Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Патогенная и условно-патогенная микрофлора кишечника кур и эффективность нетрадиционных средств антибактериального действия

На правах рукописи

АРТЕМЬЕВА Татьяна Николаевна

ПАТОГЕННАЯ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННАЯ МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА КУР И ЭФФЕКТИВНОСТЬ НЕТРАДИЦИОННЫХ СРЕДСТВ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ.

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт- Петербург 2004

Работа выполнена в отделе микробиологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства.

Научный руководитель - заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Борисенкова Адель Наумовна

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор Данко Юрий Юрьевич

Кандидат ветеринарных наук Фогель Леонид Сергеевич

Ведущая организация -

ФГУ ВПО Костромская государственная сельскохозяйственная

академия

Зашита состоится 02 июля 2004 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГУ ВПО Санкт-Петербургская государственная академии ветеринарной медицины по адресу: 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВПО Санкт-Петербургская государственная академии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доцент

Узюмова О.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сосредоточение на ограниченных площадях большого поголовья кур и цыплят-бройлеров, применение многоярусных клеточных батарей, создание искусственного микроклимата в помещениях с птицей, использование в рационах нетрадиционных кормов - все это ведет к изменению микробиоценоза кишечника птиц. В связи с этим создается благоприятный фон для развития гастроэнтеритов алиментарного происхождения, длительных кишечных расстройств на фоне снижения естественной резистентности и иммунной реактивности организма больной птицы (Н.Ш.Сингариева, 1999; Р.Н.Коровин, 1995; А.Н.Борисенкова, 1999; М.А.Трунов, 2000; И.П.Степаненко, 2001).

При выборе способа борьбы с какой-либо инфекционной болезнью бактериальной этиологии, прежде всего обращают внимание на патогенные микроорганизмы (возбудители этих болезней), забывая о постоянном спутнике любого живого организма - условно-патогенной микрофлоре, которая представляет серьезную опасность для здоровья птицы и имеет огромное значение в возникновении и развитии болезни, оказывает влияние на экономические показатели птицехозяйств, обусловленные прямыми и косвенными потерями (М.А.Сидоров, В.В.Субботин, 2000; Э.Д.Джавадов, 2001, А.Н.Борисенкова, Т.Н.Рождественская, В.А.Чавгун, 2003).

С учетом этого весьма актуальным следует считать поиск эффективных и безопасных средств, усиливающих иммунную защиту, устойчивость к стрессам, стимулирующих обменные процессы в организме птиц, позитивно влияющих на кишечный биоценоз (Ю.В.Конопатов, 1992; В.И.Сапего, М.А.Ровин, 1999; И.П.Степаненко, 2001). В связи с этим остро встает проблема иеспецифической профилактики кишечных инфекций у птиц, направленной на поддержание и сохранение, формирование и коррекцию видового и численного состава резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Такими свойствами обладают иммунотропные препараты, изготовленные из специальных сортов меда, содержащие в высокой концентрации ферменты, флавоноиды, витамины, минеральные соли, органические кислоты и другие вещества, повышающие жизнедеятельность организма (Ю.В.Тулев, 1998,2001). Аспекты использования медовых иммунотропных препаратов в птицеводстве требуют предварительного изучении свойств данных препаратов. Необходимость обратить внимание на эти вопросы является очевидной, так как не только дополнит уже имеющиеся сведения о действии иммунотропных препаратов, но и будет способствовать их применению в промышленном птицеводстве. Таким образом, проблема изучения микробиологического статуса кишечника птиц и изучения различных свойств препаратов, приготовленных на основе меда, является актуальной и представляет научный и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить патогенную и условно-патогенную микрофлору кишечника птиц, выявить доминирующие виды микроорганизмов, изучить их биохимические и вирулентные свойства, исследовать антибактериальные свойства препаратов,

Для реализации данной цели были

вадачи: БИБЛИОТЕКА !

- изучить микрофлору кишечника птиц с использованием групповых проб помета в производственных условиях;

- провести исследование кишечника цыплят и кур при энтеритах с целью обнаружения возможного источника загрязнения мяса птицы и продуктов его переработки;

- определить наличие сульфитредуцирующих клостридий в мясе птицы механической обвалки и готовой продукции с учетом сортности;

- изучить антибактериальную активность препаратов, изготовленных на основе меда (апитулима и тулима) в отношении микрофлоры, выделенной из кишечника птиц и в отношении эталонных штаммов ряда патогенных микроорганизмов;

- для определения достоверных результатов и избежания однозначной их трактовки при изучении антибактериальных свойств препаратов, изготовленных на основе меда, рассчитать доверительные интервалы подавления роста микроорганизмов и изучить фармакологические свойства препаратов на лабораторных животных.

Научная новизна. Получены новые данные по микроэкологическому статусу кишечника бройлеров, цыплят и кур яичных пород. Выявлен широкий набор энтеробактерий и другой микрофлоры.

Впервые выделена 8а1топе11аЬоу18 тогЫйсаш, нехарактерная для содержимого кишечника птиц. Впервые из помета птиц выделена микрофлора рода ХепогЬаЬёш (сем. ЕМегоЬайепасеае). При массовых геморрагических энтеритах цыплят и кур из содержимого кишечника, слизистых оболочек и печени выделена С1.рег1М^еш. Установлена зависимость санитарно-микробиологи-ческих показателей колбасных изделий от наличия сульфитредуцирующих кло-стридий в сырье. Впервые изучены антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда - апитулима и тулима, в отношении микроорганизмов, выделенных из помета кур и референс-штаммов. Впервые при изучении антимикробных свойств применен математический метод расчета доверительного интервала на модели иммунотропных препаратов апитулима и тулима. Впервые изучены токсичность, пирогенность и безвредность вышеуказанных препаратов.

