Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Морфологическая и гистохимическая характеристика изготовленных in vitro хондротрансплантатов лошадей
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 16.00.02
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Морфологическая и гистохимическая характеристика изготовленных in vitro хондротрансплантатов лошадей
На правах рукописи
ПОНОМАРЁВ ИГОРЬ ВЛАДИМИРОВИЧ
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗГОТОВЛЕННЫХ IN VITRO ХОНДРОТРАНСПЛАНТАТОВ ЛОШАДЕЙ
16.00.02 - Патология, онкология, и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Ульяновск-2008
003452766
Работа выполнена в Новосибирском государственном аграрном университете и исследовательском центре по медицинской технике и биотехнологии, Бад Лангензальца, Германия
доктор биологических наук, профессор Короткевич Ольга Сергеевна
доктор биологических наук, профессор Сыч Виталий Федорович доктор биологических наук, профессор Любовцева Людмила Алексеевна
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Самарская государственная сельскохозяйственная академия
Защита состоится «¿7» г в УР часов на заседании
диссертационного совета Д 212.278.07 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет по адресу: Набережная реки Свияги, 106, корпус 1, аудитория 703.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом - на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru.
Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432000, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.
Автореферат разослан <%д£<^/2008 года
Научный руководитель: Официальные оппоненты:
Ведущее учреждение:
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент
.О)
С.В. Пантелеев
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время ведётся активный поиск оптимальных методов лечения травматологических и дегенеративных повреждений гиалинового хряща коленного сустава. Расширение спектра лечебных мероприятий привело к появлению и развитию нового направления, находящегося на стыке биотехнологии и медицины - тканевой инженерии. В современной ортопедии достаточно широко используются методы тканеинженерного восстановления дегенеративных изменений гиалинового (суставного) хряща такие как: Mosaik-Plastik-Transplantation (MPT), Autologe Chondrocyten Transplantation (ACT) и Matrix Associated Autologous Chondrocyte Transplantation (MACT). Два последних метода находят всё большее применение в ветеринарии, в особенности при лечении суставных заболеваний лошадей (Barnewitz et al., 2003; Litzke et al., 2004).
Травмы, а также дегенеративные изменения хряща как следствие реакции сустава на перегрузку играют в развитии остеоартроза (OA) в случае, например, спортивных лошадей значительно большую роль чем возрастные или инфекционные факторы (Mac Kay-Smith, 1962; Raker et al., 1966; Vachon et al., 1986).
Необходимость создания нового направления регенеративной медицины обусловлена ограниченной возможностью к самовосстановлению гиалинового хряща in vivo. Основой метода тканевой инженерии является создание трёхмерных хрящевых трансплантатов в условиях in vitro и последующая их имплантация в область поражения поверхности сустава. В качестве клеточного материала для изготовления „инженерных" хондротрансплантатов используются аутологичные хондроциты, полученные путём биопсии. Изолированные из хрящевой ткани биоптата клетки размножают затем в монослойной культуре до необходимой концентрации, после чего их переводят в трёхмерную форму. Для поддержания пространственной формы существования клеток суставного хряща in vitro применяют, как правило, различные резорбируемые матрицы-носители (Sittinger et al., 1994). Их изготавливают либо из синтетических полимеров молочной и/или гликолевой кислот, либо из органических материалов типа коллагена.
Несмотря на многочисленные позитивные свойства, матрицы-носители являются чужеродными агентами в среде, как самого трансплантата, так и всего сустава в целом. Резорбция материалов, из которых состоят матрицы в условиях суставной жидкости, происходит значительно дольше (год и более) чем, к примеру, в костной ткани, а то и вовсе «ограничивается» капсулированием инородного тела. Процесс элиминации компонентов матриц-носителей сопровождается повышением местного иммунитета, в частности, значительным увеличением количества макрофагов. К тому же продукты распада влияют на изменение рН среды как в условиях in vitro, так и in vivo. Необходимо учитывать и тот факт, что все предлагаемые в качестве
матриц-носителей препараты, являются коммерческими продуктами и соответственно повышают конечную стоимость лечения.
Исходя из этого, была разработана концепция создания трёхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения матриц-носителей (Ponomarev et al., 2004). В основе метода лежит способность клеток гиалинового хряща активно синтезировать компоненты внеклеточного матрикса (коллаген и протеогликаны) в ответ на механическую стимуляцию. С помощью данной методики удалось получить хондротрансплантаты размером до 2 см в диаметре и толщиной до 3 мм, которые по своей природе являются полностью аутологичными пациенту, так как состоят из собственных клеток и продуктов их синтеза. К тому же в процессе культивирования клеток в качестве необходимой добавки к питательной среде используется аутологичная сыворотка крови.
Использование в экспериментах по изучению репарации гиалинового хряща лабораторных мышей и кроликов сыграло важную роль в понимании механизмов хондрогенеза, однако экстраполяция результатов полученных на суставах мелких животных (толщина коленного хряща кролика около 400 мкм) на объекты типа лошади (толщина коленного хряща 3-5 мм), представляется проблематичной. Имеется незначительнре количество публикаций по использованию лошади в качестве экспериментального животного (Barnewitz et al., 2003; Litzke et al., 2004), что, по-видимому, объяснимо стоимостью проведения исследований. Исходя из этого, изготовление объёмных (диаметром более 1 см и толщиной 2-4 мм) псанеинженерных конструктов из хондроцитов лошади и изучение процессов формирования хрящевой ткани в них является актуальной задачей.
В литературе описаны примеры создания хрящевых трансплантатов без применения матриц-носителей (Adamietz et al., 2003; Grogan et al., 2003), но размеры этих конструктов не превышают 5 мм в диаметре, что является серьёзным ограничением при внедрении данных методов в ветеринарную лечебную практику крупных животных, каковым является лошадь.
Таким образом, учитывая важность проблемы изучения процессов восстановления повреждений суставного хряща, проведение сравнительного анализа качества хондротрансплантатов, изготовленных по различным методикам в условиях in vitro, является актуальной задачей, решение которой имеет не только научный, но и практический интерес.
Цель исследования. Дать сравнительную морфологическую, биохимическую и гистологическую характеристику хондротрансплантатов лошадей изготовленных in vitro на основе коммерческих матриц-носителей и альтернативных им трёхмерных хрящевых конструктов, созданных по оригинальной методике.
В задачи исследования входило:
- изучение морфологических изменений в клеточных популяциях хондроцитов в процессе культивирования трёхмерных конструкций хрящевых трансплантатов in vitro;
исследование особенностей биохимических параметров внеклеточного матрикса, синтезированного хондроцитами коленного сустава лошадей, полученного на коммерческих матрицах-носителях и трёхмерных хрящевых конструктов, созданных по оригинальной методике;
- оценка гистологически выявляемых преобразований в трёхмерных хрящевых конструктах, созданных с применением матриц-носителей или без таковых;
- изучение влияния механического стимулирования на биохимические и гистологические показатели внеклеточного матрикса в тканеинженерных конструктах хондроцитов лошади изготовленных без использования матриц-носителей;
- иммуногистохимический анализ внеклеточного матрикса de novo в созданных in vitro хондротрансплантатах лошадей.
Научная новизна. Впервые представлен способ изготовления трёхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения синтетических и искусственных матриц-носителей. Показано, что разработанный способ изготовления хондротрансплантатов без применения матриц-носителей является достойной альтернативой и дополнением, существующим инвазивным методам репарации повреждений суставного хряща. Выявлено положительное влияние механической стимуляции на изменение биохимических и гистологических параметров в трёхмерных культурах хондроцитов лошади in vitro, что может являться фактором, повышающим адаптацию хрящевого регенерата к условиям сустава in situ. В сравнительном аспекте изучены хондротрансплантаты лошадей созданных на основе современных матриц-носителей и тканеинженерных конструктов изготовленных по оригинальной методике. Выявлено, что независимо от природы и структуры материала носителя синтез основных компонентов внеклеточного матрикса происходит на поверхности хондротрансплантата, тогда как глубжележащие участки демонстрируют отсутствие поддержки хондрогенеза в ткани de novo. В противоположность результатам на искусственных матрицах-носителях хрящевые конструкты, изготовленные по оригинальной методике, проявляют значительное морфологическое и биохимическое сходство с нативным гиалиновым хрящом.
Практическое значение исследований.
Оценена практическая значимость коммерческих матриц-носителей для использования в ветеринарной практике крупных животных на примере лошадей.
Предложенный способ микрокапельного нанесения суспензии хондроцитов на матрицы-носители и последующего предкультивирования представляет интерес для специалистов медико-биологического профиля, занимающихся проблемами тканевой инженерии гиалинового хряща.
Изменение биохимических и гистологических параметров внеклеточного хрящевого матрикса под влиянием механического воздействия свидетельствует о целесообразности использования данного вида стимуляции трёхмерных клеточных культур в условиях in vitro как
подготовительный этап при оперативном способе репарации суставных повреждений.
Использование лошади в качестве модельного животного и полученные результаты позволяют не только расширить спектр лечебных мероприятий в случаях травматических артрозов, например, спортивных лошадей, но и дают возможность применения полученных данных в клинических исследованиях, поскольку коленный сустав лошади наиболее схож по таким параметрам как толщина, площадь и степень нагрузки с аналогичным суставом человека.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Сравнительный анализ морфологических, биохимических и гистологических параметров хрящевых конструктов, изготовленных по разным методикам.
