Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Особенности биологических свойств нетермофильных кампилобактеров и их эпидемиологическая значимость

РГб од

. , На гоавах рукописи

1 1 LAP 1Ь „О

Диалло Альфа Умар Силли

ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НЕТЕРМОФИЛЬНЫХ КАМ1ШОБАКТЕРОВ И ИХ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

14.00.30. - эпидемиология 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 1996

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Госкоксакзпкднадгора России. Научные руководители!: доктор медицинских наук профессор Б.Л.Черкасский, кандидат медицинских наук,-с.н.с. Н.З.МинаеЕа

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор Юшенко Т.В. доктор ыедицнских наук профессор Соколова Н.Ф.

Ведущая организация : Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Зашита состоится "_29_"_Марта_"1995 г. в ¿£с<час.

на заседании диссертационного совета Д 074.13.01 в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии (г.Москва,111123 ул.Новогиреевская,д.За)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНИИЗ. Автореферат разослан' " 1996 г.

Учёный секретарь диссертационного соЕета

кандидат медицинских наук Пименова М.Н.

сад ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Впервые открытые в 1909 г. бактерии ода Са-пру1оЬасЬег широко распространены в природе,они обнаруживаются в разнообразных объектах окружающей среды,у всех домашних . [ у большинства видов диких животных и птиц.

Проблема кампилобактериоза у людей остается актуальной уже-¡выше 20 лет и интерес ней не ослабевает. Лавинообразный поток, ¡убликаций.по-, данной инфекции'отмечался в 80-х годах вашего сто-сетия и охватил практически все страны мира. Статьи были посвящена в основном различным методам обнаружения,случаям выделения возбудителей из различных объектов и эпидемиологическим закономерностям кампилобактериоза. В начале 90-х годов число публикаций заметно уменылшось,но это не било связано со снижением актуальности проблемы,это объясняется тем, что к дзнному времени практически повсеместно была налажена диагностика этой инфекции и исследования на кампилобактериоз .стали рутинными в практическом здравоохранении.

В последние годы возрос интерес к изучению факторов патоген-ности возбудителей, их молекудярно-гене.тических характеристик, выяснению роли кампилобактеров в патогенезе ряда инфекционных и соматических заболеваний и, конечно, совершенствованию методов индикации и идентификации кампилобактеров.

Кроме того, высокая частота восительства кампилобактеров различных видов кяинически здоровыми людьми, в том числе С.Ьуо1п-testinalis, окружающей среды обнаружение С. сгуаегорЬИа в объектах окружающей среды возрастающее значение - ранее малоизвестных видов, кампилобактеров как этиологических агентов вызывает заслу-

женный интерес у исследователей. Актуальным является углублен! изучение биологических свойств С. hyointestinalis, С. cryaeropí" la, С. fetus spp. fetus и других видов кампилобактеров, что сдуа основой для возможной дифференциации возбудителей по пзтовара^

целью уточнения их роли в инфекционной патологии человека.

>

Делыо работы явилась разработка подходов к установлению эг демиологичеекой значимости нетермофильных видов кампилобактер на основе изучения особенностей их биологических характеристик.

Основные задачи исследования:

1- Выявить оптимальные условия для изучения биологическ свойств Еогбудителей камлилобактериоза.

2. Изучить культурально-биохимические свойства камлилобакт ров. -

3. Охарактеризовать адгезигные свойства возбудителей камп лобактериоза и некоторые дополнительные факторы вирулентное кампилоОйктеров. - • • -

4. Изучить резистентность кампилобактеров к некоторым л карственным препаратам.

5. Предложить схему внутривидовой дифференциации негерм фильных кампилобактеров.

Научная новизна. Впервые охарактеризованы биологическ свойства каипилобактерев аетермофильных видов (C.hyolntestinali C.cryaerophila, С.fetus spp.fetus). Изучены в сравнительном пла адгезивные свойства'штаммов термофильных и нетермофильных камп лобактеров.в первую очередь таких,как длительность нахсаден штаммов возбудителей во внешней среде, характер источника выдел ния. ■ 1' ' .

Впервые оценена возможность использования биологических х рактеристик штаммов нетермофильных видов кампилобактеров в к

scTEe эпидемиологических маркеров.

Практическая ценность работы. Отработана методика вдентифи-ации-таких видов кампилобактеров как C.hyointestinalis, С. сгуае-ophila, и С. fetus spp.fetus, Подбор наиболее информативных био-огических характеристик нетермофильных кампилобактеров предоста-ил возможность создать схему внутривидовой дифференциации возбу-ителей в целях помощи практическому здравоохранению при расшиф-овке случаев кампилобактериоза у людей.

