Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Метод выделения Campylobacter Jejuni из молока и его биологические свойства

РГ6 Ой

, . , , • ' г \

На правах рукописи

ДЕМЧЕНКО Александра Геннадьевна

МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ самруъовастеп лелла ИЗ ШОКА И Ш БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, ЭПИЗООТОЛОГИЯ, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наун

Москва - 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследователь-сксы институте ветеринарной санитарии, гигиеш и экологии .

Научный руководитель: Заслукенный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор КАРТАШОВА В.Ы.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор КУЛИКОВСКИЙ A.B. ШШИВСГ

кандидат ветеринарных наук ТАРАНОВАД.А. (Дентрааьнал научно-производственная ветеринарная лаборатория)

Ведущая организация - Московская Государственная академия прикладной биотехнологии

Залита состоится "di/" 1Ш г. в_час.

на заседании диссертаииокного^совета Д.020.50.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5).

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан "<£0 ° I^Lfi-itfj) Jt^L 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л.Н.Пименова

ОБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из глав)шх задки ветеринарной службы, имеющей большое сопиельно-экономичвское значение, является охрана населения от болезней, обидох для человека и кивотных. Среди эооантропонозов с установленным бактериальным втиодогическим агентом наибольшую значимость в последнее десятилетие приобрел кампилобактериоз (Черкасский В.Я., 1995).

В настоящее время за рубежом широко и основательно изучается кишечный кампилобактериоз, вызываемый термофильными микроорганизмами Campylobacter jejuni и Carapylobacter coli, который занимает одно из первых мест в инфекционной патологии людей и структуре диарейних заболеваний молодняка «цветных ( Butzier J.p. I9&4; Ooeterom J., 1986} Tenover и др. , 1968). В нашей стране введения о кишечной кампилобактериоэе среди животных малочисленны (Голикор A.B. и др., 1985; Лучко М.А., Шыанов U.C., 1986). Здаако не вызывает сомнений, что недостаточное освещение проблемы кампилобактериоза кишечной формы отражает не низкий уронен!:, забслегания, а лишь неудовлетворительное состояние диагностади этой ич$екиии.

Нампилобактерии обнаруживаются практически у всех ьвде. сельскохозяйственных яиьотньа и птииы (Велик В.В., Огородишко ка. Р.Н., Горовенко Г.В. и др., 1986), которые являются резервуаром возбудителя. Основным путем передачи.возбудителгй инфьктш зля человека является пищевой - прч употреблении контаминнро-ванкых кампилобактзрккми продуктов питания животного происхок-цения

Молоко, как фактор передали возбудителей инфекний прн кампилобахтерчоэо, имеет существенное значение к с ним связывают крупные вспышки пищевых токсиконнфекиий молочного происхождения с вочлечением большого количества людей.

- г -

Долгов время считалось, что в молоко камлилобактерии попадают на всех этапах технологического проиесса получения, хранения и переработки из внешней среды (КоЫпвоп O.A., .1979;Кога-blatt,Barrett т., 1965). Однако в последующих исследованиях были выделены микроорганизмы рода Campylobacter непосредстзенн при заболеваниях коров маститом (Jasper O.K. , 1965;dudmundaon 1993).

В нашей стране попытки вццолить кампилобактерии из' молока оказались безуспешными (Пыхтарева Е.И., 1988; Минаев В.И., 1993). Не исключено, что ато объясняется в равной степрни отсутствием как методов выделения, так и элективных питательных сред, которые необходимы при исследовании молока на бактериальную обсемененность. В настоящее время существует несколько питательных сред для выделения кампилобактерий из биологического патматериала. В своем составе они содержат несколько антибиотиков для ингибипии сопутствующей микрофлоры, что мало пригодне при работе с молоком. Это связано, во-первых, с развитием анти-биотикоустойчивости микроорганизмов к лекарственным средствам при широком использовании антибактериальных препаратов для лечения коров,а во-вторых, применение антибиотиков нежелательно с экологической точки зрения. И в то же время, единственным и наиболее взрным доказательством подтверждения кампилО' бактериоаной инфекшш,является выделение возбудителя из органи

Таким образом, разработка метода выделения кампилобахтери из молока при лицевых токсикоинфехииях и маститах коров являет ся на современном этапе важной и актуальной темой.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являло изыскание метода выделения • с. jejuni из молока и изучение его биологических свойств. Исходя из этого, перед нами

- з -

были поставлены следующие задачи:

1. Изучить существующие питательные среды для выделения и культивирования кампилобактерий и выяснить в сравнительно», аспекте возможность их использования при бактериологическом исследовании молока.

2. Разработать элективную высокоэффективную питательную среду для выделения кампилобактерий ил молока.

3. Отработать условия культивирования с.jejuni с иельа повышения чувствительности новой питательной среды и скорости роста микроорганизма.

4. Изучить морфологические и культурально-биохимические свойства С. jejuni , выделенного из молока.

б. Определить чувствительность С. jejuni , выделенного из молока, к антибиотикам и дезинфицирующим средствам, применяемым при обработке молочного оборудования.