2. Значимые различия в показателях внеклеточного матрикса de novo хондротрансплантатов лошадей изготовленных разными способами, свидетельствуют о целесообразности использования такого фактора как механическая стимуляция в процессе культивирования трёхмерных конструктов in vitro.
3. Способ создания тканеинженерных трансплантатов без применения матриц-носителей является достойной альтернативой существующим методам репарации повреждений суставного хряща.
Апробация. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на международной научно-практической конференции "Проблемы развития коневодства и конного сорта в России", Новосибирск, 2003; 11. Heiligenstädter Kolloquium - Technische Systeme für Biotechnologie und Umwelt, Heiligenstadt, Germany, 2003; Conference "Strategies in Tissue Engineering", Würzburg, Germany, June, 2004; 2nd World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, May, 2005; 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society, Munich, Germany, August, 2005; региональной научно-практической конференции "Болезни лошадей", Новосибирск, 2006; II международной научно-пратической конференции "Актуальные проблемы животноводства", Новосибирск, 2006; ЕСМ VII Meeting „Cartilage & Joint Repair", Davos, Switzerland, June, 2006.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 1 таблицу. Библиографический список включает 130 источников.
Автор выражает благодарность всем коллегам лаборатории тканевой инженерии исследовательского центра по медицинской технике и биотехнологии, Бад Лангензальца (Германия), в особенности ассистенткам Даниэле Пауль и Михаэле Нойман за помощь в проведении биохимических и
гистологических исследований. Также автор выражает особую благодарность д.б.н. Кочневой M.JI. и аспиранту Одинцовой Е.С. (Россия) за оказание практической помощи при оформлении и редакции материалов диссертации.
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изолирование и культивирование лошадиных хондроцитов в монослое. Биоптаты хряща были получены из коленных суставов лошадей эвтаназированных по причинам не связанными с суставной патологией. Возраст лошадей на момент эвтаназии составлял от 1 года до 15 лет. Изолирование и культивирование хондроцитов в монослойной культуре проводилось по стандартной методике (Sittinger et al., 1994).
Культивирование хондроцитов в условиях трёхмерных культур. По достижению необходимой концентрации (10-20 млн) клетки трипсинировали и в виде суспензии с помощью микропипетки наносили на соответствующую матрицу-носитель. В качестве матриц в работе использовались два применяемых в ортопедии и апробированные в ветеринарной практике (Barnewitz et al., 2003; Litzke et al., 2004) коммерческих препарата: Ethisorb® (Ethicon, Norderstedt, Germany) и Chondro-Gide® (Geistlich Pharma AG, Schwitzerland). Ethisorb® представляет собой биорезорбируемый композитный синтетический материал, состоящий из полидиаксона (PDS) и полиглактина (PGL - гликолид/лактат-кополимер, известный также, как шовный материал применяемый в хирургии). Микроскопически Ethisorb® выглядит как рыхлая ткань, что позволяет клеточной суспензии легко проникать внутрь и гомогенно распределяться по матрице. Имеющая две поверхности - «гладкую» и «шероховатую» коллагеновая мембрана Chondro-Gide фирмы Geistlich, является биологическим производным переработки свиного коллагена I и III типов, которая также используется в тканевой инженерии суставного хряща. Культивирование клеток осуществляется на «шероховатой» поверхности мембраны, которая имеет разветвлённую структуру и служит для поддержания и сохранения пространственного фенотипа хондроцитов.
При изготовлении тканеинженерных трансплантатов без применения матриц-носителей использовалась запатентованная оригинальная методика (Ponomarev & Wilke, 2004). В основе метода лежит создание так называемой пеллет-культуры, когда клетки в высокой концентрации (30-50 млн.) путём центрифугирования образуют плотный агрегат, который в последующем, посредством механической стимуляции, образует хрящеподобную структуру, характеризуемую высоким содержанием компонентов внеклеточного матрикса. Механическая стимуляция проводится мануально с помощью стеклянной палочки необходимых размеров. Время, частота и интенсивность нагрузки определяются индивидуально для каждого конструкта и контролируются визуально. Параметры механической нагрузки возрастают по мере изменения плотности трансплантата.
Культивирование всех видов трёхмерных тканеинженерных конструктов осуществлялось в 6-ти луночной плате фирмы Sarstedt (Nümbrecht, Germany) при ежедневной смене культуральной среды.
Морфологические, биохимические, гистологические и иммуно-гистохимические исследования. По окончании сроков культивирования (3-4 недели) хондротрансплантаты фиксировались для биохимических, гистологических и иммуногистохимических исследований. Анализ морфологических изменений тканеинженерных хрящевых конструктов осуществлялся с помощью фазово-контрастного микроскопа Leica DM-IL (Fa. Leica, Wetzlar, Germany).
Для проведения биохимических анализов образцы всех тканеинженерных конструктов обезвоживались и обезжиривались в батарее ацетон - ацетон: эфир - эфир, после чего определялось содержание основных компонентов внеклеточного матрикса - протеогликанов и коллагена. Для количественного анализа протеогликанов использовалась фотометрическая реакция с 1,9-диметилметиленовым голубым, специфически выявляющая кислые (сульфатированные) гликозаминогликаны: кератансульфат и хондроитин-6-сульфат, ответственных за аммортизационные свойства хряща (Farndale et al., 1986). Количественный анализ коллагена пррводился также фотометрически с высушенными солянокислыми гидролизатами проб. Были проанализированы коллагенспецифические аминокислоты гидроксипролин и гидрокси-лизин (Blumenkrantz & Asboe-Hansen, 1978). Контролем при сравни-тельных анализах различных конструктов хондротрансплантатов служил нативный суставной хрящ лошадей.
Для гистологического анализа пробы фиксировались 24 часа в 4% - ом нейтрально забуференном формалине с последующим высушиванием в батарее спиртов восходящей концентрации. Оценка компонентов внеклеточного матрикса и общей морфологии исследуемых тканеиженерных конструктов проводилась на парафиновых срезах толщиной 7 мкм. Для выявления коллагена использовалось окрашивание по Массону, протеогликаны определяли алциановым синим. Для изучения общей морфологической картины применяли метахроматический краситель толуидиновый синий. Иммуногистохимический анализ для коллагена 11-го типа и кислых гликозаминогликанов проводился на аналогичных парафиновых срезах.
Полученные результаты количественных анализов обрабатывали методами параметрической статистики при помощи пакета прикладных программ Microsoft Excel 7,0 (USA) для Windows 98. Для оценки достоверности разности между средними значениями двух групп использовали t-критерий Стьюдента при условии нормального распределения объектов в выборке. При малом числе значений б выборках пользовались критерием согласия Колмогорова-Смирнова (Васильева Л.А., 2004). Статистически значимыми различия считали при р<0,05.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Анализ морфологических изменений тканеинженерных хрящевых конструктов
В процессе культивирования тканеинженерных хрящевых конструктов отмечались значительные морфологические изменения на клеточном и межклеточном уровне, которые регистрировались с помощью микроскопа или визуально.
3.1.1 Морфологические изменения мембраны Chondro-Gide8
Мембрана является оптически непрозрачной структурой поэтому
наблюдения с помощью микроскопа были невозможны и проводились визуально по изменению общей морфологии объекта. Под микроскопом контролировалось качество «прививки» хондроцитов на волокнистую сторону мембраны, а именно: отмечался смыв клеток с матрицы и переход их в монослой после добавления культуральной среды в лунку. Применение микрокапельного метода нанесения суспензии на носитель (5-10 мкл) позволило свести потери клеточного материала к минимуму.
После трёхнедельного культивирования отмечалась незначительная контрактура края мембраны, что можно объяснить размягчением структурных компонентов самой мембраны в процессе культивирования, а также деформирующими изменениями, вызванными созреванием внеклеточного матрикса de novo.
3.1.2 Морфологические изменения на матрице Ethisorb*
При нанесении клеточной суспензии на матрицу отмечался больший, чем в случае с мембраной Chondro-Gide®, смыв клеток, что объясняется наличием довольно крупных пор в носителе. На рис. 1а показана начальная стадия трёхмерного роста клеток (отмечено тонкой стрелкой) между волокнами носителя (толстая стрелка), а на рис. 16 - процессы происходящие через 7-10 дней культивирования. Отчётливо видно заполнение пространства матрицы-носителя вновь синтетизированным клеточным материалом.
а б
Рис.1 Морфологические изменения на матрице Ethisorb* (фазово-контрастная микроскопия, увеличение: а - х200; б - хЮО).
3.1.3 Морфологические изменения трёхмерных конструкций изготовленных без использования матриц-носителей
3.1.3.1 Субклеточные изменения трёхмерных конструкций После формирования клеточного агрегата и проведения механической стимуляции отмечаются значительные, регестрируемые под микроскопом морфологические преобразования поверхностных структур
тканеинженерного хрящевого конструкта без матрицы-носителя (ТХКбМН). На рис. 2а отмечаются отдельные, чётко различимые агрегированные клетки до начала проведения механического воздействия. На рис. 26 видны изменения произошедшие с конструктом после двукратно проведённого механического стимулирования. Практически неразличимые, погружённые в плотный матрикс, отдельные клетки после семикратного механического воздействия представлены на рис. 2в.