Практическая ценность работы. Выявлена доминирующая микрофлора кишечника кур. Установлена роль С1.регМ^еш в развитии геморрагических энтеритов кур. Выявлена взаимосвязь наличия сульфитредуцирующих клостридий в сырье и готовых колбасных изделиях. Установлены антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда в отношении кишечной микрофлоры цыплят и кур. Апробирована и предложена методика математического метода расчета доверительного интервала для определения антимикробных свойств препаратов. Учитывая антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда, нами проведены испытания апитулима и тулима на бройлерах в производственных условиях и получены положительные результаты.

Основные положения выносимые на защиту.

- микроэкологический статус кишечника цыплят и кур;

- зависимость санитарно-микробиологических показателей колбасных изделий от наличия сульфитредуцирующих клостридий в сырье;

- антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда -апитулима и тулима, в отношении кишечной микрофлоры птиц;

- применение математического метода расчета доверительного интервала для определения антимикробных свойств препаратов.

Апробация работы. Основные положения и результаты заслушаны на заседаниях Методического Совета отделов микробиологии и паразитологии ВНИВИП (1998-2001), Ученого Совета ВНИВИП (1998-2001), на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей и на Межрегиональных Ко ордина-ционных совещаниях специалистов птицеводства по ВНИВИП (1998-2001), на юбилейной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию ветеринарной науки в России (Санкт-Петербург, 1998), на конференции по птицеводству Национального комитета по сотрудничеству птицеводов России с Всемирной научной ассоциацией по птицеводству (Зеленоград, 1999), на семинарах «Современное производство конкурентоспособной мясной продукции» (Санкт-Петербургская Академия методов техники управления, ЛИТМУ, 2002-2003).

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, библиографического указателя литературы, приложения. Диссертация изложена в одном томе на 189 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 32 таблицами, 9 гистограммами, 6 рисунками, 5 диаграммами, 2 графиками. Список использованной литературы включает 317 источников, в том числе 72 иностранных авторов.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы

Работу проводили с 1997 по 2002 год в отделе микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института птицеводства (ВНИВИП), в бактериологическом отделе Государственного Учреждения Санкт-Петербургская городская ветеринарная лаборатория (ГУ ГВЛ), на двух птицефабриках. Часть работы выполнена на базе Российского Ордена Трудового Красного знамени научно-исследовательского института травматологии и ортопедии им. Р.Р.Вредена.

В работе использовало 283 культуры эптеробактерий, 17-стафилококка, 8 -стрептококка, 4-псевдоманады, 426-клостридий, выделенных из помёта цыплят и кур разного возраста, из содержимого кишечника и из трупов птицы, а также из мяса птицы и продуктов его переработки.

10 эталонных штаммов (референс-штаммов) нами получено из Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля ме-

дицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (в том числе культуры сальмонелл 3-х видов: SaLgallmarum, Sal.typhimurium, Sal.paratyphy A).

Изучение вирулентных свойств культур, выделенных из помета клинически здоровых кур и цыплят, а также из трупов птиц, проводили на белых мышах, куриных эмбрионах. Белым мышам массой 14,0-16,0 г вводили внутрибрюшин-но суспензию суточной агаровой культуры в дозе 500 млн. микробных клеток (0,5 мл), приготовленной на изотоническом растворе хлорида натрия по отечественному стандарту мутности 106 КОЕ/мл. Куриные эмбрионы заражали в хо-риоаллантоисную область (ХАО), путем введения суточной бульонной культуры сальмонелл в дозе 100 млн. микробных клеток.

Для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae из помета птиц использованы общепринятые методики.

Для идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, наряду с общепринятыми методами, широко использовали пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии - ПБДЭ (Biochemical differentiation plate of enterobacteria). Были применены отечественные тест-системы одноразового использования, содержащие 20 тестов.

Серологическую идентификацию эшерихий проводили путем обнаружения адгезивных антигенов согласно наставлению по применению агглютинирующих сывороток к адгедзивным антигенам эшерихий K88, K99,987Р, F41 и А^.

Выделение сальмонелл и определение их биохимических свойств осуществляли по стандартной методике. Серологическую идентификацию культур проводили согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике сальмонеллеза животных» (1990) с использованием диагностических агглютинирующих адсорбированных сальмонеллезных сывороток Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток.

Для выделения стафилококков нами использованы общепринятые методики. Для идентификации микроорганизмов рода Staphylococcus до вида, использовали пластины биохимические дифференцирующие стафилококки - ПБДС (Biochemical differentiation plate of staphylococci). Были применены отечественные одноразовые тест-системы, содержащие 17 тестов. Дополнительно в работе был использован набор агглютинационный для экспресс-диагностики стафилококка золотистого (Staphylococcus aureus), разработанный НИИ экспериментальной медицины РАМН, HПП «Аквапаст», Санкт-Петербург.

Для выделения стрептококков использованы общепринятые методики. Определение серологической группы стрептококков мы проводили с использованием набора антистрептококковых группоспецифических сывороток (А, В, С, G, D) и стандартных групповых антигенов.

Для выделения клостридий из трупов кур и цыплят, а также сульфитредуци-рующих клостридий из мяса птицы и продуктов его переработки использованы общепринятые методики и ГОСТы.

Для изучения антимикробных свойств апитулима и тулима был применен метод серийных разведений.

Обработку результатов проводили в соответствии с Государственным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

Биометрическую и статистическую обработку данных, полученных в ходе работы, проводили в соответствии с современной методической литературой с использованием вычислительной техники. Графическое оформление полученных результатов осуществляли при помощи ЭВМ (Intel Pentium), с применением программ «Statgraf», Microsoft office.

2.2. Результаты исследований 2.2.1 Изучение микроэкологического статуса кишечника цыплят и кур 2.2.1.1. Исследование помета птиц разного возраста в производственных

условиях

В первой серии исследований микрофлору кишечника птиц изучали используя прижизненный метод диагностики, а именно, путем бактериологического исследования групповых проб помета.

