Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Питательная среда на основе лактопептона для культивирования производственных штаммов Cl. chauvoei

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-КОНТРОЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи МОШЁВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

УДК 619:616.98:579.852.133:615.371

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРШ НА ОСНОВЕ ЛАКТОПЕПТСНА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ (X снлиуоЕ!

16.00.03. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1990

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук Кириллов Л.В., доктор биологических наук, профессор Простяков А.П.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Сидоров М.А.,

доктор биологических наук, профессор Дьяконов 1.П.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности.

^ . ¿у

Защита состоится " 6 " ^¿¿¿иуг-Л^ 1990г. в /р ~ на заседании специализированного совета Д 120.85.01 при Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов. Адрес: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ ветпре-паратов.

Автореферат разослан " 5 " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, к.в.н.

Козырев Ю.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изыскание дешёвого и более стандартного сырья непищевого назначения, пригодного для использования в качестве белоксодержащих основ при изготовлении бактерийных питательных сред, остаётся одной из важных задач ветеринарной и медицинской микробиологии. В настоящее врем для изготовления большинства биологических препаратов, особенно ветеринарного назначения, используют преимущественно мясные ферментативные гидролизаты, в том числе и в производстве вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Многочисленные попытки замены ыясннх гидролизатов на аналогичные продукты, полученные за счет белков растительного происхождения или отходов биологической промышленности в виде фибрина и эритроцитарной массы, предпринятые в разное время Д.В.Беленьким, Е.П.Макаровой (1934), М.П.Гороховой (1953), А.Г.Багмет (1956), А.И.Нефедьевым (1971) и другими, до настоящего времени не привели к промышленному внедрению и проблема поисков достаточно полноценной замены мяса, при изготовлении питательных сред для промышленного культивирования штаммов И. снлиуоЕ! продолжает оставаться актуальной.

Перспективным направлением поиска является определение возможности использования в качестве основ при изготовлении питательных сред ферментативного гидролизата белков молочной сыворотки, получаемой в виде отходов в цромышленном сыроделии и маслоделии. Препарат разработан в лаборатории биохимических методов контроля и стандартизации ветеринарных

препаратов ВГНКИ совместно с НПО "Углич" и получил название-"Лантопептон". По показателям общего, аминного и остаточного азота, содержанию полипептидов и набору аминокислот, а также по величине коэффициента протеолиза он близок к перевару Хот-тингера (ферментативному щцролизату мяса). Лактопептон стандартизирован по главным биохимическим показателям ( ТУ 10.02.02.12-89), обеспечивающим ростовую потребность принятого БОЗ набора тест-штаммов. В настоящее время освоен его промышленный выпуск. Использование этого препарата позволит сократить потребление мяса при изготовлении бактерийных вакцин и снизить их себестоимость.

Цель работы - установить возможность культивирования производственных штаммов 01. снл1шш на питательных средах, приготовленных на основе лактопептона, взамен мясного ферментативного гидролизата, используемого в технологическом цикле промышленного изготовления живых и инактивированных вакцин против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Задачи исследований '

1. Разработать состав питательной среды па основе лактопептона, обеспечивающий ростовую потребность вирулентных и аттену-ированного производственных штаммов 01. снануое! .

2. Разработать оптимальные условия технологического режима изготовления и установить тесты оценки пригодности среды с лактопептоноы при изготовлении вакцин против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

3. Провести сравнительное изучение культуральных, морфологических, гемолитических, вирулентных свойств исходных и пассируемых на изучаемой ореде производственных и музейных штаммов С1.

снацусш «

4. Изучить аминокислотный и пептидный состав питательной среды и установить динамику утилизации аминокислот и пептидов

в процессе культивирования производственных штаммов С1.снлиу<ш.

5. Приготовить из культур штаммов С1.снмж)е1, выращенных на среде с лактопептоном, инактивированные и живые вакцины против эмкара и изучить их в сравнении с коммерческими образца;ли аналогичных препаратов по срокам формирования иммунитета, степени специфической активности и стабильности их свойств в процессе хранения.

6. На основе полученных данных разработать проект дополнений к действующей "Инструкции по изготовлении и контролю вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота".

