Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотологическое моделирование биологической передачи возбудителя болезни Тешена

л-ззШ

На правах рукописи

' УДК619:616,98:578.835. 11

Андреева Ольга Николаевна

ЭПИЗОО ТОЛОГИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНИ

ТЕШЕНА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с мнкотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров-2003 г.

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

- доктор биологических наук, профессор

Стрижаков Александр Анатольевич

- доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Деев Вячеслав Иванович

• кандидат ветеринарных наук Федоров Дмитрий Геннадьевич

- ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии

Защита диссертации состоится « 4 » марта 2004 г. в 1300 часов ня заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института.

Автореферат разослан » /^¿д ^ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Савукова ВЛ.

л

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы

Энтеровирусный энцефаломиелит свиней (болезнь Тешена) является одной из опасных инфекционных болезней свиней. Болезнь широко распространена во многих странах мира, а также в некоторых, в основном, западных регионах России.

С момента появления болезни в нашей стране проведен широкий комплекс научных исследований по изучению физико*химических и биологических свойств возбудителя болезни Тешена, разработке методов диагностики и средств специфической профилактики болезни (Балышева В.И., 1978; Романенко В.Ф. и др., 1978; Цыбанов С.Ж., 1981; Бузун А.И., Жестерев В.И. и др., 1998). Изучению вопросов межвидовой передачи возбудителя болезни Тешена (БТ) положил начало Бузун А.И. (1997), которым впервые был установлен дополнительный биологический переносчик возбудителя болезни.

Однако, несмотря на значительные успехи в изучении болезни Тешена, она продолжает регистрироваться на территории РФ и стран ближнего зарубежья, нанося значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам.

Если в 1999-2000 гг. болезнь регистрировалась лишь на отдельных территориях областей, граничащих с неблагополучными по БТ Украиной и Белоруссией, то к 2001-2003 гг. наметилась тенденция к расширению ареала этой инфекции к центральной части Российской Федерации.

Принятые меры борьбы с болезнью Тешена обеспечили значительное снижение эпизоотической напряжённости по этой болезни, однако их выполнение до настоящего времени не позволяет полностью искоренить инфекцию, как в нашей стране, так и во многих странах мира. Однажды появившись в энзоотических зонах, в том числе на фоне широкого проведения вакцинопрофилактики, болезнь проявляется там периодически в течение продолжительного времени.

Таким образом, вопрос энзоппгиюгти ^г-ггщти Тешена - её главной эпизоотологической < »собенноЬМ^А?Кй^я одних из актуальнейших в связи с

фона научной литературы

трудностью искоренения болезни, широким распространением и способностью формировать стационарные очаги.

Ранее в представлениях о механизмах передачи возбудителя БТ всем животным, кроме свиньи, отводилась роль механических переносчиков. Однако анализ динамики и ландшафтно-географических закономерностей эпизоотии болезни Тешена заставляет предположить, что в эпизоотологическом процессе при болезни Тешена некоторые виды животных, наряду со свиньями, играют роль биологических переносчиков возбудителя болезни Тешена.

В связи" с вышеизложенным, является актуальным проведение исследований по эпизоотологическому моделированию БТ, выявлению возможных биологических переносчиков её возбудителя для расширения представлений об эпизоотологии, ведущих механизмах эпизоотического процесса при этой болезни, усовершенствования науч но-мето дичсских подходов при оценке эффективности средств специфической иммунопрофилактики болезни Тешена.

1.2. Цель и задачи исследований

Целью нашей работы являлось эпизоотологическое моделирование биологической передачи возбудителя болезни Тешена и проведение эпизоотологияеского мониторинга болезни в Российской Федерации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести вирусологический и серологический мониторинг болезни Тешена в регионах Российской Федерации.

2. Дифференцировать отечественные штаммы вируса болезни Тешена.

3. Изучить восприимчивость различных видов животных (грызунов и плотоядных) к заражению вирусом БТ, определить уровень и динамику выделения вируса болезни Тешена биологическими переносчиками в окружающую среду.

4. Определить патогенность для свиней возбудителя болезни Тешена, выделяемого в окружающую среду биологическими переносчиками.

5. Изучить защитные свойства вакцины против болезни Тешена при заражении свиней естественным путём с использованием метода межвидовой биологической передачи возбудителя.

1.3. Научная новизна работы

1. В результате проведённых исследований впервые получены данные, свидетельствующие о наличии биологических переносчиков у возбудителя болезни Тешена.

2. Разработан эффективный метод контрольного заражения свиней на основе межвидовой передачи возбудителя болезни для опенки защитных свойств вакцин против болезни Тешена,

3. Проведён эпизоотологический мониторинг болезни Тешена на территории Российской Федерации за 1999-2003 гг.

1.4. Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделам 3.3.1.1,, 3.3.1.2., 3.3.1,3., З.З.4.1., З.З.4.2., 3.3,4.4, практическую и консультативную помошь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Бузун А.И., Балашова Е.А., Цыбанов С. Ж., Власов А,Н„ Сгрнжакояа О.М,

1.5. Практическая значимость результатов

Полученные результаты и комплекс разработанных методов (выявление РНК энтеровирусов свиней методом ПНР, прямой метод ГХ ИФА для мазков-отпечатков на основе МКА к вирусу БТ) использованы при проведении серологического и вирусологического мониторинга болезни Тешена в Российской Федерации,

Разработанный метод биолопгческой передачи возбудителя болезни Тешена свиньям от животных других видов использован при изучении протективных свойств вакцин против болезни Тешена.

1.6. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Международной научно-

практической конференции «Биолого-эколопгческие проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей» (г. Покров, 2002 г.), IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), Международной научно- практической конференции, посвящённой 45-летию института 24-26 сентября 2003 г. (г. Покров, 2003 г.) и представлены на заседаниях Учёного совета ВНИИВВиМ, 2000-2003 гг. (г. Покров).

1.7. Публикации результатов

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе одна статья в журнале «Ветеринария» (2001 г.),

1.8. Основные положения, выносимые на защиту

1. Результаты серологического и вирусологического мониторинга болезни Тешена в Российской Федерации.

