Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Особенности биоразнообразия условно-патогенных бактерий озера Байкал и их значение при оценке качества воды

На правах рукописи

ПАНАСЮК Елена Юрьевна

ОСОБЕННОСТИ БИОРАЗНООБРАЗИЯ УСЛОВНО -ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ОЗЕРА БАЙКАЛ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ ПРИ ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ

14.00.07 - гигиена 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск 2002

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института

СО РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.В. Дрюккер

доктор биологических наук, профессор Л.П. Игнатьева

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Р. В. Киборт

доктор медицинских наук, профессор Е.Д. Савилов

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете

Защита состоится «27» июня 2002 г. в 13 час. на заседании диссертационного совета Д-208.032.02 при Иркутском государственном медицинском университете.

Адрес: 664000 Иркутск, Красного Восстания, 1 Факс: (3952) 240 - 826

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «25» мая 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного сов

кандидат медицинских наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гигиеническое нормирование качества питьевой воды и санитарная охрана водных объектов в нашей стране предполагает строгий контроль за прямым и косвенным влиянием хозяйственной деятельности, бытового использования, сбросом разнообразных стоков в водоемы и водотоки. Это регламентируется Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ; Водным Кодексом Российской Федерации от 16 ноября 1995 г.; СанПиН 2.1.5.980 - 00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод»; СанПиН 2.1.4.1074 - 01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого снабжения. Контроль качества».

Санитарно-гигиеническая индикация качества вод ориентирована на показатели фекального загрязнения, значения которых свидетельствуют о потенциальном присутствии патогенных штаммов - возбудителей кишечных заболеваний. Однако, исследования последних лет отмечают, что скорость отмирания кишечной палочки в водных объектах выше, чем патогенных и особенно потенциально-патогенных бактерий, что является следствием высокой антропогенной нагрузки на оз. Байкал. Сбросы хозяйственно-бытовых, промышленных стоков, развитие рекреаций и судоходства привели к необходимости расширения числа гигиенических и микробиологических показателей, характеризующих качество воды. В СанПиН 2.1.4.1074 -01 микробиологическая оценка качества питьевой воды проводится по следующим показателям: термотолерантные колиформные бактерии, общие колиформные бактерии, общее микробное число (ОМЧ), колифаги, споры сульфатредуцирующих клостридий, цисты лямблий. Но помимо этих критериев для оценки санитарного состояния качества воды необходимы сведения о фоновом содержании потенциально-опасных бактерий в водоеме. Исследования микробиоценозов озера Байкал прошлых лет, в основном, ограничивались изучением физиологических групп бактерий: аммонификаторов, денитрофикаторов, целлюлозоразрушающих и др. Однако это направление работ, являясь важным в продукционных исследованиях, не позволяет проследить экологические изменения микробиоценозов водоемов, определяющих безопасность питьевой воды.

Выбранные нами для исследования условно-патогенные бактерии (семейства ЕгисгоЬайспасае и неферментирующей группы), обладают высокими

адаптационными возможностями при выживаемости в окружающей среде,

экологической пластичностью. Их значение возрастает как в этиологической структуре заболеваний, так и среди представителей естественных бактериальных сообществ. Кроме того, они несут потенциальную эпидемическую опасность для здоровья населения. В связи с включением Байкала в список Участков Всемирного наследия особый интерес представляет охрана этого водоема и изучение антропогенного влияния на него.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в обосновании применения условно-патогенных бактерий оз. Байкал, как дополнительных критериев оценки качества воды.

Для реализации поставленной цели определены следующие задачи:

1. Оценка влияния на озеро Байкал поступления в его бассейн разнообразных стоков.

2. Выделение и идентификация потенциально-патогенных бактерий из озера Байкал и основных притоков озера.

3. Исследование сезонного распределения, межгодовой динамики, доминирующих видов потенциально-патогенных бактерий, и использование этих данных для микробиологического мониторинга. Определение доли потенциально- патогенных бактерий по отношению к общему количеству культивируемых микроорганизмов, выделенных из воды озера.

4. Изучение свойств, характеризующих вирулентность микроорганизмов: антибиотикорезистентность, гемолитическая активность, рост при температуре 37°С.

5. Определение оптимальной температуры роста и развития потенциально-патогенных и автохтонных бактерий, выделенных из вод озера.

6. Исследование влияния низкой температуры и популяции автохтонной микрофлоры на рост и размножение потенциалыго-пагогенных и патогенных бактерий, в условиях лабораторного моделирования.

Научная новизна: Впервые из озера Байкал были выделены и идентифицированы более 898 штаммов условно-патогенных бактерий, являющихся представителями 31 вида. Показана приуроченность выделения данной группы бактерий к акваториям вблизи населенных пунктов, местам рекреаций, сброса сточных вод и устьям основных притоков. Изучено вертикальное и горизонтальное распределение условно-патогенных бактерий в водной толще озера Байкал. Впервые исследованы антибиотикорезистентность, гемолитическая активность и оптимальная температура культивирования условно-патогенных и гетеротрофных бактерий озера

Байкал. Доминирующие на протяжении многолетнего изучения виды условно-патогенных бактерий могут быть предложены, как дополнительные микробиологические индикаторы при оценке качества воды.