а б в
Рис. 2. Субклеточные изменения поверхности клеточного агрегата (фазовый контраст, хЮО)
3.1.3.2 Макроскопическая оценка хондротрансплантатов На рис. 3 демонстрируется внешний вид хрящевых конструктов без матриц-носителей, изготовленных при использовании механической стимуляции в качестве фактора формирования трёхмерной структуры. Были получены трансплантаты 3-4 мм толщиной, с плотностью позволяющей производить необходимые трансплантационные манипуляции (рис. За). Линейные размеры тканеинженерных хондро-трансплантатов представлены на рис. 36.
а
Рис. 3. Внешний вид хондротрансплантатов полученных без применения матриц-носителей
3.2 Биохимический анализ тканеинженерных хрящевых конструктов
3.2.1. Количественное определение кислых гликозаминогликанов В обезвоженных и обезжиренных пробах (ООП) тканеинженерных конструктов, а также нативного суставного хряща, было проведено количественное определение концентраций кислых гликозаминогликанов (ГАГ). На рис. 4 представлены суммарные результаты анализов всех использованных трёхмерных конструктов, а так же нативного хряща из коленного сустава лошади.
Рис. 4. Содержание протеогликанов в тканеинженерных конструктах и в нативном суставном хряще
Выявленные концентрации сульфатированных гликозаминогли-канов в ООП составили для нативного суставного хряща 78,54±7,46 мкг на миллиграмм высушенной пробы; для ТХКбМН: 27,64±1,83 мкг/мг (35% от содержания в нативной ткани); для матрицы Chondro-Gide®: 1,51±0,34мкг/мг (2% от нативной ткани) и для матрицы Ethisorb®: 1,48±0,42 мкг/мг (2% от нативной ткани).
Таким образом, значимые различия между хондротрансплантатами лошадей изготовленных по разным методикам свидетельствуют о целесообразности применения механической стимуляции в условиях in vitro для повышения синтеза одного из основных компонентов внеклеточного матрикса гиалинового хряща - протеогликанов.
3.2.2 Количественное определение гидроксипролина
Гидролизованные 6-ти молярной соляной кислотой и высушенные пробы хрящевых конструктов, а также нативной ткани были исследованы на содержание коллагенспецифической аминокислоты - гидроксипролина. Рис. 5 демонстрирует различие в концентрациях в зависимости от вида тканеинженерного конструкта.
120 100 -80 60 40 20 О
Нативный хрящ
ТХКбМН
Рис. 5. Концентрация гидроксипролина в трёхмерных тканеинженерных хрящевых конструктах и в нативном суставном хряще
Спектрофотометрически были выявлены следующие количественные показатели гидроксипролина: нативный суставной хрящ: 96,45±3,30 мкг/мг ООП, тканеинженерный конструкт без матрицы-носителя: 28,27±1,40 мкг/мг ООП (29,3% от содержания в нативной ткани, матрица Ethisorb®: 1,74±0,22 мкг/мг ООП (2% от нативной ткани).
В приведённых данных не были учтены результаты анализов проб Chondro-Gide®, так как данный носитель сам состоит из смеси коллагенов, что исключает возможность определения гидроксипролина во вновь синтезированном матриксе.
Достоверно значимые различия (Р<0,001) количественного содержания гидроксипролина в тканеинженерных хрящевых конструктах изготовленных по различным методикам, свидетельствуют о позитивном влиянии механического стимулирования на синтез структурного компонента внеклеточного матрикса - коллагена в процессе культивирования хондротрансплантатов in vitro.
3.3 Гистологический анализ тканеинженерных хрящевых
конструктов
Проведённые гистологические исследования выявили значительную разницу в структурах тканеинженерных конструктов, в распределении компонентов внеклеточного матрикса и в клеточной морфологии.
3.3.1 Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов на
матрице Chondro-Gide®
Рис. 6 демонстрирует состояние трёхмерной клеточной культуры на мембране Chondro-Gide® после трёхнедельного культивирования. Данный гистологический срез (окраска толуидиновым синим) иллюстрирует отсутствие чёткой структуры внеклеточного матрикса de novo (рис. ба). Клетки расположены хаотично, отмечаются редкие рыхлые изогенные группы, в отдельных случаях отмечаются поверхностные
фиброцитоподобные образования (рис. 66). Заселение клетками глубоких слоев матрицы носит спорадический, одиночный характер (рис. 6в). В тексте диссертации также анализируются гистологические срезы, окрашенные на коллагены и протеогликаны.
->
avw
■ >с/Й|
а б в
Рис. 6. Гистоморфология хондротрансплантата на матрице Chondro-Gide® (толуидиновый синий, увеличение а - х40, б - х200, в - х400)
3.3.2 Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов на матрице Ethisorb®
На рис. 7 представлены гистологические срезы трёхмерного хрящевого конструкта, полученного на матрице Ethisorb®. Отмечается гомогенное распределение клеточного материала в структуре носителя (рис. 7а), образование рыхлых, но отчётливо различимых структур внеклеточного матрикса (рис. 76). Трёхмерное состояние клеток в глубоких слоях конструкта характеризуется отсутствием выраженной морфологии (рис. 7в). Поверхность трансплантата покрывает плотный фиброцитоподобный клеточный слой. Полученные гистологические результаты согласуются с проведёнными биохимическими анализами и подтверждают наличие в хондротрансплантате, изготовленном in vitro, основных компонентов внеклеточного хрящевого матрикса - коллагенов и протеогликанов.
Примечательно иллюстрируемое наличие нерезервированных структур матрицы-носителя (окрашены более интенсивно), представленных как отдельными нитями так и целыми блоками полимерного материала. Культивирование в трёхмерном состоянии длилось 3-4 недели, что является недостаточным для биорезорбции носителя. Тем не менее, остаётся невыясненным вопрос о полноценном замещении материала матрицы на синтезированный хондроцитами внеклеточный матрикс de novo.
а б в
Рис. 7. Гистоморфология хондротрансплантата на матрице ЕЙшогЬ® (толуидиновый синий, увеличение а - х40, б - х200, в - х400)
3.3.3 Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов изготовленных без применения матрицы-носителя Гистологическими исследованиями тканеинженерного хрящевого конструкта без матрицы-носителя (ТХКбМН) обнаружено гомогенное распределение клеток по всему пространству хондротрансплантата. Использование метахроматического красителя толуидиновый синий позволяет выявить гетерогенность распределения внеклеточных структур в ТХКбМН (рис. 8а). Распределение молекул матрикса ещё более чётко демонстрирует применение селективных красителей для коллагенов и кислых ГАГ (иллюстрации представлены в диссертации). Причём характер их распределения схож с таковым в нативном суставном хряще, а именно: поверхностно выявляется преимущественно коллаген, с преобладанием клеток веретенообразной (фиброцитопо-добной) и овальной форм (рис. 8а,б), в глубоких же слоях преобладают протеогликаны и клетки округлой формы (рис. 8в). Отмечается также характерное для глубоких слоёв гиалинового хряща формирование хондронов, в случае ТХКбМН пока ещё представленных одиночными клетками, но необходимо учитывать, что возраст данного конструкта составляет 3-4 недели.
а б в
Рис.8. Гистоморфология трёхмерного хондротрансплантата без использования матрицы-носителя (толуидиновый синий, увеличение а - х40, б - х200, в - х400)
Применение механической стимуляции в процессе трёхмерного культивирования хондротрансплантата, по-видимому, активизирует адаптацию клеток тканеинженерного конструкта к нагрузке через синтез молекул внеклеточного матрикса - коллагена и протеогликанов, что позволяет поддерживать клеточный гомеостаз и противостоять компрессионному сдавливанию.
3.4 Иммуногистохимические исследования тканеинженерных
хрящевых конструктов
Основными структурными компонентами гиалинового хряща лошади, отвечающими за его аммортизационную функцию и осуществляющие безпрепятственное скольжение суставных поверхностей, являются коллаген II типа и кислые ГАГи, представленные у млекопитающих кератансульфатом и хондроитин-6-сульфатом. Для их определения используются методы иммуногистохимического анализа. Однако, на рынке отсутствуют коммерческие препараты антител к коллагенам и протеогликанам лошади. Поэтому в процессе анализа использовались антитела к данным компонентам хрящевого матрикса других животных. Не было получено положительных результатов по выявлению коллагена II типа и протеогликанов на хрящевых трансплантатах на матрицах С1юп<1го-01с1е® и ЕЙшогЬ®, что служит подтверждением полученных ранее невысоких значений результатов биохимических анализов этих носителей. Позитивное окрашивание на коллаген II типа и кератансульфат (рисунки в материалах диссертации) было получено на тканеинженерных конструктах без использования матриц-носителей. На рис. 9 представлены иммуногистохимически окрашенные срезы ТХКбМН на коллаген II типа.
Рис. 9. Иммуногистохимическое окрашивание коллагена II типа в ТХКбМН (увеличение а - х200, б - х400, в - хЮОО)
Иммуногистохимический анализ выявляет гомогенное распределение молекул полимера в пространстве трансплантата (рис. 9а, б). Более иллюстративно демонстрирует коллагеновую архитектуру тканеинженерного конструкта рис. 9в (тысячекратное увеличение, масляная иммерсия). Расположение окрашенных волокон вокруг клеток свидетельствует о значимости для хрящевого гомеостаза структурных (каркасных) протеинов, каковым и является коллаген II типа.