6. Определить сроки выживаемости С.Jejuni в молоке, воде и на объектах окружающей сроды.

7. Разработать методические рекомендации по выделении ц идентификации термофильных кбмпилооактерий пэ молока.

Научная новизна. В результате то веденных исследован'.-.-впервые предлоаена новая высокочувствительная олективнш: питательная среда - ШЖ - для шдалснкя «ермофильных кампило-б&кгерий из молока. Изучены морфологические и основные культу-рально- биохимические свойства c.j»junl , выделенного при экспериментальном мастите у коров. Определена чувствительность с. jejuni , выделенного из молока,, к антибиотикам и деакн-фипирукщим средствам, применяемым при обработке молочного оборудования. Определены сроки инкиваемости С» jejuni л :/ойо-ке и воде при разных температурных режимах.

Практическая ценность. На основании полученных данных разработаны "Временные методические рекоыэндавии по выделению и идентификации термофильных кампилобактерий из молока", которые рассмотрены и одобрены на Ученом Совете' ШКйВСГЗ(про т. #Z5 от 02.iI.S5 г.), на заседании сенпии "Ветсони^ария, догиена и екологияп(прот.$ J5, от 02.XI.95 г.) и утвр/рз&зны РАШ (X99S г.

Определена высокая чувствительность c«jejimi к еритро-иищаду и леводаиетину, что даот возможность практическим врачам иелеиалравленно применять лекарственные средства при кам-пняобактериозном мастите коров.

Изыскан и предлонен доступный для большинства практических ветеринарных лабораторий модифицированный метод создания ник-роаэрофилькык условий при культивировании кампилобактерий.

Предложена схема идентификации С. Jejuni выделен-

ных из молока.

Определена сроки выкиваеиости С. jejuni в молоке, воде и на объектах окружающей среды. Полученные данные даст возможное^ правильно подходить к вопросам профилактики кампилобактериоэа

ЕИВОТНЫХ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всероссийской'научно-производственной конференции "Гигиена, ветсанитария и экология животноводства"(г.Чебоксары, 1994) и на меклабораторном совещании ВНИИВСГЭ (27 сентября 1995 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на ¿5^СТР* машинописного текста, содержит ¿('f таблиц, иллюстрирована рисунками и X графиками.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов,

практических предложений и списка литературы. Последний включает /¿Г источника, из них //^^иностранных.

СОБСТЕЕННШ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Экспериментальная работа по выделению с.jejuni Из молока здоровых и больных маститом коров и изучению биологических свойств проведена в течение I992-J995 гг. в лаборатории санитарии молока и профилактики мастита ШИИВСГй, Центральной научно-производственной ветеринарной лаборатории РФ (отделе бактериологии), ЩИИ эпидемиологии КЗ РФ, хозяйствах агрофирм "Заря Подмосковья", "Павловское" Домодедовского района Московской области.

В опытах по изучению биологических свойств использовали тест-штаммы: 0.jejuni f С,coll ,C»laridle HC«fetue, a так*е культуры с» Jejuni , выделенные из молока при мастите коров. Для определения элективных свойств питательных сред брали з опит гетерогенные бактерии, наиболее часто встречающиеся в молоке:S. nuroue (штаны 75), s. faecalis (штамм 4/09) И Е л i- .>1-1 (штамм 0-265.

Всего бактериологически исследовали JI4I пробу молока, из них 268 проб сборного молока и 873 пробы молока от здоровых я больных маститом коров.

Пробы молока, взятые с соблюдением правил асептики, доставляли в лабораторию для бактериологического исследования и термосах со льдом не позднее 2-3 часов.

Диагноз на мастит ставили на основании данных анамнеза* результатов клинического и лабораторного исследований. Клиническое исследование молочной железы проводили путем осмотра, пальпации и дробного доения. Ранние формы мастита выявляли на основании результатов реакции секрета вымени из каждой четверок

- б -

с раствором димастина, пробы отстаивания и бактериологического исследования. Отбор проб молока и секрета вымени от хоров, больных маститом« а также исследование их на наличие возбудителей мастита производили в соответствие с "Методическими указаниями по бактериологическому исследован;;*: молока и секрета вымени коров"Ц983).

В опытах по сравнительному изучению существующих питательных сред для выделения кашилобактэрий испытали 6 плотных сред. Из них три среда готовили на основе 1ШПА, 2 - на основе аритрит-агара для выделения брупелл и I - на основе кампилобак-тер-агара. В качестве ингибиторов во все среди добавляли смеси антибиотиков, разные по количественному к качественному соотношению, а для обогащения - дефибринированную кровь крупного рога того скота. На них производили посевы сборного молока, пробы от коров, больных маститом, а также искусственно контаминиро-ванное камлилобактериями молоко из разведений 1:10 и 1:100. Посевы инкубировали в анаэробной камере фирмы "0xoid°4 Англия). Микроаэрофильные условия создавали с помощью газогенерирущих пакетов при температуре +42°С. Учет результатов осуществляли через 24, 4S и 72 ч.