Предложена методика определения адгезивных свойств кампилобактеров и критерии оценки их адгевивной активности.

Данные по изучению влияния условий культивирования на биологические свойства кампилобактеров позволили предложить оптимально параметры проведения их идентификаг^ш и биотипирования.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты ¡роведенной работы отражены в информационно-методическом письме 'Определение адгезивных свойств грамотрицательных бактерий", .ут-¡ераденном ГВ СЭН РФ в январе 1992 Г.; Информационном бюллетене J.1 "Пищевые зоонозы в России в 1990-1991 гг." (Москва, 1994).

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и збсуждены на: научно-практической конференции " Актуальные проб-1емы инфекционной патологии" (Санкт-Петербург, 1993); межлабора-горной конференции в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии ГК СЭН РФ. (1994,1995).

Публикации. По теме диссертации, опубликовано 4 научных зтатьк.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена 'на 170 листах-машинописи и'состоит из введения,' обзора литературы, 4 глав собственных исследований и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 24 таблицами.

Библиографический указатель включает 322 источника, в том числ< 264 зарубежных авторов..

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы исследовании. В ходе проведенной работ изучено 597 штаммов кампилобактеров различных видов, выделенные за период с 1990 по 1994 гг. на 5 территориях России и зарубежны; стран. Штаммы изолированы из различных источников при разны: зпидситуациях. В их числе 256 штаммов, выделенных на Московско] территории:. 71 культура - от людей; 101 - от птиц-и животных и - из внешней среды. Исследовано 52 штамма из Вологодской области: 6 - от людей; 40 - от домашних птиц; б - из объектов окружающее среды.

В работе использовано 38 штаммов из Казахстана: 9 - от людей, 22 - от домашних птиц; 7- из внешней среды. Изучено 4Е штаммов из Украины (Запорожская область) - 39 от людей и 6 - о] домашних пищ. . Исследовано-.206 штаммов из Монголии,- .среди них 77 получено о? людей; 127 - от домашних животных и птиц и 2 штамма -из окружающей среды.

В число штаммов, выделенных от домашних животных, вопш культуры от крупного и мелкого рогатого скота (овцы). Среди штаммов от птиц, от кур и цесарок. Штаммы кампилобактеров выделены ие следующих объектов окружающей среды: вода открытых водоемов, сточные воды, смывы в очагах кампилобактериоза:

Материалом для эпидемиологического анализа послужили данные о распространенности кампилобактериоза у людей, животных и птиц, в объектах окружающей среды на территории России и ряда зарубежных государств, а также карты эпидемиологического обследования 1£ очагов кампилобактериоза у людей, а также паспорта штаммов кампилобактеров, выделенных на разных территориях из разных источников.

В ряде экспериментов в качестве контрольных использованы галонные референс-штаммы кампилобактеров: ССМ 6214 С.Jejuni, М 57Z С. jejuni' (Чехословацкая коллекции микроорганизмов, г.Брно 385), №602 С.coll, №1728 / №S 25428 С.laridls №88 С.jejuni, ^БОг/ВСМЭбА С. jejuni (лаборатория Института Пастера,г.Оттава, анзда, 1935). В работе использованы референс - штаммы С.сгуае-. ophlla А169/В (Музей культур, Университета г. Гетеборг, Швеция); .fetus spp.fetus №3408 (Чехословацкая.коллекция микроорганизмов г. Брно, 1985), С.hyointestinalis АТСС 35217 (Музей культур ниверситега г. Гетеборг, Швеция).

Штаммы, использованные в работе хранились либо в лиофилизи-юванном состоянии (при + 4°С ), либо при - 75°С в криопротектив-гсй среде.

Исследование нативнсго материала на присутствие кампилобак-?еров, а также установление родовой и видовой принадлежности тер-«офшгьных 'кампилобактеров проводили-по методикам, отраженным в 'Инструкции по клинической и лабораторной диагностике кампилобак-гериоза (№15-6/28, 1989).

Полная идентификация и биохимическое титрование штаммов термофильных кампилобактеров поводилась по методике описанной ранее (Минаева Н.З., 1992):.

Для идентификации штаммов Campylobacter cryaerophila и Campylobacter hyointestinalis использовали следущие дополнительные тесты: продукция сероводорода на полужидкой среде с цистеин-НС1, аэробный рост при 37°С, аназробный рост при 37°С, способность к росту на среде с IX глицином.

