Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Некоторые аспекты экологии Bacillus alvei



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ^ дВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРИИ, ГИГИЕНЫ И ЭКОЛОГИИ

На правах рукописи

СОСНИ НА Виктория Викторовна

УДК 619:614,48:651.3

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОЛОГИИ BACILLUS ALVE1

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва, 1994

Работа выполнена во Всероссийском ордена Дружбы народов научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор А. В. Куликовский Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор В. М. Карташова

(ВНИИВСГЭ) кандидат биологических наук 3. Н. Меньшикова

(Московская государственная академия ветеринарной медицины и прикладной биотехнологии)

Ведущая организация — Всероссийский научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

, _

Защита состоится « ¿9 » ¿¿¿ИУ*^- 1995 г_ в-»¿'часов на заседании специализированного Совета Д.020.50.01 при Всероссийском ордена Дружбы народов научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе д. 5, ВНИИВСГЭ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВСГЭ.

Автореферат разослан « з> 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Л. П. Пименова

I. ОБЩИ ХАРАКТЕРИСТИКА РйБОТЯ

1.1. Актуальность темы. Экология микроорганизмов во внешней среде является новыы, теоретическим направлением в иикробиологической наукз. Оно витеет в себя различные аспекта поведения иикробной популяции во внешней среде,обеспечивавшие устойчивость, выяшеиость и размножение в ней микроорганизмов.

Для ветеринарии.особенно для ветершарно-саштарной науки.особый интерес представляет исследования,связанные с поведением во внешней среде патогенных для сельскохозяйственных животных микроорганизмов.

Используя оригинальные методы и прецизионное оборудование, в наией стране впервые были выполнены работы,раскрывавшие нногие аспекты экологии во вненней среде популяций таких патогенных бактерий, кдкгиерси-ний, сальмонелл, грибов кандида, микобактерий.-возбудителей туберкулеза ( И.Б.Павлова и др., 1990, Й.В.Криковский и др.. 1930,Т.Г.Путина, 1989, О.Лштенирова,1990,А.И.Касышенко,1992). Было установлено итого характерных морфологических изменений в попряции кикроорганкзков.ииекдос кесто при воздействии на них биотически и абиотических ©акторов внегней среды.а такзе в процессе естественного роста и развития.

Окйко.следует подчеркнуть.что результат ваае^азанных исследований нельзя экстраполировать 1а все кикроорганизш,особенно га спорообра-зущие. Последние занимает особое место в игфждоошой патологии с\х ш-вотши.а их вшшаеиость и устойчивость во внезней среде создает трудности в борьбе и щэофнлактике вызванных ими заболеваний. Накненее изученной га этого семейства иикроорганизиов, является экология спороооб-разувда возбудителей болезней пчел,в частности- В.а1уе1.

Данный микроорганизм является одним из возбудителей европейского гнильца пчел - инфекционного заболевания. распространенного во всех регионах мира и наносящего больной увдрб пчеловодству.

Со вреши открытка данного заболевания ( 1827 г.) инрекция не

только ограшчилась европейским регионов, ко распространилась по всей континентам кира,нанося больвой экономический ущерб пчеловодству,Установлено, что гнильцовая сеиья на добирает в среднем 24-36.62 кеда, количество воска в больных семьях снизается в 2 раза, количество пчел (рои. отводки) уменькается в 3-7 раз по сравнении со здоровой пчелиной семьей. Количество расплода, вскармливаемого весной в больных семьях, сокращается на 34-45* (О.Ф.Гробов и др..1992).

В зтой связи очевидно, что борьба и профилактика европейского гнильца пчел будет иалозффективной без фундаментальных знаний экологии его возбудителей во внешней среде, и преаде всего В.а!уш, который является, в отличии от других возбудителей данной инфекции (Str.plut.on. М. faecalis.Str.apis) спорообразушадм микроорганизмом. Очевидно,что именно устойчивость этого микроорганизма во внеиней среде,его характерные биологические особенности будут определять в конечном итоге подбор дезшщм-цирукщ средств и ретан дезинфекции при европейском гнильце пчел.

Учитывая ваанун роль В.а1уе1 в этиологии европейского гнильца пчел, повсеместное распространение этого инфекционного заболевания, больвой экономический урон, наносимый им пчеловодству, изучение экологии В.а1ие1 во внешней среде жмется астцольной проблемой ветеринарной микробиологии,санитарии и гигиеш.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работа-изучить экологии В.а1ие1 со внекней среде, т.е. взаимоотношения популяции данного кикроорганизыа с внеяней средой, обусловливавшие его внзиваеиость, развитие и возкокность разишзения.