Морфологию колоний с.jejuni изучали визуально с помощь» лупы, путем просмотра под микроскопом мазков, окрашенных по Граму или % карболовым фуксином,под иммерсией, а также в препарате монослойной культуры. Мазки готовили из культур кампило-бактерий, выращенных на плотной среде, в течение 2, Б, ? и 10 суток. Подвижность микробных клеток определяли в препаратах "раздавленная", "висячая" капля и при фазоконтрастной микроско пии. Размеры с.Jejuni определяли с помошыо микромера окулярного винтового (M0B-I).

При подборе ингибиторов и ростовых добавок при разработке новой элективной среды для выделения кампилобактерий из молока использовали данные отечественной и зарубежной литературы о чувствительности микроорганизмов к тем или иным препаратам. Готовили питательные среды на основе кампилобактер-агара (НПО "Питательные среды", г.Махачкала) с содержанием различного количества ингибиторов. Посевы инкубировали в газовой анаэробной камере и эксикаторе в течение 48 час. при температуре +42°С.

Определение чувствительности, скорости роста, стабильности биологических свойств каыпилобактерий на разработанной среде изучали в соответствии с "Методическими рекомендациями к контроле питательных сред по биологическим показателям"(1980).

Культуральные и биохимические свойства, идентификацию кампилобактерий изучали согласно "Инструкции по клинической и лабораторной диагностике-кампилобактериоза" (199I). При изучении биохимических свойств определяли каталазную активность, образование сероводорода, способность культур расти в полужидком агаре (ПДА) с добавлением: 10% релчи, глицина, глюкозы, 3,5/6 поваренной соли, 30 мкг/мл налидиксовой кислоты, 400 мг/л 2,3,5-трифенилтетразолиумхдорида. Гидролиз гиппурата натрия определяли по методу Harvey (1980).

Чувствительность с. jejuni к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с помощью стандартных дисков по методике, утвержденной Минздравом СССР(1963). Учет результатов производили общепринятым способом цутем измерения диаметра зон задержки роста культуры вокруг диска с тем или иным антибиотиком. Определение бактерипидной активности дезинфицирующих средств осуществляли методом диффузии в агар (Вашков 8.И.,1977) н следующим препаратам: хлорамину Б, сульфохлорантину, гипохлориту кальиия и кальцинированной соде.

При изучении выживаемости С.jejuni на различных объектах внешней среда (дерево, металл, бетон, пластмасс) использовали общепринятую з ветеринарии методику (Поляков A.A., 1969); также определяли выживаемость с.jejuni в сыром и пастеркао-ванном молоке и водопроводной воде(стерильноП и нестерильной) при разных температурных режимах (*4°С, +20°С, +60°С, +Х00вС).

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Н.В.Садовского(1975) так называемым константным методом вычисления статистической ошибки средней арифметической, основанной на формуле Питерса и константе Ыолденгауэра.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Сравнительное изучение существующих питательных сред с целью выделения хампилобактегий из молока Для выполнения поставленной задачи нами были взяты следующие плотные питательные среды: I - СХН (сафранин-железо-новобио-циновая)(Голиков A.B., 1980); 2 - среда ВИЭВ (Шманов К.С., 2966) 3 - ПС1К-среда(шютная селективная для выделения . термофильных камгшлобактерий (Голиков A.B., Зенин И.В., ISS6); 4.и 5 - среди Ш MI и Jf2 (железо-еритрит-кровяной агар) - их отличие состоя» в том, что в качестве ингибитора были взяты разные смеси иа 4* антибиотиков и б - кампилобактер-агар со смесью из 5й антибио-

ков. Во все вышеперечисленные среда для обогащения добавляли

• - ■

5-I05S дефибринированной крови крупного рогатого скота.

При высеве]51 пробы сборного сырого молока в разведениях 1:10 и .1:100 в количестве 0,1 см3 выделить на испытуемых средах

кампилобактерии нам не Удалось. Поэтому для разрешения поставленной задачи дальнейшие исследования мы сочли целесообразным проводить с искусственной контаминапией молока разными штаммами кампилобактерий.

Из ^-суточных агаровых культур по оптическому стандарту мутности методом последовательных разведений, кратных 10, готовили взвеси микроорганизмов:С. jejuni , С. coll , c.laridia и С.fetus . Основываясь на литературные данньв по предполагаемому росту кампилобактерий, высев производили из разведений 10 Я Ю ® и 10"^. Посевы культивировали в мияроаэрофильных условиях при температуре +4Й°С.

Учитываемый рост кампилобактерий нами был отмечен из разведения Ю "6. Наибольшее Количество выросших колоний отмечали на последних трех средах. Однако при высеве I млрд. взвеси число выросших колоний составляло всего лишь 380-400 тыс.КОЕ.Такой низкий процент, по нашему мнению, говорит о низкой чувствительности сред или об ингибирующем действии антибиотических смесей на кампилобактерии.

При аналогичных опытах с искусственной контаиинаиией наиболее часто встречающимися микроорганизмами в молоке, а именно 3.aureus ,s.faecalie и B.coli , при высеве их в количестве

м.т./см3(доцустимое количество бактерий при ОБО молока) в некоторых посевах был отмечен рост s.aureus , что свкзайо с недостаточными элективными свойствами испытуемых сред.