Исследования проводили на двух птицефабриках по производству яйца.

Бактериологическому исследованию было подвергнуто 90 проб помета от цыплят и кур-несушек промышленного стада, соответсвенно 71 и 19 проб.

Из групповых проб помета птиц были выделены культуры, являющиеся представителями 11-ти родов семейства энтеробактерий.

Из проб помета от 4-5-дневных цыплят выделены 9 культур E.coli, из которых у 4-х был обнаружен адгезивный антиген F41.5 культур, не имеющих адгезивных антигенов, не вызывали гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении. Одновременно с кишечной палочкой были выделены культуры Proteus vulgaris.

Из помета цыплят в возрасте 9-11 дней, а также из помета взрослой птиц выделены 17 культур E.coli (27,4%), с выявленным адгезивным антигеном F4i, и одна культура Proteus mirabilis. Кроме протея и кишечной палочкой выявлена другая микрофлора из семейства Enterobacteriaceae: Enterobacter agglomerans, Serratia rubideae, Enterobacter intermedius, в единичных случаях — Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Providencia stuartii, Shigella boydii. В 13 пробах выделены культуры Staphylococcus lentus. Все выделенные культуры были не патогенны для белых мышей.

На другой птицефабрике по производству яиц, где не применяли лекарственные препараты, из 13 проб помета от птицы 113-ти, 211-ти и 270-дневного возраста были выделены сальмонеллы группы C/Salm.bovis morbificans (68,42%).

Из всех 19 проб помета от взрослой птицы на данной птицефабрике выделены непатогенная кишечная палочка и Xenorhabdus nematophilus, в одной -Proteus vulgaris. Представители рода Xenorhabdus относятся к малоизученным, недавно описанным энтеробактериям.

Выделенные из помета культуры Serratia rubideae, Kluyvera cryocrescens, Shigella boydii, Xenorhabdus nematophilus, Enterobacter intermedius не являются

типичными представителями микрофлоры желудочно-кишечного тракта птиц. Полученные данные требуют продолжения исследований для определения роли вышеперечисленных микроорганизмов и установления их этиологического значения в инфекционной патологии птиц.

В 13-ти пробах помета от цыплят и кур-несушек промышленного стада были выделены культуры стафилококка, которые были отнесены к виду Staphylococcus lentus, не патогенному для белых мышей.

У кур-несушек промышленного стада выделяемая из помета микрофлора стабилизируется. Обнаружение культур E.coli составляет 100%, Proteus vulgaris 42,86%, Enterobacter agglomerans 18,37%. В единичных случаях обнаруживаются культуры Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Providencia stuartii, a также Staph.lentus.

Анализируя представленные данные можно сделать вывод, что во всех возрастных группах не зависимо от типа хозяйства преобладающей является микрофлора рода Escherichia (42%). Появление в помете цыплят раннего возраста условно-патогенных микроорганизмов, таких как бактерии рода Proteus, Staphylococcus свидетельствуют о нарушении микробиоценоза кишечника птицы.

2.2.1.2. Исследование микрофлоры тонкого отдела кишечника птицы

Следующим этапом исследований микроэкологического статуса кишечника птиц было изучение микрофлоры в содержимом тонкого отдела кишечника при убое птицы. Работу проводили на двух птицефабриках

Проведено две серии исследований. В первой серии исследовано 14 проб содержимого тонкого отдела кишечника цыплят 115 - дневного возраста.

Результаты исследований показали, что среди выделенных культур преобладает E.coli- 42,2%. Выделение патогенных микроорганизмов рода Salmonella составило 27%, а условно-патогенных (p.Enterobacter и p.Citrobacter)- 30,8%.

У 50% цыплят в содержимом тонкого отдела кишечника обнаружена Salmonella enteritidis. У 78,57% исследованных проб была выделена кишечная палочка, у 14,29% выявлен адгезивный антиген А^.У 50% исследованных проб, одновременно с кишечной палочкой были выделены культуры S.enteritidis, Ent.agglomerans, в одном случае - Citr.freundii.

Микрофлора, выделенная из тонкого отдела кишечника птиц аналогична микрофлоре, выделенной из помета, однако следует отметить, что ни в одной пробе из тонкого отдела кишечника культур протея и стафилококка выделено не было.

Во второй серии исследований изучение микрофлоры тонкого отдела кишечника птиц было проведено на птицефабрике мясного направления при массовых геморрагических энтеритах.

Было проведено микробиологическое исследование 24-х проб патологического материала от 3-х, 9-ти, 30-ти, 35-ти и 142-дневных цыплят. От каждого трупа исследовано по три пробы: содержимое кишечника, слизистые оболочки тонкого отдела кишечника, печень.

Из 7 проб (29,2%) были выделены культуры Cl.perfringens тип А, являющиеся возбудителем инфекционной энтеротоксемии (клостридиоза) животных и птиц. Тип токсина был установлен в реакции нейтрализации с использованием стандартных антитоксических сывороток.

Из 6 проб (25%) были выделены культуры гемолитического стрептококка (а-гемолиз). При серологической типизации с использованием антистрептококковых группоспецифических сывороток и стандартных групповых антигенов в реакции кольцепреципитации выделенные культуры отнесены к серогруппе Д, а с учетом культурально-биохимических свойств идентифицированы как Streptococcus faecalis, являющийся возбудителем энтерококкоза птиц.

Из одной пробы (содержимое кишечника) были выделены оба возбудителя.

Таким образом, в 58,4% проб патологического материала при массовых геморрагических энтеритах цыплят были выделены возбудители клостридиоза и энтерококкоза птиц.

2.2.2. Изучение условно-патогенной и патогенной микрофлоры в мясе птицы механической обработки и в готовой продукции

Зависимость наличия сульфитредуцирующих клостридий в готовой продукции (варенных колбасных изделиях) от наличия их в мясе птицы механической обвалки (сырье) изучена на одном из мясоперерабатывающих предприятий.