Для выполнения указанной цели в диссертащм бшш поставлены следунь цие задачи:

1. Провести изучение корфолегин. кцльтурально-биохиагческих свойств, чувствителыгасти к апибиотикаа и вижизаемости та различных объектах внешней среды В.аК/ей

2. Исследовать на популяционноа уровне субшкроскопическунз оргадаза-

цив B.aluei,

3. Изучить морфологический аспекты адгезии B.alvei га объектах внешней среды и определить его антагонистические свойства к некоторым патогенным бактерюм,

4. Провести исследование популяции B.alvei при воздействии абиотических факторов внесшей среды (высокой температуры и дезинфицирдаих средств).

Работа выполнена в соответствии с программой работ ВНИИВСГЗ по ре-вениш основных научно-технических проблем в период с 1991 - 1994 г.г.

1.3. Нацчная новизна. В результате проведенных исследований впервые: - изучены га популяционном уровне морфология и субыикроскопи-ческая организация вегетативных клеток и спор B.alvei;

-установлено, что B.alvei не только длительно вазивает на объектах вневней среды, но при наличии соответствующего субстрата, может адгезировать к нему.разиюяаться и формировать иикроколонии. окруженные развитии покровоа;

- изучены некоторые аспекты механизма неспецифической адгезии спор B.alvei и ее зависимость от рН окружащей среды и температуры;

- с применением метода электронной микроскопии установлено,что при неблагоприятных условиях (старение культуры,длительное нахокдение во .внезней среде) не происходит 100%-ного спороибразования.Часть популяции остается представленной вегетативными клеткани,находящимися е различных стадиях гетероморфного роста.характерного для L-трансфорнации неспорооб-разущих бактерий:

- определено влияние активации спор га их устойчивость к де-зинректантам. Впервые установлена антагонистическая активность данного микроргашзма к E.coli. S.typhiiuriuB. P.vulgaris, Y.enterocolitica. Pr.Borganii. Klebsiella, St.aureus, параметры которой обсчитаны ыорфо-денситометрическим методом с применением компьютера.

. 1.4. Практическая ценность. Показано,что система индикаторных бумажек (СИБ), серийно выпускаемых отечественной прошшсшюстьв для идентификации бактерий семейства ЕгЛегоЬаЛсгчасеа,колет быть исиользозана для индикации биохимических свойств В.а1иек

Установлены сроки выживания В.аМч на различных объектах пчеловод-ства.определена устойчивость возбудителя к антибиотикан,высокой температуре и дезипфектантан. Тем самым, дано научное обоснование о возьшзности включения В.акех в группу высокоустойчивых возбудителей инфекционных заболеваний (четвертуя группу) в действующей инструвдм ("Проведение ветеринарной дезинфекции объектов Еивотноводства",Н.,1383).

Результаты экспериментов,установивше снижение устойчивости спор В.а1уе1 к дезинфектантам за счет инициации их прорасташ1я (кратковреьен-кое прогревание),иогут быть использованы для разработки нового,эффективного режима дезинфекции при европейской гнильце пчел (за счет снкениа экспозиции и уменьшения расхода дезинфицирующих средств). Кроие этого, данные эксперименты дадт научное обоснование дврступенчатой (двухкратной) дезинфекции при данной инфекции.

Учитывая, что В.а1уе1 не считается патогенным для теплокровных еи-вотных и человека, выявленные нами антагонистические свойства этого кик-рооргапизиа в отиошши шиечной палочки, сальыонелл. протея, иерсший, проввденции, клебсиелп и золотистого стафилококка. иогут найти после дополнительных исследований соответствуйте щштаческое применение в ветеринарии и медицине.

Материалы диссертация Вали использованы в цикле лекций по падевой гигиене и экологии для студентов 5-го курса ветеринарно-саюггарного факультета Московского института прикладной биотехнологии.

1.5. Апробация полеченных результатов. Па материалам диссертации с дела! ш сообщения:

1.На национальном Конгрессе греческой ветершярно-иедицинской ассоциации (18-23 ноября 1ЭЗЗ г.,г.йфины).

2.На семинаре Московского общества пчеловодов (МОП),г.Москва. 1934.

1.6. Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 статей.

