Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Оценка иммунитета у свиней, привитых вирус-вакциной, против болезни Тешена и усовершенствование способаконтроля вакцины.

КАБІНЕТ МІНІСТРІВ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Р Г б ОД На правах рукопису

, , . • СОРОКА Віктор Іванович

ОЦІНКА ІМУНІТЕТУ У СВИНЕЙ, ЩЕПЛЕНИХ ВІРУСВАКЦИНОЮ ПРОТИ ХВОРОБИ ТЕШЕНА ТА УДОСКОНАЛЕННЯ СПОСОБУ КОНТРОЛЮ ВАКЦИНИ

16.00.03 — ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія, мікологія та імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Київ — 1996

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в інституті сільськогосподарської мікробіології УААН.

Науковий керівник — доктор ветеринарних наук, академік УААН В. П. Романенко

Офіційні опоненти:—доктор ветеринарних наук, професор

В. П. Литвин.

' — доктор ветеринарних наук, ,

В. А. Прискока

Провідна організація — інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.

Захист дисертації відбудеться 28 лютого 1996 р. о 12 год. на засіданні спеціалізованої ради Д 01.05.10 при Національному аграрному університеті за адресою:

252127, КиїВ'127, вул. Потєхіна, № 16, учбовий корпус 12, аудиторія 412.

Запрошуємо взяти участь в обговоренні дисертації при її захисті або надіслати відгук на автореферат за адресою: 252041, Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, НАУ.

Сектор захисту дисертацій.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці університету.

Автореферат розіслано « » січня 1996 року.

Вчений секретар

спеціалізованої ради .

доктор ветеринарних наук

В. А. Бортнічук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією із небезпечних хвороб свиней, яка характеризується негнійним енцефаломієлітом, парезами і паралічами, являється ензоотичний енцефаломієліт (хвороба Тешена). З 1929 року,коли вона вперше була виявлена в Чехословаччині (A. Klobouk, 1933) , хвороба поширилась на ВСІ континенти світу (S. Samol, 1161; ¿.О. Betts, ІЧ'Ч; Mettanu, 1986). На території бувшого СРСР вперше хворобу Тешена встановив в 1971 році в Закарпатській області України В, П. Романенко. В послідуючі роки вона зареєстрована в інших областях України та країнах СНД. При гострій формі хвороби гине близько 70-90і0/о захворів-ших тварин. Економічні.збитки, які наносяться господарствам цим захворюванням, обчислені в цінах до 1990 року, складають сотні тисяч карбованців (В. П. Романенко, 1974).

До 1979 року для вакцинації свиней в Україні використовували інактивовану вакцину чехословацького виробництва, яка при дворазовому введенні тваринам забезпечувала несприйнятливість до вірусу хвороби лише протягом чотирьох місяців. В зв’язку з цим потрібні були наукові пошуки більш ефективних, вітчизняних препаратів. В результаті по-слідуючих досліджень проти цієї хвороби співробітниками .інституту сільськогосподарської мікробіології УААН

В. П. Романенко і О. Г. Прусс була розроблена культураль-на вірусвакцина. Після чого постало завдання більш всебічного наукового обгрунтування її застосування в практиці ветеринарної медицини. В зв’язку з цим ми вважали за необхідне провести вивчення основних закономірностей формування иоствакцинального імунітету у свиней щеплених цією вакциною. Особлива увага була зосереджена на дослідженнях ступеня імунологічної реактивності організму свиней на введення вакцини, результати яких визначають найбільш раціональне і ефективне її використання: визначені дози вакцини та схеми імунізації тварин, виявленні строків формування та тривалості імунітету. .

З

Мета і завдання досліджень. Метою наших досліджень було вивчення основних закономірностей формування пост-вакцинального імунітету у.свиней, щеплених вірусвакцішою із штаму «Перечинський-642». '

Для досягнення цієї мети були поставлені слідуючі завдання:

— розробити методику оцінки Імуногенності вірусвакцини, визначити дозу та схему імунізації свиней;

— визначити строки формування та тривалість імунітету;

— вивчити динаміку колостральних антитіл і їх вплив на антигенну активність вакцини, динаміку рівнів лейкоцитів, Т- і В-лімфоцитів та вірусовиділення;

— визначити строк придатності та удосконалити спосіб контролю, вірусвакцини.

Наукова новизна. Вивчені основні властивості вірусвакцини із штаму «Перечинський-642». яка була вперше розроблена в СРСР. В результаті чого визначено найбільш оптимальну дозу вакцини та схему імунізації свиней. Встановлено початок формування, завершення та тривалість поствакци-нального і колострального імунітету у щеплених свиней та народжений від імунних свиноматок поросят. Показано захисний ефект вакцини для поросят різного віку та вплив материнських антитіл на антигенну активність вірусвакцини.

Встановлено, що вакцинний вірус приживляється в організмі щеплених тварин, періодично виділяється з фекаліями і передається при контакті не вакцинованим поросятам

Вперше пропонується контроль вірусвакцини на імуно-генність та специфічність здійснювати лише по матриксній розплодці штаму «Перечинський-642» замість перевірки на поросятах кожної п’ятої серії вакцини.

Практична цінність. Вивчення основних закономірностей формування поствакцинального імунітету у свиней щеплених вірусвакциною, дозволило найбільш раціонально і ефективно застосувати вакцину в практиці ветеринарної медицини, внести зміни і доповнення в ТУ та інструкцію по виготовленню та контролю вірусвакцини.

Контроль вірусвакцини по матриксній розплодці вакцинного штаму «Перечинський-642» дозволяє спростити спосіб, скоротити строки та знизити собівартість контролю вірусвакцини без погіршення якості препарату. ^ .

Запропоновано стандартний вірулентний штам «Черні-

гівський-2372» Euterovlrus suls-1 №28.6/5 ВДНКІ (Авторське свідоцтво № 1747487) для оцінки імуногенності та специфічності вірусвакциии.