Согласно нормативной документации масса продукта, в которой не допускается наличие сульфитредуцирующих клостридий для вареных колбас, составляет 0,1г. Мясо птицы механической обвалки (кур, индеек) широко используется в рецептуре вареных колбасных изделий.

Согласно техническим условиям, в колбасах высшего сорта мясо птицы ме-хобвалки составляло 20-25%, первого и второго сортов 28-38% и 40-50% соответственно.

Количество сульфитредуцирующих клостридий определяли в ОД и в 0,01 г мяса птицы мехобвалки, поступающего на предприятие и в 0,1 г вареных колбасных изделий, в производстве которых было использовано это мясо.

Было исследовано 34 партии мяса птицы механической обвалки. В 28-и из них обнаружены сульфитредуцирующие клостридии.

В ходе исследования было выделено 313 культур микроорганизмов. Все они были отнесены к виду Clostridium perfringens. Результаты, полученные при исследовании мяса птицы механической обвалки, показали, что в 91,3% исследованных партий мяса птицы механической обвалки (93,4% проб) были обнаружены сульфитредуцирующие клостридии и только в 9,7% партий (6,6% проб) данная микрофлора отсутствовала.

Учитывая, что птица может быть носителем патогенных для людей серова-риантов сальмонелл, что показано и нашими исследованиями, и в соответствии с требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01, мы проводили исследования мяса птицы механической обвалки на наличие сальмонелл.

Результаты исследований показали, что в трех партиях (45 пробах) были обнаружены сальмонеллы. При серологической типизации одна из культур саль-

монелл была отнесена к группе В: S.chestcr; вторая - к группе И: S.braenderup; третья была отнесена к сальмонеллам редких групп.

Результаты бактериологического исследования птичьего мяса и изготовленных из него изделий показали, что колбасные изделия первого и второго сортов, приготовленные с добавлением мяса птицы механической обвалки в 0,1 г которого обнаружены сульфитредуцирующие клостридии, имеют значительную бактериальную обсемененность этими микроорганизмами: 80% и 96,6% соответственно.

Наличие клостридии в 0,01 г птичьего мяса является причиной микробного обсеменения всех изготовленных из него колбасных изделий независимо от сорта: 76,9%, 100% и 100% соответственно.

В результате проведенных исследований установлена прямая зависимость между обсеменностыо клостридиями продовольственного сырья и готовой продукции.

2.2.3 Изучение свойств препаратов, изготовленных на основе м е д а -апитулима и тулима 2.2.3.1. Изучение антимикробных свойств апитулима и тулима

Антимикробные свойства апитулима и тулима изучали на 30-ти штаммах различных микроорганизмов: 20 штаммов были выделены от птиц с различных птицефабрик Северо-Запада, 10 - получены из ВГНКИ им. Л.А. Тарасевича. В опыт были включены представители следующих семейств: Enterobacteriaceae-19 штаммов, в т.ч. сальмонелл - 7, кишечных палочек - 5, протея - 4, клебсиелл - 2, цитробактер - 1; семейство Micrococcaceae - 6, в т.ч. стафилококков - 5, стрептококков - 1; семейство Pseudomonadaceae - 5.

На первом этапе исследования определяли максимальное разведение препаратов, обеспечивающее подавление роста микроорганизмов по наличию или отсутствию роста культур в МПБ при добавлении апитулима и тулима в разведениях от 1/2 до 1/128. По результатам исследований минимальной подавляющей концентрацией для кишечных палочек, сальмонелл, кокковой микрофлоры, псевдомонад, клебсиелл является применение апитулима и тулима в разведении 1/16, а для протеев и цитробактеров - в разведении 1/8.

Дальнейшую работу поводили для получения более точных результатов исследования, увеличения предела обнаружения определяемого компонента, т.е. изменяя совокупность операций и правил исследования, старались обеспечить получение необходимых результатов исследования с гарантированной точностью. Количество микроорганизмов N в 1 см3 инокулюма вычисляли как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях.

Для удобства расчетов среднего результата мы объединили все исследуемые культуры в 7 групп: эшерихии, сальмонеллы, кокковая микрофлора, псевдомонады, протеи, клебсиеллы, цитробактеры. Для того чтобы определить достоверность результатов и избежать однозначной их трактовки, мы рассчитывали доверительные интервалы, которые характеризуют статистическое распределение микроорганизмов в образце.

Цельный апитулим, а так же цельный тулим обладают бактериостатическим действием, поэтому не участвовали в рассчетах доверительного интервала. Доверительный интервал представляет собой сумму и разность среднего арифметического М и среднеквадратического отклонения т. При подсчете колоний, выросших на чашках, велика вероятность случайных погрешностей, т.е. погрешностей, в проявлении которых не наблюдается какой-либо закономерности. Такие погрешности, как правило, неустранимы. Они вызывают рассеяние результатов при многократном определении величины при постоянных условиях, обуславливая различия в их последних значащих цифрах.

Доверительный интервал представляет собой интервал значений случайной погрешности, внутри которого с заданной вероятностью находится искомое (истинное) значение погрешности результата измерений.

Анализируя полученные данные можно сделать вывод о том, что препараты апитулим и тулим имеют сходные бактериостатические свойства, а именно: разведения препаратов от 1/32 и более не оказывают существенного бактерио-статического действия на микроорганизмы. Разведения 1/8 и 1/16 обладают значительным бактериостатическим действием. Так, если в 1 см3 инокулюма количество Е. coli без внесения "медового" препарата составляет порядка 3,0 х 105, то в инокулюме с добавлением апитулима в разведении 1/16 количество Е. coli в аналогичном объеме составляет порядка 1,0 х 104, т.е. 3,3%. Аналогичная картина наблюдается при действии разведений апитулима и тулима на сальмонеллы, псевдомонады, клебсиеллы. Количество кокковой микрофлоры в 1 см3 инокулюма без внесения "медового" препарата составляет порядка 2,0 х 105, а с добавлением апитулима в разведении 1/16-8x103, т.е. 4%; количество протея в 1 см3 инокулюма без внесения препарата составляет порядка 5,5 x 105, а с добавлением апитулима в разведении 1/16-2 х 103 т.е. 3,6%; количество цитро-бактера соответственно составляет 6,5 х105 и 3,3 х104, т.е. 5%.

