Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Морфо-биологические и антигенные свойства патогенных эшерихий, выделенных от кур

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯМ;ТМ И ПРОДОВОЛЬСТВ1Я РОССШ£КОН ФЕДЕРАЦИИ

санкт-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКДДНШ

3 Г 5 'ой штешнашой мадициш - 5 ДЕК 199**

, На правах рукописи

Бис1ио Паритош Пумар

удк 579.642.ii. .№».12:616-092:636.5

морм-шолошчвспив и антигенные сюиства патошмых зшешхий.шдеденкых от кур

16.00.03 - ветеринарная шкробцология, • вирусология, эпизоотология, кинология и иммунология

АВТО РВФВРАТГ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наув

Санкт-Пг-србург 1994

Работа Ешолпепз ira кафэдрэ ютробиологпп □ глруоолотп, f Вйфедрз ônoxîjoiî Сглят-ПоторбургоксП гссударотаояпоЯ ска-Девш взтарпваркса щзпцшн, в областной го тс puta pi cîl бэраторш п па птацеф&брияе "Ударит?" ЛанннградокоЯ сбгаои.

Научниэ рувовозптолп:

- вандидат гзтсрпкарвих ноуя, доцэн? Cojas П.§.

- дозтор кшршаршзя naja, профессор Ксзюпагов S.E.

Сфпцпадьаиэ оппонента: доягор гэтеряюрназ nay в,

прсфсооор &рпоон«ога А.H., вадзяаат юторипаркых науп, доцопт фонов Г.Н»

Бздушл opmnnsaias - ПотроааисдсЕвЗ гоеударспзтнзгЗ jiEiaapsaTSî' ' ■'■

&ьита двссзртаупп соохсптся 15 Дояабрл 199-1 г s таз. еаоодепяя елсцла-'псдрогаплcr-o ccsexa Л.120.£0.0; а Сапзт-ПетгрбургогоП .рсоударзтгзппся взаземап гэгертарпсЭ setena ns едрэоу:

196064, Саляг-Погарбург, Чэрвпгоговоя ул.,5.

С дстсортаспс-1 vùzuQ езпоксязггсл s бкбиотозо Сопзг-Вэторб/ргезсЗ гсоударогастптоЭ ешадешя готоророЗ кадивши.

Автораферат раэсоглп v 0 noatípa 199Ц p.

Учений евврэтарь Ппешаяяепрагзпяого со тэта дпцав?

O.B.yas»oia

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ Актуальность тепы. В уоловиях современной тйХнрлоган оодерка -ния, кормления и воспроизводства птмцы в птицеводческих хозяйствах получили широкое раолространение инфекционные ааболевация, связанные с кишечной микрофлорой (Урбан В.П., Радчук H.A.,I975J Соколова Л.Н., 1969; Рахманина И.А,, 1989; Радчук Н-А.,1991; Борисенкова Л.Н., Радеотаопекая Т.Н., 199'»). Они нанооят хр -аяйствам зщчительный экономический yiitepö вследсташ падежа и выбраковки птиц, снижения ее продуктивности, затрат на лечение (Боссарабов £>.$>., 1978; Конёмяка Н.Б., 1991). ; '

Сельскохозяйственная птица содержится в контролируемых уо -ловиях светового, темПературно-^лаЖноотного режима ппщехозяй *

отва (Воловиков И.А., Конопагов C.B., 1993)» направленных на

. 1 адаптации к ореДе обитания. Однако иктеиоификация птицеводства

... ■ ■ • » • • • изменила течение и клиническое проявление яолипаратифозных ин -

Фекций, и, в чаотнооти, колибактериоза^ возбудималь которого

значительно усилил свои патогенные ввойотва (Артемьева СЛ.,

1976). При атом колибактериоз протекает в форме аооОциатявнця

заболеваний (Тулев 1990), оопроаолдалоь бсямйЫ от-»

ходом молодняка. , . • • , . ; ;

3 последние годы выполнены значительно иоолехования по ' изучении вопросов диагностики, и профилактики колибактвриоаа птицы (фрашвили Т.К., 1986; Рахманина Й.'А.,1>оиевй Г.А., 1985,' Радчук H.A., 1975, 1990'и Др.). Сйнако вое еще иамотаточно; изученными являются вопросы раопроотрандния «раЧи^ппш ^н^ ; теропатогенных ашерихий о фимбриальными адгвзянаш» риальных адгезивных антигенов эшврихиЙ ; .в вознЛн'овеиви а

- ц -

■у ..

Либактериоза в условиях промышленного птицеводегва, требуется изучение свойств полиадгезивных итакмов кишечной палочки о цс льп создания препаратов, профилактируюлйх болезнь.

Б свете о вышеизложенным прелотавляегся ак^альным и цел© -сообразным как б теоретическом так и в практическом отношениях проведение Дальнейших наследований этой серьезной.проблемы птицеводства. . ■•■•..■■.. Цель и задачи исследований.

Цель исследований - изучить морфо-биолсгяческие свойоттал антигенную структуру патогенных эиерихий, выделенных от кур, ог ределйть иммуногенные совПотаа адгезивных антигенов.

Для решения этой цели били поставлены следующие,задачи»

- изучить морфо-биологические и культуральнке свойства 'выделенных культур патогенных эгаерихийот кур;

- оценить патогенные й вирулентнае свойства изучаемых культур!

- определить адгезивные свойотва и адгезивные антигены у 0-серо типированиых культур; ;

- изучить иммуногенние овойотва адгезивных антигенов зшерияий в опытах на курах в производственных услсшях; ..

- получить противоадгеэивные сыворотки на кроликах и на курах о использованием иммуноюДулятора и без него;

- определить белковый спектр гипериммунных сывороток крови-

Научная новизна.