При изучении влияния различных условий фгль газирования на выраженность' 'биологических свойств кампилобактеров использовали питательные среды: агар Йаплер-Хинтон, Колумбия, Vilkins-Chalg-

ren, агар Хоттингера с 1% глюкозы, ЖЗХА. Все перечисленные сре, применяли с 5Z крови или без добавления крови.

Кров использовали: дифибринированвую баранью, кроличью И'Л< шадиную, а также донорскую человеческую. Из числа сред с замен: ■гелями крови использовали агар Хоттингера с-. 17. глюкозы и б актер; ологическим углём (конечная концентрация 0,4£)^

Оценивали влияние на биологические свойства кампилобактер< газовой среда, используемой для создания микроаэрофшшных усл< 'вий. '

Применяли газогенерирующе пакеты: Ahaerocult: С (Merck] Campy Pak (BBL), а также газовую смесь COz - 10Z, N2 -90%; атмос феру "сгоревшей свечи".

Бри отборе биохимических характеристик нетермофильных камш лобактеров, позволяющих проводить их внутривидовую дифференциащ изучено 9 свойств возбудителей по модифицированными нами метод! нами. .... .. ■

Изучение чувствительности штаммов кампилсбактеров к 13 ле карственным средствам проводили с помощью метода диффузии препг рата в питательную среду (агар Ышшер-Хинтон с 52 крови барана) по предложенной нами методике.

Исследуемый штамм кзмпилобактера, выращенный в микроазрс фидьных условиях при 37°С в течение 24 часов,, .суспендировали физиологическом растворе до конечной концентрации 106 кл/мл (п стандарту мутности 5 ед.). Засевали "газоном" на чашки с кровянь агаром. Подсушивали в термостате при' 37°С и наносили диски с ле карстветшм препаратам (фирма Becton Dickinson). Посевы инкубирс вали в микроазрофильйых услов'ий при 37°С в течение 24 часов.'

Отбор антибактериальных препаратов для исследования осущест ваялся на основе данных о широте их использования в медицинской

ветеринарной практике.

Критерии учёта скорректированы для кампилобактеров при использовании рекомендаций Becton Dickinson Microbiology Systems.

Гемолитические свойства кгмпилобактера изучали на кровяном агаре (5% крови барана или 5Z крови кролика). В-качестве основы использовали" питательные среды: агар Мшлер-Хинтон, Колумбия.. Wilkins-Chalgren, агар Хоттикгера, с 1% глюкозы. Учёт результатов проводили после инкубации з мшфоаэрофилыш условиях при 37 С при 42°С через 18,'24, 43 часов выращивания, а так® после выдерживания испытуемых штаммов при + 4°С - через 1, 2. 4, 6. 8 суток.

Изучение адгезивных свойств кампилобактеров проводили по методике разработанной нами в сравнении с"зюпреес"-методом. В качестве клеток мгкроорганкзма использовали 5% взвесь фсрмалинизи-роаавнш эритроцитов человека. Подготовка чистых культур кампило-бактеров вклшала их выращивание в никровзрофильных условиях при

,37°С-и 42°С в течении 24 и 48 часов.

Ход исследования при преложенном методе оценки адгезивных свойств кампилобактеров включает: в суяие стерильные бактериологические пробирки вносили дважды отмытую в фосфатво-буфэре культуру кампилобактеров в концентрации 1 млрд/мл в количестве 0.5 мл и 0,5 мл 5% взвеси эритроцитов. Смесь инкубировали при 37°С или 42°С в течение ЗОмин. при непрерывном встряхивании. По окончании инкубации взвесь в: количестве 0.05 ш наносили на предметное стекло делали мазок общепринятым способом. Подсушвали на воздухе, фиксировали спиртом и красили по Ромаяовскому-Гемзе.

Учёт результатов проводили при просмотре окрашенных мазков ' пом микроскопом в--иммерсионной системе. При этом подсчитывали количество эритроцитов, не имеющих -на свой поверхности прикрепившихся бактерий и количество эритроцитов с »¡тезированными баете-

риальными клетками, отдельно вели подсчет бактериальных клето

Адгезивные свойства кампклобактеров оценивали по предлага мым показателям:

I. Средний показатель адгезии (СТА), т.е.^ среднее количест: бактерий, прикрепившихся к 1 эритроциту из 50 просмотренных

2. Коэффициент участия эритроцитов (НУЭ).т.е. процент зри1

роцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные бактерии.

»

3. Индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ) - среднее кол] чество микробных клеток, прикрепившихся на 1, эритроцит из чис. участвующие в адгезии".

прикрепившихся к эритроциту.

СПА

А х 2

100

А - общее количество бактерий, прикрет вшихся к эритроцитам из 50 просмо' ренных в поле зрения.