Научная новизна. Установлено, что питательная среда на" основе црепарата лактопептона сухого бактериологического (ТУ 10.02.02.12-89), при разовом промышленном культивировании обеспечивает ростовую потребность и сохранение культурально-морфологических и антигенных свойств производственных штаммов С1. снАиуон! , а также производственных штаммов С1. вЕР-псим и С1. реирш^се^ . Показано, что промышленное использование питательной среды с лактопептоном позволяет получать вакцинные препараты той же иммуногенной активности, что и коммерческие образцы вакцин против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. Разработана, испытана и внедрена в практику биологической промышленности СССР новая питательная среда на основе лактопептона сухого бактериологического для культивирования штаммов С1. снлиуоЕI при про-

мышлением изготовлении вакцин против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Разработаны и утверадены Главным управлением ветеринарии (11.05.89 г.) дополнения к действующей технологической инструкции по изготовлению и контролю "Концентрированной гид-роокисьалшиниевой формолвакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец".

Апробация. Материалы диссертации доложены на

- научной конференции молодых ученых ШЭВ (Москва, 1989 г.);

- одиннадцатой научной конференции молодых ученых ВГЕКИ ветпреларатов (Москва, 1989 г.);

- научно-проблемной методической комиссии по контролю и стандартизации биопрепаратов, применяемых при бактериальных и грибковых болезнях животных (Москва, 1987, 1988 гг.);

- меглабораторном совещании сотрудников ВШШ ветпрепа-ратов (Москва, 1990 г.) .

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 2 статьи.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полеченных результатов, выводы, практические предлоаения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 23 таблицами, 16 рисунками. Список литературы включает 188 источников, из них 69 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований.

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против анаэробных инфекций, лаборатории биохимических методов контроля и стандартизации ветеринарных препаратов Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов и на Армавирской биофабрике.

В экспериментальных исследованиях по изучению вирулентности, тонсигенности, приживаемости и иммуногенности вакцин было использовано 1030 морских свинок, 108 белых мышей.

При выполнении экспериментов использованы производственные штаммы CI. chauvoeí Rj5 (вирулентный), Я2 (слабовирулентный) и 2/14 (вакцинный-авирулентный), музейные штаммы CI. chauvoeí ( I?94j3 и ^-"Ташкент"), цроизводственный шташ CI. septícum № 1098 и производственный штамм

CI. perfríncens ТИПа С "ВТ".

Производственные штаммы и музейные культивировали на экспериментальной питательной среде, изготовленной на основе лактопедтона сухого бактериологического и изучали в сравнении с образцами тех же штаммов, выращенных в мясопептонном печеночном бульоне под вазелиновым маслом с кусочками печени (среда Китт-Тароцци).

Контроль качества питательных сред осуществляли путём определения общего азота по методу Несслера, аминного - методом формольного титрования по Серенсену-Гаврилову, содержания триптофана - по Пешкову, полипептидов - колориметрически по биуретовой реакции, концентрацию водородных ионов -потенциометрнчески, аминокислотный состав - на автоматическом анализаторе аминокислот KLA-5 фирмы "Хитачи".

Количество микробных клеток в I см3 культуры определяли по оптическому бактерийному стандарту ГИСК им.Л.А.Тара-севича. Морфологические свойства культур изучали в мазках, окрашенных по Граму. Чистоту и типичность штаммов определяли в чашках Петри при посеве на кровяной агар с глюкозой по прописи Цейсслера. Биохимические свойства штаммов выявляли при посеве на сахара, молоко, мозговую среду. Еелатино-литическую активность определяли по методике Ф.А.Чертковой и Е.С.Шаин. Гемолитическую активность - по методу Стойловой.

Иммуногенную активность вакцин (ВД50) и уровень зараае-ния (ЛД50) устанавливали цутем определения 50^-ной дозы, используя методику Кербера-Ашмарина.