Изучена антигенная структура Е. coli , выделенных от ку из птацехозяйотв Ленинградской облает, по 0- и адгезивным ан -тигенам. Установлено, что культуры с адгезивными антигенами был более вирулентными.

При иммунизации в производственных условиях кур эаерихияш о адгезивными антигенами в организме синтезировались антитела

против комплексного, 0- и адгезивного ант генОв, что позволяет рекомендовать такие штаммы для изготовления вакциниммунных . оиворотск. ; '■."'•'

Приготовлена антиадгезивная гипериммуниая колисаворотка в опытах на к роликах и курах в Двух вариантах; без иммуномодуля -, тора и . в'сочетании с иммуномодулятором "штимздином" и уотанов лен о, что при использовании иммуномадулятора антитела синтегц -ров?лиоь е два раза активнее.

Для восстановления утраченной едгезивности антигенов при Длительном хранении культур эшерихий можно использовать неско -лы?о пересэвов через жиДкую питательную ороду (Нинка или ШБ).

1 Практическая значинооть. ■':"■. Значительное распространение среди патогенных эшерихий, ш -двляеках от кур. культур с адгезивными свойствами и антигенами позволяет сделать вывоз о необходимости внесения э н,Матодичео -кие указгния по бактериологической Диагностике колпбактэриоза (эшерихиоза) животных" (утверждена 12.12.91) исследований на адгезивяость и оиерихий,-'выделяемых, от кур, с использованием коммерческих антиадгезивных сывороток для Животных/

Учитывая иммуиогеннке овойства адгезивных антигенов эшери -*ий, при создании поливалентных инактивированных ко вакцин следует учитывать штаммы, тапированныа не только по 0- , но и адгезивным антигенам. ;ч- - ' .

Апробация работы. ' * • .," . -

Материалы диссертационной работы использувтоя в учебном процессе кафедра м!кробцологии и вирусологии, кафедри юхимии, кафедры болезней птиц, рыб.и промысловые животных Санкт-Петер -бурге кого ветеринарного института при чтении лекций, проведении лабораторных -/онятий. .

- Материалы диссертации дол смени на 47 и № научных и онферён чиях молодых ученых, аспирантов и студентов Санкт-Петербургско ветеринарного института (1923, 19У4 гг),! на научной конференци профессорско-прсподаватольсуого состава, научных сотрудников и аспирантов СПЙИ "Актуальные проблемы ветеринарии" (.1994), на П Международном конгрессе по патфи эиологии (Киото, Япония,1994

Ооновниг) положения, выниоимно на.зачиту.

1. Определение-О-серотипов Е. сон циркулирующих в условиях п'лше!абрш: Ленинградской облаот^,. и изучение их'морфологи чеоких, культуряльно-биохимичесхих» патогенных и В1рулентны свойств» * • ....

2. Определение адгезивных свойотв и изучение 0- и адгезивных

V»* - * '

антигенов изучаемых культур. . Э' Приготовление формолкваоцовой вакцины с адгезивными штаммам и изучение ео влияния на иммуногенные показатели кур в про ' извОДственчых условиях. Получение гипериммунных антиадгезив ных сывороток на кроликах и на курах с применением иммуно -модулятора "витамеДина" и боз него.

. Объем и структура щб оты. Диссертация изложена на 140 страницах маиинопибного текста и вклкчает .введение, обзор литературы, методы исследований, ре зультаты собствешШх исследований автора, выводи, рекомендации производству, список использованной литературы в количестве 21 источников, из них 119 - иностранных авторов. Работа иллюотри рована 16 таблицами и 3 графиками. •

МАТЕРИАЛЫ И ИЗТОДЫ ИССЖДОВАНИЙ Работа выполнена в период о 1992 по 1994 г на кафедре микро биологии и вирусологии, ка$еДро биохимии Сгнкт - Петербу ргског

ветеринарного института, в облаотной ветеридарной лабпратоци« и в уолодаях птицефабрики "Ударник" Лэиидграно:^

3 опытах и^дользоавны. в качаотвр катв|иалов исследования Яра» лики порсдь: Шиишида 2-месячного возрзста, ??9дые мики, цнплята И курв-изрушки. В прадзаскотшнник услолиях пгичофдбрики исследования выполнены на 92 тыо голов пщца. Подвергнуто изучению И оерологичео^ой типизации 136 культур кивечной палочки, виде ленных из различных тканей и органов 9 птицефабрик Ленинграда» оЯ области. / : ' . ; •:

Для выдолегая культур использовали от больных и певших цоддот и кур кровь из сердца, почень, селезенку,'поад, желчный пузир*>, костный и головней мозг. Патологечзоки^ материал паоавЕ.« на МПА, МПС и на чашки о Дифференциальной средой ЭнДО иди .Ирвина. Засеянные чаяки помечали и ьцдерадвали в термоотам при тейпе ратуре 37°С в течение 24 чаоов. Воли через чаза" рдё* на ела^. Дах отоутотвовал, то пооезд выдерживали е«е сутки»

Из каждой чашки проверяли не менее 10 характерных колоний по реакции агглютинации (РА) на отекла о полнаалечтцоЧ О »-.я о ли -сывороткой. В ояучав однотипности яоех выделенных «улмур, с^ г тих с одной чааки, далвнейвецу изучении подв^геаи одну куль ~ туру* Для огого отпивали по два типичные, имевших ►форму во-» лонии, каддуп в Две пробили в МПА для Далвкейввго изучения и в полувддкув среду 0,# МПА для хранения. .'•" '".^Х .