Рівень реалізації та впровадження результатів досліджень. Результати досліджень використані в настанові по застосуванню живої культуральної вірусвакциии проти ензоотичного енцефаломіеліту (хвороби Тешена) свиней із штаму «Перечинський-642», в рекомендаціях по діагностиці_та захо: дах боротьби з ензоотичним енцефаломієлітом (хворобою Тешена) свиней (Київ, 1992), »при внесенні змін і доповнень в ТУ та інструкцію по виготовленню та контролю вірусвак-цини, а вірулентний штам «Чернігівський-2372» використовується для оцінки імуногенності та специфічності вірусвакциии.

Апробація та публікація результатів досліджень. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідались на річних наукових конференціях {1984-1985 pp.) та засіданнях Вченої Ради (1986-1994 pp.) Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, на науково-в'иробничій республіканській конференції «Повышение эффективности ветеринарного обеспечения промышленного свиноводства» (м. Київ, 1987 p.), на Республіканській конференції «Ветеринарная медицина: экономические, социальные и экологические проблемы» (м. Харків, 1990 р.), на науково-практичній конференції «Біотехнологія ветеринарних препаратів» (м. Харків, 1993 р.), на І установчому (VIII) з’їзді українського мікробіологічного товариства (м. Одеса, 1993 p.), на Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (м. Львів, 1994 p.). По темі дисертації опубліковано 20 наукових робіт.

Структура та об'єм дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, викладення результатів власних досліджень, обговорення результатів дослід-женнь, висновків та практичних пропозицій, списку літератури і додатку. Робота викладена на 135 сторінках машинописного тексту,- ілюстрована 24 таблицями та 27 рисунками. Список цитованої, літератури складається з 456 найменувань, в тому числі 241 на іноземних мовах. В додатку наведено З документи.

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових результатів, що виносяться на захист. Особистий внесок дисертанта в виконання.роботи полягає в самостійному виконанні методичної, експериментальної роботи та проведенні вірусологічних, серологічних, імунологічних та гематологічних до-

сліджень. , ■

На підставі аналізу результатів експериментів та співставлений їх з даними літератури дисертантом сформульовані такі положення, що виносяться на захист: s — методика оцінки імуногенності та специфічності ві-русвакцини; • .

■ — визначення дози та схеми імунізації свиней;

— визначення строків формування, тривалості загального і колострального імунітету та, придатності вакцини;

— доцільність ревакцинації поросят, щеплених у ранньому віці; „■

— залежність між стійкістю свиней до зараження пато- • генним штамом вірусу і титрами посгвакцянальних вірус-нейтралізуючих антитіл;

— удосконалення способу контролю вірусвакцини.

Методологія, методи досліджень. Гіперимунну сироватку до вірусу хвороби Тешена готували на конях, застосовую-, чи схему імунізації, розроблену у відділі вірусології та імунології тварин. '

Титрування сироваток крові, молозива (молока) та ти-пування- виділених вірусів проводили в реакції нейтралізації вірусу на перещеплюваній культурі клітин лінії СНЕВ по загальноприйнятій методиці.

Імуногенність та специфічність вірусвакцини визначали шляхом інтрацеребрального зараження свиней стандартним вірулентним штамом «Ч е р н і г і в'с ь к и й - 2 3 7 2» в дозі

0.4-jo2 25 лд50 та титрування сироваток крові на наявність специфічних віруснейтралізуючих антитіл.

Відносну і абсолютну кількість Т- і В-лімфоцитів в пе-риферийній крові поросят визначили відповідно методами спонтанного та комплементарного розеткоутворення з еритроцитами барана за методиками В. І. Собка, В. Г. Квачова (1987) і ,Г. Фрімеля (1987) в нашій модифікації.

Гематологічні дослідження (визначення лейкоцитів та виведення лейкоцитарної формули) проводили по методиці Р. П. Золотницької (1987). .

Для статистичної обробки результатів вірусологічних досліджень застосували методику Ріда та Менча (1938), серологічних — Т. С. Оайдулдіна (1981), гематологічних —

1. О. Ойвіна (1960), кореля'ційний аналіз здійснювали згідно

посібника Г. Ф. Лакїна (1980). _ •

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Оцінка імуногенності вірусвакцини. Для цього спочатку було одержано 4 епізоотичних штами вірусу хвороби Тешена свиней: «Чернігівський-2372»; «Житомирський-157 Ь- «Корю-ківський-2615» та «Малинський-1730», ідентичних референт ному штаму Konratice enterowirus si-is-1 Найбільшу інфе^ ційну активність із них проявив штам «Чернігівський-237Я» Один мілілітр вихідного матеріалу цього штаму вміщував 4467 летальних і 10000 інфікуючих доз. Крім того в інокульованих цим штамом тварин в більшій мірі простежувалась залежність зараження від дози. У поросят заражених штамом «Чернігівський-2372» відмічались відносно короткий інкубаційний період (7-10 діб) і характерні для класичної cbop-ми Тешена свиней клінічні ознаки хвороби. Тому цйй штам

■ і був відібраний нами для оцінки імуногенності рірусдакци-ни.Штам депонований в колекції мікроорганізмів бувшого Всесоюзного державного науково-контрольного інституту ветеринарних препаратів, реєстраційний номер 286/5 і на нього одержано Авторське свідоцтво номер 1747487'від 15.03.1992 року.

Придатність штаму «Чернігівський-2372» для перевірки імуногенних властивостей вірусвакцини визначали на 12-ти поросятах 3-місячного віку, імунізованих трьома способами-дворазово внутрішньом’язово по 1см3, одноразово внутріш-ньом’язово.та інтраназально по 2 см3, одноразово інтрацере-брально і інтраназально по 1 та 2 см3. Штам для зараження брали в дозі 0,4-102 25ЛДбо.

Ь результаті встановлено, що при вибраній нами дозі зараження, вакцина, не дивлячись на різну схему вакцинації, захищала щеплених тварин від патогенного вірусу. При цьому метод внутрішньом’язового введення вакцини не поступався перед іншими методами.