Количественное измерение аденозинтрифосфата (АТР) в суспензиях клеток проводили на лшинометре (celltester, model 1030. фирш Lumak ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Конструирование питательной среды на основе лактопептона для культивирования производственных штаммов CI. chawo«;; '

Был проведен цикл исследований по изучению возможности использования лактопептона в качестве азотсодержащей основа питательной среды для культивирования производственных штаммов CI. chauvoei при промышленном изготовлении живых и инактЕвированных вакгщн против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Испытано свыше 20 вариантов питательных сред с различным содержанием лактопептона ( от I до Ъ% ) и в сочетании с до-

б явлением печёночного экстракта, хлорида натрия, глюкозы, кусочков печени в других ингредиентов. Первоначальная оценка пригодности различных вариантов сред, изготовленных на основе лактопептона, давалась после определения концентрации микробных клеток засеваемого штамма по оптическому бактерийному стандарту ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Среда, содержащая только раствор лактопептона, не обеспечивала ростовые потребности штаммов С1. снлиуоЕ!, поэтому оказалось необходимым добавлять к основному раствору лактопептона различные количества печеночного экстракта, который содержит Ж- соединения и тем самым поддерживает низкий окислительно-восстановительный потенциал и создаёт условия для протекания восстановительных реакций.

Из различных вариантов смесей растворов лактопептона с • печеночным экстрактом нами был выбран вариант среды, состоящей из 3 частей 2^-ного раствора лактопептона и I части печёночного экстракта. Это сочетание компонентов обеспечивало накопление микробных клеток до 5,5 млрд в I сы3 культуральной жидкости, что приближает её по этому показателю к среде Китт-Тароцци, избранной нами в качестве контрольного образца среды. В дальнейшем состав среды был дополнен последовательным добавлением 0,5% хлорида натрия, 0,2? (в пересчете на сухое вещество) глжозы 50^-ной и кусочков печени. Добавление к среде 0,5? хлорида натрия в среднем повысило концентрацию микробных клеток на 0,14-0,3 млрд клеток в I см3. Хотя это увеличение и незначительное, но хлорид натрия был включён в состав питательной среды для обеспечения потребности микробных клеток в анионах и катионах. Включения других минеральных элементов в состав среды не проводили, так как они содержатся в

достаточном количестве в лактопелтоне и печеночном экстракте. Включение в состав среды кусочков печени повышало концентрацию микробных клеток на 1,4-1,6 млрд клеток, что связано, по-видимому, с созданием более строгих условий анаэробиоза. Однако в дальнейшем было решено не включать их в окончательный состав среды по двум причинам: во-первых, в производственных условиях при изготовлении вакцины против эмфизематозного карбункула от кусочков печени отказались из-за технологических трудностей, связанных с появлением так называемой "печеночной крошки", образующейся под действием микробного протео-лиза и необходимости перемещения культуральной жидкости в дополнительный реактор для формольного обезвреживания; во-вторых, достигаемое накопление микробных клеток, с учетом последующей концентрации вакцины, является уг.е достаточной для изготовления препарата (рекомендованная действующей нормативно-

технической документацией концентрация микробных клеток -4 млрд в I см3).

Добавление глюкозы в количестве 0,2$ к объему среды непосредственно перед засевом увеличивало концентрацию микробных клеток на 0,7-0,8 млрд, что объясняется доступностью глюкозы, как источника углерода. В своей дальнейшей работе мы добавляли глюкозу только при промышленном культивировании штаммов в процессе изготовления вакцины, а при проведении 15 пассажей отказались от нее из-за быстрого закисления среды и нарушении вследствии этого нормального метаболизма микробов, что сказывалось при дальнейших пересевах.

Окончательный вариант предложенной питательной среды имел следующий состав: I часть печеночного экстракта, 3 час-

ти 2%-иото раствора лактопептона и 0,5% хлорида натрия. Перед засевом ростовых реакторов к среде добавляется 0,2% (в пересчете на сухое вещество) 50^-ного стерильного раствора глюкозы.

Методика изготовления среды на основе лактопептона. В I литре деминерализованной воды растворяется 20 г лактопептона сухого бактериологического (ТУ 10.02.02.12-89). Раствор доводится до кипения. Добавлением 10#-ного раствора соляной кислоты (ГОСТ 1382-69) рН раствора кратковременно (на 10-15 минут) снижается до 5,0 (для осаждения балластного белка), после чего 10#-ным раствором едкого натра рН повышается до 7,9-8,0. К раствору лактопептона прибавляется одна часть печёночного экстракта. Смесь доводится до кипения. На I литр среды добавляется 5 г хлорида натрия и устанавливается рН 7,9-8,0. Среда в горячем ваде фильтруется через бельтинг-ткань или пластины марки "Ф" и стерилизуется при температуре П8-120°С в течение 50*10 минут. рН среды после стерилизации - 7,4-7,6. Химические показатели готовой среды должны быть следующие: аминного азота 110-120 ит%; триптофана 50-75 пептона не ниже 1,5%. Разработанная питательная среда получила название лактопептонно-го печеночного бульона (МБ).