При анализе полученных результатов свой выбор для дальнейшей работы мы остановили на кампилобактеф-агаре по нескольким причинам. Во-первых, он имеет промышленный выпуск н менее трудоемок при приготовлении. Во-вторых, по своему составу он со-дергит необходимое количество питательных веществ для роста н развития кампилобактерий. И в третьих, по чувствительное™ он превосходи? остальные питательные среда в раза.

- 10 -

Разработка новой элективной питательней ' среды для выделения кампилобактерий из молока

Для выделения и культивирования термофильных кампилобактерий требуются не только определенная температура культивирования (+43°С) и микроаэрофильные условия (Е® 02, 10$ С02 и но и элективная, богатая питательными вещьстзами среда, способна длительное время задерживать реет сопутствующей микрофлоры,

За основу при конструировании новей олективной среда был взят кампилобактер-агар. Разработку питательной среды проводили по данным изучения чувствительности с.jejuni и гетерогенных микроорганизмов к антибиотикам, поверхностно-активным вещества! (алкиларилсульфонату,. синтанолу, Твину-80) по отдельности и в сочетании с питательными добавками: экстрактом кормовых дрожжей," сывороткой крови, гидролизином и аминокровином.

При испытании ПАВ наилучшие результаты были получены с алкиларисульфонатом - он не влиял отрицательно на рост c.jejur в кониентрапии 0,5-2,055, оказывая при атом ингибирующий аффект на стафилококки и стрептококки.

Бактерии кишечной r^iiiai инактивироваяи полусинтетическим антибиотиком рифампииин (30 мкг/илКМПК для с. jejuni -40 мкг/ил).

Кониентрашш алкиларилсульфоната, качественный и количес; венный состав других компонентов отрабатывали эксперкментальж с агаровыми культурами s.aureus , s.feecalia и e.coli Приготовили 9 вариантов плотных сред. Наилучшие результаты по элективным свойствам мы получили на среде следующего состава: кампилсбактер-агар - 3,75 г

активированный уголь - 0,5 г

- II -

алкиларилсульфонат - 1,0 г

рифаыпииин - 0,003 г

ьминокровин - 5,0 см3

Зода до 100,0 см3.

При этом аминокровин использовали с иелью улучшения ростовых свойств и повышения чувствительности среды. Активированный уголь оказывал двойной э^ект - как вещество, повышающее аэро-олерантность к ам пиле, бактерий и как контрастное общество.

Приготовление сг-вД". К навеске келшилобактер-агара добавить i,0 г алкиларллсуль^оната, 0,5 г активированного угля и воду до 100 см3. Тщательно размешать полученную смесь, довести на водяной бане до кипения и кипятить 2-3 ь.ин, не допуска :'я прогорания среды. Среду автоклавировать в течение 20 мин при 120°С. После охлаждения агара до 48-50°С внести 5 см3 оминокровинв и 0,003 г рифаапииина. Тщательно геремелать, не допуская образования пены, и разлить в стерильные чллки Петри пс 15-20 см3. После заставания среды чашки подсушить в терме с;ате при 37°С в течение 2-3 часок.

• Посев. Искусственно конташнированное молоко i млрд взвесьа С, Jejuni выпевали на ert ну*>(каык разработанную КЭСК-среду) и контрольную Скампилобактер-агар с антибиотиками) в количестве 0,1 сиэ на поверхность агара, тщательно растирая шпателем.

Параллельно произвели посев i. ¡сусотвенно коптаминирован-ногс молока гетерогенными микроорганизмами: E.coli. s.aureus и с. faecoiis В конппнтрании 25х iö1* КОЕ/са3^Попевк инкубировали б микроаэрофильных условиях при +42°с. Учет результато^ через 24,36 и 4U часов инкубирования. Опыты проводили ь 5 повтор1 "'.ст я::.

- 12 - '

В результате проведенных испытаний установлено, что предлагаемая НЗСК-среда обеспечивает рост С. Jejuni Б виде отдельных серебристо-серых колоний, с ровными краями, отчет ливо выделяющихся на темном фоне, диаметр колоний 2-4 мм. рост отмечается через 35 часов культивирования в микроаэрофиль-ных условиях ири +42°С.

Данные по чувствительности, скорости роста и элективным свойствам среды представлены в таблице .

Из таблииы следует, что разработанная новая элективная среда для камлилобактерий (HSCK) обладает высокими элективными свойствами, она подавляет полностью рост гетерогенш-« бактерий в концентрации 250 тыс. К0Е/смэ через 36 часов инкубашш. Чувствительность среды при выделении кампилобактерий из молока

с

составила Ю , что на порядок выще контрольной. На темном фоне среды наблюдался характерный рост колоний 2-4 мм в диаметре, серого ивета с серебристым оттенком.