Таким образом, препараты апитулим и тулим обладают антимикробным действием и требуют дальнейшего изучения с целью возможного использования их, для коррекции кишечного биоценоза.

2.2.3.2. Опыт применения апитулима в производственных условиях.

Опыт проводили на одной из птицефабрик в течение 60 дней на ограниченном поголовье цыплят (24 тыс.), из которых половину составляла контрольная группа. Цельный апитулим разводили водой 1:50 и назначали с кормом из расчета 1 мл на голову. Препарат применяли двукратно в 7-ми и в 14-дневном возрасте. Других препаратов антимикробного действия на протяжении всего периода исследования птица не получала и была клинически здорова.

Контролем эффективности апитулима было выделение патогенной кишечной палочки и сальмонелл из трупов павших цыплят и в помете. Из десяти трупов цыплят опытной и контрольной групп, павших в течении 7 дней до применения апитулима, были выделены культуры патогенной кишечной палочки сероваров О2О115-3 и 2 соответственно. После применения апитулима из 30 проб патологического материала от птицы опытной группы было выделено 4 культуры

патогенной кишечной палочки сероваров О2 и O115 (13,3%). В контрольной группе, при исследовании такого же количества патологического материала было выделено 12 культур патогенной кишечной палочки сероваров О1 О2 и О115 (40%) и 2 культуры S.enteritidis (6,6%). На 50-ый день наблюдения в пробах помета от птицы опытной группы патогенной микрофлоры обнаружено не было, а из помета птицы контрольной группы были выделены две культуры E.coli (О2) и одна - S.enteritidis.

Проверка достоверности различия результатов по критериям Стьюдента показала, что различие достоверно при уровне значимости 0,05 - для патологического материала |Z|>1,96 ^=2,56) и 0,1 - для помета ^|>1,64 ^=^89).

2.2.3.3. Определение токсичности, безвредности, пирогенности апитули-

ма и тулима

Были проведены испытания на токсичность, пирогенность, безвредность в экспериментальной лаборатории РНИИ травматологии и ортопедии им. Р.Р.Вредена.

Для определения острой токсичности препараты разводили 1:4 0,9%-ным физиологическим раствором, подогревали до 37 С и в объеме 0,5 мл вводили со скоростью 0,1 мл/сек, в хвостовую вену 10-и белым мышам: 5 - раствор апиту-лима, 5 - раствор тулима. Наблюдение за животными вели в течение 48 часов. Ни одной мыши ни в одной группе не погибло. Следовательно, при однократном введении больших доз лабораторным животным данные препараты не токсичны.

Далее исследование проводили на 30 белых крысах и 6 кроликах. Животные были разделены на 3 группы, одна из которых служила контролем. Препараты разводили в соотношении 1:10 в 0,9% растворе натрия хлорида, вводили внутримышечно в дозе 0,05 мл/кг в течение 7 дней. Результаты сравнивали на 1-ый, 10-й и 30-й день после последнего введения препарата. Наблюдение за животными на протяжении 30 дней не выявило внешних признаков токсического действия препаратов. Достоверного изменения морфологического состава крови и биохимических показателей в сыворотке крови после введения всех препаратов на 1-й и 30-й день не наблюдалось. Дегенеративных изменений клеток крови не обнаружено. После убоя животных на вскрытии патоморфологических изменений внутренних органов не обнаружено.

Лпитулим и тулим, разведенные 1:4 0,9%-ным физиологическим раствором, вводили в ушную вену кроликов в дозе 1,5+-0,1 мл/кг. В течение трех часов измеряли температуру тела животных. Изменения температуры не превышали норму, следовательно, препараты апирогенны.

Испытание апитулима и тулима на безвредность проведено на 4 морских свинках (по 2 на препарат). Каждой свинке вводили по 5,0 мл рабочего раствора препаратов подкожно (по 2,5 мл в оба бока). При наблюдении в течение 7 суток общих и местных реакций не обнаружено. Следовательно, данные препараты безвредны.

выводы

1. Анализ патогенной и условно-патогенной микрофлоры, выделенной из кишечника птиц в хозяйствах различного технологического направления при различной эпизоотической ситуации, позволил выявить следующие виды микроорганизмов: E.coli, Salm.bovis morbificans, Ent.agglomerans, Prot.mirabilis, Prot.vulgaris, Ent.intermedius, Cit.freundii, Kl.pneumoniae, Prov.stuartii, Ser.rubideae, Sh.boydii, Xen.nematophilus, Kl.cryocrescens, Staph.lentus. Доминирующими видами являются эшерихии и протеи, выделение которых составляет 42% и 24,5% соответственно.

2. При исследовании 19 групповых проб помета от птиц с птицефабрики, на которой, согласно технологическому процессу, антибиотики не применяются, выделено 13 культур Salm. bovis morbificans, нехарактерной для содержимого кишечника птиц. Из всех 19 проб помета птиц выделен вид Xenorhabdus nemat-ophilus (ceM.Enterobacteriaceae), не выделяемый ранее. Данный вид не обладал вирулентными свойствами.

3. Из содержимого тонкого отдела кишечника кур выделены Salm.enteritidis, E.coli, Ent.agglomerans, Cit.freundii. Доминирующими видами являются эшерихии и энтеробактеры, выделение которых составляет 42,3% и 27% соответственно.

Культуры кишечной палочки, имеющие адгезивные антигены F41 и А^ (26,03%) обладали выраженными вирулентными свойствами, в то время, как культуры, не имеющие адгезивными антигенами, не обладали вирулентными свойствами для белых мышей при внутрибрюшинном заражении.