Биохимические изменения лактопептонного печеночного бульона в процессе культивирования производственных штаммов Р.1-' .!РН*УУ"1£1. ..'

Биохимическое исследование этой среды до и после культивирования производственных штаммов С1. снлиуоЕ| выявило тен-донцию к снижению общего и аминного азота, пептона, а также сдвигу рН в кислую сторону, что свидетельствует об использовании низкомолекулярных азотистых соединений для построения мик-

робннх клеток и интенсивном метаболизме, сопровождающимся накоплением органических кислот и других кислых продуктов обмена. Хроматографическое определение качественного состава свободных аминокислот в ЛПЕБ показало присутствие 19 аминокислот, из которых четко идентифицируются 17 (два пика отражают их следовые количества). Наиболее активно вдет утилизация важна, изолейцина, лейцина, лизина.

Рост и размножение производственных штаммов на лактопеп-тонноы печеночном бульоне свидетельствует о том, что их метаболические потребности с достаточной полнотой удовлетворяются подобранным составом питательной среды.

Влияние среды культивирования на биологические свойства производственных штаммов С1. сна»уог1_.

Морфологические, культурные и биохимические свойства.

Исследование морфологических, культуральных и биохимических свойств производственных штаммов С1. снацуое! , проведенные после 5, 10 и 15 пассажей в ЛШШ показало, что измене- •-"■ ний указанных свойств не произошло. "•

Яелатинолитические свойства.

Желатинолитическая активность культур, пассируемых в лан-топептонном печеночном бульоне, снизилась по сравнению с исходными образцами тех ке культур, что свидетельствует об изменении уровня продукции протеолитических ферментов у изучаемых штаммов.

Гемолитические свойства. ..

Гемолитическая активность у всех пассируемых в ЛППБ штаммов также снижалась. Если у исходной культуры штамма 2/14 гемолиз эритроцитов барана отмечался в разведении 1:120, то у той ке

культуры 15-го пассажа - в разведении 1:100. Гемолиз у исходных культур штаммов и Я2 отмечался в разведении 1:140, а у культур 15-тых пассажей - в разведении 1:120.

Вирулентные свойства.

Длительное культивирование вирулентного штамма в лак-топептонном печеночном бульоне показало, что наиболее выраженному изменению подвергаются вирулентные свойства, тенденция к незначительному снижению которых отмечалась уже после первого пассажа штамма. При дальнейших пересевах степень снижения вирулентности увеличилась по сравнению с исходными образцами штамма более чем в четыре раза и к 10-15 пассажу вызвать гибель морских свинок в первоначально избранных нами дозах не представлялось возможным. Так, если величина ЛД^ исходной культуры составила 0,12 см3 (600 млн микробных клеток). ДД5"0 первого пассажа - 0,17 см3 (850 млн микробных клеток), то культуры пятого пассажа составляла уже 0,79 см3 (3,95 млрд микробных клеток), а к десятому пассажу вирулентные свойства культуры в опытах на морских свинках уже не выявлялись. Данные эксперимента представлены в таблице й I.

Приживаемость, распространение и локализация вакцинного штамма С1. с^лугое!_2/14 в организме морских свинок.

С целью изучения свойств авирулентного штамма С1. снацуое! 2/14 после проведения многократных (пяти) пассажей в лакто-пешгонном печеночном бульоне и сопоставления со свойствами исходного варианта указанного штамма, выращенного на среде Китт-Тароцци, были проведены эксперименты по определению приживаемости, распространения и локализации микробных клеток в организме морских свинок. На основании проведенных экспериментов

Сохранность вирулентных свойств производственного штамма С1. снлиусш в процессе пассажей в ЛИПБ

№ ; Среда ) Доза {Результаты; | Л%о

пас-¡культивиро; культу-¡заражения ( <м !---;—,,лпп

сажа; вания |ры, см3;_! ! 088 ¡шгарлсл.