Таким чином, методика оцінки імуногенних властивостей вірусвакцини стандартним штамом «Чернігівський-2372» Enterovirus suis-l №■ 286/5 В ДНК І в дозі 0,4 ■ 102 25 ЛД50 в цілком придатною.

Визначення дози та схеми вакцинації. Для визначення оптимальної дози вакцини і кратності її введення вакцинували по 6-8 поросят (10 дослідних груп). Контрольну (11-ту) не щепили. Тварин щепили одно-, дво- та триразово в дозах

0,5; 1,0; 2,0; 3,0 та 5,0 см3. При дворазових ін’єкціях вірус-

вакцину- вводили з інтервалом 14 діб, а при триразових — через 7 діб. Заражения проводили через 30-37 діб після першого введеная вакцини.

, Як показали .дослідження, в усіх тварин .відмічалась се-роконверсія. Але у поросят, щеплених .-різними-дозами'Вакцини одноразово,, титри - антитіл становили в цілому 1:49(+1,4%), а у щеплених дво- та триразово 1:91±2,1%. (Р<0,001). .

В-той же час величина об’єму, або доза препарату, суттєвого впливу на титри антитіл не чинила. При одноразовому введенні поросятам вірусвакцини в дозах 1,0; 2,0; 3,0 та 5,0 см3 титри антитіл через 21-30 • днів були відповідно 1:52 (+39,5;—28,2%); 1:52 (+56,9;—36,3 %); 1:56(+71,1;

—41,6%) та 1:104 (+75,3;—42,8%); при дворазовому —

і:158(+11,7;—10,4%); 1:79(+23,1;—18,7%); 1:128(+15,7;

—13,5%) та 1:84(+22,3-18,2%).

Така ж закономірність встановлена і при визначенні стійкості щеплених тварин до зараження. Якщо серед поросят, вакцинованих -дво- і триразово, не було випадків захворювання та загибелі, то при одноразовому введенні вакцини ефективність захисту становила 16,7—66,7%.

Із результатів дослідів виходить, що одноразове щепле-пня2,5—3,5 — місячних поросят вірусвакциною в дозах 1,0; 2,0;!3,0 та 5,0 см3 не створює в усіх щеплених тварин .несприйнятливості до зараження вірулентним вірусом, тоді як дворазове щеплення.в дозі 1,0 см3 створює иовнин.імунологіч-ний захист.

З метою встановлення оптимального інтервалу між- щепленнями, було використано 14 поросят, яких розділили на

4 дослідні групи (по 3-є поросят) і контрольну • (2-е поросят). Дослідних тварин вакцинували дворазово в дозі 1 см3, з інтервалами 7, 14, 21 та ЗО діб. Контрольних .не щепили. ,

Найбільш виражену гуморальну відповідь відмічали у поросят, щеплених з - інтервалами 14 та 21 діб (відповідно 1:111+26,6;—21,2% та. 1:104+20,6;—17,1%), в той час як _у поросят, щеплених з інтервалом 7 та ЗО діб, вона була майже в 2 рази меншою (1:60+36,6;—26,8% і 1:64+16,5;—14,2%).

.При. цьому у тварин вакцинованих з інтервалом 14 діб вона була ліайвищою. .

При випробуванні напруженості імунітету інтрацере-бральним зараженням встановлено, що поросята, щеплені з інтервалом 7 діб,-виявились.всі сприйнятливими до патоген-

ного штаму вірусу, вакциновані з інтервалом ЗО діб —одне

13 трьох. При інтервалах між щепленнями 14 і 21 днів захист

був постійно 100%-ним. .

Отже, найбільш раціональним і оптимальним застосуванням вірусвакцини, є дворазове щеплення свиней в дозі 1 см3, з інтервалом 14 діб. ’

Строки формування імунітету. Для вивчення строків утворення поствакцинальних віруснейтралізуючих антитіл використано 17 серонегативних 2,5-місячних поросят, із яких 10 вакцинували внутрішньом’язово, дворазово з інтервалом

14 діб, в дозі 1,108 ТЦД50/см3, а 3 інтрацеребрально одноразово в тій же дозі, 4 залишили для контролю нещепленими.

В результаті було встановлено, що через 3 доби відбулося чотири-, восьмикратне збільшення антитіл у 20% щеплених в'нутрішиьом’язово поросят, а через 4 доби ще у 30% тварин. На 5-ту добу відмічено 4-32-х кратне збільшений рівнів антитіл у решти 50% тварин. Через місяць після щеплення середній титр антитіл склав у них 1:274+24,0;—19,4%.

У поросят, яким вакцина була введена інтрацеребрально, динаміка утворення антитіл в цілому була схожою і різниця, між титрами антитіл у них була статистично недостовірною (Р >0,5).

Для визначення строків формування загального імунітету, нами був поставлений дослід на п’яти групах 3-місячних поросят (по 3-є поросят в групі). Поросят 1-4 груп вакцинували дворазово в дозі 1 см3 з інтервалом 14 діб, а 5-ту залишили контрольною. Тварин першої групи заражали через 7 діб після імунізації, другої — через 14 діб, третьої — через 21 -ну добу і четвертої — через 28 діб. Поросят контрольної групи заражали одночасно з поросятами четвертої групи.

Дослідження показали, що в усіх щеплених поросят спостерігалась сероконверсія. Незалежно від строку зараження, серед вакцинованих поросят, не було відмічено клінічних ознак хвороби Тешена (на протязі 30-ти діб), тоді як контрольні поросята захворіли і загинули.

Таким чином, у щеплених поросят віруснейтралізуючі антитіла в крові з’являються на 3-5-ту добу після першого введення вакцини, а повний імунітет створюється на 7-му добу після щеплення.

Тривалість імунітету. Тривалість імунітету вивчали у одноразово і дворазово щеплених свиней. З цією метою було

вакциновано 268 поросят різного віку та 150 свиноматок.