4. При массовых геморрагических энтеритах цыплят и кур из содержимого кишечника, слизистых оболочек и печени выделены культуры Cl.perfringens и Strep. faecalis.

5. Из 34 партий мяса птицы механической обвалки в 25 г продукта были выделены 3 серовара сальмонелл: Salm. Chester, Salm. braenderup, Salm. редких групп. В 0,1 и 0,01 г продукта в 313 пробах были выделены сульфитредуци-рующие клостридии.

6. Санитарно-микробиологические показатели колбасных изделий зависят от наличия сульфитредуцирующих клостридий в сырье. При обнаружении суль-фитредуцирующих клостридии в 0,1 и 0,01 г мяса птицы механической обвалки, в 100% случаев исследованых вареных колбас низших сортов, изготовленных с использованием этого сырья, были обнаружены сульфитредуцирующие клост-ридии.

7. При изучении антибактериальных свойств апитулима и тулима установлено, что данные препараты в цельном виде обладают бактерицидными свойствами, а в разведении от 1/2 до 1/16 - бактериостатическими.

Методом серийных разведений определено максимальное разведение препаратов апитулима и тулима, обеспечивающее подавление роста микроорганизмов. Таким разведением для большинства исследованных культур является 1/4 для обоих вышеназванных препаратов.

При изучении бактериостатических свойств апитулима и тулима был применен метод определения доверительного интервала, т.е. определен интервал значений случайной погрешности, внутри которого с заданной вероятностью находится искомое (истинное) значение погрешности результата измерений. Доверительный интервал определен по двум препаратам (апитулиму и тулиму), для семи групп микроорганизмов (эшерихий, сальмонелл, протея, кокковой микрофлоры, псевдомонад, клебсиелл, цитробактеров), при разведении препаратов от 1/2 до 1/128.

8. Препараты, приготовленные на основе меда (апитулим и тулим) не токсичны, апирогенны, безвредны.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты наших исследований вошли в справочник «Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки», выпущенный издательством «КолосС» в 2002 году. В нем обобщена действующая нормативно-техническая документация по микробиологии мяса, яиц и продуктов их переработки, изложен порядок отбора проб и проведения их бактериологического анализа с использованием дифференциально-диагностических пластин для энтеробактерий и стафилококков, отработанный нами при выполнении диссертационной работы в разделе по идентификации культур, выделенных из помета и содержимого кишечника цыплят и кур.

2. Разработанные с нашим участием «Технические условия (ТУ)» на препараты апитулим и тулим согласованы с Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 07.10.2000 г.:

на апитулим ТУ 9325-007-00493361-00;

на тулим ТУ 9325-007-00493362-00.

«Наставления по применению апитулима и тулима в качестве иммуностимулирующих средств при бактериальных и вирусных болезнях телят, поросят и собак» утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 11 сентября 2000 г. Целесообразно дополнить их применением для птиц.

3. Для более точной и объективной оценки антибактериальных свойств препаратов использовать метод математического расчета доверительного интервала в соответствии с Государственным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 51446-99 «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Борисенкова А.Н., Артемьева Т.Н. Характеристика микрофлоры, выделенной из помета птиц в производственных условиях// Материалы конференции по птицеводству национального комитета по сотрудничеству птицеводов России с Всемирной научной ассоциацией по птицеводству. Зеленоград,

2000, С. 165.

2. Артемьева Т.Н. Опыт применения апитулима на цыплятах// Материалы межвузовской научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов. Санкт-Петербургская ГАВМ,

2001, С. 14-15.

3. Артемьева Т.Н. Антимикробные свойства апитулима и тулима// Материалы 8-й международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии». Санкт-Петербург, 2001, С. 46.

4. Артемьева Т.Н., Страхова У.И. Об испытании апитулима и тулима на токсичность// Материалы 8-й международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии». Санкт-Петербург, 2001, С.108.

5. Артемьева Т.Н. О микрофлоре мяса птицы и колбасных изделий// Актуальные проблемы ветеринарной медицины. Сборник научных трудов №133. Санкт-Петербург, 2001, С. 5.

6. Борисенкова А.Н., Артемьева Т.Н. Роль стрептококков и клостридий в этио-патогенезе желудочно-кишечных заболеваний бройлеров// Актуальные проблемы ветеринарной медицины. Сборник научных трудов №134. Санкт-Петербург, 2002, С. 25-26.

7. Артемьева С.А., Артемьева Т.Н. и др. Справочник. Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки. М., «КолосС», 2002,288 с.

Отпечатано в ООО «АкадемПринт». С-Пб. ул. Миллионная, 19 Тел.: 315-11-41. Подписано в печать 26.05.04. Тираж 100 экз.

№12 4 6 0

Сосредоточение на ограниченных площадях большого поголовья кур и цыплят-бройлеров, применение многоярусных клеточных батарей, создание искусственного микроклимата в помещениях с птицей, использование в рационах нетрадиционных кормов — все это ведет к изменению микробиоценоза кишечника птиц. В связи с этим создается благоприятный фон для развития гастроэнтеритов алиментарного происхождения, длительных кишечных расстройств на фоне снижения естественной резистентности и иммунной реактивности организма больной птицы (Н.Ш.Сингариева, 1999; А.Н.Борисенкова, 1999; М.А.Трунов, 2000; И.П.Степаненко, 2001; А.Н.Борисенкова, Р.Н.Коровин, Т.Н.Рождественская, О.Б.Новикова и др., 2003).

При выборе способа борьбы с какой-либо инфекционной болезнью бактериальной этиологии, прежде всего обращают внимание на патогенные микроорганизмы (возбудители этих болезней), забывая о постоянном спутнике любого живого организма - условно-патогенной микрофлоре, которая представляет серьезную опасность для здоровья птицы и имеет огромное значение в возникновении и развитии болезни, оказывает влияние на экономические показатели птицехозяйств, обусловленные прямыми и косвенными потерями (А.Н.Борисенкова, Т.Н.Рождественская, В.А.Чавгун, 1997; М.А.Сидоров, В.В.Субботин, Н.В.Данилевская, 2000; Э.Д.Джавадов, 2001; А.Н.Борисенкова, 2001).