2. Восприимчивость различных видов животных к заражению вирусом болезни Тешена, уровень и динамика экскреции вируса биологическими переносчиками я окружающую среду.

3. Патоген н ость для свиней возбудителя болезни Тешена, выделяемого с экскретами в окружающую среду биологическими переносчиками данного вируса,

4. Результаты экспериментов по изучению защитных свойств вакцины против болезни Тешена с использованием метода межвидовой передачи возбудителя.

1.9. Объем и структура работы

Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 61 отечественный и 81 зарубежный источников. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей, 14 рисунками, приложениями.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2000-2003 г.г. в лабораториях Эпизоотологии и Биофизики ГНУ ВНИНБВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Российской академии сельскохозяйственных наук по теме 01.01.01 «Проведение непрерывного эпизоотологического мониторинга особо опасных, экзотических и наиболее распространённых болезней животных в странах мира и в России с целью оценки эпизоотической ситуации и выявления основных закономерностей развития эпизоотического процесса при АЧС, КЧС, КПП, б. Тешена, ЧКРС, НРТ, НЕ, ГП, АЧЛ, КЛО, ЛДР, СЯ и др.»

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Шташш: «Нав.тя-96», «Закарпатский», «Konratice», «Tal fon» вируса болезни Тешена; штамм «Т-80» тешовирусов свиней 2 серотипа, штаммы «V-13», «А-1» энтеровирусов свиней 9 и 10 серотнпов, соответственно. Все штаммы получены из лаборатории «Музейных штаммов» ГНУ ВНИИВВиМ.

Вакцины: вакцина против энтеровирусного энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) инактивированная эмульгированная из штамма «Навля-96» серия .Y? 24, контроль .Ча 24.

Животные: свиньи породы «крупная белая», невакцинированные против болезни Тешена, беспородные морские свинки, собаки, кролики, белые крысы и мыши.

Культуры клеток: перевиваемая культура клеток тестикуд поросёнка (ПТП).

Сыворотки крови: Сыворотки крови, нормальные и специфичные к вирусу БТ от интакгных и зараженных морских свинок, собак, свиней, кроликов, крыс, получены в процессе проведения экспериментов; сыворотки специфичные к вирусу БТ - из лаборатории Музейных штаммов ВНИИВВиМ; сыворотки свиней, полученные в процессе проведения серологического мониторинга болезни Тешена из хозяйств различных регионов России.

Выделение вируса из патологического материала, его идентификацию в РН, титрование, а также постановку РН для определения уровня В НА в сыворотках

крови животных проводили в соответствии с Временными методическими указаниями по лабораторной диагностике болезни Тешена (1996 г.).

Выделение РНК вируса болезни Тешена из инфицированных клеток культуры ПТП и проб патологического материала проводили с помощью

гуанидин-тиоцоината с последующей фенол ьно-хлороформенной экстракцией.

Постановка пояимеразной цепной реакции: кДНК синтезировали с

помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц в течение 60 мин при температуре 37°С. Амплификацию проводили в реакционной смеси объёмом 50 мкл по следующей программе: денатурация 94°С- 40 с, отжиг при различных температурах 45-50-55°С-40 с, синтез 72°С-60 с, всего 35 шшов. ПЦР-продукты анализировали методом электрофореза в агарозном геле, положительным результатом считали выявление ПЦР-продукта размером, соответствующим расчетному (375 п.о.).

Постановка прямого метода гистохимического штуноферментиого анализа для мазков-отпечатков на основе моноклональных антител к вирусу болезни Тешена: на обезжиренных покровных стёклах делали мазки-отпечатки с внутренних органов (лёгких, тонкого и толстого отделов кишечника) крыс, кроликов, убитых в разные сроки после заражения вирусом болезни Тешена; лёгких, поджелудочной железы, мозжечка свиней, павших с клиническими признаками болезни Тешена после заражения вирусом, прошедшим пассаж на биологических переносчиках.

Мазки-отпечатки высушивали на воздухе, фиксировали охлаждённым до минус 10-20°С ацетоном, инкубировали с 1%-ым раствором БСА-ЗФР при температуре 37°С в течение 30 минут. Затем препараты инкубировали во влажной камере при температуре 37°С в течение 1 часа с пероксидазным конъюгатом на основе моноклональных антител (МКА), обладающих специфичностью к антигенам ВБТ (клон Т20, предоставленные к.в.н. Власовым А.Н.) в рабочем разведении на БСА-ЗФР, двукратно промывали раствором ЗФР. Связавшийся с антигеном вируса болезни Тешена коньюгат выявляли субстратом (50 мл 0,05 М ацетатного буфера рН 4,4; 10 мг З-амино-9-этилкарбазола, предварительно растворённого в 3 мл М,М-диметид- формами да;

33%-ый раствор перекиси водорода: 10 мкл/10 мл). УчЗг результатов проводили под световым микроскопом. Положительным результатом считали окрашивание участков мазка-отпечатка, содержащих антиген вируса БТ, в малиновый цвет.

Определение видов животных, восприимчивых к заражению вирусам болезни Тешена. Внутримышечно животным инокулировали во внутреннюю поверхность бедра культуральную жидкость, содержащую штамм «Навля-96» вируса БТ (2 пассаж в 11111 с активностью Ю7,0 ТЦДи^л). Доза заражения составляла: для мышей 3- 10й ТЦЦ^гол., для крыс 107 ТЦД^гол., морских свинок 2' 107 ТЦД5(/гол., кроликов 5- 107 ТЦЩо/гол., собак 10® ТЦДзо/гол., однократно, внутримышечно. Выведение из опыта осуществляли через 60 суток после заражения.

Пероралькое заражение проводили путём скармливания собакам, крысам, кроликам и мышам в течение 3-х дней кусочков ободочной кишки с содержимым от подсвинка, павшего от болезни Тешена. Доза заражения для собак составляла 5- 106,75 ТЦД5</гал„ для кроликов З- 106'75 TLUWro.i. ,для крыс 2- I05'75 ТЦДя/гол., для мышей 105,75 ТЦЦ;с/гол.