0,05 1/4

0,1 ' 1/4

I ЖБ 0,2 2/4 2,7 0,17 0,85

0,4 3/4

0,8 4/4

0,05 0/4

0,1 0/4

5 ЛППБ 0,2 0/4 0,5 0,79 3,95

0,4 0/4

0,8 2/4

0,05 0/4

10 0,1 0/4

и ЛППБ 0,2 0/4 0,8

15 0,4 ' 0/4

0,8 0/4

0,05 1/4

Ис- 0,1 2/4

ход- Китт-Тароц- 0,2 2/4 3,2 0,12 0,6 •

ная ци 0,4 4/4

0,8 4/4

Примечание: в числителе - количество павших животных;

в знаменателе - количество животных, взя-

тых в опыт

оказалось возможным сделать следующее заключение. Способность к воспроизведению генерализованного вакцинного професса сохраняет как исходная культура штамма 2/14, выращенная на среде Китт-Тароцци, так и культура пятого пассажа в ЛППБ. Но генерализация исходной культурой наступает быстрее и в процесс захватывается большее число органов и лимфатических узлов. Штамм 2/14, выращенный на среде Китт-Тароцци, выделяется из органов и лимфатических узлов уже через 2 часа после введения (индекс инфицированности составляет 66,6?), а через 8 часов индекс ин-фицированности достигает 100?. Интенсивная генерализация продолжается 12-15 часов, а с 24 часов и до 8 суток культура указанного штамма выделяется только из регионарного пахового лимфатического узла. Несколько иная картина наблвдается при изучении процесса локализации культуры штамма 2/14 пятого пассажа. В этом случае 100? индекс инфицированности отмечен только через 24 часа после введения культуры, а интенсивная генерализация продолжалась с 12 часов до 2 суток. С 5-ых по 8-ые сутки штамм ввделялся только из регионарного пахового лимфатического узла. Такт* образом, было установлено, что длительное культивирование вакцинного штамма 2/14 приводит к заметным изменениям его свойств.

Изучение иммуногеиннх свойств живых и инактивированных вакцин против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота,, приготовленйых на лактопедтонном печеночном бульоне. (ЛППБ).

С целью изучения влияния новой питательной среды (ЛППБ) на иммуногенность производственных штаммов С1. снлиуоЕ! 1^5 и 2/14 были приготовлены 4 серии вакцин: две серии концен-

трированной гидроокисьалшиниевой нивой вакцины из образцов штамма 2/14 первого и пятого пассажа и две серии концентрированной гидроокисьалшиниевой формолвакцины из образцов вирулентного штамма ^ первого и пятого пассака в ЖШБ. В качестве контроля были приготовлены кивая и инактивированная вакцины против эмфизематозного карбункула из образцов тех же штаммов, выращенных на среде Китт-Тароцци. Для изготовления вакцин использовался ЛППБ со следующими биохимическими показателями: аминный азот 110-120 мг$; триптофан 50 мг$; пептон не ниже 1,5%.

Сроки формирования иммунитета у морских свинок, вакцинированных опытными образцам вакцин.

Сроки формирования иммунитета проверяли на морских свинках, иммунизированных однократно подкожно в дозе 0,4 см3 опытными и контрольными вакцинами (живыми и инактивированными). На каждый срок использовалось по 3 животных. Через 5, 10, 15 и 20 суток - для инактивированных вакцин и через I, 2, 4, 8 и 10 суток - для живых вакцин животных заражали сухой споровой культурой вирулентного штамма ^¡-5 в дозе 20 Д^д- Результаты проведенного опыта представлены в таблицах № 2 и й 3.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что живые вакцины, изготовленные из образцов штамма 2/14 первого и пятого пассажей, приводят к формированию иммунитета у вакцинированных животных, в конечном итоге, в те же сроки, что и контрольные образцы. Однако по мере увеличения количества пассажей в ЛППБ несколько сокращаются сроки защиты животных от прямого заражения эмкаром. Так, 100$ защита свинок, вакцинированных образцом препарата, полученным из культуры первого пассажа