СНА X 100

ИАМ -

КУЭ

Критерия оценки адгезивного процесса:

Степень адгезии Ко данным СТА ' ' По данным ИАМ

низкая

средняя

высокая

до 3,0

3,01 - 5,0 5,01 и >

до 3,5

3»51 5,5 5,51 и >

Ход исследования при "Экспресс-метод" определения адгезивной ктивности кампилобактеров: '.

дважды отмытые фосфатно-солевым буфером эритроциты суспенди-'овали в этом же буфере до концентрации 100 кл/мл. Затем на пред-(етное стекло наносили одну каплю буферного раствора, в которую ¡носили по 1 капле (или одну бактериологическую петлй) взвеси ритроцитов и исследуемой культуры кампилобактера непосредственно ■ чашки с питательной средой.

После чего предметное стекло помещали во влажную камеру на О мин. при температуре 37°С, затем препарат высушивали при этой ;е температуре, фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гемэе.

Учёт результатов и оценка адгезивной активности при "эксп-есС'-методе проводился аналогично.

При определении плазмокоагулазной активности кампилобактеров как возможного фактора патогенности). использовали пробирочную ¡етодику. • ■ " ' "

При интерпретации полученных результатов использовали метод шидемиологического анализа. Материалы подвергались необходимой статистической обработке.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Первым необходимым этапом исследований изучение и подбор оптимальных условий культивирования для поведения биологического лидирования возбудителей кампилобактериоза. В результате опреде-1ены универсальные условия, позволяющих изучить все необходимые сарактеристики кампилобактеров, не изменяя режима культивированы.

Удалось установить, что при определении чувствительном бактерий к лекарственным препаратам является неприемлемым использование питательных сред -с добавлением активированного угля (заменитель крови), так как при этом ряд лекарственных сред.инакти-вируется, что проводит к получению заведомо-ложных результатов.

Оптимадьной средой для " субкультивирования кампилобактеро: можно считать Ыюллер-Хинтон агар, допустимо также исяользоват] агар Хоттингера С IXтлюкозы и 5% крови (барана, человека и др.) Добавление крови к питательным средам для' подготовки к изучени адгезивных свойств искусственно снижает , адгезивную активност: штаммов. Следовательно, при изучении факторов вирулентности кампилобактеров следует использовать, стандартизованные коммерчески« питательный среды (например агар Ыюллер-Хинтон), позволяющие получать необходимое количество бактериальной массы. Представляете: целесообразным рекомендовать использование для культивировали ■ • кампилобактеров нетермофильных' и-термофильных видов газогенериру-ющих пакетов, продуцирующих водород (типа Campy Рак, BBL), чи необходимо да улучшения ростовых свойств возбудителей (особен» C.hyointestinalis) и создания возможности проведения более полно; биохимической дифференциации кампилобактеров.

Оптимальной температурой для изучения биологических свойст: представителей Есех шести изученных видов кампилобактеров следуе1 считать 37°С.

В результате проведенной видовой-идентификации культур кам пилобактеров, выделенных из различных источников в 1992-1994 гг установлено что, к виду С. jejuni принадлежало 46,6%; к C.-coli 21,6%; С.laridis - 19,91; C.cryaerophila: - 6,4%, С.fetus spp':fetus - 3,3%; C.hyointestinalis - 2,2%. штаммов.

(

Далее в проведенной работе-штаммы С. jejuni, C.coli и C.lari-

dis использовались только для сравнения при изучении биологических характеристик и подборе тестов эпидемиологического маркирования штаммов нетермофильных кампилобактеров.

Учитывая немногочисленность изученных' объектов выделения кампилобактеров, а также повсеместную широкую распространенность возбудителей, не представилось возможным констатировать видовой приуроченности того или иного представителя рода Campylobacter к определенному "хозяину" или объекту выделения.

' Наиболее распространенным видом, независимо'от источника выделения, остается С.jejuni, по нашим данным наиболее часто С.jejuni обнаруживаются у людей, и реже всего в водных объектах(50,4% против 13,3%).

Второе место частоте распространения у людей и птиц занимают штаммы C.coli. При этом среди С.coll максимальная доля (77,5%) приходится на штаммы, выделенные у сельскохозяйственных птиц и животных. '' " ' ~

Наши данные показали довольно значительную широту распространения -штаммов C.laridis среди сельскохозяйственных птиц .(68,1% от всех выделенных культур). В целом в структуре возбудителей

кашилобактериоза, выделяемых у животных' и птиц, преобладали

1

штаммы C.coli, C.laridis и C.hyointestinalis.