1.7. Сттщктчда и обгем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,собственных исследований, обсуждения,полученных результатов, выводов и списка использованной литературы.

Диссертация кзлоаена га 133страницах машинописного текста.содержит 7 таблиц! график,5 диаграмм и74 злектроннограмм(рисунгав),Список литературы включает 40 источников отечествеюшх и 39 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕН! ШЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и метода исследования.

Экспериментальная работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и санитарии в пчеловодстве Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии.гигиены « экологии в 1331-1394 г.г.

В опытах были использованы 3 втащи В.а1уе1:Н20Г,Н5 и Н104, полученные из лаборатории санитар»« в пчеловодстве ВНИИ ветеринарной санитарии. гигиены и экологии.

Все изученные атаман бши идентична по морфологии и культу. 1ль-но-биохимическиы свойствам. В опытах использовались вегетативные клетки и споры В.а1уе1.Пазки крьтурн ощшивали на спори по И.В. Пескову (1955) и просматривали под световым микроскопом. При завераенки спорообразования (90Х спор в микробной популяции) проводили смыв культуры В.а1-Уе1 яшщш физиологическим раствором и доводили их концентрации до 10? Полученную взвесь спор хранили в холодильнике при +4#С и использовали'во

всех последувцих экспериментах. При изучении поведения популяции B.alvei ш различных объектах вненней среда t дерево, кеталл, бязь, воцшаи пенопласт,а такге в воде),использовали общепринятую в ветеринарии кетодкку <ОЛ1олжов,1369)

Морфологии бацилл изучали в световой микроскопе (Biolar Pi, Польша) в иазках, а такае в прешрате монослойюй культуры.В процессе роста микрокультуры B.alvei производили (ротосьеы]<у в световом микроскопе.Биохимические свойства B.alvei изучали на дифферещмлъш-дгагностических средах с углеводааи,на пластшвд для биохимической дифференциации знтеро-бактерии С ГШДЗ) и на системе индикаторных буьшик (СИБ) для идентификации шкроорганизнов семейства Knterobacteriaceae.

Антагошстические свойства B.alvei испытали на следувдих культурах ихщюрпхмзшв: Staphylococcus aureus йтаАш 209-Р; Escherichia coli нтаам В; Proteus vulgaris errata 0-21; Yersinia enterocolitica итаиа 08 (получены в ИЗМ иы.Н.Ф. Ганалеи РАМН ); Providuncia uorganii; Klebsiella pneuaoniae референс-итаьш (получен из Швеции); Salmonella typhisuriua (выделен от больной птицы кандидатом ветерширных наук Й.И. Касъяненко). Все указанные ¡атаман наели типичные культурально-биохимические свойства.

Для изучения антагонистического эффекта и изменений морфологии микроорганизмов в популяции использовали шшипоровые фильтры,на которых выращивали культуру продуцента,а затей после его удаления высевали тест-культура.Количественное определение антагошсткчгского эффекта проводили методой коапьвтерной ыорфоденситоиетрической скстеш "Дга-иорФ".программы GINO-ZO (И.Б.Павлова.с соавт.,1934).

Изучение чувствительности к антибиотикам проводилось методом диффу-зки в агар с использованием букаашх дисков по методике,утверзденной Мкнзравоа СССРС19835.

Изучение наспещ^изспой адгезии на поверхности дерева и на токе личинки пчелы,а та:сс влияние различных значений рН и теипературы на адгезии спор B.alvei проводили га капроновых нитях по ыетодике,разработанной в лаборатории санитарной кикробиашгиии В1ШИЕСГЭ ( А.В.Куликовский,

И. Б. Павлова, i 993).

Определение бактерицидной активности дезинфицирущих средств осуществляли методом диффузии в агар (В.И.Вашлз,1Э77).По дашой методике была изучена устойчивость B.alvei к препаратам Buraton FIO и Lysovet (Германия).

Определение динамики гибели споровой популяции B.alvei при воздействии дезинфицирующих средств проводили по методике, рекомендованной ВОЗ (1981).

Устойчивость B.alvei к дезгафектантам определяли !И бязевых тестах (Й.Оолдаов.1975).ГСо данной методике бша испытана устойчивость к препаратам. полученным из лаборатории дезшлекции ВПИИВСГЗ (N2,N3.<PX,HK-n. ФН и Н),а такге к надуксусной кислоте. Кроме этого.на бязевых тестах была изучена устойчивость спор к высокой температуре (кипячении).

