Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Морфология, морфогенез и продукция вируса лейкоза крупного рогатого скота в культурах клеток ФЛК на различных микроносителях

^ИНЖТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ • : л-" РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Московская государственная академия ютеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

На правах рукописи

БАДЦЕ МАМАДУ АЛИМУ

I ХЛПЖЛ ПАП1 ДП 1 1Л"П*Л Т11ЧТ ТIIГ Л II II Г»Л ГГ*Г»#»Т1 шгл л ИпН|«Л #~ч л

шиг^или! ад, тигт/хьпьо п игид^оцущ шпия лшгш.ис5А КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК ФШ НА РАЗЛИЧНЫХ МИКРОНОСИТЕЛЯХ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Научные руководители: академик РАСХН, доктор ветеринарных наук

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук КУНАКОВ A.A.

доктор биологических наук, профессор ВОРОНИН E.G.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

на заседании специализированного совета Д 120.36.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина 109472, ул. академика Скрябина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

профессор ШИШКОВ В.П.

кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник КРИКУН В.А.

Защита состоится

[асов

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

/ 'Г-( с- •

Слесаренко H.A.

I. ОБи^Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Работа посвяцена изучению оптимальных условий для пролиферации-----------------

хронически "инфицированных вирусом лейкоза перевиваемых клеток FlK_ £>LV. на микроносителях в псевдосуспензионных культурах, репликации вируса лейкоза и продукции гликогтротейдкого антигена БЛ'РС, позволяйте экономить дорогостоящие компоненты питательней среды при производстве биологических препаратов.

Актуальность исследований. Лейкоз крупного рогатого скота -хроническое инфекционное ли"ыф°проли6еративное заболевание, наносящее значительный экономический ущерб народному хозяйству. Этиологический агент - вирус лейкоза крупного рогатого скота (BJÎKPC) является экзогенным ретровирусом и принадлежит совместно с Т-клеточными лимЛотроп-нши вирусами-человека С fffl»V-I и HTLiV -2) и Т-лим^о тройным вирусом, обезьян (STL V ) к одному подсемейству On СО v'ftUltt-^C SClCjCliCl ïhtf I960; ¿t al. , 1980; lUttmorin xi al , 1980).

Заболевание характеризуется персистентным лимфоцитозом и развитием Б-клеточных лимфом после длительного инкубационного периода (ÀoucKcutt etui, i364; Grt^bda^. «toi, i984).

Экономические потери, связанные с преждевременной выбраковкой « убоем с недополучением продуктов животноводства, с огра-

ничениями племпродажи и реализации молока, а также с потерями, связанными с диагностическими и оздоровительными мероприятиями в неблагополучных по заболевании хозяйствах выдвигают лейкоз крупного рогатого скота по значимости на одно из первых мест среди индукционных заболеваний. _

Выделение ВЛКРС (J^UUX ¿tot., 1969) изучение его биологических и биохимических свойств позволило разработать аффективные методы серологической диагностики, которые являются основой современных методов оздоровления неблагополучных хозяйств и профилактики заболевания ( Van dit Aiaatax ц 4 i9?ô; isve;

Шишков Ь.П. и др., 1966). В настоящее время проводятся интенсивные исследования по создании средств специфической профилактики лейкоза

( Mill là vrai , 1983; Olumct £tol. 1984;$&tantffcla£ 1987;

Jl^tCUltl fctCli, 1988). Изготовление диагностикумов и вакцинных препаратов сталкивается с трудностями, связанными с получен.-.ем необходимого количества вируса я вирусных антигенов, источником которых являются перевиваемые культуры клеток хронически инфицированные EJKPJ

(Van сШ JKaaitn , wittu Т , 19те; 6га ггъ . Feue г isvô;

Крикун В.Л. и др., 1979). Используемые, до настоящего времени, на

биофабриках традиционные методы йуЛЬ'гйвироваНйй «летен в стационарны) и вращающихся флаконах не уД0Ш)е?в6рях)Ф вое роэрастающей потребности в вирусных антигенных препарата*. Поэтому актуальной задачей являете; разработка более эффективна И экономичных способов крупномасштабноГ( культивирования клеток и уелшшй» позволяющих увеличивать репликацию вируса и продукции вирус шд аягипжов в культурах. Наиболее перспективным методом крупномасштабно культивирования клеток является высокотехнологичный метод ЕКравфВйНИЯ клеток на микроносителях (МН), позволяющий вырахцивать большие количества клеток и получать высокоактивные биологические продукта,

Цель и задачи исслвяокашр. Цель» настоящей работы является сравнительное изучение оеоббтш¥вй хронической инфекции ВЛКРС в монослойкой и псевдосуспеняионной культурах перевиваемых клеток и определение оптимальных условий вырЗДИРания линии клеток РИЛ.-ЕЛ-'У на микроносителях для накопления гликопротеидного антигена.