Находки штаммов C.cryaercphila и C.hyointestinalis немного численны, данные о частоте встречаемости указанных видов в литературных источниках не встречаются, а в России сведений об них обнаружении до настоящего времени не было. Ввиду этого полученные нами результаты являются первыми в стране, среды всех изученных штаммов C.cryaerophila, B3.2Z получены из воды открытых водоемов и в то же время штаммы данного вида были обнаружены у людей. Тогда как по данным последние годы удельный вес данного вида в' зтио-

логической структуре кампилобактериоза начинает нарастать. Штаммы C.hyointestinalis в 2,0% случаев обнаруживались у людей-бактерионосителей, профессионально связанных с- разведением и убоем сель- • скохозяйственных птиц (кур). Основная часть изученных культур данного вида принадлежала к штаммам, выделенным у кур (9 штаммов из 13). . " - ■

Установлено преимущественное распространение C.cryaerophila в воде открытых водоемов (63,2% от число штаммов данного вида).

Находки С .'fetus spp. fetus как'у людей, так и у обследованных животных (телята) можно отмести к числу редких. •

Следовательно, на фоне широкой циркуляции С. jejuni имеет место сходство видового пейзажа кампилобактеров, распространенных в различных объектах исследования, и определенное своеобразие в частоте встречаемости тех или иных видов возбудителей в зависимости от источника их выделения.

•Результаты изучения . ферментативных характеристик позволили • -отобрать наиболее стабильные и информативные признаки, позволяющие проводить ЕнугривидоЕую дифференциацию кампилобактеров различных видов,включая нетермофильные. Б итоге предложена сокращенная универсальная схема, позволяющая дифференцировать 8 биоваров кампилобактеров и основанная на 3-х тестах: гидролиз гиппурата : натрия, продукция ДНКазы и щелочной фосфатазы.

В доступной нам литературе сведений о биохимической ' дифференциации штаммов C.cryaerophila и C.hyointestinalis обнаружено не было.

В соответствии с предложенной схемой штаммы С. fetus spp.fetus удалось подразделить на 2 биоЕара (биовары 5 и '7), C.cryaerophila на 3 биовара (б,7<8), C.hyointestinalis на 2 биовара (7 и 8).

Установлена некоторая зависимость между частотой встречаемости тех или иных биоварови видом возбудителя, так, биовар 7 доминировал среди штаммов C.coli и C.laridis, биовар 5 -среди культур С.fetus spp.fetus, биовар 8 -среди штаммов C.cryaerophila и C.hyointestinalls. В число доминирующих биоваров кампилобакте-ров вошли: 7, 1," • 5, 3, на долю которых приходилось 67,21 всех изученных штаммов; ведущим являлся биовар 7, которой встречался среди всех изученных видов камлилобактеров.

Анализ биоварового пейзажа кампилобактеров, изолированных из различных источников показал, что штаммы циркулирующие в пределах одной территории в разных"объектах, относятся к сходным биоварам. так, штаммы выделенные из объектов внешней среды (Московской территории) в большинстве случаев аналогичные по биоваровой принадлежности штаммам подученным от животных и птиц, к от людей, что указывает на массивность загрязнения вод открытых водоемов сточными жидкостями." Кроме того все штаммы, выделенные от людей, аналогичны по биоваровому пейзажу штаммам, циркулирующим среди животных и птиц, а в ряде случаев-и. воде открытых водоемов.

Биохимическое типирование штаммов C.hyointestinalis позволило подтвердить идентичность культур, выделенных при обследовании от кур на одной из птицефабрик и от обслуживающего персонала той же птицефабрики, явившегося бессимптомными бактерионосителями такого довольно редкого1 возбудителя кампилобактериоза. Обнаружение C.hyointestinalls на. птицеперерабатывающем комплексе выдвигает

ттгчлЛ*ft»itr т»nn\ino11n Ллчглл пчлттлллтпптти«»! ^wnrn

M^W^MWU^ iJVUt»UHtnwl fWUVV jynywitw* W WA W ^(xAtf

ля как в окружающей среде., так и среди людей.

Возможность внутривидовой'дифференциации C.fetus spp.fetus, C.cryaerophila и C.hyointestinalis с помощью биохимического тйпи-. рования позволяет устанавливать определенные закономерности цир-

куляции данных возбудителей, что в свою очередь является неотъемлемой частью эпидемиологического надзора за кампиловактериозом.

Учитывая предпочтительность комплексного подхода к выбору методов внутривидовой дифференциации кампилобактеров, представлялось целесообразным охарактеризовать отношение возбудителей к лекарственным препаратам.