Для изучения биологической стабильности с. jejuni изучили культурально-биохимические свойства, выросшие на НЭСК. Микроорганизмы выделяли каталазу, не продупировали сероводород, росли в ПЖА с глииина, 10$ желчи, гидролизавали гиппу-рат натрия, не росли в ПЖА с 8$ глюкозы, 3,5$ поваренной соли, 30 мкг/см3 налидиксовой кислоты и 400 мг/л ПХ. Полученные

экспериментальные данные согласуются с литературными.

i

Таким образом, результаты испытания НЭСК показали ее высокую чувствительность, хорошие элективные-свойства, ускоренный рост кампилобактерий при выделении их из молока. Среда проила комиссионное испытание с положительным результатом в лабораториях условиях и подана заян:а на авторское свидетель-стр;;. Следигательно,разработш.нук среду' мсикс рекомендовать

Таблича

Данные по чувствительности, скорости роста и элективным свойствам новой элективной среды для кампилобактерий (НоСН)

¡Питатель-! Культуры !Посев расчетного ные среды

!микроорга-!количества ыикро-1 низмов !организмов

Чувствительность среды .

!3лек- ¡Скорость (тивные! роста (св-ва I ¡КОЕ ! |т.7см3|

Морфология выросших ¡сслоний

нэск

С.ЗеЗип! | Ю7, 10б, ЮЕ I

1

! 1 ! !

1 З.ацгеиэ | 1' Э.гаесаИ^ ! 3. оо11 1 -1-----+

ЮС

|292+8 1

36 ч.

25 х 25 х 25 х

10 ю4

Кампило-бактер-агар со спесью 5 антибиотиков (контроль)1

! С.Зе.]иШ 1 ! 1 ' Б.аигеиз ' • 3.£аеса1:Ы

10?, ЮТ, 10Е

10

!

! { ! !

!нет роста -! ! ! -"- ! 4.---!---

Крупные, серые с серебрис-ш оттенком,2-4 мм,с ровными краями.гладкой блестящей поверхностью, не ' вязкой консистенции

оз

I

1180+5 I ! I

' Е.ссИ |

25 25 25

10 ю4

ю4

1

50+7

нет роста

1 !

I ! 1 1

48 ч

24 ч

Мелкие бежевого цвета 0,5-1,5 мм с не^тки-т краями

- 14 -

для использования в практике при выделении термофильных кампилобактерий из молока и молочнпс продуктов.

Изучение условий культивирования кампилобактерий

Кампклобакгерии являются микроаэрофильньаш бактериями, т.е. дня их роста и развития необходимо пониженное содержание кислорода и повышенное - углекислого газа. При этом оптимальной для культивирования кампилобактерий является смесь газов следующего состава: 555 02, 10% С02 и 85Й которая достигается в настоящее время разными способами. Найти наилучший из них,и в то.же время высокоэффективный к доступный способ сиздания микроаэрофильных условий входило в нааи задачи.

В исследованиях по создании микроаэрофильнгх условий /¡/-Я культивирования кампилобактерий мы использовали 4 способа: 1 -с пэно^ыс газогенерируэдих пакетов в анаэробной камере фирмы "0хо/<1" (Англия); 2-й ьакуумном термостате с оптимальней гп зовой смесьи заводского чэготов."ения;3 - ь э:ссикаторс в атмосфере "сгоревшей свечи" и 4 - в эксикаторе с одновременным отка-чиваниьм воздуха. Контролем в донном случае служило отсутетще роста микроорганизмов ь аэробных условиях. Во ьсех случаях условия культивирования "создавали при температуре ♦4£?С.

При учете результатов наилучший был получен при использовании газогенериру.^их пакетов и газовой смеси заводского изгитоьления. Характерный рост культур кшлпилебак1еркй на среде без ингибиторов наблюдался через 24-36 часов.

По ряду независящих от нас причин (импиртное производство, дорогостоящее и недостаточное о«, (енио большинства практических лаборатория) мь свой гыбар остановили на использовании эксикатора.

В результате многочисленных исследований ьщ разработали

- 15 -

модифицированный способ создания микроаврофильнкх условий в эксикаторе с помощью зажженной с^ечи.

В первую очередь, для более полной герметизации края эксикатора обматали липкой лентой'(скотчей), поскольку плотное притирание крышки не обеспечивало в течение 2х суток в полной мере абсолютной герле-тизании. Применение липкой ленты обеспечило рост кампидобактерий через 36 часов инкубирования, в то время как без ленты - через 48 часов.

Далее обратили внимание, что при сжигании I бытовой свечи на дне эксикатора рост бактерий в чашках был неодинаков, а именно в нижних чашках он был заме;.;ен почти на сутки. По нашему мнению, это связано с неравномерным распределением остаточного кислорода при ¿горании свечи (17%) и в силу завышенной конаентраиии образующегося углекислого газа на дне эксикатора, что сказалось отрицательно на скорости роста исследуемых бактерий. При использовании 2х свеч на разных уровнях расположения мы добились более стабильных результатов,

т.е. через 48 часов инкубирования посевов рост бьгл отмечен во всех засеянных чашках.

Кроме того, нами было отмечено, что наилучший рост кам-пилобактерий наблюдали в эксикаторах меньшего объема (1,5 л), что необходимо учитывать при исследовании малых количеств проб.