Сроки формирования иммунитета против эмфизематозного карбункула у морских свинок, иммунизированных живыми вакцинами

Ваквдны ; I ; 2 ! ^ ; 8 ; ^

Вакцина из штатлма первого

пассажа 0/3 1/3 1/3 3/3 3/3

Вакцина из штамма пятого

пассажа 0/3 0/3 0/3 1/3 3/3

Контрольная вакцина, изго-

товленная на среде Китт-Та-

роцци 0/3 1/3 1/3 3/3 3/3

Контроль: 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2

Таблица № 3

Сроки формирования гогмунитета против эмфизематозного карбункула у морских свинок, иммунизированных инак-тивированными вакцинами

Вакцины

• Результаты проверок (в сутках) | 5 | 10 ! 15 | 20

Вакцина из штамма первого

пассажа 1/3 3/3 3/3 3/3 Вакцина из штамма пятого

пассана 0/3 3/3 3/3 3/3 Контрольная вакцина, изготовленная на среде Китт-Та-

роцци 1/3 3/3 3/3 3/3

Контроль: 0/2 0/2 0/2 0/2

Примечание: в числителе - количество выживших животных;

в знаменателе - количество животных в опыте.

~ 16 ".

штамма 2/14, наступает на 8 день после иммунизации, то есть в те же сроки, что и в контроле. Аналогичные показатели для кивой вакцины, изготовленной из штамма 2/14 пятого пассажа, отмечены только на 10 день после введения препарата.

В то же время сроки формирования иммунитета у морских свинок, вакцинированных инактивированными образцами препарата, изготовленными из культур штамма Р^ первого и пятого пассажей, практически не различались. Полная защита привитых животных всех групп, включая контроль, отмечена через 10 суток после введения препаратов.

Специфическая активность вакцин, изготовленных на ЛППЕ. в сравнении с сухим стандартом иммуногенности.

Иммуногенная активность вакцин определялась количественным методом, в основе которого лежит расчет 50%-ной иммунизирующей дозы по методу Кербера-Ашмарина. Для сравнения использовался стандарт иммуногенности вакцины против эмфизематозного карбункула. Опыт поставлен на морских свинках кивой массой 350-400 г. Используемые образцы вакцин вводились подкожно в объеме 0,5 см3 в разведениях от 1:3 до 1:81 с шагом разведения кратным трем при уровне заражения 20 ЛД^. Указанный диапазон иммунизирующих доз принят, при количественной оценке специфической активности официальных вакцин против эмфизематозного карбункула. В опыте использованы живые и инактивированные образцы препаратов, применявшиеся ранее при проверке сроков наступления иммунитета. Результаты представлены в таблице № 4. Проведенное количественное определение иммукогенной активности показало, что по степени специфической активности испытуемые препараты различаются. Образцы живой и инактивированной

Иммуногенная активность опытных вакцин против эмфизематозного карбункула, изготовленных на ЛППБ, в зависимости от сроков хранения

Название препарата

Вдзд в зависимости от сроков хранения (в месяцах)

после !~! изгот.! ° ! i t

X ± i»

Концентрированная ГОЛ формолвакцина из штамма первого пассажа 0,016 0,008 0,018 0,0143±0,012 Концентрированная ГОА формолвакцина из штамма пятого пассажа 0,026 0,015 0,008 0,0163*0,022 Концентрированная ГОА кивая вакцина из штамма первого пассажа 0,016 0,015 0,013 0,0147±0,004 Концентрированная ГОА живая вакцина из штамма пятого пассажа 0,026 0,031 0,031 0,0293±0,007 Стандарт иммуноген-

ности 0,021 0,018 0,013 0,017±0,009

вакцин, изготовленных из штаммов'первого пассажа на лактопеп-тонном печеночном бульоне, оказались более иммуногенными, чем

образцы, изготовленные из штаммов пятого пассажа, причем наиболее уловимая разница в иммуногенности отмечена мевду образцами живых вакцин. В то же время специфическая активность всех испытуемых образцов оказалась сопоставимой с иммуноген-ностью стандартного образца вакцины против эмфизематозного карбункула.