Известно, что уровень лекарственной резистентности, зависит от видовой принадлежности возбудителей и, главное, от источника их выделения. В результате анализа данных об устойчивости 442 штаммов кампилобактеров были экспериментально отобраны те лекарственные препараты, уровень резистентности к которым имеет видовые и штаымовые вариации. .К их числу отнесены: аыикацин, ампициллин, эритромицин, гентамицин.канамицин, карбенициллин, тетрациклин, хлорамфеникол, стрептомицин, и фуразолидон.

Нами впервые установлены различия по признаку антмбиотикоре-зистентности среди-штаммов камшЬбакгеров .-нетермофидьных -видов.. ■ Аналогичных данных в литературных источниках нами обнаружено не было.

Полученные результаты показали, что штаммы кампилобактеров рагличных видов отличается друг от друга по частоте распространения признака резистентности и по фенотипам устойчивости к лекарственным препаратам.

Так, наибольший удельный вес полирезистентных культур отмечался среди щташов C.hyointestinalis (100%) и С.coli (38,7%), , среди культур C.cryaerophila резистентность к 4-5 препаратам от- . мечалась в 26,3% случаев, в 73,7% установлена устойчивость к 1-3 препаратам. Необходимо подчеркнуть, что не было обнаружено ни одного штамма, чувствительного ко всем изученным препаратам среди культур C.'nyointestinalis и С.сгугзгсрМ1а в отличие от С.coli'

- 17 -

(27ДХ штаммов оказались чувствительными).

Отличительной особенностью изученных штаммов C.cryaerophila, явилось чкЕствительность к тетрациклину, стрептомицину и- эритромицину; максимальный процент устойчивости к'пенициллину (100,0%), значительный удельный вес штаммов, резистентных к ампициллину я канамицину (по 65,5%), и фуразолидону (15,8).

Штаммы C.hyointestinalls характеризовались полной чувствительностью к пенициллину, тогда как штаммы других видов кампило-бактеров в том или ином проценте случаев оказывались резистентными к данному препарату. Кроме того особенностью кампилобактеров данного вида можно.считать 100,0% устойчивость к ампициллину, канамицину и стрептомицину, а также наиболее высокий процент'культур, резистентных к эритромицину (45,2%).

Учитывая небольшое число изученных культур С.fetus spp.fetus, можно предположить, что характерной особенностью данного вида 'является чувствительность "к, амикацину и'кавамицину.

Изучение фенотипов лекарственной устойчивости кампилобактеров различных видов показало их значительное разнообразие." Число спектров резистентности у циркулирующих штаммов достигало 45 по 10 детерминантам. В число доминирующих оказались спектры Kb; Hen; Тс KB Str;. Ар Pen Str;' Er Kn Str Cm (37,9%). Среди каждого из изученных видов кампилобактеров получили преимущественное распространение штаммы с 'определенным фенотипом резистентности. Так, штаммы С.fetus spp.fetus характеризовались, в основном, следующими резистограмыами: Реп; Ар Реп (68,8%); C.cryaerophila: Ар Реп Кп; Реп (73,7%); C.hyolntestlnalis: Ег Ар Kn Str; Тс Ар Anile Kn Str (84,6%). ' ] :

Дальнейшее слежение за формированием и распространением ан-тибиотикорезистентности кампилобактеров вероятно позволит выявить

- 13 -

видовйе метки кампилобактеров по данному признаку.

Нами установлено, что уровень резистентности кампилобактеров к лекарственны,! препаратам зависит от источника выделения штаммов.

Так, наиболее широким разнообразием спектров резистентности характеризовались штаммы, изолированные у кур, 3,0% которых оказались устойчивыми к 10 лекарственным препаратам. Среди штаммов, выделенных от больных людей, доминировали культуры устойчивые к карбещщиллину (44,4%), и стрептомицину (41,7%). В отличие от них I среди культур, полученных от кур и животных, преорбладали штаммы, |

I

устойчивые к аеткацину (62,0?.) и пенициллину (61,1%). В воде открытых водоемов преимущественное распространение имели штаммы, ус/

/

тойчивые к кавамицину (61,32)пенициллину (37,1%) и тетрациклину (30,5%). ,

Вместе с тем доля культур, резистентных к стрептомицину, -хлорамфениколу и фуразолидону, оказалась максимальной- среди -культур, полученных от людей. Среди штаммов, устойчивых' к'гентамици-ну, хлорамфениколу,не было ни одного, выделенного из объектов окружающей среды, одного к числу последних принадлежали большинство культур, устойчивых к эритромицину и канамицину. Большая часть" '{ пташсв, резистентных к тетрацигаошу, ампициллину, пенициллину,. ; амикацину, приходилась на штаммы, выделенные у птиц.