В соответствии с цельп рабе?« были Пбетавлекы следующие задачи:

1. Изучить динамику репликации Ы1КРС И продукции растрориид вирусных антигенов в монослойной и пееадосубпенЗИОННОЙ КУЛЬТУРАХ клеток.

2. Изучить влияние стимулирующих пренаратеи не ряетбвйё п вирус-продуцирующие параметры Перевиваемой линии клеток в ПвевдееуепвНШ» ной культуре.

3. Провести сравнительную оценку и выбрать оптимальные типы микроносителей для псевдосуспензионного культивирования клеток

4. Определить оптимальные режимы культивирования хронически инфицированной ВЛКРС перевиваемой линии клеток Ы\ на микроносителях.

Научная новизна. Определена динамика репликации БЯСРС и продукции гликопротеидного антигена в монослойных и псевдосуспвнзионных культурах клеток -ТЩ ~ на микроносителях.

Определено влияние типа синтетических сред и их сочетания на пролиферативную активность клеток ТЬ^С - &ЦУ » репликацию ВЛКРС и продукцию"вирусного антигена.

Установлено влияние сывороточного фактора питательной среды на пролитеративную активность клеток и возможность частичной замены сыворотки эмбрионов коров сывороткой овец без снижения продуктивное* культур клеток Ч-Цк -£>1Л/ . .

Дана оценка влияния стимулируюсь препаратов на рост клеток, репликацию вируса и продукцию вирусных антигенов в псевдосуспензионной культуре клеток.

Определены оптимальные режимы культивирования хронически инфици-

ровамкья ВЛКРС перевиваемых клеток-FLVC-6LV- на-МН,-позволяющие------- —

экономить дорогостоящие компонента питательной среды при накоплении ВЛКРС и его растворимых антигенов.

Практическое значение работ». Результаты сравнительного исследования различных типов микроносителей, позволяют рекомендовать отечественные коллагеновыё микроносители полигональной форда ВИ-3 для крупномасштабного культивирования хронически инфицированных ВЛКРС перевива-зшх клеток FLK.--6LV Р для промышленного производства антигенных препаратов ВЛКРС.

Данные о возможности использования препаратов влияющих на рост и продуктивность перевиваемой линии клеток -FLIC- 6 LV и разработка зпткмальных р,ехимов культивирования хронически инфицированных ВЛКРС 1еревиваемых клеток в псевдосуспензионных культурах на отечественных iSi позволят экономить дорогостоящие компоненты питательной среды при скоплении ВЛКРС и его растворимых антигенов при промышленном произ-аодстве диагностикумов и вакцин.

Но эаадту выносятся следушцие основные положения:

1. Преимущества коллагеновых. микроносителей полигональной формы ЗИ-З отечественного производства для культивирования хронически инфи-деровонной ВЛКРС перевиваемой линии клеток TLlc- & LV •

2. Стимулирующее действие инсулина, ДЫСО, глюкозы и ФГА на проли-[еративнуп и продуктивную активность перевиваемой линии клеток

! псевдосуспензионкых культурах на Ш.

3. Репин культивирования хронически инфицированной ВЛКРС переви-»аемой линии клеток -FLU-bLV в псевдосуспензионных культурах на № >течественного производства, позволяющий экономить дорогостоящие ¡омлоненты питательных сред при накоплении ВЛКРС и его растворимых lhth генов.

Апробация работы, /материалы диссертации доложены на научно-«тодической межвузовской конференции по подготовке кадров для зарубежных стран ЯША, I9i)3 г.) и заседаниях Ученого совета МВД.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи.

Объем и структура работа. Диссертация состоит из введенич, обзора итературы, собственных исследований, обсуждения результатов у. выводов.

2. ССБкДЬЬйНЬЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работу проводили в лаборатории гемобластоэов и имууномлдулягоров осковсхсй государственной академии ветеринарной медицины и биотех-ологии им. К.Л.Скрябина.

