальмонел - 25-27 млрд/мл, 1822 млрд/мл відповідно, пастерел - 22-28 млрд/мл і 1518 млрд/мл, стрептококів - І2-13 млрд/мл і 9-10 млрд/мл, із штаму ерізіпелотрікс ВР-2 0,9 - 2 млрд/мл і 0,6 - 1,2 млрд/мл.

9. Перевірка фізико-хімічних і біологічних властивостей 23-х експериментальних серій вакцини проти сальмонельозу свиней із штаму Salmonella cholerae suis ТС-177, 9 серій вакцини проти пастерельозу птиці інактивованої сорбованої з штаму Pasteurella multocída 115, 7 серій вакцини проти бешихи свиней з штамів Erysipelothrix insidiosa ВР-2 і ВДНКІ 6/24, 9 серій вакцини проти сальмонельозу, пастерельозу і ентеро-кокової інфекції поросят асоційованої з штамів Salmonella cholerae suis 370, Pasteurella multocida 656, Streptococcus faecalis 13,345, “Соколова", “Костянтинівський” показала повну їх відповідність всім вимогам і нормам діючих інструкцій і технічних умов.

Практичні пропозиції

1. Для виготовлення живильних бактеріологічних середовищ при виробництві ветеринарних біологічних препаратів замість м’яса пропонується сухий білковий концентрат. В сухому білковому концентраті міститься 94,5±0,84% білка, 0,21±0,0004 фосфору, 0,63±0,006% кальцію, 27 амінокислот, в той час як у м’ясі є тільки 20% білка та 18 амінокислот.

2. Рекомендується методика прискореного виготовлення ферментативних гідролізатів сухого білкового концентрату протягом.4 -X годин при 49°С замість прототипового способу одержання м’ясних переварів Хоттінгера через 5-6 діб.

3. Ферментативні гідролізати сухого білкового концентрату доцільно використовувати для виготовлення різних живильних середовищ, поскільки вони забезпечують при глибинному культивуванні мікроорганізмів в 1,5-2 рази більшу концентрацію мікробних клітин в порівнянні з м’ясними переварами Хоттінгера.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації

1. Рахманов В.О., Доценко В.В. Виготовлення м’ясних живильних середовищ в реакторах //Експрес-інформація “Передовий науково-виробничий досвід в біопромисловості МСГ СРСР". -М., 1977. - № 8 - с. 11-12.

2. Рахманов В.О., Доценко В.В., Шестаков В.І., Євдоки-менко М.і. і ін. Використання гідролізатів із курячих ембріонів в якості основи живильних середовищ при виготовленні вакцини проти бешихи свиней //Експрес-інформація “Передовий науково-виробничий досвід в біопромисловості МСГ СРСР”. -М., 1979. - с. 14-15.

3. Асаф'єва Л .A., Рубан Е.А., Асаф’ев М.В., Доценко В.В. і ін. Оптимізація живильних середовищ для глибинного культивування пастерел //Експрес-інформація “Передовий науково-виробничий досвід в біопромисловості МСГ СРСР”. -М., 1980. - № 3 - с. 16-17.

4. Ніконоров Б.А., Шишов В.П., Доценко В.В. Вплив пептону і екстракту печінки на ростові властивості живильного середовища при культивуванні бактерій бешихи свиней і пастерел //Експрес-інформація “Передовий науково-виробничий досвід в біопромисловості МСГ СРСР”. -М., 1981.

- № 5 - с. 3-4.

5. Каришева А.Ф., Доценко В.В., Простяков О.П. Ефективна основа живильних середовищ для культивування клітин //Ветеринарія, 1995. - № 10. - с. 34-35.

6. Доценко В.В., Каришева А.Ф., КаришевС.В. Використання сухого білкового концентрату в якості азотвміщуючої основи бактеріологічних живильних середовищ//Ветеринарія, 1995. -№ 10. - с. 29.

7. ДоценкоВ.В., Каришева А.Ф., КаришевС.В. Культивування і контроль виробничих штамів бактерій на середовищах із сухого білкового концентрату // Матеріали міжнародної наукової

конфренції “Загальна епізоотологія: імунологічні, екологічні та методологічні проблеми". - Харків, 1995. - с. 371-372.

8. Доценко В.В., КаришевС.В. Використання сухого білкового концентрату в якості основи при виготовленні ветеринарних бактеріологічних препаратів // Матеріали міжнародної наукової конфренції “Загальна епізоотологія: імунологічні, екологічні та методологічні проблеми”. - Харків, 1995. - с. 373-374.

Доценко В.В. Питательные бактериологические среды из сухого белкового концентрата при производстве ветеринарных биологических препаратов.

Диссертация в виде рукописи на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 -ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и иммунология.

Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 1996.

Защищаются результаты исследования по изготовлению питательных бактериологических сред из сухого белкового концентрата, являющегося побочным продуктом мясоперерабатывающих предприятий, для выращивания микроорганизмов при производстве ветеринарных биологических препаратов. Определены оптимальные условия получения ферментативных гидролизатов из сухого белкового концентрата и методики изготовления и использования различных производственных питательных сред. Установлено, что ферментативные гидролизаты сухого белкового концентрата по качественному составу значительно превосходят контрольные мясные перевары Хоттингера и обеспечивают в 1,5-2 раза большее накопление бактериальной массы при культивировании производственных штаммов бактерий в биореакторах.

Dotsenko V.V. The nutritious bacteriologicals midsts from the dry concentrât in the production of the veterinaries biologicals preparations.

Thesis for obtain the scientific degree of doctor philosophy in the speciality 16.00.03 - Veterinary microbiology, virology, epizootiology and immunology. Institute of experimental and clinical veterinary medezine UAAS, Kharkov, 1996.

Realized the researches for preparation the nutritious bacteriologicals midsts from the dry protein concentrât that is the secondary produce of meat transformations enterprise, to the microorganisms cultivations in the production of the veterinaries biologicals preparations. Determined the optimals conditions of getting the fermentatives hydrolysates from dry protein concentrât and methodic of obtain diverses inductrials nutritious midsts. Etablished, that the fermentatives hydrolysates of the dry protein concentrât on composition quality surpasses considérablement the locals controls midsts of Hottinger and provides more 1-1,5 once the accumulation of the bacterial mass industrials bacterials cultivation in the bioreactors.

Ключові слова:

сухий білковий концентрат, середовища, ферментативні гідролізати, культивування в біореакторах, вакцинні штами мікроорганізмів.