ВЫВОДЫ
1. В результате проведённого исследования были выявлены значительные морфологические, биохимические и гистологические различия между изготовленными in vitro хондротранс-плантатами лошадей, на основе коммерческих матриц-носителей и трёхмерных хрящевых конструктов без применения матриц-носителей.
2. На основании проведённых биохимических и гистологических анализов была выявлена незначительная поддержка хондрогенеза на матрице Chondro-Gide® у размноженных в монослое и привитых на носитель хондроцитов. В связи с этим, применение данной матрицы для проведения инвазивной репарации повреждений суставного хряща лошади методом тканевой инженерии не является оптимальным.
3. Матрица Ethisorb® демонстрирует свойства необходимые для поддержания трёхмерного клеточного фенотипа: гомогенное распределение клеток по материалу носителя, пролиферация клеток, синтез основных компонентов внеклеточного матрикса. Однако, наличие крупных нерезервированных полимерных блоков в структуре хондротрансплантата оставляет нерешённой проблему полноценного замещения пространства искуственного материала на вновь синтезированный внеклеточный матрикс гиалинового хряща. Также представляется проблемной структурная организация матрикса de novo,
выявляемая гистологически: основная масса плотного внеклеточного матрикса распологается поверхностно, тогда как глубокие слои хондротрансплантата заполнены рыхлой тканью и клетками со слабо выраженным хондроцитарным фенотипом.
4. Тканеинженерные конструкты, созданные без применения матриц-носителей, обнаруживают значительное морфологическое, биохимическое и гистологическое подобие с гиалиновым хрящом:
а) клеточная морфология и структурная организация хондротрансплантата схожи с нативной тканью;
б) распределение основных компонентов внеклеточного матрикса (коллагенов и протеогликанов) в тканеинженерном конструкте соответствует таковому в суставном хряще;
в) концентрация протеогликанов в конструкте составляла до 35%, а содержание коллагенспецифических аминокислот гидроксипролина и гидроксилизина - 29,3% и 18,4% соответственно, от такового в нативной ткани;
г) иммуногистохимически установлено, что основным типом коллагена в хондротрансплантате является коллаген II типа, а локализация кератансульфата в околоклеточном пространстве свидетельствует об активности хондроцитов в отношении синтеза протеогликанов.
5. Выявленные в результате исследования морфологические, биохимические и гистологические различия между изготовленными in vitro по различным методикам хондротрансплантатами лошади свидетельствуют о перспективности применения при репарации повреждений суставного гиалинового хряща тканеинженерных конструктов созданных без применения искусственных матриц-носителей.
6. Несмотря на большое число пассажей монослойных культур (3-4), использованная при создании трёхмерных хрящевых конструктов механическая стимуляция значительно влияет на поддержание тканевого хондроцитарного фенотипа и синтетическую активность клеток, что является важной предпосылкой для успешного применения хондротрансплантата при репарации повреждений суставного хряща лошади.
7. Полная аутологичность тканеинженерного хондротрансплантата изготовленного без применения матриц-носителей к хрящевой ткани пациента позволяет говорить о возможности апробации данного метода и в клинической практике.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Пономарев, И. Диагностика и терапия суставных заболеваний у лошадей: состояние вопроса и прогноз на будущее / И. Пономарев, Д. Барневиц, О. Act, Е. Каракин, И. Вильке // Проблемы развития коневодства и конного сорта в России. - Новосибирск, 2003. - С. 112113.
2. Пономарев, И. Мезенхимальные стволовые клетки: новое направление для эффективных терапевтических подходов в ветеренарии / И. Пономарев, И. Вильке, Д. Барневиц, О. Аст, Е. Каракин // Проблемы развития коневодства и конного сорта в России. - Новосибирск, 2003. - С. 114-115.
3. Ponomarev, I. Osteoarthrite-aktivated chondrozytes produce super pattern of matrix metalloproteinases in osteoarthrite equine cartilage / I. Ponomarev, E. Karakine, D. Barnewitz, I. Wilke // Cartilage & Joint Repair : ECM III Meeting, Davos, Switzerland, 2002. - Davos, 2002. - P. 17.
4. Ponomarev, I. Stammzelltechnologie fur Knorpelreparatur beim Pferd -Zellisolierungsmethoden /1. Ponomarev, D. Barnewitz, E. Karakine, I. Wilke // Technische Systeme für Biotechnologie und Umwelt : 11 Heiligenstadter Kolloquium, Tagungsband, 2003. - Tagungsband, 2003. - P. 525-531.
5. Ponomarev, I. Cell Culture Chondrocyte Models for Traumatic and Septic Osteoarthritis in Horse Display Different Matrix Metalloproteinase Patterns ! I. Ponomarev, E. Karakine, D. Barnewitz, M. Fischer, A. Donchenko // Chemical and Biological Problems of Proteomics : International Conference, Novosibirsk, Russia, Juli 5-9,2004. - Novosibirsk, 2004. - P. 54.
6. Ponomarev, I. The Models for Joint Osteoarthritis (OA) in Horse : Matrix Metalloproteinase (MMP) Patterns of Equine Chondrocytes (Cc) in Cell Culture May Mimic the Traumatic (T-OA) and Septic (S-OA) MMP Cartilage Patterns in situ /1. Ponomarev, E. Karakine, D. Barnewitz, Wilke // Strategies in Tissue Engineering : International Conference, Wurzburg, Germany, June 17-19,2004. - Wurzburg, 2004. - P. 72.
7. Ponomarev, I. Post-operational monitoring of matrix metallo-proteinase patterns in synovial fluids reflects normal or osteoarthritic status of equine joint, after implantation of engineered cartilage / I. Ponomarev, E. Karakine, D. Barnewitz, M. Beck, I. Wilke // Congress on Regenerative Biology, Stuttgart, Germany, November 4-6,2004. - Stuttgart, 2004. - P. 91.
8. Ponomarev, I. Deutschen Patent. Verfahren zur Herstellung dreidimensionaler tragerfreier Gewebestrukturen und nach diesem Verfahren hergestellte Gewebestrukturen / I. Ponomarev, I. Wilke // Nr. 10 2004 001 225 des Deutschen Patent.-und Markenamtes, 2004.
9. Ponomarev, I. Mechanical Stimulation of equine mesenchymal cells as differentiation factor for chondrogenesis /1. Ponomarev, M. Fischer, I. Wilke // Strategies in Tissue Engineering : conference, Wurzburg, Germany, June, 2004. - Wurzburg, 2004. - P. 72.
10.Ponomarev, I. MMP-diagnostics of joint arthritis in horse : is applikation for the primary diagnosis and for post-operational monitoring of joint status / I. Ponomarev, E. Karakine, D. Barnewitz, ChD. Werner, I. Wilke // 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society, Munich, Gremany, August, 2005. - Munich, 2005. - P. 94.
11.Ponomarev, I. Molecular mechanisms of induction of different forms of horse joint arthritis point out the way for both the differential diagnosis of the diseases and the joint status after implantation of engineered cartilage / I. Ponomarev, E. Karakine, D. Barnewitz, M. Fischer, I. Wilke // 2nd World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, May, 2005. - Leipzig, 2005.-P. 59.
12.Ponomarev, I. Regenerative medicine: New production process for cartilage transplant / I. Ponomarev, M. Fischer, I. Wilke // 2nd World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, May, 2005. - Leipzig, 2005. - P. 94.
13.Ponomarev, I. Scaffold-free cartilage grafts: from an in vitro study to application /1. Ponomarev, E. Kahl, M. Fischer, I. Wilke // 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society, Munich., Germany, August, 2005. -Munich, 2005.-P. 268.
Н.Пономарев, И. Новые возможности тканевой инженерии при лечении суставных заболеваний лошадей / И. Пономарёв, Д. Барневиц, М. Нойман, И. Вилке // Болезни лошадей: материалы регион, науч.-практ. конф. -Новосибирск, 2006. - С. 60-63.
15.Пономарев, И. Тканевая инженерия при репарации повреждений суставного хряща у лошадей / И. Пономарев, М. Нойман, И. Вильке, О. Короткевич // Актуальные проблемы животноводства: наука, производство и образование. - Новосибирск: НГАУ, 2006- С. 221-222.
16.Пономарев, И. Хондрогенный потенциал мезенхимальных стволовых клеток у лошадей / И. Пономарев, Е. Каракин, И. Вильке, О. Короткевич // Сиб. Вестн. с.-х. науки. - 2006.- № 4. - С. 38-40.
17.Ponomarev, I. Scaffold-free chondrocyte transplantation as alternative to matrix associated chondrocyte transplantation /1. Ponomarev, D. Paul, M. Neumann, I. Wilke // Cartilage & Joint Repairm: ECM VII Meeting, Davos, Switzerland, June, 2006. - Davos, 2006. - P. 73.
Оглавление диссертации Пономарев, Игорь Владимирович :: 2008 :: Ульяновск
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Объективные предпосылки возникновения метода тканевой инженерии.
1.2. Особенности морфологии суставного хряща.
1.3. Методы восстановления повреждений суставного хряща.
1.3.1. Радикальные хирургические методы.
1.3.2. Методы тканевой инженерии.
1.3.2.1. Клеточная терапия.
1.3.2.2. Трёхмерные системы поддержки хондрогенного фенотипа.
1.4. Альтернативные методы создания трёхмерных хондротрансплантатов.
1.5. Механическая стимуляция при создании тканеинженерных хондротрансплантатов.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Изолирование и культивирование лошадиных хондроцитов в монослое.