Для з’ясування можливості застосування одноразового щеплення, в двох господарствах Житомирської області імунізували 127 поросят п’яти вікових груп (1 доба, 2тижні, 1,2 та 3 місяці) від леімунних свиноматок в дозі 1 см3. Для.вивчення тривалості поствакцинального імунітету у дворазово щеплених тварин, вакцинували 129 поросят таких же вікових груп, як і при одноразовому щепленні. Для вивчення впливу на тривалість імунітету іншої дози вакцини, вакцинували дворазово з інтервалом 14 діб в дозах 1 • 109 ТЦД5о/см3 та 1 і 2-109 ТЦД50/см3 по четверо 3-місячних поросят. Для визначення гіерсистенції віруснейтралізуючих антитіл в організмі щеплених свиней на протязі 2-х років, імунізували дворазово в дозі 1 см3 150 свиноматок. •

Як і в попередніх дослідах в усіх поросят відмічалась сероконверсія. Але, якщо інтенсивність імунологічних змін у щеплених тварин, пов’язаних з утворенням віруснейтралізуючих антитіл, в цілому чітко не корелювала' з їх віком та кратністю введення вакцини, то імунний захист свиней від зараження вірулентним вірусом мав пряму залежність від кратності вакцинації. Суттєву різницю в титрах антитіл відмічали тільки у свиней, щеплених в одноденному віці. Так, у тварин, щеплених одноразово, максимального рівня, причому порівняно невисокого, титри антитіл досягли черёз

4 місяці після вакцинації (1:39+41,1;—29,3%) і вже через б місяців почалося зниження їх концентрації. В середньому рівень антитіл становив у них 1:26(+8,7;—8,0%) і був самим нижчим серед решти вікових груп тварин. У дворазово щеплених свиней, рівень антитіл через місяць був майже в 2 рази вищим в порівнянні з одноразово щепленими тваринами Найбільшу концентрацію антитіл відмічено через 3 місяці, тобто на місяць раніше, ніж у попередньому досліді. Середній титр антитіл становив у них 1:49(+8,7;—8,0%), що на 53% вище в порівнянні з одноразово вакцинованими Р<0,001). Титри ж антитіл у одно- та дворазово .щеплених свиней інших вікових груп достовірно не відрізнялись (Р >0,05; Р >0,1; Р = 0).

Результати зараження показали, що у поросят, щеплених одноразово в одноденному- віці, імунологічний захист був ЕІдсутнім. Поросята, вакциновані у двотижневому і місячному віці виявилися стійкими до зараження на протязі трьох місяців. Свиней, щеплених у 2- та 3-місячному віці,

було захищено протягом року відповідно 50 і 12,5%. В результаті дворазової вакцинації тварин, стійкий імунітет на протязі 9-ти місяців досліду був більше, як у половини свиней, щеплених в одноденному віці, у 100% тварин, щеплених у двотижневому віці. Протягом 12-ти місяців було захищено 75% свиней,'щеплених у місячному віці. Стійкими на протязі року виявилися . усі тварини, щеплені у 2- та 3-місяч-ному віці.

У свиней, дворазово вакцинованих у 3-місячному віці по 1 та 1 і 2 см3, титри антитіл в середньому за 12 місяців були теж майже однаковими і становили відповідно 1:64 (+ 20,6;—17,1%) та 1:60 (+10,2;—9,3%). Визначення напруженості імунітету показало 100%-ну їх стійкість незалежно від дози вакцини.

У дворазово щеплених в дозі 1 см3 свиноматок величина середнього титру специфічних віруснейтралізуючих антитіл через 20 місяців становила 1:60(+32,9;—24,8%), через 24 місяці Л:29(+21,4;—17,6%), а за весь період спостереження 1:69 (±0,7%). ... .

Таким чином, не дивлячись на наявність в сироватках крові віруснейтралізуючих антитіл, одноразове щеплення поросят не створює необхідного імунного захисту, в той час, як дворазова імунізація 2- і 3-місячних поросят забезпечує захист тварин ьід захворювання на протязі 12-ти місяців, а , у свиноматок збереження антитіл до 2-х років. Дворазове щеплення в дозах 1 та 2 см3 не має переваги в порівнянні з дворазовою вакцинацією в дозі 1 см3.

Доцільність ревакцинації поросят щеплених у ранньому віці. В зв’язку з тим, що у частини поросят, щеплених до 2-місячного віку, не в повній мірі вироблявся імунітет, ми провели вивчення імунної відповіді і стійкості поросят після їх ревакцинації.

Вивчення динаміки утворення специфічних віруснейтралізуючих антитіл показало, що кількість антитіл в сироватках крові всіх вакцинованих поросят після дворазового щеплення, тобто до ревакцинації, була майже однаковою (Р >0,2; Р»0,5). Навпаки, через 2 тижні після ревакцинації поросят у 3-місячному віці, інтенсивність продукції антитіл була в 2,5 рази вищою у ревакцинованих поросят в порівнянні з не ревакцинованими. Рівні антитіл в- цей період у них складали відповідно 1:315(+21,4;—17,6%) та 1:128(+26,6; —21,1%) і мали достовірну різницю (Р<0,002).

Заражениям щеплених поросят встановлено, що від вірулентного вірусу були захищені усі ревакциновані і дві третини не ревакцинованих тварин.

Таким чином, поросят, щеплених до 2-місячного віку необхідно ревакцинувати у 2-3-місячному віці. '

Колостральний імунітет. З метою встановлення тривалості збереження колостральннх антитіл був поставлений дослід на 4-х свиноматках, дворазово щеплених в дозі

1 * 108 ТЦДбо/см3 за 1-2 місяці до опоросу та 20-ти поросятах, одержаних від них. ■

Вплив колостральннх антитіл на утворення поствакци-пальних визначали по динаміці утворення специфічних ві-руснейтралізуючих антитіл у поросят, які ссали молозиво до щеплення вірусвакциною. . Поросят імунізували дворазово з інтервалом 14 діб в дозі 1-1070 ТЦД5о/см3. .