в

Для изучения устойчивости спор B.alvei к температуре 80 С использовали метод, аналогичный предломнноиу ВОЗ для испытания дезинфицирующих средстве 1981).

Для электронноыикроскопического изучения целых (интактных) бактериальных клеток их фиксировали нз медной подсоске с формваровой пленкой в парах 2Ж-ного глутарового альдегида в течение 20 кинут.Капельный диализ проводили по методике А.С.Тихоненко и И.А.Беспзловой (1S61). Полученные препараты после напыления углем просматривали в электронном микроскопе "Hitachi-800".

При приготовлении прегаратов для исследования популяции B.alvei в сканирдаеи и трансмиссионном микроскопе использовали метод, предложенный И.Б. Павловой и Н.П. Тарабукиной (1983).Заливку осуществляли в полимерные смолы. Ультратонкие срезы получали на ультратоые "LKB-4800" (Езе-ция). с noMoibD стеклянных ножей. Ноет готовили на приборе "Knife Maker - 78018, LKB" (1веция).Для контрастирования препаратов использовали лимоннокислый цитрат свинца по Reynolds( 1983).Съемку объектов проводили на электронном микроскопе "Хитачи-800" со сканирущей приставкой "Hitachi -8010"(Япония).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2,1. Особенности биологии и морфологии клеток B.alvei.

Изученные втамш B.alvei херово росли m МШ и через 18—24 часа (при 37°С) формировали бесцветные,прозрачные,крупные колонии неправильной форшл в виде ветвистых образований.Интересно отметить.что в процессе изучения формирующихся шкроколоний B.alvei в агаровоы ыонослое, иы обнаружили как бы гифоиодоб!Шй рост шкроорганизнов, который характерен для грибов и не описан у бацилл . При этой популяция вегетативных клеток бактерий формировала лоаный мицелий, состояний из извитых нитевидных образований. Подобное явление можно объяснить особенностью деления B.alvei.которое не сопровождалось немедленным расхоадением ыатеринской и дочерней клеток,что характерно для большинства аэробных бацилл. Позто-ыу,B.alvei не формировали цепочек из палочек,а создавали удлиненные нитевидные образования.

Вследствие активной подвиагасти B.alvei.yse через 48 часов микроорганизмы распространялись по всей поверхности агара, образуя сплошной налет грязно-аелтого цвета с характерным неприятным запахом.

Спорообразование B.alvei на Ш начиналось в первые сутки. Споры имели эллипсовиднуэ форму,располагались в материнской клетке центрально или терминально. На вторые сутки после лизиса иатершекой клетки споры выходили во внешта среда. Характерным являлось расположение спор в мазках параллельно друг другу,т.е.в виде частокола.

Спорообразование B.alvei в ШШ и» не наблвдали. Попытки получить и накопить кассу спор для исследований в специальной еидкой среде с набором солей,предлозеннуш Hashieoto (1960) для аэробных спорообразувэдк бактерий.закончились безуспеию. Это говорит о том.что длз развития и особенно спорообразования B.alvei требуется ряд спецщических аминекке-лот.на что указывали Knight,Prooa (1950).

Изучение биохимических свойств B.alvei показало ,что они является

характерными для этих микроорганизмов,за исклпчамем того,что атаки N5 не ферментировал мальтозу,но гидролизовал крахмал,в отличии от этаикоз

N104 и 20Г.а втахи 20Г -гидролизовал казеин,в отломи от итаююв N5 и N104. Нами было установлено,что система индикаторных бумажек обладает высокой чувствительностью в отноаенга В.а1-уй и с их поыощыз можно определить ферментации углеводов С лактозы,мальтозы. глюкозы,сахарозы, арабинозы и маннита) данными микроорганизмами.

Пластины.предназначенные для биохимической дифференциации энтеробак-терий.оказались нечувствительными в отновенш В.а1уей При изучении ан-тибиотикочувствительности В.а1уе1 установлено.что В.а1уе1 устойчив к гаь яоиксину.коноыицину и канамищну и проявляет вырагеннув чувствительность к стрептомицину, тетрациклину, олеандоницину.левомицетину и эритромицину (рис.1).

Подобная устойчивость В.а1уе1 к некоторым антибиотикам.по наяеку нненив,долив учитываться при лечении европейского гнильца пчел,а ее определение следует проводить в кахдом конкретном случае при выделении возбудителя.