2.2. Культивирование хондроцитов в условиях трёхмерного состояния.
2.3. Морфологические, биохимические, гистологические и иммуно-гистохимические исследования.
2.3.1. Биохимические исследования.
2.3.2. Гистологические и иммуногистохимические исследования.
2.4. Статистические методы исследований.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Анализ морфологических изменений тканеинженерных хрящевых конструктов.
3.1.1. Морфологические изменения мембраны С1юпс1го-01с1е®.
3.1.2. Морфологические изменения на матрице Е^пбогЬ®.
3.1.3. Морфологические изменения трёхмерных хрящевых конструктов изготовленных без использования матриц-носителей.
3.1.3.1. Субклеточные изменения трёхмерных конструкций.
3.1.3.2. Макроскопическая оценка хондротрансплантатов.
3.2. Биохимический анализ тканеинженерных хрящевых конструктов.
3.2.1. Количественное определение кислых гликозаминогликанов.
3.2.2. Количественное определение гидроксипролина.
3.2.3. Количественное определение гидроксилизина.
3.3. Гистологический анализ тканеинженерных хрящевых конструктов.
3.3.1. Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов на матрице С1юпс1го-С1с1е®.
3.3.2. Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов на матрице Е^богЬ
3.3.3.Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов изготовленных без применения матрицы-носителя.
3.4. Иммуногистохимические исследования тканеинженерных хрящевых конструктов.
3.4.1. Иммуногистохимический анализ коллагена II типа в хондротрансплантатах изготовленных без применения искусственных матриц - носителей.
3.4.2.Иммуногистохимический анализ сульфатировапных гликозаминогликанов в ТХКбМН.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
Введение диссертации по теме "Патология, онкология и морфология животных", Пономарев, Игорь Владимирович, автореферат
Актуальность темы. В настоящее время ведётся активный поиск оптимальных методов лечения травматических и дегенеративных повреждений гиалинового хряща коленного сустава. Расширение спектра лечебных мероприятий привело к появлению и развитию нового направления, находящегося на стыке биотехнологии и медицины — тканевой инженерии. В современной ортопедии достаточно широко используются методы тканеинженерного восстановления дегенеративных изменений гиалинового (суставного) хряща, такие как Mosaik-Plastik-Transplantation (MPT), Autologe Chondrocyten Transplantation (ACT) и Matrix Associated Autologous Chondrocyte Transplantation (MACT). Два последних метода находят всё большее применение в ветеринарии, в особенности при лечении суставных заболеваний лошадей (Bamewitz et al., 2003; Litzke et al., 2004).
Травмы, а также дегенеративные изменения хряща как следствие реакции сустава на перегрузку играют в развитии остеоартроза (OA) в случае, например, спортивных лошадей значительно большую роль, чем возрастные или инфекционные факторы (Mac Kay-Smith, 1962; Raker et al., 1966; Vachon et al., 1986).
Необходимость создания нового направления регенеративной медицины обусловлена ограниченной возможностью к самовосстановлению гиалинового хряща in vivo. Основой метода тканевой инженерии является создание трёхмерных хрящевых трансплантатов в условиях in vitro и последующая их имплантация в область поражения поверхности сустава. В качестве клеточного материала для изготовления „инженерных" хондротрансплантатов используются аутологичные хондроциты, полученные путём биопсии. Изолированные из хрящевой ткани биоптата клетки размножают затем в монослойной культуре до необходимой концентрации, после чего их переводят в трёхмерную форму. Для поддержания пространственной формы существования клеток суставного хряща in vitro применяют, как правило, различные резорбируемые матрицы-носители (Sittinger et al., 1994). Их изготавливают либо из синтетических полимеров молочной и/или гликолевой кислот, либо из органических материалов типа коллагена.
Несмотря на многочисленные позитивные свойства, матрицы-носители являются чужеродными агентами в среде как самого трансплантата, так и всего сустава в целом. Резорбция материалов, из которых состоят матрицы, в условиях суставной жидкости происходит значительно дольше (год и более) чем, к примеру, в костной ткани, а то и вовсе „ограничивается" капсулированием инородного тела. Процесс элиминации компонентов матриц-носителей сопровождается повышением местного иммунитета, в частности, значительным увеличением количества макрофагов. К тому же продукты распада влияют на изменение рН среды как в условиях in vitro, так и in vivo. Необходимо учитывать и тот факт, что все предлагаемые в качестве матриц-носителей препараты являются коммерческими продуктами и соответственно повышают конечную стоимость лечения.
Исходя из этого была разработана концепция создания трёхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения матриц-носителей (Ponomarev, Wilke, 2004). В основе метода лежит способность клеток гиалинового хряща активно синтезировать компоненты внеклеточного матрикса (коллаген и протеогликаны) в ответ на механическую стимуляцию. С помощью данной методики удалось получить хондротрансплантаты размером до 2 см в диаметре и толщиной до 3 мм, которые по своей природе являются полностью аутологичными пациенту, так как состоят из собственных клеток и продуктов их синтеза. К тому же в процессе культивирования клеток в качестве необходимой добавки к питательной среде используется аутологичная сыворотка крови.
Использование в экспериментах по изучению репарации гиалинового хряща лабораторных мышей и кроликов сыграло важную роль в понимании механизмов хондрогенеза, однако экстраполяция результатов, полученных на суставах мелких животных (толщина коленного хряща кролика около 400 мкм), на крупные объекты, например лошадь (толщина коленного хряща 3-5 мм), представляется проблематичной. Имеется незначительное количество публикаций по использованию лошадей в качестве экспериментальных животных (Barnewitz et al., 2003; Litzke et al., 2004), что, по-видимому, объяснимо стоимостью проведения исследований. Исходя из этого, изготовление объёмных (диаметром более 1 см и толщиной 2-4 мм) тканеинженерных конструктов из хондроцитов лошади и изучение процессов формирования хрящевой ткани в них является актуальной задачей.
Имеется ограниченное количество публикаций по созданию хрящевых трансплантатов без применения матриц-носителей (Adamietz et al., 2003; Grogan et al., 2003), но размеры этих конструктов не превышают 5 мм в диаметре, что является серьёзным ограничением при внедрении данных методов в ветеринарную лечебную практику крупных животных, каковым является лошадь.
Таким образом, учитывая важность изучения процессов восстановления повреждений суставного хряща, проведение сравнительного анализа качества хондротрансплантатов, изготовленных по различным методикам в условиях in vitro, является актуальной задачей, решение которой имеет не только теоретический, но и практический интерес.
Цель исследования. Дать сравнительную морфологическую, биохимическую и гистологическую характеристику хондротрансплантатов лошадей, изготовленных in vitro на основе коммерческих матриц-носителей, и альтернативных им трёхмерных хрящевых конструктов, созданных по оригинальной методике.
В задачи исследования входило:
- изучение морфологических изменений в клеточных популяциях хондроцитов в процессе культивирования трёхмерных конструкций хрящевых трансплантатов in vitro; исследование особенностей биохимических параметров внеклеточного матрикса, синтезированного хондроцитами коленного сустава лошадей, полученного на коммерческих матрицах-носителях, и трёхмерных хрящевых конструктов, созданных по оригинальной методике;
- оценка гистологически выявляемых преобразований в трёхмерных хрящевых конструктах, созданных с применением матриц-носителей или без таковых;
- изучение влияния механического стимулирования на биохимические и гистологические показатели внеклеточного матрикса в тканеинженерных конструктах хондроцитов лошади, изготовленных без использования матриц-носителей;
- иммуногистохимический анализ внеклеточного матрикса de novo в созданных in vitro хондротрапсплантатах лошадей.
Научная новизна. Впервые представлен способ изготовления трёхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения синтетических и искусственных матриц-носителей. Показано, что разработанный способ изготовления хондротрансплантатов без применения матриц-носителей является достойной альтернативой и дополнением существующим инвазивным методам репарации повреждений суставного хряща. Выявлено положительное влияние механической стимуляции на изменение биохимических и гистологических параметров в трёхмерных культурах хондроцитов лошади in vitro, что может являться фактором, повышающим адаптацию хрящевого регенерата к условиям сустава in situ. В сравнительном аспекте изучены хондротрансплантаты лошадей, созданные на основе современных матриц-носителей и тканеинженерных конструктов, изготовленных по оригинальной методике. Выявлено, что независимо от природы и структуры материала носителя синтез основных компонентов внеклеточного матрикса происходит на поверхности хондротрансплантата, тогда как глубжележащие участки демонстрируют отсутствие поддержки хондрогенеза в ткани de novo. В противоположность результатам на искусственных матрицах-носителях хрящевые конструкты, изготовленные по оригинальной методике, проявляют значительное морфологическое и биохимическое сходство с нативным гиалиновым хрящом.
Практическое значение исследований. Оценена практическая значимость коммерческих матриц-носителей для использования в ветеринарной практике крупных животных на примере лошадей.
Предложенный способ микрокапельного нанесения суспензии хондроцитов на матрицы-носители и последующего предкультивирования представляет интерес для специалистов медико-биологического профиля, занимающихся проблемами тканевой инженерии гиалинового хряща.
Изменение биохимических и гистологических параметров внеклеточного хрящевого матрикса под влиянием механического воздействия свидетельствует о целесообразности использования данного вида стимуляции трёхмерных клеточных культур в условиях in vitro как подготовительного этапа при оперативном способе репарации суставных повреждений.