Специфическая активность вакцин, изготовленных на ЛППБ в зависимости от сроков хранения.

Сохраняемость иммуногенных свойств живых и инактивирован-ных вакцин против эмфизематозного карбункула проводили путём определения степени их специфической активности количественным методом на морских свинках, используя те же дозировки и уровень заражения, что и в предыдущих экспериментах. Была исследована активность вакцин, хранившихся 6 и 12 месяцев при температуре 6-8°С в условиях бытового холодильника. Суммарные результаты представлены в таблице № 4.

В результате проведенных экспериментов установлено, что в процессе хранения (в течение 12 месяцев) иммуногенная активность вакцин против эмфизематозного карбункула, изготов-лешшх на лактопэдтоивом печеночном бульоне, остаётся практически на исходном уровне.

Проведенные нами исследования показали, что питательные среды, изготовленные на основе лактопептона по предложенной прописи, пригодны для разовых промышленных культивирований производственных штаммов С1. снал!уое1 , предназначенных для изготовления как кивых, так и инактивированных вакцин

против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Но поддержание штаммов и подготовка посевного материала, предназначенного для засева промышленных культиваторов (реакторов), должна осуществляться на средах, изготовлениих на основе ферментативных гидролизатов мяса. Полученные в результате экспериментальных исследований данные позволили провести испытания лактопептонного печеночного бульона в производственных условиях.

Промышленное изготовление и испытания опытных серий вакцин против эмфизематозного карбункула, изготовленных на ЛППБ.

Для проведения промышленных испытаний научно-производственным объединением "Углич" было изготовлено две партии лактопептона сухого бактериологического, свойства которого соответствовали действующим техническим условиям (ТУ 10.02.02.12.89), общим весом 40 кг. Указанные партии лактопептона были доставлены на Армавирскую биофабрику, где в соответствии с ранее разработанной нами прописью были изготовлены две партии лактопептонного печеночного бульона. Первая партия (объем 1500 л) состояла из 375 л,печеночного экстракта и 1125 л 2^-ного раствора лактопептона с добавлением 0,5% хлорида натрия и имела следующие биохимические показатели: аминного азота 115 пептона 1,5$; триптофана 73 мг$; pH готовой среды-7,4. Вторая партия.(объем 750 л) имела в своем составе 187,5 л печеночного экстракта, 562,5 л 2$-ного раствора лактопептона и 0,5% хлорида натрия. Биохимические показатели готовой среды были следующие: аминного азота 115 мг$; пептона 1,5%; триптофана 68 мг$; pH 7,5.

Полученные партии среды были использованы для изготовле-

ния двух серий вакцин (нивой и инактивированной) против эмфизематозного карбункула. Указанные серии иммунизирующих препаратов были проверены в отделе биологического контроля по показателям стерильности (чистоты), безвредности и специфической активности. При этом они были признаны соответствующими требованиям действующих технических условий (ТУ 10.19. 57-89 и ТУ 46-21-1527-84), что было подтверждено параллельным контролем образцов тех же серий в профильной лаборатории ЕГНКЙ.

Влияние среды культивирования на токсинообразование производственных ШТаММОВ С1. ЗЕРТЧ^ИМ и С1 . РЕМВ1ИСЕ^_.

В ходе последовательных пассажей в ЛППБ штамма "ВТ" ( С1. ренгкшсьяз чип С) незначительное снижение токсигеннос-ти отмечено уже после пятого пассажа и с увеличением количества пассажей уровень токсигенности продолжал снижаться. Так, культура первого пассажа в ЛППБ обладала той же токсигенностью, что и контрольный образец штамма "ВТ" - более 16 тыс. ДЛМ в I см3 культурального фильтрата. Культура того же штамма, прошедшая 15 последовательных пассажей в ЛППБ, обладала токсичностью на уровне 8-10 тыс. ДЛМ. Следовательно, и на процесс токсипообразования клостридий длительное пассирование штаммов в среде с лактопелтоном оказывает угнетающее воздействие. Длительное культивирование штамма И. вЕРтчсим № 1098 в лактопептонном печёночном бульоне также приводит к снижению уровня токсинообразования, причём степень снижения прямо пропорциональна количеству проведённых пересевов, что наглядно прослеживается по гибели мышей, которым пассируемые культуры вводились в дозах 0,05 и 0,1 см3.