У выделенных культурпо обшеприиятой методикв изучали морфологические 4 обычной и электронной »«роо копией), тинктвриалв -нив (окраска по; Грану), культурально-йиохниичввкю оас"ДОв к КаиГГтвп К ,1566; Вгаа*еп В.А. в* а1. ,1977; %рхакЬ -

ва X.К«, 1960,' Радчук Н.А., 1990).''1^_9ашячшДвдвшшХ.1|у|!>»ГГ/>>

проводили оогласио оу шествующей систематике, принятой подкоми ■ ; тзтом кииэчных бактерий номенклатурного комитета Международной ассоциации микробиологов (1963), а также при помсии определи -

л- "..........■ ■ . ■

те ля Борги (1974), книги Кауфмана 3. (1966) "СемеЯотво кишечны! бактерий". -

Серологическую типизация выделенных культур проводили со ~ глаоно "Наставление по применение агглютинирующих 0-коли онво ■ ; рогоя", утвержденному Глагным Управлением ветеринарии Ibcarpo -прома СССР, 16 иМ 1980 г * Н5-ба. ,

Протеолитическую активность изучали по способности культур разжижать гелатину к пептонизирогвть обезжиренное молоко ( Eduard <з Р.Я. et al. ,1952; Heller В. et »1* ,1977)»

Пзмолитичео*ую активность культур устанавливали по рооту на МПА о добавленном *>% дефибротированной крови барана ( Вре -меев H.H.,1975).

Подвижность бактерий изучали в полужидком МПА (Hemeler Л.ч. et nl. /1967; Антонов Б.И., 1986).

Патогенные и жрулентные свойотва проверяв на белых ш -■ах мароой 16-16 г. Для этого готов! ли взвесь (суспензии) ру -точных агаровых культур, выделенных из двух внутренних органов, в концентрации I млрд жкровных тел/мл. Заражение проводили wq триб реви нно я дозе 500 млк ткробных тел. Культуру признавали патогенной в случае гибели одной или более белых мышей в течет двух суток после заражения ( Cibbe R.B. ,1964; Картувика А.] 1971; Масвчига К. et al» . ,1985).

Адгезивные свойства культур изучали в РА о дрожжевнми Мет • ками. Изучение адгезии к дрожжевым ^леткам (пищевые Дрожжи) пр( ведили по методу Ki honen Т.К. et al. ,1968. Массу Дрожжевых

клеток взлошивали з слегка подогретом фосфатном буферо, рН-7,I, центрифугировали 7 минут при 1000 эб/мин, затек 0,0];. мл пслучоц-нсго осадка переносили и дру^'ю пробирку с новой порцией фосфатного буфера доводили объем взвзои до 10 мл, получал при этом 0,1% взвесь клеток.

Определение аДгезди з РА проводили в кгшельноч вартенте на отекле. В качестве контроля использовали для исключения опситан ной агглютинации Физраствор и фос^атныД буфер. При наличии еДгй-зинов не позже чем через 30 сек в суспензии Дрою.;евых клеток о культурой, выращенной при 37 °С, появлялся четко выраженный агпв-тинат. Б контроля* и.с культурой, выращенной ггри 18°С, реакции не тблпЧали.

. Соматические пиди определяли при помощи электронной млкро -скопии ( IBM 100 СХ) методом негативного контрастирования ( De Oreaf У.К. , 1981; Hagaraja K.V. , I983J Kyzj^a М. et al., ' 1986). Для этого использовали 1% раотвор фосфорноволяфрамовой кислоты ($j3K). ' ; ■ , '

Для выявления пили культуры серотипа 015/Г41'выраДизаЛя на жидкой ораде №?нка 21 и 48 часов, бульонные культуры смешивали с физраствором в ооотнопении 1:1. Затея сдну капли омеой наносили на формбар сетки ( Iroo гоо Ы) ). Сетки подоувивали в еушильч ном шкафу. Сетки обрабатывали 1% раотзорон $ВК при помощи рас -пыяителя в течение одной ми ну ты. Лоо« этого, сетки, промывали дистиллированной водой,,подсушивали на воздухе и иополвзовали для просмотра.' • '■•'*''-

С цэльп Еыявления адгезивных антигенов у выделенных культур использовали ЫПБ, МПА, а также специальнуи гтлотнув.я якЯкуо epesy Минка (1>гковский А.А., 1990). Среду Минка готовили по редепту (Метоличоские указания, 198б) с заменой казаминовой кислота те -

" io -

дролиаатом лакталибужиа» ,

Для об кару же нп* аДгвэншых антигенов иопользвэаликоммпрче>< «ко аатичиге эдвьив агглятинируваие сыворотки, выпускаемые НИИ прикладной кикробкологии-г.0бни:?с* а соо?в0тсувик о ■ Временник наставлением со применении агглютинирующих вывороток гаг гевияным еншгвна* ошврихай К8б, >К99, 967Р, Ш, Л20 утвер доенным Главным /правленном ветеринарии Государственного arpe промыдленяого .хоминга СССР, 21 февраля 1987 г«

$ормолхв&оцов} в вакцину для аэрозольной векцинации птиц го тоаиля из одгваивиих «талмол .09, 015* 076, 01П. Вакцинировал цпплт з возразте 10-13 дней на птицефабрике 'УдарникДоза жля аарозоявиой .с&кцмкащаг ~ Г мя/м^. После вакцинации оыво -ротку крови циплят иоолодовали через различнее сроки» Наличие 07 к антеад^еэивцих е:<титеа к их титр определяли в PA Cayinah J.F*et«l. , 1936; Rar ley W.II* et all 988; awennood P.S. ,et al. # i9ö8).' .;■.:' ■■ ;.., • ■

0б«щй0блоя »воротки крови до и л о<э л в пшеришуниэации жк гожи и птиц исследовали рефрактометрическим методом. Опреде ленке концентрации белковых фракций выворотки крови проводили. нефе лометржчео кии методом по Оллу я Мак корну ,в модификации Кар лига. V. .'<