При подсчете выросших колоний референтных штаммов кампидобактерий из разведения 10 ® количество достигало 450 тыс.КОЕ/см3, что подтвердило возможность роста и развития их в модифицированном способе создания требуемых условий.

Таким образом, модифицированный способ создания микроаэро-фильнкх условий можно рекомендовать при Еыделении кампилобак-терий как при исследовании-молока, так, и других объектов.

-16 -

Определение чувствительности С. jejuni к антибиотикам и дезинфицирующим средствам, применяемым при обработке молочного оборудования

. Исходя из поставленных на разрешение задач, определение антибиотикочувствительности С.jejuni проводили с нелью подбора ингибиторов сопутствующей микрофлоры молока в конструированной среде, а также пеленалра; ленного использования антибактериальных препаратов при выявлении кампилобахтериозного мастита V коров.

Чувствительность с* Jejuni к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с помощью стандартных бумажных дисков по общепринятой методике. Изучили чувствительность х 15 антибиотикам, полученные данные представлены в графике.

Анализируя представленный график',, наибольшую чувствитель ность с. jejuni проявили к эритромииину, левомипетину, стрептомицину и олеандомииичу. Зона задержки роста кампилобактерий(ЗЗР) составляла 30-35 мм. Ц&лочувствительными эти бактерии оказались к мономиоину, канамииину, карбенииидлину, твтрашисяину, новобиоиину (ЗЗР » 15-25 мм). Устойчивость с.jejuni проявили к ампнаиллину, ристомииину, полимиксину, рифампипину и аифоте-рииину В (ЗЗР - 00-15 мм)..

Полученные данные были использованы при подборе ингиби-руюцего компонента конструируемой среды, а также их необходимо учитывать при выборе препаратов для лечения и профилактики мастита коров кампилобактериозной этиологии.

Дальнейшую работу проводили на основании того факта, что -зачастую путем контаминирования молока кампилобактериями могут быть объекты внешней среды (фекалии животных, вода, хорм, доильные установки и молочная посуда) и поатоцу необходимо

- 17 -

График

Определение чувствительности СатрПоЬасгег -Зе^дагга. к антибиотикам

Щ, *........■"

/-71......................

8

2:7

зоны задержки роста мм

1 — эритромииин> левоминетин:

г — стрептомицин» олеандониаик;

3 - моиомшшк;

>4? — каканицин, карбенициллин!

5 — тетрациклин» ковобиоцин;

в — ампидилнн, ристанидин!

Т - полиниксин. рифанпинин!

в — амФотерииин&

- 18 -

было изучить возможность применения установленных режимов дезинфекции молочного оборудоьания. С атсй целью нами изучено действие мояще-дезинфииируюцих средств в киниентратаях, рекомендованных "Санитарными правилами по уходу за доильными установками и молочной посудой, контролю их санитарного систоякиг. и санитарного качества молока"(1987), позволяющих достигнуть бактерицидный эффект по отношение к С. jejuni

Опыты проводили методом диффузии в агар в лабораторных условиях к следующим деэинфектантам в процентном соотношении: 'к хлорамину В - Й-ный раствор; сульфохлорантину - гипо-хлориту н&трия 2% и горячему раствору кальцинированной соды v. 1 и £5-ной концентрациях. Бактерицидную зффективность учитывали по зоне задержки роста испытуемой культурыСне менее 20 мм).

В результате проведенных испытании установили губительное действие на с. Jejuni всех хлорсодержащих препаратов с бактерицидной конпентрапиеП 0,002-0,00356. Наилучшие результаты при использовании горячего раствора кальцинированной сода получены в 2$ концентрации.

Таким образом, используемые режимы дезинфекаии, применяемые для обработки ' доильного оборудования л молочной посуды, вполне вффехтивны при выделении кампилобактерий из молоха особенно с хлорсодержащими препаратами.'

Изучение морфологически* и хультурально-биохимических свойств с« Jejuni . выделенных из молока при мастите коров

За период исследований нам не удалось евделить С. jejuni

пэ производственных проб молока - сборного и от коров, боль- ' пых маститом. В то же время нам необходимо было изучить их биологические свойства при ввделении из молока, поэтому мы воспроизвели мастит у коров кампиЛобактеркозной агиологии.

Реизоляиионние культуры с» ЗеЗип1 (обозначенные РИЗ-1 и РИЗ-2), выделенные из секрета вымени коров, больных кампило-бактериозным маститом, по морфологическим и культурально-био-химическим свойствам сравнивали с референтным штаммом С .¿е -З-лЧ У' СТО 1/11168.

Культуры кампилобактерий - выделенные из молока и референтный штамм - высевали на разработанную нами питательную среду (НЭСК). Через 36 часов культивирования в микроаэрофиль-ных условиях при температуре +42°С на ней отмечали рост серебристо-серых колоний, с ровными краями, 1-3 мм в диаметре, неувязкой консистенции, с блестящей гладкой поверхностью. На контрольной среде рост кампилобактерий был через 48 часов инкубирования в виде мелких (0,5-1,0 мм)бежевого пвета колоний, часть из которых учитывали с помощью лупы при визуальном просмотре посевов.