Выделение вируса БТ проводили из лёгких, печени, селезёнки, почек, тонкого и толстого кишечника. Головной мозг и мозжечок отбирались полностью. Выведение из опыта и взятие крови осуществляли на 2, 14 и 60 суток после заражения. Клинический материал (экскреты) от животных всех групп отбирали каждые 2-4 дня. В качестве контрольных использовались животные, не подвергавшиеся заражению вирусом БТ.

Изучение патогенності! возбудителя болезни Тешена, выделяемого биологи ческилш переносчиками с экскретами в окружающую среду. Для изучения фекально-орального пути передачи возбудителя болезни Тешена свиней заражали вирусом болезни Тешена, прошедшим пассаж на крысах, кроликах, собаках и морских свинках. Доза заражения для свиней составляла, соответственно, 106,75 ТЦД^гол., 104'5 ТЦЩо/гол., 10і ТЩЫгол.» 103S ТЦДк/гол. Использовали материал, отобранный на 2-4 сутки после перорапьного заражения крыс, кроликов н собак вирусом БТ, и на 14-31 сутки после внутримышечного заражения морских свинок.

У всех свиней периодически отбирались сыворотки крови, пробы клинического и патологического материала.

Для изучения аэрогенной передачи возбудителя БТ свиньям от грызунов, в станок со свиньями помещали клетку с морскими свинками, и н окулированным и штаммом «Навля-96» вируса БТ в дозе 2- 107 ТЦДзо/гол., Для создания изолированного воздушного пространства, станок закрывали полиэтиленовой плёнкой, исключив таким образом возможность заражения свиней оральным путём.

Изучение защитных свойств вакцины против болезни Тешена с использованием метода межвидовой передачи возбудителя. Животных разделили на 5 групп, в зависимости от дозы вводимой вакцины. Перед вакцинацией у всех животных отбирали «нулевые сыворотки». Вакцину вводили согласно наставления по применению вакцины против болезни Тешена (утверждено Департаментом ветеринарии 17.04.96). Свиньям групп №1 и ЛГ<;2 вводили по 2,0 мл/гол.; свиньям групп №3 и №4 по 1,0 и 0,5 мл/гол., соответственно; животных труппы №5 не вакцинировали.

На 27 сутки у всех вакцинированных животных отбирали пробы крови для определения уровня ВНА н проводили контрольное заражение свиней групп №2-5 перорально вирусом БТ штамм «Навля-96», прошедшем пассаж на крысах. Использовали материал, отобранный на 2-4 сутки после перорального заражения крыс вирусом. Доза заражения свиней вирусом БТ Ю6,15 ТЦЩо/гол, За животными вели ежедневное наблюдение, периодически измеряли температуру тела, отбирали клинический материал.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1 .Мониторинг болезни Тешена п РФ

При проведении эпизоотологииеского мониторинга болезни Тешена для определения её ареала на территории РФ, за период с 1999 по 2001 гг. нами исследованы 613 проб сывороток крови и 36 проб патологического материала от свиней га хозяйств различных областей РФ, а также республики Молдова, где было установлено подозрение на болезнь Тешена по клиническим признакам, патологоанатом ическим изменениям и результатам эпизоотологического обследования, и благополучных по этой болезни

территорий.

Сыворотки крови исследовали в РН с 1000 ТЦД50 вируса болезни Тешена штаммами «Навля-96» и «Закарпатский».

Основываясь на результатах наших исследований и данных Департамента ветеринарии МСХ РФ, в периоде 1999 по 2003 гг. по болезни Тешена являются неблагополучными следующие области РФ: Брянская, Воронежская, Курская, Орловская, Псковская, Смоленская, Тверская, Белгородская. В 2001-2002 гг. циркуляция вируса БТ выявлена в Московской и Новгородской областях РФ, ранее считавшихся благополучными по данной болезни. Подтверждено благополучие по болезни Тешена Вологодской, Нижегородской, Липецкой и Пермской областей.

Данные проведённого серологического мониторинга показывают, что на территории России циркулируют, как минимум 2 иммунологических подтипа возбудителя болезни Тешена. Если на территории Брянской, Смоленской, Московской, Воронежской, Орловской и Белгородской областей выявлена циркуляция штамма, антигенно-близкого штамму «Навля-9б» вируса болезни Тешена, то на территории Тверской и Новгородской областей циркулирует штамм, антигенно-близкий штамму «Закарпатский».

2,2.2. Дифференциация штаммов вируса болезни Тешена молекулярно-С пологически ми методам».

В связи с большой гомологией штаммов «Навля-9б» и «Закарпатский» вируса болезни Тешена нами проведены исследования по межигтаммовой дифференциации вируса БТ методом ПЦР.

На первом этапе при выборе специфических ираймеров для идентификации возбудителя БТ нами использованы консервативные последовательности, комплементарные гену 3D, который кодирует фермент, необходимый для репликации вирионной РНК.

В результате установлено, что с пранмерами, комплиментарными гену РНК-пол имеразы вируса БТ, ам пли ф ицируется фрагмент генома энтеро- и тсюовирусов свиней, размер которого соответствует рассчитанному (375 п.о.). Для выявления межродовых различий были подобраны реехриктазы Pstl и Aval на основании анализа нуоеотидной последовательности генома штамма

«Тальфан». Показано, что рсстриктаза Pstl гидролизует ПЦР-продукт (размер 375 п.о.) штаммов «Закарпатский», «Навля-96», «Тальфан», «Т-80» и изолята, выделенного из головного мозга подсвинка, павшего от БТ, на два фрагмента размерами 75 и 300 п.о., а ПЦР-продукт штамма «V-13» разрезается на два фрагмента размерами 175 и 200 п.о. Рестриктаза Aval расщепляет ПНР продукты всех штаммов на два фрагмента размерами 180-190 п.о. Таким образом, расщепление ПЦР-продуктов размером 375 п.о. рестриктазой Pstl позволяет проводить дифференциацию между энтеро- и тешовирусами свиней.

IIa следующем этапе для внутривидового типирования штаммов «Навля-96» и «Закарпатский» вируса болезни Тешена использовали праймеры, комплементарные вариабельному участку гена белка Vpl, фланкирующие ПЦР продукт размером 261 п.о. Отрицательным контролем служили РНК, выделенные из других энтеровирусов свиней и эукариотической ДНК интактной культуры клеток U l li.