Условно-патогенная микрофлора является обитателем организма здоровой и переболевшей птицы, многие микроорганизмы широко распространены и длительно сохраняются во внешней среде. Заселяя первоначально организм, микроорганизмы находятся в симбиотической связи с макроорганизмом, создавая на определенное время иммунологическое равновесие. Однако при стрессах, сопровождающихся ослаблением общего состояния организма и снижением его естественных защитных функций, «микробное давление» усиливается, что приводит к возникновению аутоинфекции, которая может протекать самостоятельно, приводя к массовому падежу птицы, особенно молодняка, или быть вторичным процессом (М.Умитжанов, 1993; А.С.Орешкин, В.В.Пономарев, 2000).

С учетом этого весьма актуальным следует считать поиск эффективных и безопасных средств, усиливающих иммунную защиту, устойчивость к стрессам, стимулирующих обменные процессы в организме птиц, позитивно влияющих на кишечный биоценоз (Ю.В.Конопатов, 1992; В.И.Сапего, М.А.Ровин, 1999; И.П.Степаненко, 2001). В связи с этим остро встает проблема неспецифической профилактики кишечных инфекций у птиц, направленной на поддержание и сохранение, формирование и коррекцию видового и численного состава резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Такими свойствами обладают иммунотропные препараты, изготовленные из специальных сортов меда, содержащие в высокой концентрации ферменты, флавоноиды, витамины, минеральные соли, органические кислоты и другие вещества, повышающие жизнедеятельность организма (Ю.В.Тулев, 19952001). Аспекты использования медовых иммунотропных препаратов в птицеводстве требуют рассмотрения ряда проблем: возможности коррекции кишечного биоценоза, коррекции иммунной, гормональной, ферментной и эндокринной систем, при предварительном изучении ряда свойств данных препаратов: токсичности, пирогенности, безвредности, антибактериальных свойств. Необходимость обратить внимание на эти вопросы является очевидной, так как не только дополнит уже имеющиеся сведения о действии иммунотропных препаратов, но и будет способствовать их применению в промышленном птицеводстве. Таким образом, проблема изучения микробиологического статуса кишечника птиц и изучения различных свойств препаратов, приготовленных на основе меда, является актуальной и представляет научный и практический интерес.

Цель работы - изучить патогенную и условно-патогенную микрофлору кишечника птиц, выявить доминирующие виды микроорганизмов, изучить антибактериальные свойства препаратов, изготовленных на основе меда. Для реализации данной цели были сформулированы следующие задачи:

- изучить микрофлору кишечника птиц с использованием групповых проб помета в производственных условиях;

- провести исследование кишечника цыплят и кур при энтеритах, с целью обнаружения возможного источника загрязнения мяса птицы и продуктов его переработки;

- определить наличие сульфитредуцирующих клостридий в мясе птицы механической обвалки и готовой продукции с учетом сортности;

- изучить антибактериальную активность препаратов, изготовленных на основе меда (апитулима и тулима) в отношении микрофлоры, выделенной из кишечника птиц и в отношении эталонных штаммов ряда патогенных микроорганизмов;

- для определения достоверных результатов и избежания однозначной их трактовки при изучении антибактериальных свойств препаратов изготовленных на основе меда, рассчитать доверительные интервалы подавления роста микроорганизмов и изучить их фармакологические свойства на лабораторных животных.

Научная новизна.

Получены новые данные по микроэкологическому статусу кишечника бройлеров, цыплят и кур яичных пород. Выявлен широкий набор энтеробак-терий и другой микрофлоры.

Впервые выделена Salmonella bovis morbificans, нехарактерная для содержимого кишечника птиц. Впервые из помета птиц выделена микрофлора рода Xenorhabdus (сем. Enterobacteriaceae). При массовых геморрагических энтеритах цыплят и кур из содержимого кишечника, слизистых оболочек и печени выделена Cl.perfringens. Установлена зависимость санитарномикробиологических показателей колбасных изделий от наличия сульфитре-дуцирующих клостридий в сырье. Впервые изучены антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда — апитулима и тулима, в отношении микроорганизмов, выделенных из помета кур и референс-штаммов. Впервые при изучении антимикробных свойств применен математический метод расчета доверительного интервала на модели иммунотропных препаратов апитулима и тулима. Впервые изучены ' острая и . хроническая: ■ токсичность, пирогенность и безвредность вышеуказанных препаратов.

Практическая значимость.

Выявлена доминирующая микрофлора кишечника кур. Установлена роль Cl.perfringens в развитии геморрагических энтеритов кур. Выявлена взаимосвязь наличия сульфитредуцирующих клостридий в сырье и готовых колбасных изделиях. Установлены антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда в отношении кишечной микрофлоры цыплят и кур. Апробирована и предложена методика математического метода расчета доверительного интервала для определения антимикробных свойств препаратов. Учитывая антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда, нами проведены испытания апитулима и тулима на бройлерах в производственных условиях и получены положительные результаты. Основные положения выносимые на защиту:

- микроэкологический статус кишечника цыплят и кур;

- зависимость санитарно-микробиологических показателей колбасных изделий от наличия сульфитредуцирующих клостридий в сырье;

- антимикробные свойства препаратов, изготовленных на основе меда -апитулима и тулима, в отношении кишечной микрофлоры птиц;

- математический метод расчета доверительного интервала для определения антимикробных свойств препаратов.