Практическая значимость работы: Данные проведенных исследований представлены в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Иркутской области в 1998 году» Государственного комитета по охране окружающей среды Иркутской области. Результаты проведенных исследований являются составной частью отчета по научно-исследовательской работе Лимнологического института СО РАН в рамках темы № 01960011465 « Разработка, апробация и внедрение новых методов биологического и химического мониторинга» и приняты к реализации по результатам научно-исследовательской работы № 1.6.16-1 «Комплексный экологический мониторинг экосистемы озера Байкал: обоснование, разработка новых методов и системы наблюдений, оценка состояния».

Теоретическая значимость. В работе обсуждены вопросы терминологии «патогенности», «вирулентности», «условной патогенности», так как в литературе мнения авторов расходятся. Показано, что антибиотикорезистентность и гемолитическая активность являются дополнительными факторами патогенности водных бактерий, которые так же необходимо учитывать при микробиологическом мониторинге озера Байкал. Результаты работы представляют интерес при рассмотрении вопросов, связанных с санитарно-гигиеническим нормированием безопасности воды, эволюцией водных экосистем, персистенцией условно-патогенных бактерий в объектах окружающей среды.

Защищаемые положения.

Научная новизна и практическая значимость работы, составляющие предмет защиты диссертации, заключаются в следующем:

В результате многолетних исследований впервые дана характеристика численности, биоразнообразия и пространственного распределения условно-патогенных бактерий (УПБ) озера Байкал. УПБ обнаружены в значительном количестве проб воды. Впервые установлено распределение этих бактерий в зонах антропогенного влияния: литоральные области озера, основные притоки, районы, прилегающие к населенным пунктам.

- Доминирующие виды потенциально-патогенных бактерий, выделенные из воды озера Байкал: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Burkhalderia cepacia, могут быть использованы как дополнительные

индикаторы в микробиологическом мониторинге для оценки качества вод озера Байкал.

- Впервые в сезонном и межгодовом аспектах изучен не только видовой состав, но и свойства потенциально-патогенных бактерий в сравнении с байкальскими гетеротрофами. Показано, что такие свойства как антибиотикорезистентность, гемолитическая активность и рост при температуре 37° С, являющиеся основными и дополнительными факторами патогенности, присущи не только УПБ, но и автохтонной микрофлоре озера Байкал. Низкая температура и автохтонная микрофлора озера Байкал не влияют на выживаемость потенциально-патогенных и патогенных бактерий в байкальской воде в условиях лабораторного моделирования. Использование полученных данных позволит усовершенствовать микробиологический мониторинг воды озера Байкал для сохранения чистоты его вод.

Апробация работы и публикации. Материалы исследований были доложены и обсуждены на: региональной научно-практической конференции «Биоразнообразие микроорганизмов Восточно - Сибирского региона и их научно-практическое использование», Иркутск, 1999; региональной научно-практической конференции «Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири», Иркутск, 2001; Российской научно-практической конференции, посвященой ¡00-летию со дня рождения профессора Е.В. Талалаева «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-сибирском регионе», Иркутск, 2002. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав, в которых представлены и обсуждены собственные результаты исследований, заключения, выводов, списка

литературы из _ источников. Материал диссертации изложен на _ страницах,

содержит_рисунков и __ таблиц.

Автор выражает благодарность научным руководителям зав. лабораторией водной микробиологии Лимнологического института СО РАН, д. б. н., профессору В.В. Дрюккеру, д. б. н., профессору Л. П. Игнатьевой. Выражаю искреннюю признательность ст. н. с. лаборатории водной микробиологии к. б. н., В. В. Парфеновой за поддержку, внимание и помощь в проводимых исследованиях, н.с. Т. Я. Косторновой, н.с. Бельковой Н. Л. и всем сотрудникам лаборатории за помощь на различных этапах работы.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Обзор литературы Роль потенциально-патогенных бактерии в экосистемах водоемов и водотоков.

Приводятся данные литературы по микробиологической индикации качества вод различных водоемов и водотоков, включая и объект исследования - озеро Байкал. Обсуждено распределение условно - патогенных бактерий в природных водных объектах. Рассмотрены вопросы о факторах патогенности, персистентности и влиянии условно-патогенных бактерий на автохтонную микрофлору водоема, санитарно-микробиологическое нормирование качества воды.

Объекты и методы исследования.

Отбор проб воды производили в озере Байкал и его основных притоках стандартным способом. В летний период пробы отбирались по всей вертикали от поверхности до придонного слоя на центральных станциях следующих разрезов: Южный Байкал: Солзан - Маритуй, Кадильный - Мишиха; Средний Байкал: Харауз -Красный Яр, Анга - Сухая, Болдаково - Ольхонские Ворота; Северный Байкал: Тыя -Немнянка, Елохин - Давша; в основных притоках озера (Рис. 1). Кроме этого, в зимний и летний сезоны мы изучали литоральные районы, примыкающие к населенным пунктам, где отбирались пробы воды с глубин 0 м, 5 м, 10-25 м, 50 м и из придонного слоя.