При микроскопии мазков, окрашенных по Граму или фуксином Шля (1:5), канпилобактерии (как на опытной, так и на контрольной средах) были в виде грамотрипательных, тонких, спирально-изогнутых палочек с заостренными конпами (1,5-3,5 х • 0,2-0,4 мкм). Клетки имели б -образную форму или вид запятой. Часто наблюдали соединение клеток, не разошедшихся после деления, по форме напоминающей римскую иифру "V". В старых культурах ( 5, 7 и 10 день культивирования) обнаруживали кокковидные формы кампилобактерий.

Культуры РИЗ-1 и РИЗ-2 обладали высокой подвижностью с хао-

тичнш движением "из стороны в сторону" в препарййг. "раздавленная^ "висячая" капля.

При электронной микроскопа нами обнаружены кампияо-бактерии характерной s -образной формы и в виде запятой. В наиболее удачно приготовленных препаратах на обоих полисах бактериальных клеток выявили по одному жгутику, т.е. кемпи-лобактерки являются амфитривиальными микроорганизмами.

При изучении популяиии с.Jejuni в сканирующем электрон' ном микроскопе было выявлено, что поверхность колоний имела сильно развитые покровы, сквозь которые с трудом выявлялись " очертания бактериальных клеток. Культурально-биохимические свойства культур РИЗ-I и РИЗ-2 изучали при постановке ряда тестов. Выделенное из молока культуры росли при температуре культивирования -^"С и не развивались при +25°С, обладали катахазной активностью, не продуцировали сероводород. Они росли на ПЖА с 1% гливина, 10% желчи, не развивались с 3,5& поваренной соли, глюкозы и 0,04% ГОС. Обладали чувствительностью к калидкксовой кислоте, гмдролиаовали гиппурат натрия. На основании характерных для термофильных кампилобактерий тестов, а именно наличия роста при +42?С и отсутствием его при +25°С, способности гидролиэовать гшщууат натрия м чувствительности к налидиксовой кислоте, позволяют отнестк культуры РИЗ-Г и РИЗ-2 к виду Campylobacter jejuni.

Таким образом, при изучении биологических свойств выделенных кампилобактерий из молока коров, больных маститой, в сравнительном аспекте с референтным штаммом с. jejuni ^ gjg

f/11168 мы отметили более выраженные морфологические характеристики выросших колоний. Рост кампилобактерий на НЭСК отмечали через 36 часов культивирования в микроаэрофильных условиях

(в контроле через 48 часов) в виде характерных колоний сереб- • ристо-серого пвета. 2-4 мыв диаметре (контроль 0,5-1,0 мм), видимых невооруженным глазом, с ровными краями, четко выделяются на теином фоне с гладкой блестящей поверхностью. Свежевыдвленные культуры обладали также более активной подвижностью в препарате "раздавленная" капля по сравнению с референтным штампом.

При изучении культурально-биохимичесиих свойств культуры РИЗ-1 и РйЗ-2 были идентичны референтному штампу-Следовательно , разработанная среда сохраняет стабильность биологических свойств кампилобактерий и может быть использована. при выделении и культивировании с. jejuni , выделенных из молока и от коров, больных кампилобактериозньм маститом.

Определение сроков выживаемости С.jejuni в воде, молоке и на объектах окружающей

сред»

Конкретные сроки выживаемости с. jejuni в различных объектах окружающей среды необходимо учитывать при разработке и проведении санитарно-гигиенических мероприятий в случае обнаружения их на животноводческих фермах или установлении мастита кампилобактериозной этиологии.

Выживаемость изучали на тест-объектах (дерево, металл, бетон, пластмасс) исходя из материалов, применяемых на фермах. При нанесении контаминированного молока на поверхность тест-объектов в смывах с исследуемых материалов после подсыхания молопа уже через получаса выделить кампилобактерии нам не удалось. В связи с этим мы отметили низкую устойчивость кампилобактерий к воздействию внешних факторов - высушива-

ваниг), солнечные лучдМ.

При постановке опытов по изучение сроков выживаемости кампилобактерий в молоке и в воде при температуре +Ш+20°С использовали культуры РИЗ-1 и РИЗ-2. Пробирки с контаминиро-ванным молоком и водой взвесью бактерий в концентрации I млн ы.т./см3выдерживали в термостате в течение 30 дней (срок наблюдения). Проведенные опыты показали, что в молоке, выдержанном в термостате при +18+20*С, несмотря на его пептонизаиив и окисление, кампилобактерии сохраняли жизнеспособность в течение 3-6 дней, а в воде 1-2 дня. Контролем служило наличие роста в жидкой среде - бульоне Хоттингера - кампилобактерий в продолжении всего опыта (30 дней).

При определении выживаемости кампилобактерий в холодильнике при температуре +4+6°С выживаемость в молоко и воде была значительно дольше - 14-30 дней и 3-4 дня соответственна,

При нагревании молока и воды до +60ЬС и при кипячении +100°С кампилобактерии погибали моментально.

При выживаемости кампилобактерий в стерильных исследуемых субстратах выживаемость увеличивалась почти в 2 раза.