ЧУВСТОИТИЛЫЮСТЬ Впс.а1ув1 К ПНТИБИОТИК/1М

оамндоммм

М! наличию«

шяютда ПенииА« клйкиМ! ксоклж

Рис.1

2.2.2. Электронномикроскопическое исследование В.а1уе1. Изучение интактных клеток В.а1ие1 в трансмиссионном электронном микроскопе показало, что 24-часовая бульонная культура била представлена

делящимися вегетативными клеткаш палочковидной Форш с закруглен; ¡ьки концами и перитрихиаяьно раепшютенными ггутикани.На концах ггутиков нам удалось впервые выявить вароввднне образования (утолаети), которые, по нашему кнопке.могут участвовать в фиксации клеток на субстрате (выполняя как бы Функции присосок) и способствовать характерному для этих микро-ергангомов ползучему росту.

Изучение микроколоний В.аКчм .выросших на МВД (24-часовая культура) свидетельствует о том,что микробные клетки находились в тесной ассоциации друг с /Фугеа. Часть популяции бшн представлена клетками в состоянии размножения,а остальные - находились на начальном этапе споруляции. Данный процесс характеризовался разбухашем вегетативной клетки,чаде всего - терминальна.

Основная часть популяции (около 502) споруяироваяа на МЛА на 4 сут-

о

т инкубировшмя при 3? С. Зрелые споры В.а1уе1.которые покидали мате-ринскуи клетц.выявлялись а сканвдк^ем электронном микроскопе в виде эллипсовидных образований длиной 2,&-4,0 мкы и таявдной 0,8-1.0 мкм. Поверхность спор бшн неровной,вероховатой и имела продольную исчерчен-ность. На концах спор хорово просматжались образования в виде"кляви-ков".Споры в популяции располагались в гесшй ассоциации .часто в виде "частокола" .что характерно дая данного микроорганизма. При более ми-тельном культивировании В.аЬе! на Шй било обнарушга.чго оставаиеся вегетативные клетки не спорцлирсвали.а находились в состоянии гетеро-«орсиого роста.Как правило.они располагались га крал микроколонии <в зоне «е активного роста).которая к этому времени 1ша локрыта развитой пленкой-покровом.Сканкруодая электронная иикроскопия 'позволила выявить находящиеся под покровом удлиненные, "змееподобные" форма клеток В,а1-УС1.а такге нелкие шровядные я неправильной 'Форш клетки с дефектной кяеточяоа стенкой.

При дальнейзем культивировании В.а1уе1 на Ш (13 суток) отмечали исчезновение удлиненных форм и преобладание среди вегетативных кяегок варовидных бактерий .морфологически напоминаяих сферопласты;некоторые кз

Нами были проведены зштсримрнташш исследовали по изучения влияния на адгезивнув способность В.а1ие1 различие значепй рН и температура окружащей среда. Эти исследования свидетельствуют о том.что пря пело'шых показателях рН среды и повышенных температурах, адгезивная способность спор В.а1ие1 резко падает,а при кислых-растет(рис.2).

Таким образом, в результате проведегаих исследований нани выявле-но.что адгезия спор В.а1уе1 при рН среда 9,0 почти в 20 раз меныге.чем при рН среда 3,0 и в 5 раз.чей при рН-7.0 (независимо от температура сж-рузащей среды). Это объаашстса теы.что при кисши значениях рН среда белки покровов спор находятся в изо электрической точке и поэтому электростатические силн отталкивания спор от объектов не действует (Яназатк. ¡гоппег.1Э90).

2.2.5. Из учение воздействия неблагоприятных факторов внезней среда на популяция В.а1уеи

При изучении выживаемости В.а1уе1 на тест-объектах (дерево,«е-таяя.бязь,вощина.пенопласт,вода) было установлено,что данный кикроорга-низ* оставался шшеспособным в течение 910 дней -га всех тест-объектах как в условиях помещения,так и вне его в различные -сезоны года -( срок ш-блидения). Такие длительные сроки выхнваеиосш бактерий объясняйся чрезвычайно высокой устойчивостью спор к воздействия неблагоприятных факторов внешней среда.