Для посевов воды использовались методы: а) глубинного посева 1 мл исследуемой воды [Родина 1965]; б) поверхностного посева 0,01 исследуемой воды [Родина, 1965]; в) метод посева на бактериальных фильтрах, с целью концентрирования проб воды [Парфенова,1984]; Изучались соответственно две группы микроорганизмов: байкальские гетеротрофные бактерии; условно -патогенные бактерии.

Идентификацию выделенных чистых культур бактерий проводили общепринятыми методами по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам [Приказ №535 Минздрава России и Методические рекомендации «Определение грамотрицательных потенциально- опасных патогенных бактерий», Москва,1987]: Дополнительно использовали тест-системы ММТЕ-1, ММТЕ-2, СИБ, ЬасЬета (Чехословакия). Результаты биохимической деятельности культур оценивались с помощью компьютерной программы "Баканализатор", степень гомологии при идентификации культур по биохимическим признакам достигала 70100%.

р.Кичера

р.Тьк р.РельГ

м.Епохин/

р. Верхняя 'Ангара

>.Фролиха р.Томпуда

1 Давша

р. Сарма;

ХуГ

Ангарск

р.бугульдейка ^

Б.Голоустная Иркутск, Л^стеянка]

порт Байкал

(Чи&ыркуйсхий

\»ЗПИ8.

(р. Баргузин

' Усть-Баргузин '•ГострфЬ Ольхон

р.Селенга

БольшаяРечка

эаикальск

р.Мишиха 'Танхой

• Отсутствие ППБ

♦ Наличие ППБ

О Населенный пункт

100

_2£>0 Километров

Рис.1. Схема отбора проб и распределение потенциально-патогенных бактерий, выделенных из озера Байкал.

Гемолитические свойства определялись по Методическим рекомендациям МЗ СССР "Выявление гемолитических, адгезивных и энтеротоксигенных энтеробактерий", от 23.02.1987 г. № 28-6/7, Москва 1987.

Антибиотикорезисгентность культивируемых бактерий определялась двумя методами: методом серийных разведений на твёрдых питательных средах и с использованием дисков 8-ми антибиотиков (тетрациклин, ампицилин, стрептомицин, полимиксин, канамицин, левомицетин, невиграмон, цефазолин) [Приказу Минздрава СССР №250 от 13.03.75 г].

Определение температурных оптимумов роста определяли методом инкубации посевов при температурах от +4°' до + 37° С. Динамику накопления биомассы микроорганизмов изучали нефелометрическим методом на спектрофотометре СФ-46.

Микробный антагонизм изучали с использованием музейных штаммов Esherihia coli (026), Shigella sonne, Shigella fiexneri, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium. Для эксперимента по изучению выживаемости условно-патогенных и патогенных бактерий в воде озера Байкал использовались клинические изоляты штаммов бактерий следующих видов: Salmonella typhi, Shigella Fiexneri 2a, Citrobacter freundii, Esherihia coli 026, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, которые высевались в стандартных количествах - 10б кл. /мл в стерильную и не стерильную байкальскую воду. Далее по контрольным высевам определяли кривые развития данных видов бактерий в условиях влияния низкой температуры и популяции автохтонной микрофлоры.

Распределение н биоразнообразие потенциально-патогенных бактерий, выделенных из воды озера Банка л и его основных притоков.

Анализ существующих материалов о состоянии качества воды Иркутской области показал, что все водоисточники подвергаются антропогенному, техногенному воздействию с различной степенью интенсивности. Удельный вес проб воды водоемов, не отвечающих гигиеническим нормативам по санитарно-химическим показателям изменился с 14,4% в 1997 г. до 18,7% - в 2000 г. По микробиологическим показателям, удельный вес нестандартных проб составил в 1997 г. -13,3 %; в 1998 г. - 15,2 %; в 1999 г. - 15,3 %; в 2000 г. - 18,2 % [Гос. доклад «О санитарно-эпидемиологическом состоянии Иркутской области» 1997-2000 гг.].

Основными источниками загрязнения озера Байкал'и факторами, влияющими на экосистему озера являются: промышленные и хозяйственно-бытовые сточные воды портов, городов бассейна реки Селенги, Селенгинский ЦКК; АО «Байкальский ЦБК»,

расположенный на берегу озера, стоки которого составляют основную долю (9195,6%) от сбрасываемых в бассейн озера недостаточно очищенных сточных вод; сельскохозяйственные предприятия Прибайкалья; туризм, рекреационная деятельность; порт Байкал, Листвянка; участок БАМа, проходящий по северной оконечности озера.

Особое внимание привлекают сбросы загрязняющих веществ в поверхностные воды, т. к. во-первых, не один из существующих методов очистки не обеспечивает полной гибели микроорганизмов, в том числе патогенных для человека. Во-вторых, недостаточно изучено комбинированное воздействие многокомпонентного состава стоков на популяции как микроорганизмов, зоо-, фитопланктона, а так же на безопасность питьевой воды, используемой человеком.

■ За весь период изучения нами было выделено 898 штаммов условно-патогенных бактерий, изолированных из различных районов озера, собрано и обработано более 1000 проб воды.