Серологічні дослідження показали, що в сироватках крові одноденних поросят колостральні антитіла виявлялись в титрі' 1:256—1:2048, а в середньому 1:630(+23,1;—18,7%). Через тиждень їх рівень склав 1:446(4-12,5—11,1%). Через 6 тижнів середня величина титру знизилася до 1:39(4-14,1; —12,3%). Через 7 і 8 тижнів кількість антитіл була вже рівною відповідно 1:23 і 1:20(4-7,2;—6,7%), а через 9 і 10 тижнів вона зменшилася до 1:18 і 1:14(4-14,1;—12,3%). відповідно.' . -

Динаміка титрів колостральннх антитіл у щеплених свиноматок була схожою з такою у народжених від них поросят. Вона відрізнялась лише більш різким спадом антитіл в перший тиждень спостереження-.

Вивчення динаміки титрів антитіл в сироватках крові щеплених поросят показало, що до вакцинації рівень антитіл у дослідних тварин складав 1:74(4-18,9;—15,9%), у контрольних — 1:2(4-14,1;—12,3%). Через^2 місяці після першого введення вакцини вони були в "титрах відповідно 1:15 (4-24.0; —19,4%) та 1:104(4-18,9;—15,9%). Тільки через 4 місяці, кількість специфічних антитіл в сироватках крові щеплених поросят в порівнянні з вихідними титрами зросла в 1,6 рази. Зниження поствакцинальних антитіл відбувалось навіть в тих випадках, коли рівень материнських антитіл становив у них 1:16. ,

Отже, в крові поросят, колостральні антитіла зберігакь ться 2,5 місяці. Вони пригнічуть утворення поствакциналь-

них антитіл протягом 2-4 місяців. На утворення, гуморального імунітету негативний вплив чинять -колостральні антитіла навіть в титрах 1:16. ■

Залежність напруженості імунітету від титру антитіл.

З метою встановлення корелятивної залежності між стійкістю до зараження і титрами віруснейтралізуючих антитіл у свиней, щеплених вірусвакциною, ми співставили результати визначення гуморальних поствакцинальїшх антитіл і інтра--церебрального зараження 143-х голів свиней різного віку. В результаті було, встановлено, що в одноразово щеплених свиней, при наявності в крові специфічних антитіл в титрах .1:8—1:32 не утворювався стійкий імунітет. При концентрації антитіл 1:64, було захищено 20% свиней, 1:128—64,3%, 1:256—80%. Дворазово щеплені тварини, з титрами антитіл 1:8, яких виявляли в поодиноких випадках, були не стійкими до зараження. Тварин з рівнями антитіл 1:16—1:32 було захищено 75,0—76',2%, а 1:64 і вище —93г1 —100%. .

Таким чином, нами встановлена пряма залежність між стійкістю тварин до зараження вірулентним вірусом і титрами поствакцинальних віруснейтралізуючих антитіл в сироватках крові тварин (гху =0,746 при Р<0,05).

Динаміка рівнів лейкоцитів. Вивчення рівнів лейкоцитів ,проведено у одноденних, двотижневих, одно- та трьохмісяч-них поросят дворазово щеплених вірусвакциною в дозі

1-Ю7 ТЦД5о/см3. '

В результаті було встановлено, що до вакцинації середня кількість лейкоцитів у одноденних поросят становила 5,3±0,58 тис./мкл, двотижневих —8,1±0,69, місячних

— 10,0=Ь2,08 і трьохмісячних —16,9±0,81 тис./мкл. Поскільки у поросят до 3-місячного віку відбувалося фізіологічне збільшення кількості лейкоцитів, у них певної закономірності в змінах лейкоцитів, пов’язаних з вакцинацією, нами не встановлено. У поросят 3-місячного віку через 14 діб після щеплення середній рівень лейкоцитів становив 21,1± 1,47 тис./мкл. Максимального рівня він досяг через місяць (23,5±2,94 тис./мкл). Через 2, 3 та 4 місяці лейкоцитів нараховували в середньому відповідно 20,0±2,43; 15,1±1,44 та 14,8± 1,83 тис./мкл. З 6-ти і до 12-ти місяців середній їх рівень коливався в основному в однакових межах 12,5±1,81— 13,1±0,99 тис./мкл.

Певна закономірність встановлена і в лейкоцитарній формулі, в якій зміни сегментоядерних нейтрофілів мали

обернений корелятивний зв’язок із змінами лімфоцитів (гху ==—0,642). Якщо до вакцинації рівень сегментоядерних нейтрофілів і лімфоцитів складав відповідно 42,4±5,39 і 50,6±5,23%, то вже через 14 діб після імунізації відбувалося зменшення сегментоядерних нейтрофілів до 35,2±6,78% і збільшення лімфоцитів до 60,0±7,04%. Через 1 місяць рівень сегментоядерних нейтрофілів і лімфоцитів становив відповідно 30,7±3,25 і 65,0±2,34. Найбільш різко така залежність була виражена ферез 2 місяці після щеплення. Кількість сегментоядерних нейтрофілів до цього часу знизилась до 25,5±8,01 %,. а лімфоцитів збільшилась до 71,0±7,52%. Приблизно такі ж рівні збереглись і через 3, місяці (відповідно 25,5±3,08 і 70,2±2,71%). Через 4 місяцгвідбувались повільні зміни цих показників в протилежну сторону. Через 10 місяців після щеплення поросят їх рівні досягли вихідних меж. В цей час рівень сегментоядерних нейтрофілів складав 45,0±7,13%, а лімфоцитів 49,3±6,52%. В таких же межах вони збереглись і до кінця досліду.

Проведені гематологічні дослідження свідчать про реактивність крові свиней у відповідь на введення вірусвакцини.

Динаміка рівнів Т- і В-лімфоцитів. Для визначення кількісних показників імунокомпетентних клітин було поставлено три досліди на 24-х 3-місячних поросятах. В першому досліді в якості комплементу в системі ЕАС використали сві-жеприготовлену сироватку крові миші. В другому і третьому — сироватку морської свинки. Поросят вакцинували дворазово в дозі 1-107 ТЦД,5о/см3.