Однако, до сих пор остается неясна*, лак влияет ;на споры .сталь длительное пребывание в окрухавдей среде.-. С этой целью'-мн провели ¡исследо-

.0

■вание первичного посева 24-^исовой «уяьтурч, выросяей на Ш1А да 37 С после вшивания ¡в воде в течение 382 »суток. ¡Исследование данной популяции в сканярущек аяектронкои.вдкроскопе <показало,что ■морфология .вегетативных клеток отличается от ¡ранее наки списанной суточной ¡культура В.а1-■уе1.В1Ц)оснвй та -МШ.Зти .различия закстчаяись в тон^что бактерии .имели упорядоченное,■ волнообразное,цяпричестьспирашгае располояение ¡в лккро-

колонии .иногда в виде параллельно вддаих тягей .хорошо просматривавшихся под плешгай-пгафовом,которая заадает популяции микроорганизмов от воздействия неблагоприятных факторов.

Край колонки -был представлен в основном клетками.характерными для гетероморфного роста бактерий: мелкими и крупными шаровидными, которые иногда образовывали скопления клеток в виде гроздьев винограда,а тагае-мелкими клетками неправильной формы .Подобный гетероморфный рост ны габ-лвдали ранее только у старых культур В.аке1 .выросших на КПП.

Такое проявление морфологической изменчивости В.alvei.no нашему мнения,является отражением своеобразной формы адаптации к условиям длительного пребывания во внешней среде (воде).

Изучение термоустойчивости споровой популящм В.а1уе1 показало,что она достаточно чувствительна к воздействия высокой температуры.Так,чистая споровая культура этих микроорганизмов погибала на бязевых тестах при кипячении в течение одной минуты. Зто распирает наши познания о термоустойчивости спор В.а1уе1 .которые по данным fi.fi.Полякова (1975) в патологическом материале могут выдергивать кипячение в течение 10-25 минут.

о

Кратковременное прогревание популяции спор (2 мин при 80 С) не угнетало их жизнеспособность,а приводило к так называемому эффекту "инициации" прорастания. Так.при прямом посеве 1 мл. исходной культуры спор

В.а1уе1 .взятых из холодилышка.на твердую питательную среду через 24 ча-5

са вырастало 1.4*10 клеток, а после кратковременного прогревания количество выросших клеток не уменьшалось, а наоборот-даяе незначительно .увеличивалось до 1,45*10^.

Данное явление объясняется тем,что кратковременное воздействие высокой температуры на споры приводит к нарушив проницаемости споровых покровов,выходу из клеток ионов кальция.дипиколиновой кислоты,что в конечном итоге как бы "запускает" дремлщие в спорах механизмы. ответственные за их прорастание (й,В.1^риковский,1979 и др.).

При испытании отечественных дезинфектантов .которые использовались в

Ш-ной концентрации при экспозиции 3 часа (кроме препаратов 112 и N3, применявшихся без разведения) установлено,что все они не обладали споро-ЦИД1Ш действием в отнопении В.а^сп.а импортные - убивали споры в течение 3-х часов.

Учитывая,что кратковрекешое прогревание споровой популяции,согласно пазим данным, не влияет на ее »»неспособность,возникла необходимость изучения устойчивости "прогретых" спор В.аЬег к воздействия испытанных нани дезинфектантов. С этой целью была поставлена сери опытов по воздействии на "прогретые" споры отечественного препарата "Н",ке обладающего спороцщцш действием. Установлено,что данный препарат в 102-даЯ кш-

о

центрации при 3-х часовой экспозиц!« приводит к гибели "Г!рогретие" (80 С в течение 2-х минут) споры В.а^ек Из этого следует,что кратковременное высокотемпературное воздействие на споры В.а1уе1 выводит их из состоя пи криптобиоза, активизирует неханизиы прорастания и тем сакнм сгизает устойчивость спор к воздействии дезющмцирущнх средств.

Испытание сыеси глутарового альдегида (22) с анионным ПАВ (0,5%) показал о, что она вызывала гибель споровой популяции после часовой экспозиции. Однако, наиболее перспективным,как с точки зрения экологии окрузаз-щей среды,так и спороцидного действия в отнгаении В.а1ие1,оказалась над-уксусная кислота.

Данный препарат в 1%-ной концентрации приводил к гибели споровуа культуру в течение 2 часов. При изучении динаьшки гибели споровой популяции было установлено,что надцксусная кислота в указанной концентрации приводит к гибели больиуп часть споровой популяции в первые минута своего воздействия. Так,10% спор погибало .через 2,5 данутн (Т10),502 - через б кинут (Т50), 902-через И кищт (190) и 99£-через 18 кинут (Т9Э) соответственна (рис.3).