В работе использовали перевиваемую линию клеток-flK - &LV-клетки почки эмбриона овцы, полученную в США путом сокультивировання клеток почки эмбриона овца о инфицированными ВЛКРС лейкоцитами крови больной лейкозом коровы, н перевиваемую линию клеток CC-8I - линия кошачьих клеток, трансйориирабанная вирусом саркомы мышей.

В качестве питатзлькьк сред использовали среду Игла Ю с глютаг. мин ом, экспериментальную бреду ДМЕМ - производства Института полиомиелита и вирусных онцефалимв АШ РФ, а также смесь среды ДМЕМ с глютамином и среды 199 в соотношении 2 объема к I объему.

Во все среды добавляли 10 объемных процентов сыворотки эмбрионов коров или сыворотки овоц и антибиотики - 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 200 мкг/мл канамицина.

Пересев монослойных культур перевиваемых клеток fLK - ftLV проводили один раз в неделю с коо<ЭДмциентом пересева 1:5 - 1:8, а клетки CC-6I пересевали один pas 6 3-4 дня 0 коэффициентом пересева 1:3 - 1:4.

С поверхности стекла клетки сникали й помаяв омой рветмров Версена (0,02,£) и трипсина (0,2ов соотношении 1:1, методом.

Жизнеспособность клеток определяли путем подсчета »имя И вых клеток с помощью "метода исключения красителя" - 0,li трипанового синего. Ростовые свойства клеток в монослойных - стационарных и в псевдосуспензконных культурах определяли путем вычисления индекса пролиферации (отношение количества выросших клеток к количеству ззасеянных) .

Для изучения морфологии клетки выращивали на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах. Фиксированные метанолом клетки окрашивали по Романовекоку - Гимза и заключали в бальзам.

В работе были использованы следуете микроносители:

1. Цитолар (НПО Виолар, г.Олайне, Латвия), представляющий собой частицы пзперечносшитого денатурированного коллагена.

2. Цитодекс-1, Цитодекс-2, Цитодекс-3 (Греция), являющийся попе-речносажтыми декстраиовыми микроносителями.

3. БИ-3 - частицы поперечносшитого коллагена неправильной формы (изготовлен в Российском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности МСХ РФ, p.iifesKiBo).

4. iiiO - частицы попере-чг.осантого коллагена круглой формы (разработан и изготовлен в ЫВА).

о. Биосилон - полистирологые частицы круглой формы.

о

6. Дермацель - частицы круглой формы.

Микроносители подготавливали к работе в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя«______________________________________________________________

ГликопротеидныЯ антиген определяли в культуральной жидкости после ее 70-кратной концентрации методом форсированного диализа против ЩГ. Ь'.ЮО. Специфичность и активность антигена определяли с помощью реакции иммунодиффуэии (ГОД) в геле агара. Учет реакции проводили через 48 часов инкубации чашек Петри с реакцией во влажной камере при 25°С.

Титром антигена считали его последнее разведение способное формировать лини» преципитации о контрольной сывороткой.

Продукцию вируса в культурах клеток определяли в тесте синцитие-обраэоваиия (ÎC0). В качестве индикаторных клеток использовали перевиваемые клетки CC-8I, выращенные на покровных стеклах в пеницилли-новых фяаконах. Синцитием считали много ядерную клетку, содержащую не менее ти ядер.

Статистическую обработку, полученных в експериментах цифровых данных проводили по ГЛ.Лакмну (i960).

2.2. Результаты исследований

Изучение »ф4екткгкест:; разжимных типов сред и их сочетания

на пролифератквную и продуктивную активность клеток FLU - 6>LV в монослойных культурах

Одним из важнейших факторов, влияющих на рост перевиваемых клеток является состав питательной среды. Для разных линий перевиваемых клеток эмпирически родбирают различные синтетические среды простые или более сложные, обогащенные микроэлементами, витаминами или с более высокой концентрацией питательных веществ.

Нами проведено сравнительное изучение эффективности среды Игла, 199 среды, экспериментальной среды ДОМ и смеси среды ДНЕМ и 199 в соотношения 2:1 при выращивании хронически инфицированных ВДКРС перевиваемых клеток "FLVi. - feLV в присутствии I05& сыворотки эмбрионоь . коров.

Посевная концентрация клеток составляла 50 тысяч клеток/мл среды. Качество клеток, характер роста и скорость формирования монослоя определял* путем ежедневного просмотра культур под световым микроскопом. Индекс пролиферации определяли через 96 часов культивирования. Репликацию инфекционного вируса оценивали в ТОО в 4-суточных культурах клеток. С каждым типом сред было проведено по 7 пассатеЯ в 3-х повторах.