Использование лошади в качестве модельного животного и полученные результаты позволяют не только расширить спектр лечебных мероприятий в случаях травматических артрозов, например, спортивных лошадей, но и дают возможность применения полученных данных в клинических исследованиях, поскольку коленный сустав лошади наиболее схож по таким параметрам, как толщина, площадь и степень нагрузки, с аналогичным суставом человека.
Апробация. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на международной научно-практической конференции "Проблемы развития коневодства и конного сорта в России", Новосибирск, 2003; 11. Heiligenstädter Kolloquium - Technische Systeme für Biotechnologie und Umwelt, Heiligenstadt, Germany, 2003; Conference "Strategies in Tissue Engineering", Würzburg, Germany, June, 2004; 2nd World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, May, 2005; 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society, Munich, Germany, August, 2005; региональной научно-практической конференции "Болезни лошадей",
Новосибирск, 2006; II международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы животноводства", Новосибирск, 2006; ЕСМ VII Meeting „Cartilage & Joint Repair", Davos, Switzerland, June, 2006.
Публикации. По результатам исследований опубликовано 17 научных работ, в том числе в журнале "Сибирский вестник сельскохозяйственной науки", сборниках научных трудов НГАУ, СибНИПТИЖ СО РАСХН.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 1 таблицу. Библиографический список включает 130 источников.
Заключение диссертационного исследования на тему "Морфологическая и гистохимическая характеристика изготовленных in vitro хондротрансплантатов лошадей"
выводы
1. В результате проведённого исследования были установлены значительные морфологические, биохимические и гистологические различия между изготовленными in vitro хондротрансплантатами лошадей на основе коммерческих матриц-носителей и трёхмерных хрящевых конструктов без применения матриц-носителей.
2. Биохимический и гистологический анализы выявили незначительную поддержку хондрогенеза на матрице Chondro-Gide® у размноженных в монослое и привитых на носитель хондроцитов. В связи с этим применение данной матрицы для проведения инвазивной репарации повреждений суставного хряща лошади методом тканевой инженерии не является оптимальным.
3. Матрица Ethisorb® продемонстрировала свойства, необходимые для поддержания трёхмерного клеточного фенотипа: гомогенное распределение клеток по материалу носителя, пролиферация клеток, синтез основных компонентов внеклеточного матрикса. Однако наличие крупных нерезорбированных полимерных блоков в структуре хондротрансплантата оставляет нерешённой проблему полноценного замещения пространства искусственного материала на вновь синтезированный внеклеточный матрикс гиалинового хряща. Также представляется проблемной структурная организация матрикса de novo, выявляемая гистологически: основная масса плотного внеклеточного матрикса располагается поверхностно, тогда как глубокие слои хондротрансплантата заполнены рыхлой тканью и клетками со слабо выраженным хондроцитарным фенотипом.
4. Тканеинженерные конструкты, созданные без применения матриц-носителей, обнаруживали значительное морфологическое, биохимическое и гистологическое подобие с гиалиновым хрящом:
1) клеточная морфология и структурная организация хондротрансплантата схожи с нативной тканью;
2) распределение основных компонентов внеклеточного матрикса (коллагенов и протеогликанов) в тканеинженерном конструкте соответствует таковому в суставном хряще;
3) концентрация протеогликанов в конструкте составляла до 35%, а содержание коллагенспецифических аминокислот гидроксипролина и гидроксилизина - 29,3 и 18,4% соответственно от такового в нативной ткани;
4) иммуногистохимически установлено, что основным типом коллагена в хондротрансплантате является коллаген II типа, а локализация кератансульфата в околоклеточном пространстве свидетельствует об активности хондроцитов в отношении синтеза протеогликанов.
5. Выявленные в результате исследования морфологические, биохимические и гистологические различия между изготовленными in vitro по различным методикам хондротрансплантатами лошади свидетельствуют о перспективности применения при репарации повреждений суставного гиалинового хряща тканеинженерных конструктов, созданных без применения искусственных матриц-носителей.
6. Несмотря на большое число пассажей монослойных культур (3-4), использованная при создании трёхмерных хрящевых конструктов механическая стимуляция значительно влияет на поддержание тканевого хондроцитарного фенотипа и синтетическую активность клеток, что является важной предпосылкой для успешного применения хондротрансплантата при репарации повреждений суставного хряща лошади.
7. Полная аутологичность тканеинженерного хондротрансплантата, изготовленного без применения матриц-носителей, к хрящевой ткани пациента позволяет говорить о возможности апробации данного метода и в клинической практике.
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2008 года, Пономарев, Игорь Владимирович
1. Aicher, W. K. Quality assurance of autologous chondrocyte transplantation / W. K. Aicher, С. Gaissmaier, J. Fritz // Cartilage Surgery and Future Perspectives (Paperback) / C. Hendrich et. all.. Heidelberg : Springer Verlag, 2003. - P. 123-129.
2. Aigner, Т. Collagens : major component of the physiological cartilage matrix, major target of cartilage degeneration, major tool in cartilage repair / T. Aigner, J. Stove // Advanced drug delivery reviews. 2003. - Vol. 55, № 12.-P. 1569-1593.
3. Tissue engineering: new treatment of cartilage alterations in degenerative joint diseases in horses preliminary results of a long term study / D. Bamewitz et. all. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. - 2003. - Vol. 116, №3-4.-P. 157-161.
4. Length variation in the keratan sulfate domain of mammalian aggrecan / F. P. Barry et. all. // Matrix. Biol. 1994. - Vol. 14, № 4. - P. 323-328.
5. N- and O-linked keratan sulfate on the hyaluronan binding region of aggrecan from mature and immature bovine cartilage / F. P. Barry et. all. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270, № 35. - P. 20516-20524.
6. Bassett, C. A. L. Influence of oxygen concentration and mechanical factors on differentiation of connective tissues in vitro / C. A. L. Bassett, I.
7. Herrmann. 11 Natur. 1961. - № 190. - P. 460-461.
8. Indications and implementation of recommendations of the working group "Tissue Regeneration and Tissue Substitutes" for autologous chondrocyte transplantation (ACT) / P. Behrens et. all. //. Z. Orthop. Ihre Grenzgeb. — 2004. Vol. 142, № 5. - P. 529-539.
9. A prospective randomised comparison of autologous chondrocyte implantation versus mosaicplasty for osteochondral defects in the knee / G. Bentley et. all. // J. Bone. Joint. Surg. Br. 2003. - Vol. 85, № 2. - P. 223230.
10. Benya, P. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels / P. D. Benya, J. D. Shaffer // Cell. 1982. - Vol. 30, № 1. - P. 215-224.
11. Blumenkrantz, N. An improved method for the assay of hydroxylysine I N. Blumenkrantz, G. Asboe-Hansen // Anal. Biochem. 1973. - Vol. 56, № 1. — P. 10-15.
12. Blumenkrantz, N. Hydroxyproline to hydroxylysine molar ratio indicates collagen type / N. Blumenkrantz, G. Asboe-Hansen //Acta Derm. Venereol. — 1978.-Vol. 58, №2.-P. 111-115.
13. Bobic, V. Arthroskopie osteochondral autograft transplantation in anterior cruciate ligament reconstruction: a preliminary clinical study / V. Bobic // Knee. Surg. Sports Traumatol. Artrose. 1996. - № 3. - P. 262-264.
14. Bonassar, L. J. Tissue Engineering: The first decade and beyond / L. J. Bonassar, C. A. Vacanti // J. Cell. Biochem. 1998. Vol. 72, № 30/31. - P. 297-303.
15. Reexpression of cartilage-specific genes by dedifferentiated human articular chondrocytes cultured in alginate beads / J. Bonaventure et. all. // Exp. Cell. Res. 1994.-Vol. 212, № l.-P. 97-104.
16. Long-term results of rib perichondrial grafts for repair of cartilage defects in the human knee / S. J. Bouwmeester et. all. // Int. Orthop. 1997. Vol. 21, №5. p. 313-317.
17. Repair of superficial osteochondral defects with an autologous scaffold-free cartilage construct in a caprine model: implantation method and short-term results / W. Brehm et. all. // Osteoarthritis Cartilage. 2006. - № 4(12). -P. 1214-1226.
18. Human aggrecan keratan sulfate undergoes structural changes during adolescent development / G. M. Brown et. all. // J. Biol. Chem. 1998. -Vol. 273, №41.-P. 26408-26414.
19. Buckwalter, J. A. Articular cartilage repair and transplantation / J. A. Buckwalter, H. J. Mankin // Arthritis Rheum. 1998. - № 41. - P. 13311342.
20. Buckwalter, J. A. Articular cartilage / J. A. Buckwalter // Instr. Course Lect. 1983. -№32. - P. 349-70.
21. Effects Of Growth Factors On Cell Proliferation By Human Nasal Septal Chondrocytes Cultured In Monolayer / J. E. Bujia et. all. // Acta Otolaryngol. 1994. - Vol. 114, № 5. - P. 539-543.
22. Bullough, P. The significance of the fine structure of articular cartilage / P. Bullough, J. Goodfellow // J Bone Joint Surg Br. 1968. - Vol. 50, № 4. - P. 852-857.
23. Burgeson, R. E. Collagen types : molecular structure and tissue distribution / R. E. Burgeson, M. E. Nimni // Clinical orthopaedics and related research. -1992. -№ 282.-P. 250-272.