Результаты исследований показали, что праймеры, комплементарные вариабельному участку гена белка Vpl вируса болезни Тешена, взаимодействуют с РНК штамма «Навля-96» и не взаимодействуют с РНК штамма «Закарпатский».

2.2.3. Определение восприимчивости различных видов животных к заражению вирусом болезни Тешена.

Для изучения роли различных видов животных в эпизоотическом процессе при болезни Тешена, собак, крыс, кроликов, мышей заражали вирусом БТ перорально и внутримышечно, морских свинок внутримышечно. Выделение вируса из внутренних органов проводили только у животных, инфицированных вирусом перорально (табл. 1). На протяжении всего срока наблюдения (60 суток), каких-либо отклонений от нормального клинического состояния не наблюдали. У всех животных, убитых после инфицирования, видимых патоморфологических изменений во внутренних органах не обнаруживали.

Восприимчивость к заражению вирусом БТ мышей.

После пероралыюго заражения мышей вирусом БТ на 2-е сутки после заражения вирус в организме мышей обнаруживали в лёгких, почках, головном мозге, тонком и толстом отделах кишечника. На 14 и 60-е сутки после

заражения вирус обнаруживали только в толстом отделе кишечника. Восприимчивость к заражению вирусом БТкрыс. После перорального заражения крыс вирусом БТ возбудитель обнаруживали на 2-е сутки после заражения в пробах лёгких, почек, тонкого и толстого отделов кишечника. На 14-е сутки - в пробах почек и толстого отдела кишечника. На 60-е сутки после заражения вирус не обнаруживали ни в одном из исследованных органов.

Восприимчивость н заражению вирусом БТ собак. После перорального заражения собак вирусом БТ возбудитель обнаруживали 2-е сутки после заражения в пробах лёгких, тонкого и толстого отделов кишечника. На 14-е сутки - в пробах тонкого и толстого отделов кишечника. На 60 сутки вирус не обнаруживали ни в одном из исследованных органов.

Таблица 1

Персистенция возбудителя болезни Тешена в органах и тканях животных, заражённых перорально возбудителем БТ п=3

Органы Сутки после заражения (тигр вируса. ТЦШ(уиг>

мыши крысы собаки кроя.

2 І 14 60 2 14 2 14 2

ннтахтные ж-е - 1 - - • - - - -

головной МОЗГ 10и: ±0.32 - - - - - - -

Лёгкие ¿0,28 - - 10'"к ±0.51 - 10"" ±0.33 - -

почки 10і'» ±0,21 - • ±0,19 10"» ±0,03 - • -

селезёнка, печень - - - - - - - -

ТОНКИЙ кишечник ±0,06 - - 10ш *0Д1 І 10і"" | ±0,16 І01''* 4=0,10 10иі ±0.05

толстый кишечник ±0,02 10і'" ±0,06 10Л1 ±0,06 ±0,11 1(Г!* і ІО'^ ±0,12 1 ±0,15 10ш ±0,10 Ю-1" ±0,15

Восприимчивость к заражению вирусом БТ кроликов. После перорального заражения кроликов вирусом БТ возбудитель обнаруживали на 2-е сутки после заражения в пробах тонкого и толстого отделов кишечника. На 14 и 60-е сутки вирус не обнаруживали ни в одном из исследованных органов.

Восприимчивость к заражению вирусом БТморских свинок.

После внутримышечного заражения морских свинок вирусом БТ возбудитель обнаруживается в лёгких, почках и толстом отделе кишечника, где вирус способен персистировать, начиная с 9 суток не менее 47 суток после заражения.

В селезёнке и печени всех инфицированных животных вирус БТ не обнаруживался в течение всего срока наблюдения. Из проб органов интактных животных вирус БТ не выделен.

Определение сроков и интенсивности экскреции вируса болезни Тешена заражёнными животными.

Нами установлено, что восприимчивыми к пероральному заражению являются мыши, крысы, собаки и хролики. Выделение вируса животными с экскретами установлено уже на вторые сутки после заражения. В эти сроки его активность составляет, Ю40,104,7', Ю3,0 и 10й ТЩ^^, соответственно. Данные виды животных способны выделять возбудитель в окружающую среду с экскретами в течение не менее 60, 20, 26 и 8 суток после заражения, соответственно (рис. 1). Активность выделяемого в эти сроки вируса составляет: в экскретах мышей - Ю1,0 ТЦД}^,, крыс - 10й5 ТЦЯюлы, собак -Ю1,0 "ПДДзол.д, кроликов - ю'^ТЦДм-мд.

При внутримышечном заражении крысы способны выделять возбудитель в окружающую среду с экскретами со 2 по 12-е сутки после заражения в тігтрах от Ю4'0 до 101,г5 ТЦДычи, собаки с 5 по 23-и сутки в титрах от 10:'° до 101'5 ТЦД;а«а, мыши с 4 по 30-е сутки в титрах от 101,5 до 101,гі ТЦІЬйия, морские свинки с 14 по 43-и сутки после заражения в титрах от 102"5 до 1 СГ'° ТЦДдамл.

Определение уровня вируспейтрал изующ их антител у животных, заражённых вирусом болезни Тешена

У экспериментально инфицированных животных в разные сроки после заражения исследовали сыворотки крови в реакции нейтрализации (табл. 2).

Полученные данные свидетельствуют, что на 14 сутки после заражения ВНА К вирусу БТ обнаруживаются у всех изучаемых видов животных. У

морских свинок к 47 суткам их уровень повышается до значений 1:64. К 60 суткам после заражения ВНА в сыворотках крови уже не определялись у всех животных за исключением мышей, титры ВНЛ у которых колебались в пределах 1:4-1:16.