Из всего многообразия гетеротрофных бактерий в 1997-1998 годах были идентифицированы 24 вида, в 1998-1999 годах - 21 вид, а в 2000 году - 31 вид потенциально- патогенных бактерий. Количественные уровни этих бактерий, выделенных в различные сезоны года, закономерно достигали более высоких значений в летне-осенний период, и снижались в зимний. Максимально большое количество потенциально-патогенных бактерий было выделено летом 1998 г. и осенью 2000 г. - 57,7% и 47,3%, соответственно, от количества выделенных гетеротрофов. Пространственное распределение условно-патогенных бактерий (Рис. 1) показывает приуроченность их выделения к населенным пунктам, устьям основных притоков, местам сброса недостаточно-очищенных хозяйственно-бытовых стоков. В пелагиали озера, на глубинах озера изучаемая группа бактерий не выделялась даже при применении разнообразных методик выделения.

Общая видовая характеристика выделенных УПБ из озера Байкал в 1997-1999 годах представлена в таблице 1. В выделенной микрофлоре наблюдалось большое разнообразие видов псевдомонад - 6 видов и Enterobacter - 4 вида.

!! ;!

!, 1 I 1

I1 1 м

Рис. 2-5 Доминирующие виды ППБ, выделенные из оз. Байкал е 1998-1999 гг.

% „

Рис. 2.-В Доминирующие виды ППБ, выделенные из оз. Байкал & 1999-2000 гг.

Преобладающими видами УПБ в 1997-1998 гг. являются Acinetobacter calcoaceticum var. Jwoffi (7,8%), Alcaligenes spp. (3,9%), Ps. aeruginosa (6,3%), E. coli (2,6%) от всех выделенных гетеротрофных микроорганизмов. В 1998 - 1999 гг. преобладали также Acinetobacter calcoaceticum var. Jwoffi (5,3%), Alcaligenes spp. (3,4%), Ps. aeruginosa (2,4%), B. cepacia (1,9%), С. freundii (1,9). В 1999-2000 гг. преобладали С. freundii (13,7%), Ps. aeruginosa (6,8%), Enterobacter cloacae (6,8%), В. cepacia (4,7%) (Рис. 2 - А, Б, В).

Таблица 1.

Видовая характеристика УПБ, выделенных из озера Байкал в 1997-1999 годах.

№ Зима 1997-осень 1998гг. Зима 1998-осень 1999гг.

1. Acinetobacter calcoaceticum var. Joffe Acinetobacter calcoaceticum var. Joffe

2. Acinetobacter calcoaceticum var. anitratum Alcaligenes spp.

3. Alcaligenes spp. Burkholderia cepacia

4. Arizonae Citrobacter freundii

5. Burkholderia cepacia Citrobacter braakii

6. Citrobacter freundii Chryseobacterium greum

7. Enterobacter amnigenes Chriseomonas luteolla

8. Enterobacter intermedium Enterobacter aerogenes

9. Enterobacter aerogenes Enterobacter amnigenes

10 Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae •

11 Esherihia coli Enterobacter intermedium

12 Esherihia adecarboxilatic Esherihia coli

13 Erwinia spp. Klebsiella ozaene

14 Klebsiella ozaene Pr. agglomerans

15 Kozerella trabutsii Ps. aeruginosa

16 Ps. aeruginosa Ps. fluorescens

17 Ps. paucisnabilis Ps. paucisnabilis

18 Ps. putida Serracia marcenscens

19 Ps. stutzeri Serracia plumutica

20 Ps. oliminutae Flavobacterium meningosepticum

21 Ps. spp. Moraxella spp.

22 Pasteurella spp.

Выделение Acinetobacter calcoaceticum, Alcaligenes spp. проводилось и ранее на

Байкале, так как часть выделяемых условно-патогенных бактерий является составным

компонентом байкальского мнкробиоценоза. Однако, некоторые виды - Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Burkhalderia cepacia встречались в доминирующих количествах в тех районах Байкала, где наблюдался сброс сточных вод (районы южного Байкала) и в местах впадения основных притоков озера. Во всех сезонах изучаемого периода доля этих видов бактерий была выше, чем количество выделенной санитарно-показательной кишечной палочки. Доминирование на протяжешш всего периода изучения бактерий Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Burkhalderia cepacia свидетельствует о необходимости использования их как дополнительных критериев, характеризующих качество воды озера Байкал.

Многолетний санитарно-микробиологический мониторинг озера Байкал показал влияние основных притоков озера на внесение- загрязняющих веществ и аллохтонной микрофлоры, влияющих на качество его вод. Отмечено влияние рек Селенги, Баргузина, Голоустной, Верхней Ангары, Кичеры, Рель, Тыя, Немнянка.

Особым видовым разнообразием УПБ характеризуются: исток Ангары (влияние порта Байкал и населенного пункта Листвянка), поселок Большие Коты -река Котинка, дельта реки Селенги. Выделение ППБ в Баргузинском заливе обусловлено его географическим положением, а так же стоками сельскохозяйственного и животноводческого комплексов, расположенных в долине реки Баргузин (Рис. 1). Следует отметить, что на всем протяжении побережья озера имеет место сброс неочищенных хозяйственно-бытовых стоков [Гос. Доклад «О состоянии окружающей среды», 1997-2000 гг.]. В этих районах, УПБ выделялись без предварительной фильтрации, а значит, их количество было значительным. В тех же районах, где УПБ хоть и выделялись, но с предварительной фильтрацией, следует считать, что их количество относительно невелико. Районы наиболее подверженные влиянию сброса сточных вод характеризовались большим видовым разнообразием (Таб. 2). Таким образом, именно качественный состав условно-патогенной микрофлоры озера Байкал может служить критерием безопасности воды

Таким образом, распределение условно-патогенных бактерий носит неравномерный, локальный характер, обусловленный приуроченностью к местам более интенсивного поступления органического вещества, у

Таблица 2

Видовая характеристика УПБ, выделенных в из основных притоков озера Байкал.