На протяжении 7-ми пассажей (срок наблюдений) наиболее интенсивный рост клеток отмечен в культурах, выращенных на смеси среды ДМЕМ и 199 среды в соотношении 2:1. На протяжении всего срока наблюдений морфология и пролифер&тивные потенции клеток были стабильными. Прикрепившиеся к стеклу клетки начинали распластываться через 3-4 часа поело Лосева. Через 24 часа клетки имели полигональную форму. Появлялось значительное число круглых клеток, находящихся, по-видимому, на стадии митоза. Через 2-3 суток размножающиеся клетки заполняли всю свободную поверхность стекла и формировали сплошной монослой. Через 4 суток после посева монослой уплотнялся, клетки приобретали вытянутую, геретенообразную форму и располагались ориентировано, формируя вихрообразный рисунок. К ртому времени начинали образовываться многослойные фокусы роста. К 7-ым суткам культура представляла собой плотный клеточный пласт. рН среды изменялась в кислую сторону. К 10-12 суткам без смены среды цитоплазма клеток приобретала грубую зернистость и клеточный пласт начинал отслаиваться от поверхности стекла, появлялось больнее яоличэстзо нежизнеспособных клеток.

Таблица I

Ъдияние разлиташх типов синтетических сред на пролиферацию клеток - Е>1\/ , репликацию ВЯКРС

- . и продукция/ гля.ч'онротеидногс антигена в монослойных культурах

Индексы : Количество ; Тигры пролкфарации еинцитиев .тликопротеидного __;в I препарате : антигена

Среды

1. Игла'минимальная 3,5 ¿0,17 10,77 *2,4

j

2. Эксперименталь-

ная ДМЕМ

3. Среда 199

4. £мвсь_£Ш'и 199

6,64*0,13 39,9 ±4,6 2,7 ±0,13 7,В ±2,4

1)

I: 5,3 ± 0,3а

1:14,4 ± 0,76 I: 3,8 ± 0,65

7,96± 0,14 52,2 ± 5,6 1:16,8 ± 0,34

При использовании среды 199 и минимальной среды Игла интенсивность роста клеток была значительно ни*е (таблица I), монослой формировался в более поздние сроки (на 3~4 сутки) и но плотности значительно уступали клеточным пластам в культура*, вырагрииьгх на скоси сред 199 и ДНЕМ. Репликация вируса, определяема« в ТСО и продукция гликопротеидного антигена БЯКРС в культурах клеток, выращенных на указанной смеси сред также были наиболее высокими. Экспериментальная

среда ДМЕМ поддерживала достаточно высокий уровень пролиферации клеток, репликации вируса и продукции вирусного антигена на протяжении всего срока наблюдений, но уступали по эффективности смеси сред.

------------ -------------Влияние сывороточного компонента среды

на пролиферацию клеток TL (С - &LV и их продуктивные свойства а монослойных культурах

Перевиваемые клетки fLVC-&LV изначально и в процессе длительного пассирования были адаптированы к среде, содержащей 10 - 2СЙ сыворотки эмбрионов коров. Однако, эта сыворотка является дефицитной и дорогостоящей. Многочисленные попытки замены эмбриональной сыворотки, сыворотками взрослых животных - свиней, лоэадсй, крупного рогатого скота, включая сивор?тки, обработанные полиэтилеигликолеи не обеспечивали удовлетворительный рост и продуктивность перевиьаешгх клеток-FLK -£>LV . Нами была изучена возможность полной или частичной замены эмбриональной сыворотки сывороткой овец.

Результаты сравнительных посследований показали (таблица 2), что в 10% концентрации сыворотка овец обеспечивает стабильный рост и размножение клеток FLК - &LV на протяжение 7-ми пассажей (срок наблюдений). Б течение этого срока клетки сохраняли морфологическое постоянство. Однако, скорость формирования монослоя, индексы пролиферации, продукция вируса и вирусного антигена в культурах с 105 сыворотки овец были существенно ниже, чем в культурах, выращенных на среде с добавлением IOÍ сыворотки эмбрионов коров.