АденозинтрисЬосфат (ATP), как индикатор жизнеспособности производственных штаммов CI.

Нами, совместно с С.Д.Авиловой (Институт океанографии им. П.П.Ширшова АН СССР), была проведена серия экспериментов по определению количества АТР в суспензиях клеток трёх производственных штатов CI.chauvoei , выращенных в среде Китт-Тароцци и лактопептонном печеночном бульоне. В результате этого была выявлена определенная закономерность мевду концентрацией ATP z иммуногенностыо производственных штаммов. Самая высокая концентрация АТР оказалась у штамма 2/14, являющимся и самым иммуногенным из производственных штаммов. А наименее иммуногенный штамм flg образовывал и наименьшее количество АТР. Штамм I^g по обоим показателям занимал промежуточное положение.

ВЫВОДЫ

1. Лактопептон сухой бактериологический (ТУ 10.02.02.1289) может быть рекомендован в качестве основы питательных сред для промышленного культивирования микроорганизмов рода клостридий.

2. Питательная среда,- состоящая из 2^-ного раствора лакто-пептона (3 части), печеночного экстракта (I часть) и 0,5% хлорида натрия, обеспечивает основные метаболические потребности микробных клеток и пригодна для разового промышленного культивирования производственных штаммов CI.cn*uvoEi , предназначенных для изготовления жиьой и инактивированной вакцин против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

- 22 -

3. При многократном последовательном культивировании производственных штаммов клостридий (CI.cHAuvoEi . CI.sep— ticum , CI. perfrincens ) в средах с лактопептоном происходит постепенное изменение морфологии клеток, снижение

их гемолитической и келатинолитической активности, вирулентности, токсигенности и иммуногенной активности.

4. Производственные серии вакцин против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота (живая и инактивирован-ная), изготовленные в результате разового культивирования производственных штаммов в лактопептонном печеночном бульоне, соответствуют требованиям технических условий (ТУ 10.19.57-89) и ТУ 46-21-1527-84) по показателям иммуногенной активности, безвредности, стерильности и бактериальной чистоты.

5. Живая и инактивированная вакцины, изготовленные на среде с лактопептоном, сохраняют необходимый уровень иммуногенной активности в течение всего срока годности препарата ( 12 месяцев со дня изготовления).

6. Принятая оценка качества питательных сред по учету урожайности и токсической продукции принятого ВОЗ набора тест-штаммов может рассматриваться только как предварительная, а окончательное суждение о конкретной пригодности той или иной среды может быть сделано только после сравнительного изучения биологических свойств тех видов микроорганизмов, для культивирования которых она избирается.

7. Установлена определенная взаимосвязь между концентрацией АТР и иммуногенностью штаммов, самая высокая концентрация АТР оказалась у штамма 2/14, являющимся и самым иммуноген-ным штаммом из всех производственных, а наименее имзиуногенный

штамм Я2 образовывал и наименьшее количество ЛТР, штамм ^^ по обоим показателям занимает промежуточное место.'

Экономический эффект от внедрения новой питательной среды составляет 1200 руб. на 1000 л.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложена и внедрена в производство новая питательная среда - лактопептонный печёночный бульон, для промышленного культивирования производственных штаммов С1. сллиуоЕк

2. Разработаны и утверждены Главным управлением ветеринарии СССР (11.05.89 г.) дополнения к действующей "Инструкции по изготовлению и контролю концентрированной гидроокись-.алшиниевой формолвакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец" (пункт П - "Питательная среда для изготовления вакцины").

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Мотыжева 'И.В. Влияние среды культивирования на основе лактопептона на биологические свойства производственных штаммов С1. сначусш м.| 1990.- 7 е.- Деп. во ВНИИТЭИагро-пром 31.05.90,258.

2. Мотыжева И.В., Кириллов Л.В. Изучение иммуногенных свойств вакцин против эмфизематозного карбункула, изготовленных на лактопецтонном печеночном бульоне (ЛППБ).- М., 1990.7 е.- Деп. во ВНШТЭИагропром 31.05.90, й 259.