№ Место отбора проб Видовая характеристика ППБ При меча ние

1 Пруд-аэратор БЦБК Providencia alcalifaciens, Providencia rustigiani, Burchalderia cepacia, Citrobacter freundii, Acinetobacter calcoaceticum var. Joffe, Acinetobacter calcoaceticum var. anitratum, Alcaligenes spp., Pseudomonas aeruginosa Enterobacter amnigenes, Enterobacter intermedium Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Esherihia coli *

2 Район сброса сточных вод БЦБК Burchalderia cepacia, Citrobacter freundii, Acinetobacter calcoaceticum var. Joffe, Acinetobacter calcoaceticum var. anitratum, Alcaligenes spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter amnigenes, Enterobacter intermedium, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Esherihia coli *

3 пос. Большие Коты Burchalderia cepacia, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae *

4 р. Селенга Enterobacter cancerogenes, Hafhia alvei, Esherihia coli Proteus vulgaris, Kluyvera criocrescens, Yokinella regensburgeri, Enterobacter cloacae * **

5 р. Мишиха Providencia alcalifaciens ***

6 р. Томпуда Esherihia coli, Burchalderia cepacia ***

7 0,5 км от р. Томпуды Esherihia coli ***

8 р. Кичера Serracia plumutica, Esherihia coli, Lecrecia adenocarboxilata, Citrobacter freudii, Esherihia coli, Burchalderia cepacia ***

9 1 км от р. Кичеры Serracia plumutica, Esherihia coli, Lecrecia adenocarboxilata Citrobacter freudii, Esherihia coli, Burchalderia cepacia ***

10 р. Тыя Esherihia coli, Serracia plumutica, Enterobacter cloacae ***

11 0,5 км от р. Тыя Enterobacter cloacae ***

Примечание: * - высев без предварительной фильтрации и концентрирования проб; ** - обнаружены неидентифицированные культуры с выраженной гемолитической активностью; *** - проводилась предварительная фильтрация проб воды и высев на среду Эндо.

Антибиотикорезнстентность и гемолитическая активность байкальских гетеротрофных бактерий.

Анализ гемолитических свойств 2074 штаммов гетеротрофных бактерий, выделенных нами из воды Байкала, показал, что появление этого свойства у части потенциально-патогенных бактерий наблюдалось весной, увеличивалось в летний период, и практически отсутствовало у культур, выделенных в зимний период. Таким образом, в летний период увеличивалось не только количество и видовое разнообразие ППБ, но и их гемолитическая активность, как количественная (увеличение числа культур, проявивших гемолиз), так и качественная (увеличение степени выраженности гемолиза). Проверка автохтонных гетеротрофных культур микроорганизмов на наличие свойства гемолизировать эритроциты показала, что и собственно байкальские микроорганизмы, выделенные со среды РПА и которые не относятся к патогенным и потенциально- патогенным видам, также способны проявлять гемолитические свойства.

Достаточно высокий процент гемолитически активных культур наблюдался летом 1998 года в Баргузинском заливе и летом 1998 года на Южном Байкале. Показатель достигал 18,6% и 17,1%, соответственно. При этом общее микробное число так же превышало нормативные показатели (66 кл. / мл и 13 кл. / мл соответственно). Все выделенные УПБ обладали выраженной гемолитической активностью.

Обращает на себя внимание сравнение полученных результатов по близко расположенным Баргузинскому и Чивыркуйскому заливам. В то время, как общее число гетеротрофов в Чивыркуйском заливе выше - 224 кл. /мл, в Баргузинском заливе выделено почти в два раза больше бактерий, обладающих гемолитической активностью (24 и 13). Эти результаты можно объяснить тем, что в Баргузинский залив впадает одна из самых крупных рек бассейна Байкала, воды которой обогащены микроорганизмами, участвовавшими в контакте с человеком и

сельскохозяйственными животными. Таким образом, Баргузинский залив подвергается постоянному антропогенному воздействию и претерпевает в связи с этим существенные изменения. Это привело к тому, что качество воды в заливе снизилось,

а трофность постоянно повышается. В Чивыркуйском заливе не отмечается существенного антропогенного пресса и в нем происходят, в основном, естественные биологические процессы, что характеризуется уменьшением биоразнообразия видов УПБ.

Увеличение числа гемолитически - активных бактерий можно считать показателем антропогенного загрязнения данной области озера Байкал, что позволяет использовать этот показатель при микробиологическом мониторинге, например, в летний период. Очевидно, что постоянный обмен наследственной информацией посредством плазмид вызывает изменение микробного пейзажа озера Байкал и расширение ареола распространения группы потенциально опасных для человека бактерий, в данном случае, по гемолитическим свойствам.