Таким образом, перечисленные признаки могут служить рпреде- : ленными метками штаммов кампилобактеров, выделенных из различных I источников в пределах одной и той же территории. |

. Сопоставление фенотипов лекарственной устойчивости нетермо- | * * > * . фильных кампилобактеров с данными эпидемиологического анализа'

случаев заболеваний людей позволило в ряде случаев подтвердить

идентичность штаммов и наличке эпидемиологической связи между '

изучаемыми объектами. -

Так, при сопоставлении ¡?-спектров подтверждена идентичность штаммов С.Ьуо1пЪезиЛа11з, выделенных от персонала-и у кур на одной и той же птицефабрике.

Аналогично установлена взаимосвязь при анализе спектров резистентности между штаммами С. сг/аегорШа, полученными от водоплавающих птиц и из воды открытых водоемов.

Анализ результатов изучения устойчивости- кампилобактеров, циркулирующих на различных' территориях, • показал возможность существования географической приуроченности кампилобактеров с определенным фенотипом резистентности/ Так, только в Москве и области установлена циркуляция кампилобактеров, характеризующихся резистентностью к гентамицину, эритромицину и фуразолидону. Особенностью штаммов кампилобактеров, выделенных в Монголии является их 100,0% чувствительность к-пенициллину.

"Для уточнения значимости кампилобактеров, в особенности не- * термофильных, в патологии человека и развитии эпидемиологического процесса при данной инфекции представлялось необходимым оценить ряд свойств вирулентности.

Участие в разработке метода определения адгезивных свойств кампилобактеров на модели эритроцитов человека позволило выявить и "оценить влияние различных факторов на показатели адгезии, а также опытным путем подобрать оптимальные параметры метода, в первую'очередь для нетермофильных кампилобактеров. Были разработаны и приняты критерии учёта адгезивной активности кампилобактеров по показателям. СПА, КУЭ и ИАМ.

Сопоставление' результатов изучения адгезии -с помощью двух ' предложенных методов:"классический" и "экспресс", показало низкую информативность экспресс-метода, и наблюдаемое искусственное за-

вышение числа вЫсокоадгезивных бактерий примерно в 4 раза сравне- ; нию с "классическкм"-методсм, что не позволяет рекомендовать "экспресс"-метод для практического применения.

Результаты сравнительной оценки адгезивной активности кампи-лобактеров различных видов показали, что адгезивность штаммов С.fetus spp.fetus достоверно ниже, чем установленный нами средний показатель адгезии (t>2). ,

у Самый высокий процент неадгезивных штаммов установлен среди C.cryaerophila (20,02), C.'laridis (14,3%) H'C.hyolntestinalis (2 из 13 штаммов). -

■ Выявлены некоторые различия в адгезивносги штаммов, изолированных из разных источников. Так, достоверные различия установлены при сравнении адгезивных свойств штаммов,выделенных от.больных кампилобактериозом и бессимтомных носителей. Среди кампилобакте-ров, обнаруженных в водных объектах, доля низко- и не адгезивных .штаммов, выше, чем среди прочих. .. ...

Все же, принимая во внимание все вышесказанное, необходимо подчеркнуть, что различия в степени адгезивной активности носят в первую очередь штаммовый характер и независимо от источника выделения, штаммы кампилобактеров, включая C.cryaerophila и C.hyoin- j testinalis является адгезивными, при некоторых отличиях в степени .-i выраженности их адгезивных свойств. ~ ■ !

В число показателей 'характеризующих Еирудентные свойства кашилобактеров, может быть включено определение их гемолитичес- j кой активности. Соблюдение'ряда необходимых условии даёт возможность выявить феномен гемолитической активности у 1,7-16,7% штаммов кампилобактерйв различных видов, наблюдаемые различия в показателях .зависели ст характера источника выделения, .а ' также от состава питательной среды, на которой изучался данный признак.

(

- 21 - ^ В качестве дополнительных факторов, характеризующих вирулентные свойства возбудителей, можно рекомендовать ДНКазную активность' и продукцию щелочной'фосфатазы. Выявлено существование еыс.окой ' обратной корреляционной сеязи между высокой адгезивной активностью кампилобактеров и способность их продуцировать ДНКазу . и щелочную фосфатазу (£>-0,9).