В першому досліді у вакцинованих тварин встановлена лише тенденція до збільшення загальної кількості лейкоцитів і розеткоутворюючих лімфоцитів. Кількість розеткоутво-рюючих В-лімфоцитів була низькою. "

В другому досліді характер імунної відповіді поросят був схожим з попереднім дослідом, однак більш вираженим. Загальна кількість лейкоцитів в дослідній групі збільшилась на 14-ту добу з 15,4±1,49 до 19,4±2,40 тис./мкл клітин (Р<0,02). Через місяць цей показник у щеплених поросят поступово знизився до вихідного стану. Відносний вміст Т-лім-фоцитів через 21-ну добу у вакцинованих . т в а р и н зріс з 29,1±3,38% до 39,3± 1,27 або на 10,2% (Р<0,005). Абсолютна кількість клітин зросла з 3,2±0,21 до 4,9±0,91 'тис./мкл, тобто на 1,7 тис/мкл (Р>0,1). Відносний вміст В-лімфоцитів через 21-ну добу збільшувався у щеплених тварин всього

з 22,5±2,74 /о до 26,4±2,32%, а в порівнянні з контрольними— на 5,3% (Р>0,1). Максимальний рівень абсолютної кількості клітин відмічено через 14 діб (3,5±0,63 тис-./мкл), який перевищив рівень В-лімфоцитів контрольних поросят на 1,3 тис/мкл (Р>0,1). До кінця спостереження кількість Т- і В-лімфоцитів поступово знизилась, хоча їх рецепторна активність ще і збереглась.

В третьому досліді збільшення лейкоцитів у імунних тварин з 12,1 ±0,38 до 17,7±1,60 тис./мкл наступило через 21-ну добу, (Р-<0,001). Через ЗО діб рівень лейкоцитів.у щеплених поросят знизився до 13,1±1,09 тис./мкл, в той час як у. контрольних — він був на рівні 10,6±0,33 тис./мкл.

Число Т-лімфоцитів через 21-ну добу зросло з 39,5±0,62 до 49,4± 1,19% (Р<0,001) і з "3,2±0,30 до 5,9±0,65 тис/мкл клітин (Р<0,01), а В-лімфоцитів з 2,7±0,27 до 4,1±0,71 тий./мкл. Рецепторна активність В-лімфоцитів у вакцинованих тварин -перевищувала цей показник контрольних — всього на 3,2% (Р>0,1). До кінця 30-денного досліду Т- і В-лімфоцитарна активність у імунізованих поросят зменшилась до вихідного стану.

Таким чином відносна кількість Т-лімфоцитів у неще-плених поросят коливалась в межах 28-40%, В-лімфоцитів — 10-33%; у щеплених — Т-лімфоцитів — 39-49%, В-лімфоцитів— 16-34%. Перевага рецепторної активності і абсолютної кількості популяцій Т-лімфоцитів над В-лімфоцитами свідчить про те, що клітинний імунітет у поросят, щеплених ві-русвакциною, переважає над гуморальним. Вакцинація тварин призводить до стимуляції систем Т- і В-клітин.

Динаміка вірусозиділення. Проведеними дослідами встановлено, що вакцинний вірус приживляється в організмі щеплених тварин і періодично виділяється з фекаліями. Він з’являється в фекаліях у 11,1% поросят 2,5-місячного віку вже через добу після введення вакцини. У 20% щеплених поросят вірус виявлявся на 3-тю добу, у 30% на 5-ту і у 22,2% тварин на 14-ту добу. В середньому за місяць вірус виділявся у 10±2,44% тварин.

Вірусологічне -обстеження поросят, щеплених у різному віці, показало, що у поросят, щеплених в одноденному віці пост-вакцинальне вірусовиділення тривало на протязі 7-ми місяців, у двотижневому, місячному та шестимісячному віці — на протязі 11-ти місяців, у 2-3-місячному—12 місяців.

Виділений вірус при контакті передався не вакцинова-

ним поросятам. На відміну від вакцинованих,’у контактно коитамінованих поросят вірус персистував в організмі не щеплених тварин на протязі 5-ти місяців. Через 1 місяць титри антитіл у них зростали з 1:3 (+23,1;—18,7%) до 1:11 (+ 33,8;—25,2%) (Р<0,02). Максимального рівня до 1:18(+24,0;

— 19,4%} вони досяглії через 6 місяців (Р,<0,001). На протязі року титри антитіл становили 1:5—1:18 (+24,0;—19,1 %).

Визначення строку придатності вакцини. Строк придатності вакцини визначали по цитопатичній активності в культурі клітин та антигенній і імуногенній активності на поросятах.

Цитопатичну активність в культурі клітин вивчали після зберігання вакцини при температурі +4°С; — 20°С і кімнатній темпаратурі. Зберігання вакцини при +4°С показало, що її цитопатична активність через 12 місяців зменшилася на

2-3 порядки лише в трьох серіях із 30-ти. В середньому вона зменшилась всього на один порядок, або на 1,6 логарифма (Р<0,001), тобто з 7,9+0,11 до 6,3±0,17 ТЦДбо.

Зберігання вакцини на протязі 12-ти місяців при —20°С не вплинуло на титр інфекціиності (Р>0,5). Кімнатна ж температура (19—22°С) негативно вплинула на стабільність титрів інфекційності вакцини. Вона втратила цитопатичну активність вже через 3-6 місяців. В середньому титр інфекційності вакцини при цій температурі зменшувався щомісячно на 1,3—2;2 Ід ТЦДбо/см3.

Перевірка 3-х серій вакцини,- яка зберігалася в умовах побутового холодильника (+4°С), на антигенну та імуногенну активність показала, що у щеплених ними поросят через

2 тижні після щеплення утворювалися віруснєйтралізуючі антитіла в межах 1:32(+60,2;—37,5%) — 1:79(+26,6;—21,1%) і наступав повний імунологічний захист. '

Спосіб контролю вакцини. Оцінку способу проводили шляхом порівняння цитопатичної активності в культурі клітин, антигенних та імуногенних властивостей вірусу матрик-сних розплодок і одержаних на їх основі серій вакцини.