Динамик«» гибели спор Boc.elvpt при воздействии О.1^-кой кояуи—

СЦСКОЙ КИСЛОТЫ

-1-1-1-

зо

15 45

якспоакциа (в минутах)

1 оо to 1

-О . 1 -о . Ol -О . OOl О .0001

60

Рис. 3

Исследование корфологичсша изменений популяции спор B.alvei в динамике при воздействии 1Х-ной надцксусной кислоты с помоцьш сканирувдей электронной кикроскопии показало,что начальное воздействие (Т10) дезин-©ектанта не вызшает видимых морфологических изменений. Пись при субле-тальнса воздействие препарата (Т50) отмечали набухание отдельных спор и исчезновение кероховатости на их поверхности. При наступлении летального эффекта (Т99) выявляли набухание спор,размытость их контуроз.а у »асти ю них - поврегденке покровов с вкходои содервшго нар угу. .

Таким образом, полученные данные свидетельствует об определенных морфологических изменениях в популяции B.alvei при воздействии изученная абиотических факторов .которка выражаются наличием гетероморфкого роста у вегетативных клеток с присутствием серн,характерных для L-трансформации, и повревдением субмикроскопической организации спор.

2.2.6. Антагонистические свойства B.alvei.

В опытах по изучении микробного антагонизм было установлено.что B.alvei угнетал рост Staphylacoccus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhiiuriu«,Klebsiella pneusonia и Yersinia enterocolitica. Одаако.нзра-ду с зтиа,отмечалась низкая активность БЙВ B.alvei по отношении к Proteus vulgaris и Providencia eorganii. В этих случаях угнетения роста тест-культур визуально не наблцдапось и на фильтрах как в контроле,так и

в опыте отмечалось формирование наличных па плотности колоний.

Количествешия оценка глтаготсгтеского эдасктл с помоги телевизионной компьютерной морфоденситоаетрии показала,что биологически активные вещества, продуцируемые B.alvei, снизали численность популяции до 11,8% от исходной у Escherichia col i, до 12,2% у Salaonella typhiEuriira.flo 232 у Yersinia enterocolitica, до 2(Ü y Stapliylococcus aureus и Klebsiella pneumonía, до 71,47. y Proteus vulgaris и до 82,üZ у Providencia corga-пШрис.4).

Исследоваше центральных участков пятен под сканирук^м электронным микроскопом, где визуально был виден слабшз рост колоний или не регистрировался совсем показало, что основная часть клеток находилась в стадии гетероморфного роста, для которого хараггерш мелкие гвроввдшге Фор_____ _____________________________ __ мы. часть из которых

АНТАГОНИСТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Вое.nivel

сливалась в конгломераты, а тагае извилистые палочковидные и другие форны клеток. Аналогичная картина бши обнару-neia нами при изучении зон угнетения роста у Y.enterocolitica. Тагам образом, морфологичеасая сценка антагонистическо-

E.coU | í.oileroCTlItlci | St.»ur(«o ] providente «x&mil

S tytfiluriia Ilttslill« piwlonl« й-rtrai v4lg*-l> ГО ЭффвКТв O.alVeí ПО

Рис 4

отнопении к Staph. áureos и Y.enterocolitica показала,что действие кикроба-продуцента приводит к выраженному гетероморф-ному росту (характерному для L-трансформации) в популяции этих патогенных микроорганизмов.Следует таите подчеркнуть.что инструментальный катод изучения антагонистических свойств В.а1уе1(коапьатер:ш норфоденсито-метрия) позволил впервые провести количественную оценку его ингибирущего

НЯ РАЗЛИЧНЫЕ БАКТЕРИИ

•001-

90----

эффекта. Полученные результаты свидетельствует о том.что отсутствие видимого роста изученных патогенных баперкй при воздействии БАЗ В.аЬ/г! не свидетельствует о бактерицидном эффекте,а указывает на снигение количества клеток и изменение их морфологии.

3. Выводы

1. Впервые методой электронной кшфоскопии на популяциошшм уровне изучена субмикроскопическая организация В.а1чц1 и выявлена ее диссоциация,степень которой зависит от возраста культуры,наличия питательных ве-цеств и воздействия на нее неблагоприятных факторов внешней среды.