Учитывая, что до настоящего время остается спорным вопрос о роли в инфекционной патологии человека C.hyointestinalis .С.сгу-aerophila, изучение факторов вирулентности возбудителей является ценным для осуществления и совершенствования эпиднадзора за этой инфекцией. " Оценку вирулентных свойств кампилобактеров необходимо - проводить комплексно, так как патогенность полидете'рминантный признак и определяется совокупностью факторов, к которым следует отнести адгезивную активность, продукцию ферментов щелочной фосфатазы и ДНКазы и в перспективе-гемолитическую активность штаммов.

Установленная циркуляция на территории России штаммов кампилобактеров редко встречающихся видов, обладающих высокой адгезивной активностью, а также выработкой ДНКазы и фосфатазы подтверждает, что они являются потенциальными возбудителями кампилобакте-риоза у людей. " "

Результаты изучения факторов патогеннссти кампилобактеров представляется возможным использовать для перспективной оценки значимости того или иного вида кампилобактеров в этиологической структуре кампилобактеров1. Так, на основании перечисленных характеристик возможно предопределить возрастание циркуляции на Московской территории в ближайшие годы штаммов С.coll, что несомненно является важным при организации эпидемиологического надзора за кампилобактериозом.

Тагам образом установлена циркуляция на территории России и других, стран таких видов кампилобактеров, как C.hyointestinalis и C.cryaercphila, .представлена комплексная .схема маркирования нетермофильных кампилобактеров и показана пригодность выявленных маркеров в целях совершенствования эпидемиологического'надзора за кампилобактериозом. - .

ВЫВОДЫ

1. Среди выделенных термофильных кампилобактеров доминирует С. jejuni' (46',б%}, однако установлена циркуляция и нетермофильных видов кампилобактеров: C.cryaerophila (6,42);, С.fetus spp.fetus (3,3%); C.hyointestinalis (2,2%).

2. Выявлена гетерогенность популяций кампилобактеров нетермофильных видов по большинству изученных признаков, включая чувствительность к антибактериальным препаратам и- адгезивную активность.

3. Изученные штаммы кампилобактеров характеризуются 45 спектрами антибйотйкорезйстбнтнос'фи'по 10 детерминантам. Уровень лекарственной резистентности штаммов зависит от -видовой ' принадлежности кампилобактеров, от источника и -места их выделения. ■

- 4. Наибольшая выраженность биологических свойств кампилобактеров (независимо от вида возбудителя) наблюдалась при культивировании при 37°С на кровяном питательном агаре Хоттингера с 1% глюкозы в атмосфере, -содержащей водород (газогенерирующие пакеты Кампи Бак, фирма BBL). •

. 5. Разработанный для кампилобактеров метод определения адгезивной активности показал наличие вирулентных свойств у не термофильных- видов кампилобактеров, а -также 'зависимость• степени выра^ женности этих свойств от характера источника выделения. Это свидетельствует о потенциальной эпидемиологической значимости нетер-

мофильных кампшобактеров.

6. Показана необходимость комплексного подхода к сценке вирулентных сбсйсте кампилсбактерсв с учётом дополнительных факторов (гемолитическая, ДЖагная и фссфатазная гистивностп).

7. Показатели биовароЕой принадлежности, лекарственной резистентности И'адгезиЕной активности могут служить зпидемиолсги-ческими маркерами для типирования циркулирующих в очагах штаммов нетермофильных кампшобактеров.

8. Предложенная схема внутривидовой дифференциации нетермофильных гсампилобактеров (спектр лекарственной резистентности и адгезивная активность) может быть использована в системе эпиднадзо-ра га кампилобактериозом.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Определение адгезивных свойсге грамотркиательных бактерий: Информ.методическое письмо / ГК СЗН РФ. Сост.:■ Л.Д.Мартинен-ко, Л.П.Землянкина, Е.Л.Черкасский, . ВЛ1Д1инаев, Н.З.Минаева, А.У.С Диалло - М., 1992 - 8 с.

2. МинаеЕ В.И., Минаева Н.З., Диалло А.У.С. Адгезивная активность штаммов кампшобактеров, выделенных из различных источников // Актуальные проблемы инфекц. патологии: Тез. докл. науч.-практ.Конф.- С.Петербург, 1993. - ч. I. т. С.47.

3. Определение адгезивной активности кампклобактеров к эритроцитам человека / В.И.Минаев, К.З.Минаева, А.У.С Диалло и др.// Бактериальные и вирусные инфекции: Ст.науч.тр. СМУ. - Саратов, .1993. - ч. I. - С.26-30.

4. Кампилобактериоз / К.З.Минаева, А.В.Горелов, М.А.Голоеи-ноЕа, А.У.С Диалло-// Информац.бюллетень "Пищевые зоонозы в России в 1990-1991 гг." - М., 1994. - С.30-35.