Таблица 2

Влияние различных сывороток на пролиферацию клеток TL К -E>LV , репликацию вируса и продукцию гликопротеидного антигена в монослойных культурах

' Индексы ; Количество ; Титры

.Сыворотки ¡пролиферации : синцитиев ; гликопротеидного _._:_:в I препарате Г_антигена _

Эмбрионов коров IOS 7,97 i 0,37 61 ± 4,16 1:16,2 £ 0,38

Овец 10* 4,92 ± 0,63 34,4 ± 8,71 I: 6,5 t 2,02

Смесь 7Íсыворотки овец и 3% эмбрионов

коров 7,4 ± 0,30 58,7 ± 3,49 I:Io,9 ± 0,37

Смесь сывороток, состоящая из 70& сыворотки овец и 30^ сыворотки эмбрионов к^ров в 10£ концентрации в среде обеспечивала примерно

такие же показатели пролиферации клеток, репликации вируса и продукции гликопротеидного антигена, как и эмбриональная сыворотка.

Таким образом, частичная замена эмбриональной сыворотки сывороткой овец, может существенно снизить материальные затрат» при крупномасштабной культивировании клеток -ft-K. - &LV без существенного снижения их продуктивности.

Разработка оптимальных условий культивирования хронически инфицированной ВЛКРС перевиваемой линии клеток на микроносителях

Культивирование субстрат-зависишх перевиваемых клеток в псевдо-суспензионнкх культурах на микроносителях позволяет повысить выход клеток на единицу объема культурального сосуда и среды, существенно снизить стоимость вирусных препаратов и автоматизировать процесс получения биопрепаратов на различных этапах.

С целью выбора оптимальных микроносителей для выращивания клеток TLK-SL.V проводили сравнительную оценку динамики прикрепления и распластывания клеток, сроков формирования монослоя клеток и сроков их переживания на микроносителях разных типов. Культивирование проводили в стационарных силиконизированных фигаконах объемом 250 мл. Б каждый флакон вносили 25 - 30 ад суспензии клеток с концентрацией 8 г Ю X Ю4 клеток/мл и микроносители из расчета 3 мг/кл или 0,1 мл плотного осадка на 10 «л питательной среда. Контролем служили стационарные монослойные культуры в стеклянных 250 мл матрасах.

Наибольшая адгезивная активность клеток, определяемая через 6 часов после посева отмечалась на микроносителях ЕИ-3, Цитолар-I и Цитодекс-3. Через 1,5 — 2 часа после посева клетки начинали распластываться. Конослой при посевной концентрации 10° клеток в I мл на микроносителях Бй-3 формировался в более ранние сроки, чем на других типах микроносителей, но несколько позже, чем в стационарной культуре. На частицах Биосилона, Цитодекс-I и Дермоцеля при указанной посевной концентрации монослой не формировался.

Наиболее интенсивная пролиферация клеток также была отмечена в культурах, выращенных на микроносителях Вй-3, которая примерно на 1/3 превышала пролиферацию клеток в контрольных монослойных культу-» pax (таблица 3).

Время переживания клеток на коллагеновых частицах микроносителя (ВИ-З, Цигодокс-3 и Дитолар-I) в 1,5 - 2 раза превышало время переживания клеток в монослойных стационарных культурах на стекле.

Таблица 3

Рост перевиваемых клеток - , продукция вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) * его гликолротеидного антигена в псевдосуспензионных культурах на микроносителях (МН) разного типа

' i ■ . I I . ^ ' II I | II

Индекс : Время : Среднее ; Титры

птюли- : пере- ; количество ; гликопро-

фераоии :*ивания : синцитиев : теидного

¡(сутки) :в I препарате : антигена

: , Вреия 1/якро- i обраэо-носителн : вания

:монослоя _> (сутки)

,ИТ0Д8ХС—I - - «* -

^тодекс-2 4 - 6 3 - 4 8 - 10 23,0 £ 2,7 J: 2,7* 1,1

итодекс-3 4 - 5 8 -10 30 - 45 44,2 ¿ 3,6 I: 5,3 * 2,3

яосклон - - «fe

ермацель - w вт -

¡KW 5 - 6 6 - в 15- 30 35,2 i 1,8 I: 3,3 ¿ 1,1

IM 3 - 4 12 -15 50 - 65 75,6 Í 1,5 1:13,3 * 4,6

*толар~1 4 - 5 7 - 9 40 - 55 58,9 i 2,8 1:10,7 ± 4,6

энтроль 2 - 3 е -10 20 - 30 54,8 ¿ 3,4 1:10,7 i 4,6

Наиболее высокая репликация вируса и продукция глакопротеидкого ггигена ВЛКРС отмечалась в псевдосуспензионных культурах клеток на «кроносителкх В'Л-3. В культурах клеток на микроносителях Цитодар-1 Цитодекс-3 продукция ЕШ'.РС и растворимого гликопротеидного антигена ма удовлетворительной, сравнимой с контрольными стационарным« момо-юйными культурами.