2. Установлено,что развитие популяции В.а1ие1 во внеишей среде при воздействии неблагоприятных биотических и абиотических факторов связано со спорообразованием болыашства вегетативных клеток. Одновременно наб-лздабтся и формирование гетероморфных форм С сферопласто-подобных. "гигантских тел",мелких палочковидных,шаровидных и нитевидных клеток),характерных для Ь-трансформации неспорообразукр« бактерий.

3. Методом сканирущей электронной микроскопии показано,что В.а1уеГ кокет не только вызизать во вневней среде .но при благоприятных условиях размноааться и формировать микрокапонии.Это говорит о наличии у данного микроорганизма сапрофитической фазы развития и вирокого спектра адгези-нов.позволявших В.а1^е1 не только вызывать инфекционный процесс у сивой личинки пчелы, но адгезкроваться и колонизироваться на ее поверхности (кутикуле). ,

4. Впервые изучены некоторые аспекты неспещ«ической адгезии В.а1-Уе1 к объектам вневней среды. Установлено,что неспециютеская адгезия зависит от температуры и рН внешей среды,достигая своих максимальных значений при рК-3,что коррелирует с изоэлектрической точкой белков,входящих в поверхностные структуры микроорганизмов.

5. Обнаружена способность В.а1уе1 расти на стандартных питательных средах с формированием ветвящихся "мицеливидных" кикроколоний. Впервые на поверхности сформированных колоний выявлены пленки-покровы.описанные

ранее и различных неспорообразув?!« ыикрэсрганизмов.

G. Установлено.что B.alvei вкмвал на различных объектах внеянсй среда: деревянной, металлической поверхностях.базе.всщяга.пенопласте и в водопроводной воде в течение 910 дней (срок наб.гадаш).

7. Показано.'по B.alvei устойчив к тетрациклину,олеацдоницкну.пет!-циллжу, полимиксину. монокицину,стрептомицину и чувствителен к левоки-цетгащ и зритрошщину. Споры дашого микроорганизма выдергивали кипячение в течение одной ыинуты и погибали (в лабораторных опытах) при воздействии 10Z-fflx растворов Lysovet U и Buraton F10 в течение 3-х часов, при воздействии 2%-даго глутаральдегида в смеси с 0.52-ныа ТЗЙС - в течение часа.

8. Остановлена динамика гибели споровой популяции при воздействии дезинфицирующих средств. Так.992 споровой популяции B.alvei погибает при воздействии 12-ной надуксусной кислоты через 18 мин,а спороцидцый эффект паблвдается через 120 кин.

Обнаружено снигенне устойчивости B.alvei к дезинфнциругким средствам

»

после кратковременного прогревания спор (80 С. 2 гам) перед воздействием абиотического фактора.

9. Впервые вишена способность B.alvei вырабатывать биологически-активные вецества.которые обладали хорошо выразешши антагошю-пгчес-юшя свойства® и сникали численность популяции E.coli на'83,2У., S.typ-hlnuritn - га 87,82. Y.enterocolitica - на IT/., Klebsiella и Staph.aure-us - га 742. Proteus vulgaris - на 28,5% и Prcvidencia sorganii - га 17.42,_______________________________,_____

10.Установлено,что отсутствие зоя видимого роста при воздействии га популяции сальшйеля я иерсиний БИВ, Бнрабатьвае-rax B.alvei,не свидетельствует о бактерицидном действии,а ят> гозорит о снкзении ганичества клеток и переходе их 8 стадий гетероисрфного роста.характерного для L-транарорнации бактерий.

4. СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАНИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Uocikuecu (Соснина)В.В. Электронношкроскопическое исследование Bacillus alvei в по1гуляции//Ветеринария.1993,112.с.26-28.

2.МоскалЕК (Сосшна)В.В. Адгезия и колонизация В.alvei на объектах внетей среда// Экологические проблем ветерииарной санитарии. Тезисы докл.научно-техн.ш©.. Ы.,1993,с.71-72.

3.Носкалак (Сосвша)В.В. Основные аспекты зкололм Bacillus alvei .//Доклады РйСХ11,1994,М1.с.45-17.

4.fl.Koulikovskii,Ü.Sosnina.Ecology of В.alvei in the environ-Eent.J.Greece Ueterinary-fiedical ßssociation.l934,45,N3.p.2-5.

5.Соснина B.B. Вишшг pH среди и температура на адгезии спор бациллы альвей//Тип!2ш.ветер!шрия и экология животноводства.Катериалы Все-рос.1иучно-произз.кокг.Чебонсарн,1934,с.404-405.