Крысы

Сутки после и ражий ия:

-перорапкно*

- внутримышечно

Собаки

— I____И'

Сутки после »ргжения:

-пероріпьно

- ПмуТрииышвМНО

3

Кролики

г.'1 >ї>і іііі» т ■

Сулкн поел* заражения;

-перорально

-внутримышечно

Мыши

щ к зо Сутки поем зіріямня;

порорэпьиа внутримышечно |

Рис. I, Динамика выделения вируса болезни Тешена с экскретами экспериментально инфицированных животных

Таблица 2

Уровень ВНА в сыворотках крови животных, заражённых нерорально __вирусом болезни Тешена_

Вид животного Титры ВНА в сыворотках крови, сут. п/з:

0 14 47 60

кролики 0 0 1:16-1:32 Н.и. 0

собаки 0 0 1:32-1:64 Н.и, 0

морские СВИНКИ* 0 0 1 1:4-1:16 1:16-1:64 Н.и.

крысы 0 0 1 1:16-1:32 Н.и. 0

МЫШИ 0 0 | 1:4-1:16 Н.и. 1:4-1:16

Примечания: «О»- отсутствие ВНА в сыворотках крови; «Н.и.»- не исследовали; «*»-

заражены в/м; «п/з»- после заражения

Полученные результаты показывают, что вирус БТ способен персистировать в организме перечисленных видов животных даже на фоне циркуляции ВНА.

2,2.4. Определение патогенности вируса болезни Тешена, выделяемого биологическими переносчиками с экскретами в окружающую среду.

После установления факта персистенции возбудителя БТ в организме грызунов и плотоядных определяли патогенность для свиней возбудителя, выделяемого животными этих видов в окружающую среду с экскретами. В ходе эксперимента интактным свиньям скармливали сухие корма, контаминированные вирусом БТ из экскретов заражённых грызунов или плотоядных.

При заражении свиней вирусом, прошедшим пассаж на собаках, крысах, морских свинках у них развивались клинические признаки болезни Тешена, характерные для заболевания свиней в естественных условиях. Первые клинические признаки заболевания отмечены на 14-29 сутки после заражения. Гибель наступала на 6-9 сутки после начала проявления клинических признаков. В первые дни заболевания отмечали изменения в общем состоянии, в дальнейшем у свиней отмечали клинические признаки поражения ЦНС: «плавательные движения», нистагм, тремор, парез мышц шеи и головы, повышенная кожная чувствительность.

На вскрытии свиней, павших и вынужденно убитых с клиническими признаками болезни Тешена, патологические изменения обнаружены в головном мозге - признаки негнойного энцефаломиелита, что характерно для данной болезни. При проведении вирусовыделения из внутренних органов свиней получены следующие результаты (табл. 3).

Полученные данные свидетельствуют, что после заражения свиней вирусом, прошедшим пассаж на грызунах и плотоядных, с наибольшей частотой вирус БТ обнаруживается в поджелудочной железе и толстом отделе кишечника. После заражения свиней вирусом БТ, прошедшим пассаж на

собаках, вирус удаётся выделить из всех исследованных отделов головного мозга. Максимальное накопление вируса происходит в мозжечке, спинном мозге и толстом отделе кишечника.

Таблица 3

Результаты вирусовыделения из патологического материала свиней заражённых лерорально вирусом, прошедшим пассаж на биологических переносчиках (ТОД^)

п—3

Органы Вия биологического переносчика:

крысы (24) собаки (21) морские свинки (31)

Головной мозг: аммоновы рога -

мозжечок - Ю','м±0.42 -

центральная доля - -

лобная доля - 10''±0,42 !

Спинной мозг Ю*'и>±0.07 10*'"±0,18 Н.н.

Поджелудочная железа 10'^±0.07 1 10*"1а±0,05 +

Мышечная ткань 1 -

Селезёнка, печень, почки - - Н.и.

Лйгхие 1 10;*ои±0,00 - Н.и.

Тонкий отдел к-ка ) Ю^^О.Ю 10^^0,08 Н.и.

Толстый отдел к-ка | Ю^О,^ 10^±0,13 -

Примечание: (24)- сутки после заражения свиней

Заражение свиней вирусом, прошедшим пассаж на кроликах, не вызывает проявления клинических признаков заболевания и гибели животных, однако обуславливает протекание болезни в иналпарантнои форме - образованием в крови ВНА и вирусоносительством в течение не менее 30 суток.

При выделении вируса из внутренних органов свиней, вынужденно убитых на 50, 57 сутки после заражения, вирус обнаружен лишь в поджелудочной железе в титрах 10й- Ю1,и ТЩ^ач«» соответственно.

Для определения сроков и интенсивности выделения вируса болезни Тешена свиньями, инфицированными вирусом, прошедшим пассаж на грызунах и плотоядных, изучали динамику выделения вируса заражёнными свиньями с экскретами в окружающую среду (рис. 2).

Сутки после зараження - • Гл СБТ п йіснретої іс^с ■ И'П'І ВЫ ні »кыретй* ЄФ6»к —#—г.) СБГ экс*р*?ов «рагиюз

Рис, 2. Динамика выделения вируса болезни Тешена с экскретами свиней, инфицированных вирусом, прешедшим пассаж на грызунах и плотоядных

Как свидетельствуют данные рисунка выделение віфуса БТ с экскретами свиней продолжается с 4 по 30-е сутки (время исследования) после заражения вирусом, прошедшим пассаж на крысах, собаках и кроликах.

После заражения свиней вирусом, прошедшим пассаж на морских свинках, выделение вируса БТ с экскретами начинается на 12 сутки после заражения и продолжается до окончания срока наблюдения - 43 суток.

При исследовании сывороток крови в РН установили, что инфицирование свиней вирусом БТ, прошедшим пассаж на грызунах или плотоядных, вызывает образование в крови ВНЛ в титрах 1:2-1:512 с максимумом значений 1:1281:512 на 14-31 сутки после заражения.

2.2.5. Разработка и сравнительная оценка эффективности методов выявления вируса болезни Тешена в органах и тканях заражённых животных

Пряной метод гистохимического иммуноферментного анализа мазков-отпечатков на основе МКА, обладающих специфичностью к вирусу болезни Тешена, и метод выделения вируса болезни Тешена на культуре клеток ПТП.

При проведении исследований, из 13 проб патологического материала методом прямого ПХ ИФА для мазков-отпечатков вирус удалось обнаружить в 7 пробах, активность вируса в которых составляла 102л - Ю4,0 ТЦД;ащ, тогда

как методом вирусовыделения на культуре клеток ГГГП выявлено 9 положительных проб с активностью вируса от 101'5 ТЦЦ;<Умя. Таким образом, чувствительность прямого метода ГХ ИФА для мазков-отпечатков составила Ю2,0 ТЦДїоам В контрольных материалах вирус не обнаружен ни одним из методов.