По результатам експериментов »той серии для дальнейших мсследо-» 1ний были отобраны микроносители Цитолар-I и БИ-3.

Влияние посевной концентрации на пролиферации клеток íLVC -&LV на микроносителях

Продуктивность куйьтуральных систем зависит от качества и коли-ства среды, от плог.ади поверхности, на которой могут расти клетки. •

.ним из критических параметров является отношение количества клеток единице площади культуразьной поверхности. Величина этого параметра оличество клеток/см*) зависит от потенции размножения клеток. Тах ? х потенция р&змнохения у разных линий клеток различна, то для ждой линии клеток необходимо эмпирически прдбирать оптимальнуп

посевнуи концентрация к соотношение засеваемых клеток.к единице пло-цади культуральной поверхности.

В опытах по определению оптимальной посевной концентрации клето!

П.К-В1У использовали микроносители ВИ-3 и Цитолар-1. Культивирование проводили во Флаконах объемом 250 см3 с подвешенной мешалкой. Концентрация микроносителей в конечном объеме среды составляла 0,1 а плотного осадка микроносителей на 10 мл питательной среды. Ежедневно кз культур отбирали пробы для изучения морфологии и динамики роста клеток, через б суток культивирования определяли индекс пролиферации и через 8 суток продукцию гликопротеидного антигена.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние посевной концентрации на пролиферацию клеток -Ри к - Е>иУ и продукцию гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота СВЛКРС)

: Индекс : Титры ГП ' проли- : антигена фёрации

Микро-

Посевная • Бремя ¡концентра- ¡формиро-

носителн :цил клеток : вания

¡Максимальная ¡концентрация ¡клеток в I ил

в I мл ¡монослоя :(сутки) • * :

50 х 103 6 19,4*0,9 I: 8,3*2,7

100 х 103 3-4 15,4*0,7 1:14,6*3,4

200 х 10® 2-3 6,9*0,3 1:12,6*3,6

500 х Ю3 2 3,7*0,6 I: 4,6*1,4

50 х Ю3 6 - ? 12,6*0,4 I: 6,6*2,3

100 х Юэ 4-5 6,2*0,3 1:11,6*4,7

200 х 103 3-4 4,6*0,6 1:10,3*2,6

500 х Юэ 2 2,6*0,5 I: 2,6*0,9

ЕИ - 3

Цитолар-1

0,97 х \Ф

1,54 х 106

1,76 х 106 1,60 х

0,64 х 106 0,62 х

0,92 х М6

1,42 х 1<£

Увеличение посевной концентрации клеток сопровождалось сокращением сроков формирования иокослоев и незначительным увеличением максимального выхода клеток на I мл питательной среды. Индексы про*» ферации в культурах увеличивались по мере снижения посевной концентрации клеток. При низкой посевной концентрации монослой ие успевал уплотниться, несмотря на высокий индекс пролиферации и урожай, вира-женный через максимальную концентрацию клеток на I »и, в этих культурах был существенно ниже, чем в культурах с более высокой посевно) концентрацией. Продукция гликопротеидного антигена ВЛКРС в псевдо-суспензие^т« культурах также затзисила от посевной концентрами

клоток. Кьибольхке титры антигена отмечались » культурах как на Вг

так и на Цитоларе-Ггтри~посевной концентрации 100 х 103 илеток/м._____

При низкой посевной дозе продукция антигена снижается из~<за милкой концентрации клеток в культуре, а при высокой происходит быстроо формирование монослоя и благодаря, контактному торкожснел клетки прекращают делиться, быстро с таре»*?, резко снижается продукция »круса и вирусных антигенов.

Методы стерилизации микроносителей (автокланкрованиеы или обра^-ботка атиловым спиртом) не оказывали существенного илияния из качество микроносителей.

иИхроноситоли ВИ—3 и ЦктРлар-1 могут был- мспильвованы повторно дгя выращивания клеток ■ГЬ.К. - до 3 раз. В дпльнонаем микроносители теряли свои первоначальные свойства, частично разрушались и • становились непригодны:« для выраетвания клеток.

Известно, что инсулин, оказывая стимулирующее действие на транспорт глючозц к нейтральных аминокислот, попьадзд СчОС".гнт.-.,~

к ЯП)Ш кислот является необходимым для рпста ;;«::тск ш; витро.