Противоадгэзивиуо сыворотку К80 готовили путем нипериммуни зацим кроликов о иммуиомодулятором "витамеДином" и без него. Ьтериммунизацив яур с цельо получения противоадгезивней cu • воротки F4I таяке еуполняли о иммуиомодулятором и без него Птеричмунизецио кролике® и кур для получения актиедгозивных оывороток провЗДя-и по методике Соколова H.A. и Др. (1965) ] оогласно "Метсдиче'оким указаниям по изготовлению антиадгеаимо)

сыворотки К99 и обнаружению адгезивного антигена К99 у патогенных Э1сарихий"(196б г) и в нашей модификации. . .,„ - Цифровые экспериментальные данные подвергнут^" стапютичесной обработке. 1^зличик мекду относительные Ее личинами .уценивались с помощью критерия Стьюдента. 7 '

„РНсУ-ПЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ КС СЛЕДОВАНИИ . ; '

I. Морфологические, культуральцо-биохимические свойства .

патогенных культур эшерихий : ' . ' г

Выделенные культуры представляли собой грамотрицательные палочки.от коккообразных относительно мелких палочек до тонких, длинных, прямых с закругленными концами, расположенными одиночно и непарно. ?азмеры_ отдельных бактерий составляли" длину от 0j5 до 4 мкм, в Диаметре от 0,4 до 0,6 мнм. В мазках¿пригстов -ленных из внутренних органов, костного и головного м.озга, окра--иенных.по Грану, часта наблюдали .биполярноет?».- :

Среди необладавших адгезивнобтьв 66 культур 51 (77, "¿7%) бы -ли подвижными, 5 01,57%) олабо подвижными, 10 { 15,15^) бы -ли неподвижными. Среди 28 культур с адгезинами' 23 (82,14.?) являлись подвижными, 2 (7,14© слабо подвижные и 3 (10,71$) не подвижные. Адгезивные свойства обнаружили как среди подвижных, так и среди неподвижных культур, хотя значительно больше были подвижными Ср СО, 05).

На МПА культуры эшерихий через 20-24 часа образовывали ва -пуклые колонии средней величины, влажные, блестящие, прозрачные и непрозрачные в проходящем свете, круглые о ровныни'краями о серовато-голубым оттенком, по структуре гомогенны.

На плотной среде Минна эшерихии образовывали мелкие, круг -лне, сочные с ровными краями, приподнятые в центре,'• прозрачные колонии. На среде Эндо получали 3 типа колоний: первый тип представляли колонии темно-вишневого'цвета с мегалличеоким блеском.

плоско приподнятое с ровными краями", сочные. Второй <пш крло -иий был мамикэвс-красного цвета с пачичкем бокее овстлой кай -по периферии, в Центре приподнятые.'Колонии Диаметром от I до 3 ми. Колонки третьего -типа находились ь В, -форма. Ж среде Лек» на колену, и Сыли от 'гокн о-4 и о лето во го до черного цвета, в центре приподнята, по форме, величине и Другим признакам аход-лыв с тс.ко^ыми, полученными на-МИД.

На МНЕ отменяли ^авнокерное помутнение, на Дна оероватый осадок, легко раэбиэагшийся при встряхивании. Некоторые штаммы ha поверхности сроды образуют тонкуо пленку и приотеночнОе кольцо. , . . „ ; ,

На гадкой орсАс tóiHKa культура также вызывали равномерное •помутнение, на Дне пробирки отмечался осадок серо-белого цвота< легко разбив&юпкйсн при истряхивакш. ß некоторых случаях отме • чалооь на поверхности среды пристеночное кольцо»

Определение биохимических свойств у патогенных шкроорга -нкзмов служит одним из важнейвдх признаков при их идентификаций и широко иопользу стоя в микробиологической практик о при Диагностике инфекционных заболеваний. -у

Для иоследуемых культур были характерна отрицательные реакции Фогес-Проскауэра и положительная с метилротом, что поз -водило отнес та их к роду Eocherichia.

Взе выделенные 136 культур кишечных палочек свертывали молоко на 1-2 сугки после посева- С целью Дифференциации микро -бов подгруппы Baüterlua coli от подгруппы Citrobpcter

производили посев на цитрапшй агар С&монса. Отсутствие роста, изменения цвета среды указывало на принадлежность испытуемой культуры к подгруппе Bacterium coli.

Все тзнл&еленные культуры е. coli ферментировали с образо ваннем кислоты и газа: глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, ара-

бинозу, сорбит, но ферментароталп адонит, иногда, часгь культур обладала избирателей активностью в отношении сахароги, Дуль -цита, рамцоз^. Сахарозу, дул щи т и рамиозу фер'^итиром&ли соот • хмтотяонно 55,88, 72,05 и 66,975 культур, . ; v- " '

Для определения протеолитических свойств Е. coll прово -. дили посев кул ьтур по уколу в отолбик' мяоо-г.витонной .-¡гвлатнни. Все изучаемые культуры-росли по у;<элу без рязкняения ср^ч.

В результате проведвнних тми последовать на отмечено-определенной стабильности биохимической активности у различных са-. рологических вариантов кишечных палочек, что согласуется а Дщ-"" ныж ряда аагороа ( . Негав1еу R. et э-1-. ,1967; Новгородская Э.М.,'1969; Михайлова. В.Е., 1983).

.. 2. Патогенность, зирулентность, адгезивные свойства' культур эшерих;;й . Патогенном ь и вирулентность была изучена, на бе лих датах у адгезивных и неадгезивных культур эшерихий, принаддейаних к ран-личним серологическим группам, ^озультаты исследований показали, что ъ абсолютном овоем большинстве культуры- кишечной палочки обладали выражениями патогенными свойствами (Р < 0,05). Однако культуры, имеющие адгезивные антигены F4I, К99, К88, + Н99, ■били более щрулентными и вызывали гибель мышей, в течение пер -внх суток, а Другие Лишь через 1-4 дня. ~ ■•

В зависимости от 0-серологичезкой принадлежности культур наиболее выраженной вирулентность» обладали культуры эиерихий серологического типа 015 (с адгезинами), 078, 01 и 02, на втором месте культура, при над лежание к серологическому ти"У 09, 015 ( боз адгезинов), на третьем - кулм-уры, принадлежащие к серологическому типу 0П1.