Использование антибиотиков в медицинской, сельскохозяйственной я ветеринарной практике неизбежно приводит к их попаданию в естественные водоемы - места обитания водных бактерий. Распределение устойчивых и чувствительных штаммов среди популяции водных бактерий вызывает неизменный интерес, так как может свидетельствовать об антропогенном воздействии на водоем и формировании эпидемических вариантов возбудителей кишечных инфекций в природной среде.

Нами изучена лекарственная устойчивость 590 штаммов гетеротрофных бактерий, выделенных из озера Байкал. Количество резистентных к восьми различным антибиотикам штаммов гетеротрофных бактерий представлено в таблице 3. Все выделенные УПБ характеризовались множественной антибиотикорезистентностью.

Таблица 3

Антибиотикорезистентность байкальских гетеротрофных микроорганизмов.

Число Количество устойчивых штаммов

изученных

штаммов 1 2 3 4 5 6 7 8

590 24 342 472 221 131 360 229 229

(%) 4,1% 58% 80% 37,5% 22,2% 61,% 38,8% 38,8%

Условные обозначения: 1 -канамицин, 2 -стрептомицин, 3 -полимиксин, 4 -цефазолин, 5 -левомицетин, 6 -тетрациклин, 7 -ампициллин, 8 -невиграмон.

Влияние температурного фактора на рост и развитие бактерий, выделенных из воды озера Байкал,

Температурные оптимумы роста и развития водных бактерий многочисленны и разнообразны. Численное соотношение между микроорганизмами с различными температурными диапазонами роста колеблется и зависит in situ от климатической зоны, сезона отбора проб, доминирующей температуры и ее колебаний. Однако, некоторые исследователи [Лях С.П., 1976; Morita, 1974; 1975] отмечают отсутствие корреляции между доминирующей температурой субстрата и температурой оптимального роста бактерий, что является следствием незавершенности процесса температурной адаптации. Почти все бактерии, которые были выделены в летний период, не росли при t+4°C и +8°С, т.е. нами были выделены, в основном, мезофильные бактерии. В осенний период, выделенные таким образом бактерии, не давали роста при температуре +4°С, а процент бактерий, растущих при t+8°C, увеличился. Довольно высоким он был при +18-20°С и значительно уменьшился при +37°С. В зимний и весенний период больше выделяются факультативно-психрофильные микроорганизмы. Причем, все они активно росли при температуре от +4°С до +20°С. В то же время, число бактерий, растущих при температуре +28°С и +37°С, так же, как и выделенных в осенний, период, уменьшилось в 2-3 раза. Изучение температуры оптимальной для культивирования бактерий одних видов выделенных в различные сезоны года показывает, что бактерии даже одного вида имеют адаптационные возможности, позволяющие им изменять температурные оптимумы роста в зависимости от сезона года. Все выделенные УПБ способны расти при температуре 37° С. После получения в чистой культуре и описания видового состава выделенных микроорганизмов, мы провели опыт с целью установить оптимум температуры для роста и развития их в условиях эксперимента. Прирост биомассы определяли путем нарастания мутности, фиксируемой на ФЭКе (табл. 4). В результате проведенных исследований нами установлен температурный оптимум роста для чистых культур байкальских гетеротрофных бактерий - это хотя в озере

Байкал такая температура воды устанавливается только летом в поверхностных водах, заливах и бухтах, устьях рек. Самый большой процент бактерий, от числа выделенных во все сезоны года и давшие активный рост, мы получили, как и ожидалось, при комнатной температуре +18-20°С . И в то же время, все выделенные бактерии росли и накапливали биомассу на минимальной жидкой среде как при низкой температуре +4-

8-12°С, так и выше +20°С, но более высокие температурные условия тормозили развитие байкальских гетеротрофных бактерий.