В результаті було встановлено, що цитопатична активність вірусу трьох матриксних розплодок практично не відрізнялась від активності вірусу"у виготовлених з них 56-ти серіях, вірусвакцини. Середні титри вірусів становили відповідно 7,9±0,18 і 7,8±0,09 ТЩЬо/см3.

- Подібні дані були одержані і по відношенню до антиге-

ішої активності вірусу матриксних розплодок та одержаних

з них вакцин. Титр віруснейтралізуючих антитіл в сироватках крові поросят, щеплених матриксною розплодкою № 1 (1:84+14,1 — 12,3%), достовірно не відрізнявся від рівня антитіл у поросят, щеплених одержаною із неї вакциною (1:79+5,7;—5,4%;Р>0,5). У поросят, щеплених вакциною із матрихсної розплодки № 2, навпаки, рівні антитіл були в 2 рази вищі ніж у тварин, імунізованих № 3 відповідала антигенній активності одержаної із неї вакцини.

Імуногенна активність вірусу матриксних розплодок також не відрізнялась від імуногенної активності одержаних на їх основі серій вакцини. Поросята, щеплені як матрикс-шімп розплодками вірусу,так і одержаними із них вакцинами мали 100%-ний імунітет.

Таким чином, одержані дані свідчать про те, що цито-натична, антигенна та імуногенна активність вірусу матрик-сннх розплодок вакцинного штаму «Перечинський-642» ідентична таким же показникам всіх серій вакцини, одержаних на їх основі. Це дозволяє спростити спосіб,знизити собівартість та скоротити строки контролю вірусвакцини без погіршення якості препарату. Контроль вакцини на імуногенність та специфічність можна здійснювати тільки по матриксній розплодці штаму «Перечинський-642», замість перевірки ко-, жної серії вакцини на 5-ти поросятах 3-4-місячного віку, який і проводиться тепер при виготовленні вакцини. Кожну серію препарату достатньо перевіряти лише по цитопатичній активності. ■ '

висновки

1.' Для створення напруженого імунітету проти хвороби Тешена свиней найбільш доцільним є дворазове щеплення вірусвакцішою в дозі 1 см3 з інтервалом 14 днів.

2. Формування поствакцинального імунітету розпочина-

ється на 3-5-й день після першого введення вакцини і завершується на 7-й день після другого введення. Тривалість імунітету залежить від віку тварин: у поросят, щеплених в 2-мі-сячпому віці і старше імунітет зберігається на протязі 12-ти місяців, а специфічні віруснейтралізуючі антитіла в крові' щеплених свиноматок — на протязі двох років. Поросята, щеплені до 2-місячного віку, підлягають ревакцинації у 2-

3-місячному віці. ’

3. Колостральні антитіла в крові поросят і молоці щеплених свиноматок зберігаються протягом 2,5 місяців. Воші пригнічують утворення поствакцинальних антитіл протягом

2-4 місяців. На утворення гуморального імунітету негативний вплив чинять колостральні антитіла навіть в титрах 1:16.

4. У свиней, щеплених вірусвакцииою проти хвороби Тешена, існує пряма залежність між стійкістю до зараження патогенним штамом вірусу і титрами поствакцинальних ві-руснейтралізуючих антитіл в крові (гху=0,746). Показником ефективності препарату є титр антитіл 1:16 і вище. __

5. У щеплених свиней клітинно-опосереднений імунітет

переважає над гуморальним. При цьому вірусвакцина стимулює системи Т- і В-клітіш. ,

6. Вакцинація тварин супроводжується підвищенням рівня лейкоцитів в крові до 17,6—23,5 тис./мкл. Збільшення рівня лімфоцитів знаходиться в оберненій залежності від зміни сегментоядерних нейтрофілів.

7. Вакцинний вірус приживляється і персистує в організмі щеплених свиней протягом 12-місячного строку спостереження. Він передається контактним тваринам і являється для них додатковим імунізуючим фактором.

8. Цитопатичні, антигенні та імуногенні властивості ві-русвакцини зберігаються при +4°С протягом 12-ти місяців.

9. Методика оцінки імуногенності та специфічності вірус-

вакцини стандартним штамом вірусу хвороби Тешена «Чер-ПІгівський-2372» Enterovirus suls-1 '№ 286/5 ВГНКІ (Авторське свідоцтво № 1747487 від 15.03.92 р.) в дозі 0,4 • 102 25 ЛД50 є цілком придатною. -

10. Метод контролю вакцини по матриксній розплодці вакцинного штаму «Псречинський-642» дозволяє знизити її собівартість, спростити спосіб і скоротити строки проведення контролю без погіршення якості препарату.

Список опублікованих робіт.

1. Романенко В. Ф., Сорока В. И., Прусс О. Г. Рекоме-

ндации по диагностике и мерам борьбы с энзоотическим энцефаломиелитом (болезнью Тешена) свиней // Киев — 1992. — 17 с. .

2. Романенко В. Ф., Прусс О. Г., Бабич Н. В., Сорока В. И., Савченко Т. Ф. Эффективность вакцины против энзоотического энцефаломиелита свиней // Ветеринария — к., 1987. — Вып. 62. — С.-24-25.

3. Романенко В. Ф., Прусс О. Г., Полевик Е. И., Куп-невская Л. В., Бабич Н. В., Сорока В. И. Диагностика болезни Тешена // Ветеринария—1988. — №11. — С. 65.

4. Романенко В. Ф., Сорока В. И. Динамика образования антител в организме свиней, привитых вирусвакциной против болезни Тешена // Ветеринария—1989. — №10. —

С. 27-28.

5. Сорока В. И. Влияние колостральных антител на об-

разование поствакцинального имунитета у поросят, привитых вирусвакциной против энзоотического энцефаломиелита (болезни Тешена) свиней // Ветеринария — К., 1990. — Вып. 65. — С. 25-27. .

6. Романенко В. Ф., Прусс О. Г., Сорока В. И., Бабич Н. В. Иммунологическая активность вирусвакцины против болезни Тешена свиней и методы ее контроля // Ветеринария — К., 1990. — Вып. 65. — С. 23-24.