Отпавших мншеП производили высевы из костного мозга, печени и сердца на плотную среду Минка и на МПА с целью выявления адгезивных антигенов. Из шести культур, выделенных из печени мы -сей, пять культурдалн,положительную РА-о моноспецифическими сыворотками, только в одном случае выДалена культура о едгагив-ным антигеном К99 иг сердца. У культур из костного мозга нам не удалось обнаружить адгезивных антигенов. Наличие на поверхноотй'' выделенных культур^эмерихий адгезиноз свидетельствует о роли адгезивных антигенов в 'патогенезе к патогеннооти (Соколова Н.А» и Др., 1989).

Известно, чг'О культура эшерихкй,-обладающие адгезинаш, ото -ообны присоединяться к различным кяотк&м. Нами: пров&$ены исследит вания по обнаружение адгозивних свойств у 9'; патогенных культур кишечиоЛ пр.лочки, выделенных от кур с использованием 0,1£ взве -«и дрознхввях клеток. Из 94 культур, ааращенных на плотной ерв^в /лика прн 3?°и, 54 обладали четкой агглютинацией на стекле с дроААевы141 клетками, что хорошо обнаруживалось визуально в те чение одной шнуты. .Эти яс кулиури, внраиеннне на оролэ Нинка г пр: 19°С, адгвзчшооуь я дротеквмм клеткам на проявляли, что оо-г'лаоуетоя о метойичезкйии рекомендациями по обнаружение адгвзив -ных саоиотв и антигонов у патогенных э верней животных (1986). • Лучшая едгззивкостъ была у культур после Двух пересевов на жид кой и затем пересевом на пяотнув ораду Минка.

Параллельно культуры были испытаны о МПА после Двух предвари -тельных пересевов на МПЕ. Все культуры, вырай«иные на плотной ореДе Шика при 77°С, которые дали положительную РА о Дрожжевыми клетками, также были положителвны при выращивании на МПА при 37°С. Однако в нескольких случаях нам

дась обнаружит! jo лежите льнув РА о культурами кишечной naV пси, вираще -л х на <f!A и при 18°С. .

Полученные данные пи.'ззали» .что Ъ'1,44% выделенных культур :адаяи адгезивными свойствами.. Кишечные палочки, у которых ; [аружены адг^Зины, относились к патогенным оёроварам 078, 01,' , 0Ш, 015, 09, 020, 0115, 0138. Из них 15 культур были ювара 078, 9 г-'льтур оеро^ра 01, по 7 культур - серовара и 015, по б кул тур - сер4'.,;. ¿а 09, OUI и по одной культуре ¡ероваров 08, 020,' 0115 и OIS . í' • •

В процеосе работу выявлено, что старые культуры, хранянисоя ' МПБ более трех к$сяцёв,- на Давали положительной РА о древ -ими клетками. Для восстановления адгезипшх свойств.кишечной i очки были проведены паосажи через МПБиАи жидкую ораду №т«' >' или "jepés восприимчивых животных и уоШноаленЬ» что через только (2-5) пассажей через жидкур*<^еду Минка кулмури вое-1навливают свои адгезивные овойотва/

Э. Антагень«я структура культур зябриха*

3 целях выяснения распространения различных о ер ол отче оких зиантов кяиечнкх палочек на-« проведена серологическая иД"йя -Мадия зсех 135 выделеннь'х культур из птицехозяйста Ленинград-эй области. Серологическое типирование культур 'зше^тхий nj^o -шли о помощью поливалентных и моновалёнтаых -О-колиснвороток.

Из 136 исоледованных кулвтур кишечной палочки имеющимся на-ром О-колисыворо^ок были типированн 9ц, что о оставляет 69, аавляютее число тапированинх культур отнесено к оеровариантам Ш,7бЯ, 02 (10,29^), 015 (8,08£), 078 (19,Н£>, реже вы -яялиоь культуры серологического вартнта 09 (3,Э5%), 0III ,61%'s, 08 (2,29$), в Двуэ случаях серологических вариантов 15, 0138 и в одном случае 020.

Злачительное количество выделенных культур были р.Ь-фс g давали рионтанну! агглютинацию о физраствором, что но-пс воляло их эрологичвоки типировать. Это явление овязано с роким применением антибактериальных препаратов ц птт'цеяаэя ;ств^х о целью профилаг .ики бактериальных инфекций. ; : В.отдельных птице-.ээяйотвах области в основное циркул ■'Ют не более Двух или твдх серологических типов патогенной шечной палочки. Так из 30 типированных культур ni патматер 'ла птицефабрики "Ударник" 15 культур отнесены к еерогруппе .по 5 К'серогруппе 015 и .02. На птицефабрике "Ломоносовокая льшинс^гво выделенных культур принадлежало к сер труппе, 0J "в условиях птицефабрики "1^оско-Васоцкач" - 09 и 01, птцце< : рики "Даголово" - 01, 02 и 078, птицефабрики "Ли'я&ье"О 078, 08, птицефабрики "Вэйскс лцы" - 02, 01, 0Ш, Следует метить, что, нередко отгоднога; девшего 'йлИДольне; о цыпленк* Деляли/ло Два'-разных. серологических типа кишечной" пал очки, простроенных в Данном хозяйств?; ' . . -.,-'. ■••■'.".'