24. Altered aggrecan synthesis correlates with cell and nucleus structure in statically compressed cartilage / M. D. Buschmann et. all. // J. Cell Science. 1996. Vol. 109, № 2. - P. 499-508.
25. Cohen, N. P. Composition and dynamics of articular cartilage: structure, function and maintaining healthy state / N. P. Cohen, R. J. Foster, V. C. Mow // J. Orthop. Sports. Phys. Ther. 1998. - Vol. 28, № 4. - P. 203-215.
26. A human-specific polymorphism in the coding region of the aggrecan gene. Variable number of tandem repeats produce a range of core protein sizes in the general population / K. J. Doege et. all. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, №21.-P. 13974-13979.
27. Recent developments in cartilage reseach: matrix biology of the collagen II/IX/XI heterofibril network / D. R. Eyre et. all. // Biochem. Soc. Trans. — 2002. Vol. 30, № 6. - P. 893-899.
28. Farndale, R. W. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue / R. W. Farndale, D. J. Buttle, A. J. Barrett // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - Vol. 883, № 2. -P. 173-177.
29. Articular Cartilage Repair In Rabbits By Using Suspensions Of Allogenic Chondrocytes In Alginate / E. M. Fragonas et. all. // Biomaterials. 2000. -Vol. 21, № 8.-P. 795-801.
30. Fraser, J. R. Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover / J. R. Fraser, T. C. Laurent, U. B. Laurent // J. Intern. Med. 1997. - Vol. 242, № 1.-P. 27-33.
31. Biomaterialien für die Transplantation chondrogener Zellen zur biologischen Rekonstruktion artikulärer Knorpeldefekte / C. Gaissmaier et. all. // SFA Arthroskopie Aktuell. 2003. - № 16. - P. 1-16.
32. Apoptotic chondrocyte death in cell-matrix biocomposites used in autologous chondrocyte transplantation / J. Gille et. all. // Annals of anatomy. -2002. Vol. 184, № 4. p. 325-332.
33. Goldwasser, M. Analysis of types of collagen present in human newborn and adult articular cartilage / M. Goldwasser, M. Van der Rest, F. H. Glovieux // Trans. Orthop. Res. Soc. 1978. - № 3. - P. 75.
34. IGF-I and mechanical environment interact to modulate engineered cartilage de-velopment / K. J. Gooch et. all. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001. - Vol. 286, № 5. - P. 909-915.
35. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces / A. J. Grodzinsky et. al. //Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000. - № 2. - P. 691-713.
36. A static, closed and scaffold-free bioreactor system that permits chondrogenesis in vitro / S. P. Grogan et. al. // Osteoarthritis Cartilage. -2003 . Vol. 11, № 6 (Jun.). - P. 403-411.
37. Guo, J. F. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads / J. F. Guo, G. W. Jourdian, D. K. MacCallum // Connect Tissue Res. 1989. - Vol. 19, № 2/4. - P. 277-297.
38. Haebler, C. Experimentelle Untersuchungen über die Regeneration des Gelenkknorpels / C. Haebler // Klin. Chir. 1925. - № 134. - S. 602-640.
39. Treatment of osteochondritis dis-secans of the talus : use of the mosaic-plasty technique a preliminary report / L. Hangody et. al. // Foot Ankle Int. - 1997. - № 18. - P. 628-634.
40. Hardingham, T. A Tissue engineering : chondrocytes and cartilage / T. Hardingham, S. Tew, A. Murdoch // Supplement Review. Arthritis Res. -2002. № 4 (Suppl. 3). - P. 63-68
41. Hardingham, T. Aggrecan, the chondroitin sulfate/keratan sulfate proteoglycan from cartilage / T. Hardingham, A. J. Fosang, J. Dudhia //
42. Articular cartilage and osteoarthritis / in eds. : K E. Kuettner, R. Schleyerbach, J. G. Peyron, V. C. Hascall. N. Y. : Raven Press, 1992. - P. 5-20.
43. Synthesis and turnover of proteoglycans by human and bovine adult articular chondrocytes cultured in alginate beads / H. J. Hauselmann et. al. // Matrix. 1992. - № 12. - P. 116-129.
44. Adult human chondrocytes cultured in alginate form a matrix similar to native human articular cartilage / H. J. Hauselmann et. al. // Am J Physiol. 1996. - Vol. 271. - P. 742-752.
45. Phenotypic stability of bovine articular chondrocytes after long-term culture in alginate beads. / H. J. Hauselmann et. al. // J Cell Sei. 1994. - Vol. 107.-P. 17-27
46. Herbage, D. Biochemical and physiochemical characterization of pepsin-solubilized type-II collagen from bovine articular cartilage / D. Herbage, J. Bouillet, J. C. Bernengo // Biochem J. 1977. - Vol. 161, № 2. - P. 303312.
47. Holtzer, H. J. The Loss Of Phenotypic Traits By Differentiated Cells In Vitro. I. Dedifferentiation Of Cartilage Cells / H. J. Holtzer et. al. // Proc Nat Acad Science. 1960. - № 46. - P. 1533-1542.
48. Horas, U. Autologous chondrocyte implantation and osteochondral cylinder transplantation in cartilage repair of the knee joint. A prospektive, comparative trial / Horas U. et. al. // J Bone Joint Surg Am. 2003. - P. 2487-2488.
49. Hunter, W. Of The Structure And Diseases Of Articulating Cartilages / W. Hunter // Philos Trans Roy Soc. L., 1743. - № 42. - P. 514-521.
50. ITunziker, E. B. Articular cartilage repair : basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects / E. B. Hunziker // Osteoarthritis Cartilage. 2002. - № 10. - P. 432-463.
51. Arthroscopic mosaic arthroplasty in the equine third carpal bone / M. Hurtig et. al. // Vet Surg. 2001. - Vol. 30, № 3 (May-Jun.). - P. 228-239.
52. The new collagen gene COL27A1 contains SOX9-responsive enhancer elements / E. Jenkins et. al. // Matrix Biol. 2005. - № 24. - P. 177-184.
53. Discrete integration of collagen XVI into tissue-specific collagen fibrils or beaded microfibrils / A. Kassner et. al. // Matrix Biol. 2003. - № 22. - P. 131-143.
54. Knudson, C. B. Cartilage proteoglycans / C. B. Knudson, W. Knudson // Semin Cell Dev Biol. 2001. - Vol. 12, № 2. - P. 69-78.
55. A novel marker of tissue junctions, collagen XXII / M. Koch // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, № 21. - P. 22514-22521.
56. Expression of cartilage-specific molecules is retained on long-term culture of human articular chondrocytes / E. Kolettas // J Cell Sci. 1995. - Vol. 108, № 5.-P. 1991-1999.
57. Kuettner, K. E. Articular cartilage matrix and structure / K. E. Kuettner, M. B. Aydelotte, E. J. Thonar // J Rheumatol 1991. - № 18. (Suppl. 27). - P. 46-48.
58. Kurz, B. Physiko-mechanische Stimulation von Zellen am Beispiel des Gelenkknorpels / B. Kurz, M. Schiinke // Tissue Engineering : neues zum Gewebeersatz im Muskel-Skelett-System / ed. J. Bruns, V. Steinkopff. -Darmstadt, 2003.-S. 11-20.
59. Langer R. Tissue engineering / R. Langer // Mol Ther. 2000. - Vol. 1, № 1. -P. 12-15.
60. Lee, D. A. Expansion of chondrocytes for tissue engineering in alginate beads enhances chondrocytic phenotype compared to conventional monolayer techniques / D. A. Lee, T. Reisler, D. L. Bader // Acta Orthop Scand. — 2003. T. 74, № 1.-P. 6-15.
61. Lewis, M. L. Use of microgravity bioreactors for development of an in vitro rat salivary gland cell culture model / M. L. Lewis, D. M. Moriarity, P. S. Campbell // J Cell Biochem. 1993. - Vol. 51, № 3. - P. 265-273.
62. Lexer, E. Ueber Gelenktransplantationen // Arch Klin Chir. 1909. - Vol. 90.-P. 263-278.
63. Repair of extensive articular cartilage defects in horses by autologous chondrocyte transplantation / L. F. Litzke et. al. // Annals of Biomedical Engeneering. 2004. - Vol. 32. - P. 57-69.
64. Mac Kay-Smith, M. Pathogenesis and pathology of equine ostheoarthritis // J.Am. Vet. Med. Assoc.-1962.-Vol. 141.-P. 1246.
65. Articular cartilage repair using a tissue-engineered cartilage-like implant: an animal study / P. Mainil-Varlet et. al. // Osteoarthritis Cartilage. 2001. -№9(Suppl.A).-P. 6-15.
66. Chondrogenesis of aged human articular carlilage in a scaffold-free bioreactor / S. Marlovits et. al. // Tissue engineering. — 2003. Vol. 9, № 6. -P. 1215-1226.
67. A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by mature bovine chondrocytes: the alginate-recovered-chondrocyte (ARC) method / K. Masuda et. al. // J. Orthop Res. 2003. - Vol. 21, № 1. - P. 139-148.
68. Mow, V. C. Cartilage and diarthrodial joints as paradigms for hierarchical materials and structures / V. C. Mow, A. Ratcliffe, A. R. Poole // Biomaterials. 1992. - № 13. - P. 67-97.
69. Muir, H. The chondrocyte, architect of cartilage. Biomechanics, structure, function and molecular biology of cartilage matrix macromolecules / H. Muir//Bioessays.- 1995.-Vol. 17, № 12.-P. 1039-1048.
70. Scaffold-free, engineered porcine cartilage construct for cartilage defect repair—in vitro and in vivo study / K. Park et al. // Artif Organs. — 2006. — Vol. 30, №8. -P. 586-596.
71. Pauwels, F. Eine neue Theorie über den Einfluss mechanischer Reize auf die Differenzie-rung der Stützgewebe / F. Pauwels // Z Anat Entwicklungsgesch. 1960.-Vol. 121, № 6.-S. 478-515.
72. Piez, K. A. Structure and assembly of the native collagen fibril / K. A. Piez // Connect Tissue Res. 1982. - Vol. 10, № 1. - P. 25-36.
73. Ponomarev, I. Regenerative medicine : New production process for cartilagetransplant / I. Ponomarev, M. Fischer, I. Wilke // 2nd World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, May, 2005. Leipzig, 2005. - P. 94.
74. Poole, A. R. Cartilage in health and disease / A. R. Poole // Arthritis and Allied Conditions : a Textbook of Rheumatology. Philadelphia : Lea & Febiger, 1993. - P. 279-333.
75. Poole, C. R. The structure and function of articular cartilage matrices / C. R. Poole. -NY. : Marcel Dekker, 1993.
76. Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints / K. H. Pridie // J Bone Joint Surg Br. 1959. - Vol. 41. - P. 618-619.
77. Radin, E. L. Joint physiology and biomechanics / E. L. Radin, D. Fyhrine. -NY. : Springer-Verlag , 1990.
78. Chondrocyte extrazellular matrix synthesis and turnover are influenced by static compression in a new alginate disk culture system / P. M. Ragan // Arch Biochem Biophys. 2000. - № 383, № 2. - P. 256. - 264.
79. Raker, C. Pathophysiology of equine degenerative joint disease and lameness / C. Raker, R. Baker, J. D. Wheat // Proc. 12th Ann. Meeting Am. Assoc. Equine Pract. 1966. - P. 229-241.
80. Robins, S. P. A Cross-linking of collagen. Location of pyridinoline in bovine articular cartilage at two sites of the molecule / S. P. Robins, A. Duncan // Biochem J. 1983.-Vol. 215, № l.-P. 175-182.
81. Roughley, P. J. The structure and function of cartilage proteoglycans / P. J. Roughley // European Cells and Materials. 2006. - Vol. 12, sup. l.-P. 11.
82. Roughley, P. J. Cartilage proteoglycans: structure and potential functions / P. J. Roughley, E. R. Lee // Microsc. Res. Tech. 1994. - Vol. 28, № 5. - P. 385-397.
83. Rubak, J. M. Reconstruction of articular cartilage defects with free periosteal grafts : an experimental study / J. M. Rubak // Acta Orthop. Scand. 1982. -Vol. 53, №2.-P. 175-180.
84. Sah, R. L. The biomechanical faces of articular cartilage in growth, aging,and osteoarthritis / R. L. Sar // The Many Faces of Osteoarthritis / ed by K. E. Kuettner and V. C. Hascall. New York, 2002.
85. The biological effect of continuous passive motion on the healing of full-thickness defects in articular cartilage / R. B. Salter et al. // J. Bone Joint Surg. 1980. - Vol. 62, № 8. - P. 1232-1251.
86. Isolation and characterization of disulfide-bonded peptides from the three globular domains of aggregating cartilage proteoglycan / J. D. Sandy et al. //J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265, is.34.-P. 21108-21113.
87. Santer, V. O-Linked oligosaccharides of human articular cartilage proteoglycan / V. Santer, R. J. White, P. J. Roughley // Biochim. Biophys. Acta. 1982. - Vol. 716, № 3. - P. 277-282.
88. Seyer, J. M. Covalent structure of collagen / J. M. Seyer, K. A.Hasty, A. H. Kang // Eur J Biochem. Amino acid sequence of an arthritogenic cyanogen bromide peptide : II collagen of bovine cartilage. 1989. - Vol. 181. № l.-P. 159-173.
89. Shapiro, F. Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage / F. Shapiro, S. Koide, M. J. Glimcher // J. Bone Joint Surg. 1993. - Vol. 75A. - P. 532-553.
90. Tissue engineering and autologous transplant formation : practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques / M. Sittinger et al. // Biomaterials. 1996. - Vol. 17, № 3. - P. 237-242.
91. Engineering of cartilage tissue using bioresorbable polymer carriers in perfusion culture / M. Sittinger et al. // Biomat. 1994. - Vol. 15. - P. 451456.
92. Sittinger, M. Künstlicher Gewebeersatz aus vitalen Komponenten / M.
93. Sittinger // Tissue Engineering : Laryngo Rhino Otol. — 1995. Vol. 74. - S. 695-699.
94. Outcome after total hip arthroplasty : Part II. Disease-specific follow up and the Swedish National Total Hip Arthroplasty Register / P. Soderman //Acta Orthop. Scand. 2001. -Vol. 72, №2.-P. 113-119.
95. Solursh, M. Formation of cartilage tissue in vitro / M. Solursh // J. Cell Biochem. 1991. - Vol. 45, № 3. - P. 258-260.
96. Solursh, M. Effects Of Cell Density On The Expression Of Differentiation By Chick Embryo Chondrocytes / M. Solursh, S. Meier // J. Exp. Zool.- 1974. -Vol. 187, № 3. P. 311-322.
97. Die Technik der Mikrofrakturierung zur Behandlung von kompletten Knorpeldefekten im Kniegelenk / J. R. Steadman et al. // Orthopäde. -1999.-Vol. 28.-S. 26-32.
98. Stockwell, R. A. The cell density of human articular and costal cartilage / R. A. Stockwell // J. Anat. 1967. - Vol. 101, № 4. - P. 753-763.
99. Stoddart, M. J. Enhanced matrix synthesis in de novo, scaffold free cartilage-like tissue subjected to compression and shear / M. J. Stoddart, L. Ettinger, H. J. Hauselmann // Biotech, and Bioeng. 2006. - Vol. 95, № 6. -P. 1043-1051.
100. Stoddart, M. J. Generation of a scaffold tree cartilage-like implant from a small amount of starting material / M. J. Stoddart, L. Ettinger, H. J. Hauselmann // J. Cell Mol Med. 2006. - Vol. 10, № 2. - P. 480-492.
101. Structure of equine type I and type II collagens / R. J. Todhunter et al. //Am J. Vet Res. 1994. - Vol. 55, № 3. - P. 425-431.
102. Vacanti, C. A. Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices / C. A. Vacanti, J. Upton // Clin. Plast. Surg. 1994. - Vol. 21, № 3. - P. 445-462.
103. Evaluation of the repair process of cartilage defects of the equine third carpal bone with and without subchondral bone perforation / A. Vachon etal. //Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47, № 12. - P. 2637-2645.
104. Van den Berg, F. Das Bindegewebe des Bewegungsapparates verstehen und beeinflussen / F. Van den Berg // Angewandte Physiologie : 1. Stuttgart; NY. : Thieme, 1999. -P. 80-81.
105. Identification of hyaluronan-binding domains of aggrecan / H. Watanabe et al. // J. Biol Chem. 1997. - Vol. 272, № 44. - P. 2805728065.
106. Characterization of collagen types XII and XIV from fetal bovine cartilage / S. L. Watt et al. // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267, is. 28. - P. 20093-20099.
107. Weigel, P. H. Hyaluronan synthases / P. H. Weigel, V. C. Hascall, M. Tammi // J. Biol Chem. 1997. - Vol. 272, № 22. - P. 13997-14000.
108. Williams, D. F. Engineering a concept : the creation of tissue engineering / D. F. Williams // Med. Device Technol. 1997. - Vol. 8, № 7. -P. 8-11.
109. Wolf, A. Collagen synthesis of articular cartilage explants in response to frequency of cyclic mechanical loading / A. Wolf, B. Ackermann, J. Steinmeyer // Cell and Tissue Research. 2007. - Vol. 327, № 1. - P. 155156.
110. Wolter, J. R. Sessile macrophages forming clear endothelium-like membrane on inside of successful keratoprosthesis / J. R. Wolter, R. F. Meyer // Trans Am Ophthalmol Soc. 1984. - Vol. 82. - P. 187-202.
111. Woo, S. L. Y. Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissue / S. L. Y. Woo, J. A. Buckwalter // 1st ed. Park Ridge : American Academy of Orthopaedic Surgeons. 1992.
112. Wu, J. J. Identification of hydroxypyridinium cross-linking sites in type II collagen of bovine articular cartilage / J. J. Wu, D. R. Eyre // Biochemistry. 1984. - Vol. 23, № 8. - P. 1850-1857.
113. Hyaluronan-based polymers in the treatment of osteochondral defects / J. U. Yoo et al. // J. Orthop. Res. 2000. - Vol. 18, № 5. - P. 773-780.
114. Молекулярная биология клетки. В 3-х т. Т. 2 / Б. Албертс и др.. — М. :Мир, 1993.-499 с.
115. Гланц, С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. / С. Гланц. М. : Практика, 1999. - 459 с.
116. Тканевая инженерия при репарации повреждений суставного хряща у лошадей / И. Пономарев и др. // Актуальные проблемы животноводства: наука, производство и образование. Новосибирск: НГАУ, 2006. - С. 221-222.