Таблица 4

Влияние температурного фактора среды на активность развития микроорганизмов

озера Байкал в условиях лабораторного эксперимента

Номер Номер Название штамма Время Единицы оптической

группы штамма инкубации плотности *

(час) 4 8 12 20 25

I 16 Aeromonas achromogenes 85 0,13 0,12 0,13 0,14 _*+

44 Bacillus stearothermophilus 78 0,14 - 0,24 0,25 0,24

45 В. polymyxa 78 0,11 - 0,24 0,28 0,25

48 Pseudomonas malthophila • 78 0,14 - 0,23 0,22 0,24

II 24 Acinetobacter calcoaceticus 78 0,09 - 0,14 0,21 0,22

32 Ac.calcoaceticus 75 0,07 0,11 0,16 0,22 -

17 Bacillus alvei 92 0,03 0,07 0,21 0,22 -

26 B. brevis 78 0,04 - 0,08 0,18 0,21

36 B. clrculans 75 0,02 0,08 0,16 0,22 -

23 B. firmus 78 0,11 - 0,19 0,23 0,26

30 B. licheniformis 78 0,09 0,11 0,18 0,28

28 B.sp. 78 0,03 - 0,05 0,07 0,11

27 Micrococcus luteus 78 0,06 - 0,08 0,11 0,15

31 Planococcus citreus 75 0,1 0,21 0,29 0,29 -

2 Pseudomonas liguefaciens 85 0,1 0,11 0,13 0,16 -

39 Ps. mendocina 92 0,09 0,26 0,39 0,39 -

41 Ps. sinuosa 92 0,12 0,28 0,42 0,47 -

21 Ps. vesicularis 78 0,18 - 0,27 0,3 0,35

47 . Rbodotorulla sp. 78 0,15 - 0,2 0,24 0,25

III 4 Acinetobacter Iwoffi 72 0,13 0,15 0,17 0,24 -

8 Ac.calcoaceticus 85 0,06 0,06 0,05 0,1 -

1 Pseudomonas alcaligenes 72 0,1 0,1 0,13 0,21 -

11 Ps.alcaligenes 86 0,17 0,18 0,2 0,3 -

10 Ps. aureofaciens 73 0,13 0,15 0,17 0,24 -

13 Ps. facilis 86 0,13 0,12 0,15 0,2 -

14 Ps. flavis 73 0,12 0,12 0,14 0,2 -

12 Ps. fluórescens 86 0,09 0,09 0,12 0,2 -

6 Ps. maltophilia 85 0,06 0,08 0,07 0,12 -

5 Ps. sinuosa 72 0,13 0,13 0,16 0,22 -

15 Ps. synxantha 72 0,1 0,11 0,13 0,2 -

9 Zooglea ramigera 72 0,14 0,14 0,17 0,28 -

IV 7 Arthrobacter terregens 85 0,05 0,07 0,06 0,05 -

20 Alcaligenes fecalis 78 0,11 - 0,16 0,21 0,1

49 Bacillus centimorbus 78 0,1 - 0,2 0,25 0,24

46 B. coagulans 78 0,1 - 0,2 0,35 0,33

22 Nocardia rugosa 78 0,14 - 0,2 0,25 0,24

43 Pseudomonas alcaligenes 78 0,11 - 0,21 0,26 0,22

Примечание: *Биомасса микроорганизмов, выраженная в единицах оптической плотности

(-)** - Нет данных

Изучение влияния низкой температуры и популяции автохтонной микрофлоры на выживаемость патогенных и потенциально-патогенных бактерий в условиях лабораторного моделирования.

Результаты эксперимента показали общие закономерности размножения и выживаемости in vitro патогенных и потенциально-патогенных бактерий -клинических изолятов в стерильной и нестерильной байкальской воде в условиях низкой температуры (+2° -+4° С).

При исследовании влияния низкой температуры на выживаемость патогенных и потенциально-патогенных бактерий не наблюдалось нарушений их жизнедеятельности. Низкая температура инкубации не вызывала гибели бактерий -клинических изолятов, а их дальнейшее размножение и накопление биомассы соответствовало общим закономерностям роста и размножения бактерий.

Результаты эксперимента показаны на рисунке 3 (а, б) характеризующих кривые роста штаммов бактерий- клинических изолятов, при различных моделируемых условиях. Общей тенденцией для всех штаммов патогенных бактерий считается наличие адаптационного периода, который характеризуется снижением КОЕ/мл по сравнению с первоначальным высевом. Тогда как некоторые потенциально-патогенные бактерии могут миновать лаг-фазу, и сразу прогрессивно увеличивают количество клеток, достигая максимума в фазе экспоненциального роста. У некоторых штаммов можно наблюдать после максимума роста, резкое снижение численности, после чего вновь наступает прогрессивное увеличение роста клеток. Стационарная фаза у патогенных штаммов - длительная, колебания численности клеток во время нее - незначительно, у условно-патогенных бактерий наблюдается вторичный пик роста и длительное выживание как в стерильной, так и в не стерильной байкальской воде. Все исследованные in vitro штаммы обладали более длительным периодом выживания в байкальской воде при низкой температуре по сравнению с санитарно-показательной кишечной палочкой.

В результате лабораторного эксперимента показаны высокие адаптационные возможности патогенных и потенциально-патогенных бактерий, вынужденных выживать при резких изменениях биохимического состава среды (в воспалительных очагах, внутри фагоцитов и при переходе во внешнюю среду). Таким образом, низкая температура и популяция автохтонной микрофлоры не влияют на выживаемость патогенных и условно-патогенных бактерий в байкальской воде в условиях эксперимента.

Hafnia alvei

с;

о s

га

о О

О

3000 2000 1000 0

-Hafnia alvei -1! - Hafnia alvei-2 I

2 3 4 5 6 7 Кратность отсевов

Pseudomonas aeruginosa

о ш с; 5 3000

LU О ! —♦— Pseudomonas j

о ф 2000 I • ц aeruginosa -1 :

S ^ о 1000 \ j -»— Pseudomonas |

с о t- о> i aeruginosa-2 |

§ 0 1 23456789 Кратность отсевов

к

О 2

Ч о

40 30 20 10 0

Контроль

2 3 4 5 6 7 кратность отсевов

- Контроль стерильной воды-1

- Контроль нестерильной воды-2

В

Рис. 3 (а) Выживаемость патогенных и потенциально-патогенных бактерий в условиях эксперимента.

s1

со —.