Серологичейкий Анализ показал, что в течение ^пределе! времени в птице хозяйстве,'неблагополучном цо-колиС гктериоз] гут циркулировать несколько серологических типов кишечндй i л очки, которые с течением' времени' moisit заменят г".я Другими ротипами, что'согласуется.с данными Урбана В.П., Радчука Н< (1875), . Siene 3. (1961), Аккузииой С.Г.. (Î9SJ\ Черных i (1991). ' : :

Нами проведаны исследования по обнаружения адгез/зны} антагенов у эщерихий, выделенных от кур и установлено, что 54 культур с адгезивными свойствами, Давшими положительную с Дроижгвыии культурами, 28 имели адгезивные антигены и бы; гипированы выпускаемыми коммерческим противоадгезивньми сь

- IT -

«акт. Наиболвшб -количество культур (10) содержали йдгезин ! (ЗЬ,7№,-1 солеуадл антиген ОД (14,28$), 3 апг/гвп кг О ;/,71^й;(:ОДна культу^- содержала адгэзин.К99 тнбли-

г:"' ' .■•:"..■■ :

, ' ' Таблица I

■ Тип" адгезивных'антигенов у патогенных ,

эщевихий, выде?"тных от кур

. _____________

личеотво- ,. олэДозанных льтур. пированных О-антигену

Из, них

количество культур <;'аДЁезивными... ■ свойствами в Щ ? дрожжевыми; клетками ___

•' типированы в РА с е.ити-адгезивными сыворотками

типы адгезивного количество . ' антигена : культур.

94

P4I ■ . ' ' К99 А20 . •987р + F4I -к К99. ■ Г« + К99 К88 + 987Р К88 V А20 К88 + К99

К88 К88

F«

КВ8 + Fill + "А20

Ю 7 4

1 3

2 3 I X

1 I I' I

При анализе О-серогрупповой принадлежности 28 исследуемых ьтур и способности экспреосировать фимбрии не установлено кой корреляции. Адгезины чаще обнаруживались у культур зшэ-ий, выделенных от кур, относиящихся к серогруппам 078, 015, 02, ОIII и 09. Культуры, оодервдие адгезия К89, относи -ь практически ко всем выявленным нами оероварам 01, 02, 015, 078, ОШ (таблица 2).

' • Таблица 2

эщер хиЯ, имею1чие адгезивные антигены и «'ерогрупп эад принадлежность по 0-антаге у ■ •

—--' ■ Ч1. 1 У ' . ' ,-—1—I-:-;—----——-'----г--—г- —г—г —

Адгезивиаа I Серовары (колич-'отво*.

антигены ' . по 0-а.нтигену серовар)

К88 .-г | _2_ ■..2 ■; I - I

' < ' . 09 02 015 078 020 0111

—-——-I——_———_—. -

:■*>. , Г41 \<{ ' ' ■ '} I 3 ' ' " 01 015 :

{ - А20 : / ' ' "г 01 - '078 •

Г- 987? ;

К88.ь Р41 " ■' •: ■ 1 ■ V1.V."'- '' • 015 . 0 V'' ' V

; х-.- '.-.Я -' ч^-.л". 01 • . 078

1. ( ,11, .... ^ " К99 . . , 078 ■ ; ' . : •

' К88 + 937Р ' .''-."■I • '.-Л ' ' .Х—' 1 оэ ; /■ " ' ;

1(89 + А20 ; "У ■ ' .ог ■ • :

К88 + К99 + Г41 у: " I ■ 09'' ■

. К88 + Й1 + А 20 078

Всего: 2Й

Штампы B.ooli о адгезии ом К88 выделяли из печени (5.6 67$) сердца (28, 97#), косоного мозга (17,85/0. Из 4 культур; F4Í 2 обнаружили d печени и 2'» сердце. ífce 3 культурн Á20 были выделены иЗ печени, куль.уру К99 обнаружили в оердце. Штаммы К83 + Г11, К8В + К99. К88 + 987p, К88 f А20, К88 + К99 + F4I выделяли в единичных олучаях из печени. Коб + F4I и К88 ♦ К99 обнаружили также в сердце. Только в одном случае К88 + ГЦ + А20 выдёляли из костного мозга. .■'»'. : .

Нами установлено, что для. выявления'адгезивных антигенов у патогенных Е* coli кур иопользоыть среду Миняа всегда не обя зательно. Культурн, внращённне на среде Минка И: дадШие•положительную РА о ¿нтиадгезивными сыворотками. Давали таккэ псложителЙ1 нуо реакций РА при выравдвании иа КПА. СЙнако длявыявления Цн тигека К99, и F4I среда Минка была более эффективна, чем WIÁ.

4. Иммуногеинне овойотва адгеаиэных антигенов . ' эшерихий в опытах на курах л производственных ; условиях ■,•■•■:.

При анализе литературы н^ми не выявлено оо'Ьбдвнй* ,вб ивполв-зовашп для пригатовления вакцин против эвёрихиоза кур итаммов оперихий о наличием адгезивных антигенов и иммуногенности таких ■ вакцин по синтезу у вакцинированных птиц специфических антител протйв адгезивных антигенов. .Опыта п этом направлении имеет бо -льшой практический интереса ' .

В нашей работе Для приготовления формолкваоцбвоЯ вакцины, содержащей адгезивные антигены, были выбраны 4 адгезивных штамма: 09/адгеэин+, 0I5/F4I, 078/К99 и ОШ/адгезин+( адгезии* - куль -туры нетипированнне имеющими коммерческими антиадгвэивяыми сыворотками). Взятые штаммы по своим морфологичеоким, тенкториалыпи» и культу рал ьно-биохимичео ким о войотвам были характерна для своего вида и обладали

выраженниш вирулентными свойотвами для.цыплят и белых мышей, / агглютинировались п <осневдфичеокими еыворотками по 0~a:^тигв^ до презедьь го титра.