Целью иястоя'дас исследований являлось изучение гозыотаости поты денкя продуктивности хронически инфицированных ¡хИРС пер-евквадшх клаток ^- ?>1~У под действием инсулина в псевдосусяензионных культурах на иикоонзспгелях Ш-3.

Влияние инсулина на пролиферацию клеток, репликацию вируса и продукцию гликопротеидкого антигена в йсевдосуспекзиокных культурах

Таблица о

Влияние инсулина на пролиферацию клеток - , репликации ЕЯКРС и продукцию гликопротеидкого антигена в культурах ка микроносителях ВВ-3

; Инд?кс Культуры ггрслкферации

ТСО

,Титры ГП

К-

(количество 'синцитиав в I препарате)

антигена

Контрольные 14.6 ± 0,82 , Зс,7 ± 0,26 1:12,4 ± 3,8

Зс,7 ± 0,26

1:12,4 ± 3,8

йксулмн вносили в доза 2 ед/цл питательней срады, состоящей из смеси сред ДМЕМ в соотношении 2:1 с добавлением 7» сьгаоротлм овец я

3Í сыворотки плодов коров. Клетки вырацивали на микроносителе БИ> » 250 мл флаконах при перемешивании со скоростью 60 оборотов в мх Посевная концентрация составляла 100 х I03 клеток/мл. В пробах, в тих на контрольных (без инсулина) и опытных 1с инсулином) культур через 4 суток с помощью ТСО определяли репликацию вируса, через 6 суток индекс пролиферации, а через 8 суток продукцию гликопротеид антигена ВЛКРС.

Приведенные в таблица 5 данные показывают, что добавление хн хина в дозе 2 ед. на I мл питательной среды усиливает пролифераци хронически инфицированных ВЛКРС клеток П.« -Ы-V в псевдосуспен а ионных культурах, повышает репликацию вируса и продукцию гликопр »видного антигена.

Влияние ДМСО ма продуктивные свойства длительно переживающих культур клеток TLK, - bLV на яикроносителях .

Максимальная репликация вируса и продукция глккопротендного тигена в хронически инфицированных ВЛКРС перевиваема культурах п исходит в период активного деления клеток. После формирования пло монослоя (на 6-7 сутки) происходит контактная ингибиция пролифера клеток. Клетки стареют, появляется грубая зернистость в цитоплазм снижается их жизнеспособность и функциональная активность.

Таблица 6

Влияние ДМСО на репликацию ВЖРС и продукцию г ли копротеидно го антигена в длительнопереживающих культурах клеток-fLVC. - fcLVf на микроносителях

Длитель- ; ТСО (количество синцитиев ! Титры гликопротеидного ность :_в I препарате)_: антигена в ГИД

wwhvunu— 'irríu'rnnjiktttjo . 'гпитнид m/я к— *кли<ртвьяий ^ nnumiAjo'W

культивирования (в сутках) .'контрольные ; (сультуры ¡опытные культуры ♦ ДиСО • :контрольные : : культуры : • - • опытные к туры + Д

8 53,6 ± 2,4 . 1:22,6 t 4,8

13 J.2,3 i 4,6 36,? t 3,4 1:14,5 ± 3,7 1:18,6 ±

18 6,2 i 3,2 28,6 t 2,7 Ir.9,3 ± 6,1 1:12,0 ±

23 6,3 t 4,2 24,3 t 3,6 I: 3,3 t 1,1 1:10,6 ±

28 2 15,6 t 2,6 следы I: 5,3 *

33 - 11,3 £ 2,4 следы I: 3»3 *

38 - 4,7 - 3,6 следы I: 2,0

42 • 2,5 - 2,3 — следа

______Увеличение длительности переживания и функционирования моно-

хяойных культур клеток имеет важное значение в производстве зируоных

трепаратов. Продлению переживания и функционирования клеток"« плотно»--------------

«энослое способствует препарат диметклсульфоксид (ЛЫСО), изханизм »того действия объясняется способностью ДИСО связывать свободные раскали гидроокиси (ОН) и кислорода, которые по мнению Церспс Т Е и ч? 1 др. (1979, 1953) является ответственными за повреждение и старение слеток.