7. Романенко В. Ф., Сорока В. И., Прусс О. Г. Иммуно-генность вирусвакцины против болезнн Тешена свиней // Ветеринария — 1991. — № 7. — С. 27-28.

8. Сорока В. I., Романенко В. П., Прусс О. Г. Імунна відповідь у поросят щеплених проти ензоотичного^ енцефа-ломієліту (хвороби Тешена) свиней у ранньому віці // Ветеринарія — К. — 1992. — Вип. 67. — С. 35-37.

9. Романенко В. Ф., Бокуц А. А., Сорока В. И., Поле-

вик Е. И., Пиичук И. H., Иванов C. H., Гераськин A'^C. Этилогическая роль энтеровирусов при болезнях свиней // Ветеринария — 1992. — № 1. — С. 25-26. ,

10. Романенко4 В. П., Сорока В. I.,1 Прусс О. Г., Бабич Н. В. Стандартний вірулентний штам для контролю іму-ногенності та специфічності вірусвакцини проти хвороби Тешена свиней // Ветеринарна медицина К-, 1995. — Вип. 70. —

С. 155-158.

11. Романенко В. Ф„ Сорока В. И., Прусс О. Г. Особенности эпизоотологии энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) // Матеріали міжн. наук. конф. «Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы» — Харьков, 1995. — С. 92-95.

12. Романенко В. Ф., Бабич Н. В., Сорока В. И., Прусс

О. Г. Иммуногенность вакцинного штама «Перечинский-642» вируса энзоотического энцефаломиелита (болезни Тешена) свиней // Там же — С. 422-424. .

13. Романенко В. Ф., Сорока В. И.; Прусс О. Г., Бабич '

Н. В. Оценка иммуногенности вирусвакцинь: против энзоотического энцефаломиелита (болезни Тешена) свиней // Там же — С. 424-427. ' -

14. Романенко В. Ф., Прусс- О. Г., Сорока В. И., Бабич Н. В. Штам энтеровируса свиней для контроля иммуногенности вакцины' против болезни Тешена свиней // Авторское свидетельство № 1747487, приоритет изобретения 1990.

15. Романенко В. Ф., Сорока В. И. Динамика колостра-льных антител у вакцинированных против болезни Тешена свиней свиноматок и рожденных от них поросят // Тези доп. конф. «Повышение эффективности ветеринарного обеспечения промышленного свиноводства». — Киев, 1987. — С. 51.

16. Романенко В. Ф., Сорока В. И. Уровень лейкоцитов

у поросят, привитых вирусвакциной против болезни Тешена свиней // Там же — Киев, 1987. —С. 53-55. •

17. Романенко В. Ф., Прусс О. Г., Сорока В. И. Имму-

нологические аспекты оценки биологических препаратов против вирусных болезней свиней // Тез. докл. конф. «Ветеринарная медицина: экономические, социальные и экологические проблемы». — Харьков, 1990. — С. 226.

18. Романенко В. Ф., Прусс О. Г., Сорока В. П., Бабич

' Н. В. Штам энтеровируса свиней для контроля иммуногенности вакцины против болезни Тешена свиней // РЖ — Официальный бюллетень изобретений России — 1992. — №26. — С. 84.

19. Сорока В. И. Клеточный имунный ответ'у поросят,

, привитых против энзоотического энцефаломиелита (болезни

Тешена) свиней // Мікробіологічний журнал — К., 1994. — Т. 56, №5. — С. 105-106. . ,

-20. Романенко В. П., Сорока В. I., Бокун О. О. Реактив-

ність. крові’ свиней на'еитеровіруси 11 Тези доп. «Всеукраїнська конференція з фізіології і біохімії тварин» —.Львів, 1994. — С, 124-125. '

Сорока В. И. Оценка иммунитета у свиней, привитых вирус-вакшшоц против болезни Тешена и усовершенствование способа контроля вакцины. Защищается рукопись диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук то специальности 16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология. Национальный аграрный университет, Киев, 1996.

Изучены основные свойства вирусвакцины против энзоотического энцефаломиелита (болезни Тешена) свиней из штамма «Перечинский-642». Показано, что у свиней, двукратно.привитых с интервалом 14 дней в дозе 1 см3, формирование иммунитета начинается на 3-5-й день и заканчивается через 21 день. У поросят, привитых в 2-месячном возрасте и старше иммунитет сохраняется на протяжении 12-ти месяцев, а специфические вируснейтрализующие антитела у свиноматок — на протяжении 2-х лет.

Оценка иммуногенности и специфичности вирусвакцины осуществляется путем определения устойчивости привитых поросят с помощью стандартного вирулентного штамма «Черниговский-2372» в дозе 0,4-102 25 ЛДбо, а ее контроль — по матриксной расплодке вакцинного штамма,

Soroka V. I. Immunity estimation In pigs inoculated with viral vaccine, against Teshen disease and improbement of the control vaccine method. Manuscript of thesis for candidate’s degree of verinary science in specialized fields 16.00.03—veterinary microbiology, virology, epl-zootology, mykology and immunnology. National Agricultural University, Kiev, 1990.

The main characters of viral vaccine from .PeiechInsky-642* strain against enzootic encephalomyelitis (Teshen disease) of pigs were studl-

edlt was shocok that In the pigs inoculated twofold with the interval 14

. . 3

days in dose 1 sm, the immunity formation begins at 3-5 th day and finishes in 21 daiis. The immunity preseroes in pigs, inoculated at 2 month age and elder during 12 months and the specific virus neutra'iz-ing antibodies In sew preserve during 2 years.

The estimation of viral vaccine immunogeneslf.y and specifity is realized by determination of pigs resistance inoctila!ed with standart

' 2,25

virulent atrain .Chernigovsky-2372“ in dose 0,4,10 LD and its control

50

in productlonal vaccine strain.

Ключові слова: ензоотичний енцефаломієліт (хвороба Тешена) свиней, вірусвакцина, поствакцинальний імунітет, імуногенність, сероконверсія, віруснейтралізуючі антитіла.