Приготовленной вакциной были 'вакциниротаны 55798 кнцлят в I " расте 10 - 12 суток аэровольнкм методом о поыои;ьи аппарата . САГ-2 при расходе вакцины I ыл/м3. Спустя 14, 30 и дней •■. после вакцинации у цыплчт. брали кровь для анализа на наличие титра антител. СоматиЧ(. кие и антиадпеяивные антитела проверл с применением РА. • '

Через две недели титр 0-антител сыворотки крови был 1:00. : Титри елтиадгезивных антител против Т41 и К99 бь и 1:9 и про1 адгезика; принадлежащего серошрам 09 и 0Ш -1:4. Через мс сяц пооле вакцинации титр 0-антител ооотавлял I: Э и титр прс ■всех адгезивных антигенов'был а:Спустя 78-79 Дней ^ооле I циншма ентиадгезивные ёнтителана обнаруживали,^. цо имели 1 то < О-антитела*' их титр была нивким- -1:10. ~

Для .приготовления ? серии фор^олквасцовой вегцины'били зьг брады адгезивные итаммы 015/Г^14* 078/К99 и 0Ш/аД-ззин+, вое три культуры былц Л-яратно перэоеяны на жкдшэй, ор де Мидка. Приготовленной вакциной был привит 36201 цыпленок в возрасте I? суток. Кровь для исследований получали от пти;т в возрасте 22, II л 47 суток. 1 '

л Через ,9 дгк»Я после вакцинации титр 0-антктел -ротив взвх штаммов был равен 1:40, 'а для адгезивных антигенов 1:8 - 16. рез 26 Дней титр адгезивных антител у всех шт^ммпе был /аззок 1:32 и соответственно 0-антнтел 1:160. Спуотя 34 Дня посла ва ■ цинации титр адгезивных антител для Г*»1 был 1:8-16, а для ОН едгезин4" •»-1:8.'Титр против в^ех'О-антигенов был 1:60.

Результаты эт. л экспериментов показали» что в сыворо :ах (рош вакцкнипочанны" цыплят содержались антивДгозивные анти -тела не только против и К99, но и против адгезина нетипиро-зайцого коммерческими оывороткйми штаммов 09/адгезин и 0111/ адгездн. Ьри э ом установлс.ю, что адгезивные ытаммы после «скольких пересевов на жидкой среде Минка лучше проявляли антигенные и иммуногенные свойства и поело иммунизации такими дтаммами у вакцинированных tku *т титр антиадгезивных антител 5ыл значительно ваше. .

При количественной оценка результатов фракционирования белков сыворотки крови- ионизированных цыплят отмечено повышение концентрации глобулинов на 9 и 28 сутки после иммунизации птиц' поливалентной адгезивной формолквасцовой вакциной против колй^-Зактерибза в основном за счёт гамма-глсфМиновЬй фракция. Мак -оимальной концентрация этой Фракции: бед/а сыворотки крови была на 28 день' после иммунизации цыплят. ' :

Учитывая, что антитела представлены в. основном гамма-глобу -ЗДновой фракцией сыворотки крЬви, можно полагать, что изменения белкового спектра сыворотки крови птиц в результате применения вакцины нося7 иммуногенный характер, овязанные о выработкой one- \ цифичеохих антител. .■ • /:..''' '.'1' . ; f

5. Получение антааДгвэивноИ еыворо»кн на КроЛМах иг на курах

Противоадгезивные сыворотки К83 готовили лутем гипериммуни-заИии кроликов культурой из штамма Б.colt , содержащей адгезивный антиген K88/0I5 о поолвДувямм адоорбярованием гомолопЛной Культурой.'Цыплят иммунизировали культурой с адгезивный анти -геном ОД/015.

Лшериммунизацию адгезивными антигенами проводила на кроли-ftfix и ра цыплятах в .^ух вариантах: без им^уноыодулятора р о иммуноиодул,..1'ором "витамаднном". Животных гапериммувизировали согласнр методическим указаниям С£986 г) и в нашей к Дификации

Установлено, что тит^ антител полученной сыворотк- против /комплексного антигена: эи^рихий,/О- и адгезивного ант гена у кр Дика, трериммунизирова"ч<?го без иммуномсдулятора, ооставили соответственно 1:1600, ,.800, 1:200,- а у кролика при гиперим -мукизацир о использованием штамсдина титр антцтел сыворотки был соответственно 1:3200, 1:1600, 1:400. ::■ ■

, V Титр« антител сыворэгки против комплексного ai. .игена, 0- и адгезивного антигена у кур, гипвриммунизированннх без щтаиеЧи на, были соответственно 1:1600, 1:400, 1:100, а с . иур, лммутг жированных оонетанно о зитама^.лом.титры «оставили ооответетве; во рзт, 1000-800, i.-'гоо. д'-'í '•

Иммунизация кроликов и кур о«прововдалаоь определенным пе,-рераопрвДелонцем белковых фракций сыворотки кроЗД. В частноотк, отмечоно значительнее повишение концентрации гамка-^лобулиново! Фракции выворотки кроар кроликов. Причем, если концентрация эт< го белка оыворотки крови животных, иммунизированных бее внтаме-Дина, пошоилась на 0,45 г£, то в случае приненв[ :я и«гнуномоду. лятора поанаение отоц фрикции белка ооставило О,Г '» т% 0,051 . 7 V/ 1ипвр1;нмунизирсванных1 цыплят обеих групп ог мечено повыше, нив концентрации рбнего оелка, альбуминов и памма-гдобулиноц oí воротки крови. При отом.концентрация гамма-глобушнов в оыворо' ve крови цыплят второй группы, то есть на фона и en о л мотом bi тамйАина, оказалась выше, по сравнении с таковой у цыплят, ям • Мунизироиннных боз иммуномсдулятора,т 47,25$ (Р<0,05).