Апробация работы. Основные положения и результаты заслушаны на заседаниях Методического Совета отделов микробиологии и паразитологии ВНИВИП (1998-2001), Ученого Совета ВНИВИП (1998-2001), на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей и на Межрегиональных Координационных совещаниях специалистов птицеводства по ВНИВИП (19982001), на юбилейной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию ветеринарной науки в России (Санкт-Петербург, 1998), на конференции по птицеводству Национального комитета по сотрудничеству птицеводов России с Всемирной научной ассоциацией по птицеводству (Зеленоград, 1999), на семинарах «Современное производство конкурентоспособной мясной продукции» (Санкт-Петербургская Академия методов техники управления, ЛИТМУ, 2002-2003).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, библиографического указателя литературы, приложения. Диссертация изложена в одном томе на /Я9 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 32 таблицами, 9 гистограммами, 6 рисунками, 5 диаграммами, 2 графиками. Список использованной литературы включает 317 источников, в том числе 72 иностранных авторов.

-1524. ВЫВОДЫ

1. Анализ патогенной и условно- патогенной микрофлоры, выделенной из кишечника птиц в хозяйствах различного технологического направления при различной эпизоотической ситуации, позволил выявить следующие виды микроорганизмов: E.coli, Salm.BOvis morbificans, Ent.agglomerans, Prot.mirabi-lis, Prot.vulgaris, Ent.intermediusr, Cit.freundii, Kl.pneumoniae, Prov.stuartii, Ser. rubideae, Sh.boydii, Xen.nematophilus, Kl.cryocrescens, Staf.lentus. Доминирующими видами являются эшерихии и протеи, выделение которых составляет 42% и 24,5% соответственно от числа всех видов выделенной микрофлоры.

2. При исследовании 19 групповых проб помета от птиц с птицефабрики, на которой, согласно технологическому процессу, антибиотики не применяются, выделено 13 культур Salm.bovis morbificans, нехарактерной для содержимого кишечника птиц. Там же, из всех 19 проб помета птиц выделен вид Xenorhabdus nematophilus (сем. Enterobacteriaceae), не выделяемый ранее. Данный вид не обладал вирулентными свойствами по отношению к лабораторным животным.

3. Из содержимого тонкого отдела кишечника кур выделены Salm.enteritidis, E.coli, Ent.agglomerans, Cit.freundii. Доминирующими видами являются эшерихии и энтеробактеры, выделение которых составляет 42,3% и 27% соответственно. Культуры кишечной палочки, имеющие адгезивные антигены F41 и А20 (26,03%) обладают выраженными вирулентными свойствами, в то время, как культуры не обладающие адгезивными антигенами, в нашем случае были невирулентны для белых мышей при внутрибрюшинном заражении. В тонком отделе кишечника клинически здоровой птицы гнилостной микрофлоры (протея) не обнаружено, в то время, как из помета цыплят и кур выделение протея составляет 24,5%.

4. При массовых геморрагических энтеритах цыплят и кур из содержимого кишечника, слизистых оболочек и печени выделены Cl.perfrindens и Strep, faecalis.

-1535. Из 34 партий мяса птицы механической обвалки в 25 г продукта были выделены 3 серовара сальмонелл: Salm.chester, Salm.braenderup, Salm. редких групп. В 0,1 и 0,01 г продукта в 313 пробах были выделены сульфитредуцирующие клостридии.

6. Санитарно-микробиологические показатели колбасных изделий зависят от наличия сульфитредуцирующих клостридий в сырье. При обнаружении сульфитредуцирующих клостридий в 0,1 и 0,01 г мяса птицы механической обвалки, в 100% случаев исследованых вареных колбас низших сортов, изготовленных с использованием этого сырья, также были обнаружены сульфитредуцирующие клостридии.

7. При изучении антибактериальных свойств апитулима и тулима установлено, что данные препараты в цельном виде обладают бактерицидными свойствами, а в разведении от 1/2 до 1/16 - бактериостатическими.

Методом серийных разведений определено максимальное разведение препаратов апитулима и тулима, обеспечивающее подавление роста микроорганизмов. Таким разведением для большинства исследованных культур является 1/4 для обоих вышеназванных препаратов.

При изучении бактериостатических свойств апитулима и тулима был применен метод определения доверительного интервала, т.е. определен интервал значений случайной погрешности, внутри которого с заданной вероятностью находится искомое (истинное) значение погрешности результата измерений. Доверительный интервал определен по двум препаратам (апиту-лиму и тулиму), для семи групп микроорганизмов (эшерихий, сальмонелл, протея, кокковой микрофлоры, псевдомонад, клебсиелл, цитробактеров), при разведении препаратов от 1/2 до 1/128.

8. Препараты, приготовленные на основе меда (апитулим и тулим) не токсичны, апирогенны, безвредны.

- 154

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты наших исследований вошли в справочник «Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки», выпущенный издательством «КолосС» в 2002 году. В нем обобщена действующая нормативно-техническая документация по микробиологии мяса, яиц и продуктов их переработки, изложен порядок отбора проб и проведения их бактериологического анализа с использованием дифференциально-диагностических пластин для энтеробактерий и стафилококков, отработанный нами при выполнении диссертационной работы в разделе по идентификации культур, выделенных из помета и содержимого кишечника цыплят и кур.

2. Разработанные с нашим участием «Технические условия (ТУ)» на препараты апитулим и тулим согласованы с Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 07.10.2000 г.: на апитулим ТУ 9325-007-00493361-00; на тулим ТУ 9325-007-00493362-00.

Наставления по применению апитулима и тулима в качестве иммуностимулирующих средств при бактериальных и вирусных болезнях телят, поросят и собак» утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 11 сентября 2000 г. Целесообразно дополнить их применением для птиц, предварительно разведя препараты изотоническим раствором хлорида натрия 1:50 в расчете 1 мл на голову с кормом, двукратно в 7-ми и 14-ти дневном возрасте.

3. Для более точной и объективной оценки антибактериальных свойств препаратов использовать метод математического расчета доверительного интервала в соответствии с Государственным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 51446-99 «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

-155