Метод полимеразной цепной реащии и метод выделения еируса болезни Тешена на культуре клеток ТГПІ.

При проведении исследований, из 9 проб патологического и клинического материалов методом ПЦР вирус БТ обнаружен в тех же пробах, в которых данный вирус выделен методом вирусовыделения на культуре клеток ПТП. Активность вируса в положительных пробах составляла 101,5 - 104'' ТЦЦ№и11. Чувствительность метода ПЦР составляет 10и ТЦД50Лчл.

2.2.6. Изучение защитных свойств вакцины против болезни Тешепа с использованием метода межвидовой передачи возбудителя.

Разработанный метод контактной передачи использован нами для определения дозы вакцины, необходимой для защиты свиней от заболевания и вирусоносительства в естественных условиях.

Динамика образования вируснейтралюуюирсс антител в сыворотке крови вакцинированных свиней в зависимости от дозы вакцины

Свиней, вакцинированных разными дозами вакцины прогин болезни Тешена, на 27 сутки после вакцинации заражали вирусом БТ, прошедшим пассаж на крысах. Доза заражения свиней вирусом - Ю*'1 ТЦДздгол. После вакцинации и контрольного заражения у свиней периодически отбирали сыворотку крови для определения уровня ВНЛ (табл. 4).

После контрольного заражения никаких отклонений от нормального клинического состояния у вакцинированных свиней выявлено не было. На 20 и 22-е сутки после заражения свиньи №9 и №10 пали с клиническими признаками болезни Тешена.

го

Таблица 4

Уровень ВНА в сыворотках крови свиней после вакцинации __и контрольного заражения_

. групп ж-х ЛШ подсв. Доза вакц., мл Сутки после вакц. Сутки после заражения:

0 27 14 30 50

I 1 2 0 1:64 Н.и. Н.и. 1:256

2 2 0 1:64 Н.н, Н.н, 1 1:256

2 3 2 0 1:12В 1:2048 1:2048 1:1024

4 2 0 1:64 1:1024 1:1024 1:512

3 5 1 0 1:128 1:1024 1:1024 1:1024

6 1 0 1:32 1:1024 1 1:512 1:256

Л 7 0,5 0 1:8 1:128 і 1:512 1:256

0,5 0 1:3 1:123 1 1:256 1:128

5 9 - 0 0 1:32 1 Пала Н.и.

10 - 0 0 1:16 \ Пала Н.и.

11 1 0 0 1:32 і 1:128 1:64

Примечание: «-»>- не вакцинированы

Влияние дозы вакцины на продолжительность выделения вируса БТ с экскретами свиней после их заражения

При определении динамики выделения вируса БТ из организма с экскретами свиней, вакцинированных в разных дозах, исследования показали, что длительность выделения вируса с экскретами у животных всех трёх групп, подвергшихся вакцинации в дозе 2,0; 1,0 и 0,5 мл составила 24, 32 и 41 сутки, соответственно, тогда как заражённые животные, не подвергшиеся вакцинации, выделяют вирус на протяжении всего срока наблюдения (59 суток) (рис.3). Причём выделение вируса с экскретами свиней происходит на фоне высоких титров ВНА 1:1024-1:2048 (табл. 4).

Проведённое вирусовыделенне ш патологического материала на культуре клеток ПТП от контрольных и вакцинированных разными дозами вакцины свиней показало, что на 52 сутки после заражения у вакцинированных свиней вирус БТ не обнаружен ни в одном из исследованных органов, кроме поджелудочной железы, в которой вирус БТ не обнаружен у лишь свиньи, вакцинированной в дозе 1,0 мл. У контрольного нсвакщшированного подсвинка, вирус обнаруживается в поджелудочной железе, тонком и толстом отделах кишечника.

Сутки посте вакцинации 2 мл- » - 1мп — —0,5 мя— — невакц.

Рис. 3. Динамика выделения вируса болезни Тешена с экскретами вакцинированы ыми свиньями.

3. ВЫВОДЫ

1. На основании результатов эпизоотологического мониторинга на территории Смоленской, Московской, Воронежской, Орловской, Белгородской областей Российской Федерации установлена циркуляция вируса болезни Тешена, антигенно-родственный штамму «Навля-96», на территории Тверской и Новгородской областей - штамму «Закарпатский» вируса болезни Тешена.

2. Методом ПНР с использованием праймеров, комплементарных последовательности гена белка Ур1, установлено генетическое различие штаммов «Навля-9б» и «Закарпатский» вируса БТ.

3. Установлено, что крысы, мыши, собаки, морские свинки, кролики являются биологическими переносчиками возбудителя болезни Тешена. При этом установлено, что вирус способен персистировать в организме крыс не менее 20 суток, мышей- не менее 60 суток, собак- не менее 26 суток, кроликов-не менее 8 суток после перорал ьного заражения вирусом БТ. В организме морских свинок- не менее 43 суток после внутримышечного заражения.

4. Установлено, что биологические переносчики после перорального заражения вирусом БТ способны выделять в окружающую среду с экскретами возбудитель с инфекционной активностью: крысы - 104,и-101,м ТЦЩод,^ мыши -

Ю4'0*1010 ТЦДда^ собаки - Ю^-Ю3-25 ТЦЦ^ кролики - Ю2'Мо!'75 ТЦД^ морские свинки (после заражения внутримышечно) - 10^-101,0 ТЦЩсли.

5. В результате моделирования эпизоотического процесса при болезни Тешена установлено, что грызуны и плотоядные являются одним из необходимых звеньев в эпизоотической цепи при БТ и обусловливают формирование и поддержание природных очагов БТ.