Таким образом, проведенные нами исследования по иауче-нию выживаемости кампилобактерий в молоке и воде показали, что они довольно длительное время сохраняют жизнеспособность при пониженных условиях хранения и могут служит фактором передачи кампилобактериозной инфекпии. При теплсвой обработке продуктов молочного происхождения и молока кампилобактерии полностью инактивируются. "чзкая чувствительность к воздействию факторов окружающей среды подтверждает трудность выделения кампилобактерий , что затрудняет диагностику р-ого заболевании.

-23 "

Разработка "Временных методических рекомендации по выделению и идентификации термофильных кампилобактерий иа молока" '

На основании результатов проведенных.'«следований мы разработали "Временные методические рекомендации для выделения и идентификации термофильных кампилобактерий из молока", предназначенные для производственных ветеринарных лабораторий и научно-исследовательских институтов.

Во введении излекена важность и целесообразность выделения кампилобактерий из молока при пщевь'х тсксикоинфекииях молочного происхождения и при заболрчаемости коров маститом в случае отрицательных бактериологических исследований на основные возбудители мастита - золотистого стафилококка, ага-лактийного стрептококка и эшерихий.

Методические рекомендации содержат разделы: отбор и подготовка проб к исследованию, проведение исследований (посев, инкубация, условия культивирования, учет результатов).

Учитывая данные литературу (Голиков A.B., 1985; Лучко М.А,

1986), наибольшее значение в возникновении кампилобактериоз-

ных инфекций у людей и животных имеют с» ¡Jei1111* u С.coli

В связи с этим в коние методических рекомендаций мы даем их

позволяющим

идентификацию по трем основным тестамубпределить принадлежность к с. jejuni : температурный тест, гидролиз гиппурата натрия и чувствительность к налидиксовой кислоте.

ВЫВОДЫ

I, Разработан высокоэффективный метод выделения кампилобактерий из молока, включающий новую высокоэффективную элективную питательную среду для кампилобактерий (НЭСК) и условия культивирования.

-242. В предложенную питательную среду НЭСК в качестве.ингибитора сопутствующей микрофлоры молока использовали алкил-арилсульфснат и рифампииин; с целью улучшения ростовых свойств введен аминокровин; для контрастирования фона и повышения аэротолерантности кампилобактерий - активированный уголь.

3. Среда НЭСК по чувствительности превосходит известные среды с антибиотиками в 1,5 раза и время термостатирозания .сокращается на 22 часов.

1 4. Разработан модифицированный, простой, высокоэффективный метод создания микроаэрофильных условий при культивировании микроорганизмов рода СатруйоЬесгег.

5. При изучении культурально-биохимических свойств С.^вЗию! выделенных из молока ксров, большое маститом, в сравнении с референтными штаммами, не было отмечено отличительных признаков. В то же время, КОЕ реизоляиионных культур нэ среде

НаСК были более крупных размероъ (2-4 мм), серебристо-серого ивета, с ровными краями, четко выделяются на темном фоне среды, с гладкой блестящей поверхностью, невязкой консистенции.

6. Определена чувствительность - с. к 15 антибиотикам; установлена их высокая чувствительность к эритромицину и левомииетину (ЗЗР - 30-35 мм) и устойчивость к рифампи-иину, что дало нам возможность ввести его в питательную среду в качестве ингибитора по отношению к БПШ.

7. Установлена высокая чувствительность с. к хлор-содержащим препаратам, используемом при дезинфекции помещений и молочного оборудования.

8. Предложена схема идентификации С, ¿е1чп1 гфи Еыде-лении их из молока, основанная на изучении культурально-б— химических свойств.

- 25 -

9. Разработали "Временные методические рекомендации по выделению и идентификации термофильных кампилобактерий из молока".

Предложения для практики

1."Временные методические рекомендации по выделению и иден-тификашш термофильных кампилобактерий из молока',' рассмотрен.» и одобре?«т на Ученом Совете ВНИИВСГй и на заседании секции "Ватса-нитарил, гигнекп н окэлогия" (протокол >* 15 от 2.11.95 г.) и утверждены РАШ (1995).

Новая алеитивпад среда для pi деления кемпилобакториЛ (Н8СК) и условия их культивирования с использованием модифицированного способа создания микроаэрсфильных условий.

3. Схема идентификации с. jejuni при выделении их из молока.

4. Приоритетная справка на предполагаемое изобретение.

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Демченко А.Г. Микроорганизмы молока, их выделение и идентификация. /Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник науч.трудов. Том 94. - Москва, 1994 - с.76-79.

2. Демченко А.Г. Сравнительное изучение питательных сред для выделения кампилобактерий. /Материалы Всероссийской научно-производственной конференции "Гигиена, ветсанитария и экология животноводства (22-24 сентября 1994 г., Чебоксары), C.II2-JI3.

3. Демченко А.Г. Использование антибиотиков для выделения, кампилобактерий из молока.//Дурнал "Аграрная наука", Р 4, 1995, с.60.

ВНИИВСП), 1995 г, Москва, Звенигородское шоссе, 5, аак. d^-1! Тираж 00 экз.