Данные приведенные в таблице 6 показывают, что с увеличением :роков переживания культур даже при регулярных сменах среди происходит резкое снижение как репликации вируса, так и продукции гликопро-геидного антигена. Добавление в поддерживав^ув среду Д1Ю0 в 1% концентрации (опытные культуры) существенно продлевало продуктивное ■ юстояние клеток. В опытных культурах репликация вируса и продукция гл ик опро те идно го антигена были интенсивнее и наблюдались более про-цолжителькый период времени по сравнению с контрольными культурами.

Таким образом, перевиваемые клетки -В1М при периодической змене среда, содержащей 1% ДМСО могут длительное время порезгивать на коллагеноЕых перенос и тел ях ЕИ-З и продуцировать ВЛКРС в гликопро-гекдный антиге^

ВЫВОДЫ

1. Сывороточный Фактор питательной среды играет реяаящуо роль

в прикреплении и прали*ер.щин клето1с?1_УС - ЬиУ, оптимальной является сыворотка эмбрионов коров в концентрации не ните 10?.

2. [¡итат-зльная среда ДМЕМ в смеси со средой 1?3 в соотношении

2:1 обеспечивает наиболее интенсивную пролиферацию клетокП-К. - ,

репликации ВЛХРС и продукция глккопрогеидного антигена.

3. Смесь сывороток,- состоящая на 70« сыворотки овец и 30% сыго-ротчи экбрноноп коров мотет заменить в пгевдосуспензионньпс культур« клеток ? -Ь1-М на микроносителях дорогостоящую сыворотку эмбрионов коров, обеспечивая на достаточно высоком уровне пролиферации клеток, репликацию вируса и продукцию гликопротеидного антигена.

-1. Наиболее адекватным микроносителем для хронически инфицированных к.фуоом лейкоза перевиваемых клеток -^ЬК. - В1У является отечественный коллагеном.';! микроноситель неправильной фермы ЕИ-3.

о. Инсулин я дозе 2 ед. ид I «л питательной среды усиливает , пролиферации клего*, повыаает репликации вируса и продукции вирусных антигенов в псевдосуспензионных культурах клеток ^Т-К. ~ на микроносителях.

6. Наибольший выход ВЖРС и гликопротеидного антигена в культу. р«х клеток - Ь1-У на микроносителях происходит в период активнс размножения клеток, до формирования плотного.ыонослоя.

7. Снижение содержания сыворотки в культурах клеток на микроносителях после Формирования монослоя до 5(£ замедляет изменение рН среды и способствует более длительному переживанию к функционировал* клеток.

8. Диметилсульфоксид в 1% концентрации продлевает продуктивное состояние клеток в переживающих культурах со сформировавшимся монослоем на микроносителях и способствует увеличению выхода вируса и гликопротеидного антигена.

Сведения о практическом использовании результатов исследования

(Хатериалы диссертации используются в учебном процессе при чтен» лекций и проведении лабораторно - практических занятий со студентам» четвертого и пятого курсов^ветеринарного факультета и в лаборатории гемобластозов и иммуномодуляторов Московской государственной академ* ветеринарной медицины и биотехнологии (выписка из протокола * 3 от 20 декабря 1994 года Ученого Совета ветеринарного факультета).

ЛРАКШЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Изложенные в диссертации результаты исследования условий выращивания хронически инфицированных ВЖРС перевиваемых клеток -В

в псевдосуспензионных культурах на микроносителях и факторов, повышающих пролиферацию клеток, репликацию вируса и продукцию вирусных антигенов могут найти широкое применение в научных лабораториях, разрабатывающих новые методические подходы и технологии для получен» вирусных препаратов и существенно снизить материальные затраты при крупиомасита'ном производстве ди&гностикумов, вакцин м других биологических препаратов на предприятиях биологической промьишеиности.

СПИСОК РАБОТ, ОГШЗЛШЗВАНШХ ПО ТЕаЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Балде какаду А. Продукция БШРС и его гликопротеидного антигена в культурах клеток К К - на различных микроносителях. //Актуальные мпросы инфекционных и инвазионных болезней животных: Сборник научных трудов /Московская государственная академия ветерина ной медигсч:- < биотехнологии, 1994. - С. 1оЗ - 155.

2. Балде Мамаду А., Смирнова Д.П., Крикун В.А. Сравнительная

оценка макроносителей (МН) при культивировании перевиваемых клеток -р!^, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого

скота. //Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней_____

животных: Сборник научных трудов /Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии, 1954, - С. 151-163.

1;ахжоА-вно на ротапринта, '/¡шогри^дд "Р(Л'«?лО" .«ясни^уци, оо.

осиЗДЗ 40, тири »«¿Ь ЗКЗ.