6. Заражение свиней возбудителем БТ от биологических переносчиков разных видов, вызывает разные формы проявления болезни Тешена. Острое течение болезни у свиней наблюдается при заражении их вирусом, прошедшим пассаж на собаках или морских свинках. Заболевание в подострой форме, но так же с проявлением характерных клинических признаков болезни, вызывает вирус БТ, прошедший пассаж на крысах. Заражение вирусом БТ, прошедшим пассаж на кроликах, вызывает у свиней латентную инфекцию, характеризующуюся длительным выделением возбудителя в окружающую среду с фекалиями без проявления клинических признаков болезни и образованием ВЫЛ в крови.

7. При проведении вирусологического мониторинга БТ наиболее эффективными методами обнаружения ВБТ в органах и тканях заражённых ЖИВОТНЫХ ЯВЛЯЮТСЯ вирусовыделение на чувствительной культуре клеток 11111 и ПЦР. Эти методы позволяют выявлять вирус в клиническом и патологическом материале при его накоплении в титре от Ю1'0 и Ю1,5 ПДД^щ^ соответственно,

8. Прямой метод ПС ИФА для мазков-отпечатков на основе МКА к вирусу БТ является наиболее пригодным для посмертной диагностики болезни Тешена как самый экспрессный и позволяет выявлять вирус болезни Тешена в патологическом материале при активности 102,0 ТЦД^^а в течение 3 часов.

9. Вакцинация свиней против болезни Тешена в дозе от полной до % предохраняет их от персистенции вируса в организме животных, а так же ограничивает время выделения вируса в окружающую среду с экскретами сроком до 41 суток.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 .Разработаны «Методические указания по моделированию эпизоотического процесса и контролю протективных свойств вакцин против болезни Тешена на основе межвидовой биологической передачи её возбудителя», утверждённые директором ГНУ ВНИИВВиМ 22.01.2001.

2. Разработаны «Методические указания по выявлению РНК энтеровирусов свиней методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ 10.07.2003.

3. Разработан «Набор препаратов для диагностики болезни Тешена твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител».

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Андреева О.Н., Кадетов В.В., Жигалева О.Н. Контроль полноты инактивации вируса при изготовлении инактивированной культуральной эмульгированной вакцины против болезни Тешена // Ветеринарные и медицинские аспекты зооактропонозов: Труды Междунар. науч.- иракт, конф., посвящ. 45- летию института, 24-26 сентября 2003 г.- Покров, 2003.-Ч.2.- С,503-505.

2. Бузуй АЛ., Андреева О.Н. Оптимизация лабораторной модели дополнительного биологического хозяина возбудителя болезни Тешена // Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, болезнь Крейтцфельда-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: Материалы Междунар. науч.-практ. конф., 30-31 мая 2001 г.-Покров, 2001.-С.168-171.

3. Бузун А.И., Андреева О.Н., Цыбанов С.Ж. Выявление РНК вируса болезни Тешена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) Н Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, болезнь Крейггцфельяа-Якоба и другие прионные болезни; ллстсриоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: Материалы Междунар, науч.-практ. конф., 30-31 мая 2001 г.-Покров, 2001.- C.178-I80.

4. Выявление РНК вируса болезни Тешена с помощью ПЦР / Пантюшенко М.С., Жигалева О.Н., Андреева О.Н., Цыбанова В.А., Стрижаков A.A., Копытов В.Ю.// Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Междунар. науч.- практ. конф., посвящ. 45- летию института, 24-26 сентября 2003 г.- Покров, 2003.- 4.2.-С.454-457.

5. Изучение передачи возбудителя болезни Тешена свиньям от морских свинок / Андреева О.Н., Бузун А.И., Стрижаков A.A., Власов А.Н., Коломыцев А.А,!! Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и

их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы Междунар. науч.-практ. конф., 16-18 апреля 2002 г.- Покров, 2002.-С.91-93.

6. К изучению смешанных паразитоценозов болезни Тешена и классической чумы свиней / Бузун А.И., Сидоров ИЛ., Андреева О.Н., Колбасова О.В., Стрижаков A.A. // Нейроинфехции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, болезнь КреЙтцфельда-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: Материалы Междунар. науч.-практ. копф., 30-31 мая 2001 г.-Покров, 2001.-С.171-174

7. Мониторинг циркуляции возбудителя болезни Тешена в России 1 Коломыцев A.A., Середа А.Д., Андреева О.Н., Стрижаков A.A., Бузун А.И., Лукьянов С.Б., Калантаенко Ю.Ф., Мантров С.А., Чеботарёв В.Г., Лагупш H.A. // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Междунар. науч.- пракг. конф., посвящ. 45- летию института, 24-26 сентября 2003 г.Покров, 2003.- Ч.2.-С.З60-365.

8. Разработка гистохимического метода иммуноферментного анализа для обнаружения и идентификации антигена вируса болезни Тешена / Власов АЛ., Стрижаков A.A., Сургучёва И.М., Балашова Е.А., Андреева О.Н, // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей; Материалы Междунар. науч.-практ. конф. 16-18 апреля 2002 г.-Покров,2002,-С .303-306.

9. Совершенствование вакцинопрофилактики болезни Тешена / Бузун А.И., Середа Л.Д., Жестерев В.И., Стрижаков A.A., Кропотов B.C., Андреева О.Н., Шубина НХ. //Ветеринария.- 2001.-.4» 12,- С.-16-18.

10. Сравнительная оценка методов обнаружения вируса болезни Тешена в пробах патологического материала / Андреева ОЛ., Пантюшенко М.Е., Стрижаков A.A., Жигалева О.Н., Цыбанова ЛЛ. // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Тез. докл. 4-й Всерос. науч.-практ. конф., 22-24 октября 2002 г.- М„ 2002,- С.316-318.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров, Владимирской области Тираж 70 эю.

*-2890

1.1 Актуальность темы

Энтеровирусный энцефаломиелит свиней (болезнь Тешена) является одной из опасных инфекционных болезней свиней. Болезнь имеет широкое распространение во многих странах мира, а также в некоторых, в основном западных регионах России.

С момента появления болезни в нашей стране проведён широкий комплекс научных исследований по изучениию физико-химических и биологических свойств возбудителя болезни Тешена, разработке методов диагностики, средств специфической профилактики болезни (Балышева В.И., 1978; Романенко В.Ф. и др., 1978; Цыбанов С.Ж., 1981 г.; Бузун А.И., Жестерев В.И. и др., 1998). Изучению вопросов межвидовой передачи возбудителя болезни Тешена положил начало Бузун А.И. (1997), которым впервые был выявлен дополнительный биологический переносчик возбудителя.