" ш

° о

s £

с О

о о

4000 3000 2000 1000 О

Salmonella typhi

-Salmonella typhi-1 - Salmonella typhi-2

2 3 4 5 6 7 Кратность отсевов

Г

Enterobacter cloacae

о 5 2500

а н ш 2000

о 0) о 1500 -

У s * 1000 -

i 1 500

5 0

- Enterobacter cloaca e-1

- Enterobacter cloacae-2

2 3 4 5 6 7 8 Кратность отсевов

д

Shigella Flexneri 2a

§ * CQ

ь Ш

° О

Hl К 7

I О

I S

2000 1500 1000 500 О

23456789 Кратность отсевов

- Shigella Flexneri 2а- i 1 i' -Shigella Flexneri 2a-; 2 ¡

Рис. 3 (б) Выживаемость патогенных и потенциально-патогенных бактерий в условиях эксперимента.

Выводы:

1. Впервые из воды озера Байкал были выделены 898 штаммов условно-патогенных бактерий, являющихся представителями 31 вида, относящихся к семейству Enterobacteriacae и неферментирующей группе бактерий. Максимальная численность условно-патогенных бактерий за четырехлетний период наблюдений (1997-2000 гг.), отмечена летом 1998 г. и осенью 2000 г. Количество изучаемой группы бактерий закономерно повышалось в летне-осенний периоды года и уменьшалось в зимние месяцы. Распределение условно-патогенных бактерий по всей акватории озера Байкал неравномерно и приурочено к местам сброса разнообразных стоков. Наибольшая их численность и видовое разнообразие отмечено на Южном Байкале: Большие Коты, Листвянка, порт Байкал, Байкальск, и Среднем Байкале: Баргузинский и Чивыркуйский заливы, дельта реки Селенги. В пелагиали изученная группа бактерий обнаружена не была.

2. Доминирующие виды условно-патогенных бактерий, выделенные из озера Байкал: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Burkhalderia cepacia могут быть использованы как дополнительные санитарно-показательные индикаторы, характеризующие качество питьевой воды.

3. Условно-патогенные бактерии, выделенные из озера Байкал, обладают множественной антибиотикорезистентностъю, гемолитической активностью к эритроцитам человека, способны к культивированию при 37 0 С и, следовательно, несут потенциальную эпидемическую опасность для здоровья населения.

4. Условно-патогенные и гетеротрофные бактерии озера Байкал характеризуются большими адаптационными возможностями при воздействии низких температур. Оптимальная температура культивирования байкальских микроорганизмов - +18-22 0 С, хотя температура выше 22 0 С тормозит развитие большинства байкальских гетеротрофов. Условно-патогенные бактерии выдерживают +37 0 С, что указывает на их способность к выживанию в человеческом организме.

5. В условиях лабораторного моделирования низкая температура и популяция автохтонной микрофлоры не являются лимитирующими факторами для выживаемости потенциально-патогенных и патогенных бактерий - клинических изолятов: Salmonella typhi, Shigella Flexneri 2a, Citrobacter freundii, Esherihia coli 026, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, но угнетают развитие и

размножение Esherihia coli, что указывает на необходимость использования дополнительных индикаторов, характеризующих безопасность питьевой воды. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Панасюк Е.Ю. Условно-патогенные микроорганизмы - индикаторы состояния окружающей среды // Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование, Иркутск, изд -во ИГУ, 1999. С.27-28

2. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В. Антибиотикорезистентность и гемолитическая активность потенциально-патогенных бактерий, выделенных из воды озера Байкал // Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири. Иркутск. Изд-во ИГ СО РАН, 2001. С.150-151.

3. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В., Парфенова В.В., Косторнова Т.Я. Выделение потенциально-патогенных бактерий из озера Байкал II Сибирь - Восток.-2002, №2. С. 12-15.

4. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В. Доминирующие виды потенциально-патогенных бактерий, выделенные из воды озера Байкал // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе, Иркутск, 11-13 марта 2002 г. С.64.

5. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В. Видовой состав потенциально-патогенных бактерий, выделенных из основных притоков озера Байкал // Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе, Иркутск, 11-13 марта 2002 г. С.114.

6. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В. Биоразнообразие потенциально-патогенных бактерий, выделенных из воды озера Байкал // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе, Иркутск, 11-13 марта 2002 г. С.115.

7. Дрюккер В.В., Панасюк Е.Ю. Потенциально-патогенные бактерии -индикаторы качества вод озера Байкал // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе, Иркутск, 11-13 марта 2002 г. С.140.

8. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В., Парфенова В.В., Косторнова Т.Я. Изучение влияния низкой температуры и популяции автохтонной микрофлоры на выживаемость патогенных и потенциально-патогенных бактерий в воде в условиях эксперимента // Сибирь - Восток.-2002. №3. С. 4 -7.

9. Парфенова В.В., Панасюк Е.Ю., Белькова Н. Л., Косторнова Т.Я., Дрюккер В.В. Изучение влияния температурного фактора на рост и развитие гетеротрофных бактерий оз. Байкал в условиях эксперимента II «Микробиология», 2002 (принята в печать).

10. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В., Парфенова В.В., Косторнова Т.Я. Биоразнообразие и распределение бактерий семейства Г.тегоЬа^епасае и неферментирующей группы в озере Байкал // «Сибирский экологический журнал», 2002. (принята в печать).