Таким образом, срвнительныЯ анализ иммунологических, био ■

имичеоких характеристик гипериммунных сывороток, получениях т »ивотных.о иополвзованием витамоДина и без него поКаЭал, т§,Избранный нами в работе иммуномоДулятор имеет высокую эф еНтявность'при иммуногенезе. '

выводи ■ "!

. Колибакториоз в ряде птицефабрик Ленинградской области

имеет широкое распространив. ' :

!. Серологической типизацией-.136 патогенных культур E.oöll

i:, РА ó'помощью набора О-колй снвор&гок типированы 94 кул в. -•урн. Чаще ¿сегоцвцце^лись патогенные штампы кийочной палочки, ¡ринадлежапме серолйгнчйбкймвариантам 01, 02 , 015 , 078. В отельных птицехозяйствах циркулирует одновременно 2-ЭСвролоп1 -> 1еских варианта патогенной Е. coll . 1

3. Ейологической пробой на белых мышах, при внутрибрюиинной за -ражёнии.установлено, что адгезивные4'культуры нищечнОЙ палочки являютоя более патогенными. Г ¡' . Í. Свойством адгезии обладают не только псдззикнне патогенные

культуры кишечной палочки, »Деленные от- кур., ро и нёподвиж-яне культуры, которые также имели адгезивные антагены. Адгезивные овойства"определяли в PAv о 1#.взве0ьв дрожжев*'х клвтой. Среди 94 оеротипированных по. 0-антигену культур 54 имели адгеэины. Для выявления адгезииов кишечной палочки, выделенных от кур, использовать'среду Минка не всегда обязательно. Лучше адгезив -ность была у культур после Двух пересевов на жидкой, а затем на плотной срвде (МПА или Минка). При старении культур, храня -цихся на МПБ, они теряют адгезивные свойотва и ДЛЯ их восстановления необходимо культуры многократно пересевать через жидкие питательные среды или через восприимчивых животных.

■ с

5. Из 54 культур с адгезивными свойотвами 28 были типйроваш ком^ёрч^екими ан ^адгезивными сыворотками, при этом 35,71;

из них ртцоуидась к КОЗ, 14,28# - к Ш, 10,71% - к А20, 3,5' к К99. 8 культур ссдёрхпли по 2 адгез-лна, из них 2 культуру | ли адгезини К88 + Г41, 3 культуры - К8В + К99, I кул гура Кб( Д20. Две культуры однов^змен]ио содержали 3 антигена „дгёзии: К88 + К99 + Ги КШ •» 1"41 + А20. . ^

; 26 из культур с аДгезинами не были типирораны комкерче Кими антиадгезивными сыворотками и принадлежали к Другим вари там.' ■ ■ ■■ ■!■ ■

При'анализе.О-серогрупповоЯ принадлежности и^оладув|шх ку тур и опособноота экспрессировать фимбрии но установлено четк корреляции. 15 культур с адгезинами были выделены из печени, культур- из сердца и 5 - из костного мозга- Культуры, вирами при 37^ в течение 48 часов, Давали более четкую ¿'А о коммдрч

• -л. ».'>••

киыи антиадгаэивными сыворотками. • ..■ . • ' -

6. Поливалентная фориоливаоцовая'вакцина против колибиктериоз кур, наготовленная из адгезивных штаммов ршериадй, являла

дааоко им^цогенной для цирлят при-аэрозольной вакцинации из расчета I мл на I м^ помещения.' . • ; . Через 9, 28 и 34 Дня после вакцинации титры п^отивоадгезив цых антител были соотве';твенно 1:8-16, 1:32, ,1:^-16. Б оывор не крови удалят до вакцинации концентрация Тамма-глобулинов б Да равна 0,54 г^,-а через 9, 28 и 34 Дня после вакцинации сое вила соответственно 0,87, 2,52 и 1,12 т%.

7. Полученная гипериммунная сыворотка на кроликах при ш луниз цп их культурой зшерихий о'адгезивными антигенами К88 в о

,те без иммуномо^улятора (витанеДич) и в сочетании с нммуномал

второй давала чет у» положительную реакцию агглютинации с гол ологичным яо.:п ексник 0- и адгезивными антигенами. Титр анэд-йД.йри иммунизации без чммуномодулятора составил соответственна :б00, 1:800 и 1:200, а от кролика при сочетании с иммуномоду -втором соотве.отвонно 1:32п0, 1:1600 и,1:400.

Пшерйммунная оыворотка, полученная от кур при иммунизации зз иммуномодуля'т-чза культур!.«, эшерихий о адгезшом Г41, имела итр антител протиг. комплексна - антигена 1:1600, против 0-анти-вна - 1:400 и адгезивного -1:^)0, а, от кур о применением им -рномодулятора соответственно 1:320 0, 1:400-800 и 1:200.

Таким образом, имнуномодулятор "штамеДин" стимулируё^ имму-огенез и может бить использован в процесое получения гиперим -/иныхсывороток.

ШКОШШДИИ ПР0И8ВСЙСТВГ . . Реакцию, агглютинации о применением коммерческих'противоадге-зивных сывороток можно успешно использовать при Диагностике колибактэриоза у кур как экспресс-метод. •'.-■■■ '

. Для приготовления вакцин против колибактериоза Кур реяомен -■ Дуем применять кулкгуры эшерихий о учетом не только 0-серо-' рупповой принадлежности, но'и наличия адгезивных антигенов. . Учитывая иммуногенные свойства адгезивных антигенЬ» эшерихий и

опыта по созданию коливакцин только из очищенных адгезивных или, считаем целесообразным расширить исследования в этом на -равлении по ооадани» поливалентных вакцин из адгезивных пили, чищенных от клеток. -