Однако, несмотря на значительные успехи в изучении болезни Тешена, она продолжает регистрироваться на территории РФ и стран ближнего зарубежья, нанося значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам.

Первые сообщения о болезни Тешена на территории СССР были приведены П.Н. Андреевым в 1948 г. Официально же болезнь впервые установлена в СССР в 1972 г., в Закарпатской области Украины. Первые вспышки болезни Тешена на территории России (Брянская область) были зарегистрированы в 1982 г.

За последние 5 лет болезнь значительно расширила свой ареал на территории России. Если в 1999-2000 гг. болезнь регистрировалась лишь на отдельных территориях областей, граничащих с неблагополучными по БТ Украиной и Белоруссией, то к 2001-2003 гг. наметилась тенденция к расширению ареала этой инфекции к центральной части Российской Федерации.

Принятые меры борьбы с болезнью Тешена обеспечили значительное снижение эпизоотической напряжённости по этой болезни, однако их выполнение до настоящего времени не позволяет полностью искоренить инфекцию как в нашей стране, так и во многих странах мира. Однажды появившись в энзоотических зонах, в том числе на фоне широкого проведения вакцинопрофилактики, болезнь проявляется там в течение продолжительного времени.

Таким образом, вопрос энзоотичности болезни Тешена - её главной эпизоотологической особенности, до настоящего времени остаётся одним из актуальнейших в связи с трудностью искоренения болезни, широким её распространением и способностью формировать стационарные очаги.

Ранее в представлениях о механизмах передачи возбудителя БТ всем животным, кроме свиньи, отводилась роль механических переносчиков. Однако анализ динамики и ландшафтно-географических закономерностей эпизоотий болезни Тешена заставляет предположить, что в эпизоотическом процессе при болезни Тешена некоторые виды животных, наряду со свиньями, играют роль биологических переносчиков возбудителя болезни Тешена.

В связи с вышеизложенным, является актуальным проведение работ по эпизоотологическому моделированию болезни Тешена, выявлению возможных биологических переносчиков её возбудителя для расширения представлений об эпизоотологии и ведущих механизмах эпизоотического процесса при этой болезни, усовершенствованию научно-методических подходов при оценке эффективности средств специфической иммунопрофилактики болезни Тешена.

5 Выводы

1. На основании результатов эпизоотологического мониторинга на территории Смоленской, Московской, Воронежской, Орловской, Белгородской областей Российской Федерации установлена циркуляция вируса болезни Тешена, антигенно-родственный штамму «Навля-96», на территории Тверской и Новгородской областей - штамму «Закарпатский» вируса болезни Тешена.

2. Методом ПЦР с использованием праймеров, комплементарных последовательности гена белка Vpl, установлено генетическое различие штаммов «Навля-96» и «Закарпатский» вируса БТ.

3. Установлено, что крысы, мыши, собаки, морские свинки, кролики являются биологическими переносчиками возбудителя болезни Тешена. При этом установлено, что вирус способен персистировать в организме крыс не менее 20 суток, мышей - не менее 60 суток, собак - не менее 26 суток, кроликов - не менее 8 суток после перорального заражения вирусом БТ. В организме морских свинок - не менее 43 суток после внутримышечного заражения.

4. Установлено, что биологические переносчики после перорального заражения вирусом БТ способны выделять в окружающую среду с экскретами возбудитель с инфекционной активностью: крысы - 104,75-101,25 ТЦД50/МЛ, мыши -104*0-101 ТЦЦзо/мл. собаки - 103'5-103'25 ТЦЦ50/мл, кролики - 102'5-10''75 ТЦЦ50/мл, морские свинки (после заражения внутримышечно) - 102'5-102'° ТЦД5о/мл.

5. В результате моделирования эпизоотического процесса при болезни Тешена установлено, что грызуны и плотоядные являются одним из необходимых звеньев в эпизоотической цепи при БТ и обусловливают формирование и поддержание природных очагов БТ.

6. Заражение свиней возбудителем БТ от биологических переносчиков разных видов, вызывает разные формы проявления болезни Тешена. Острое течение болезни у свиней наблюдается при заражении их вирусом, прошедшим пассаж на собаках или морских свинках. Заболевание в подострой форме, но так же с проявлением характерных клинических признаков болезни, вызывает вирус БТ, прошедший пассаж на крысах. Заражение вирусом БТ, прошедшим пассаж на кроликах, вызывает у свиней латентную инфекцию, характеризующуюся длительным выделением возбудителя в окружающую среду с фекалиями без проявления клинических признаков болезни и образованием ВНА в крови.

7. При проведении вирусологического мониторинга БТ наиболее эффективными методами обнаружения ВБТ в органах и тканях заражённых животных являются вирусовыделение на чувствительной культуре клеток ПТП и ПЦР. Эти методы позволяют выявлять вирус в клиническом и патологическом материале при его накоплении в титре от 101'0 и 101,5 ТЦД5о/мл, соответственно.

8. Прямой метод ГХ ИФА мазков-отпечатков на основе МКА к вирусу БТ является наиболее пригодным для посмертной диагностики болезни Тешена как самый экспрессный и позволяет выявлять вирус болезни Тешена в патологическом материале при активности Ю2,0 ТЦД50/Мл в течение 3 часов.

9. Вакцинация свиней против болезни Тешена в дозе от полной до 1Л предохраняет их от персистенции вируса в организме животных, а так же ограничивает время выделения вируса в окружающую среду с экскретами сроком до 41 суток.

6 Практические предложения

1 .Разработаны «Методические указания по моделированию эпизоотического процесса и контролю протективных свойств вакцин против болезни Тешена на основе межвидовой биологической передачи её возбудителя», утверждённые директором ГНУ ВНИИВВиМ 22.01.2001.

2. Разработаны «Методические указания по выявлению РНК энтеровирусов свиней методом полимеразной цепной реакции», утверждённые директором ГНУ ВНИИВВиМ 10.07.2003.

3. Разработан «Набор препаратов для диагностики болезни Тешена твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител».