Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Морфо-биологические и антигенные свойства патогенных эшерихий, выделенных от кур

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО Х03Я1€ТШ и продовольствм РОССШЙКОК ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУЛАГСТВЫШАЯ АКАД0Ш ШТЕНШАРЯОЙ МЕДИЦИНЫ

, На правах рукописи

Еиовар Паритош йумар

УДК 579.8ii2.II.£¡¡24.12:616-092:636.5

МОГФО-ЩОЛОШЧЕШЕ И АЛШГЕШШЕ СВОЙСТВА ПАТОГЕННЫХ 2ШЕНШ1Й, ШДЕЛИ1ШХ ОТ ЙУР

16.00.03 - ветеринарная шшробцологня, : вирусология, эпизоотология, ' - • ' " 1ТИК0логня и иммунология

АЗТОРВ§ВРАТ

' диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

СП:1КТ-ПГ Т?рбурГ 1994

Габона вшслпекз ja кефздрз паробиолопш п гадесолопга, зсфсдр бпохпои Сацзт-Петербургской гсеударотаэнисЯ егз-Дешв взтарппарчсй кздпцта, в областной готсрпшрнсИ бзраторп и па птаце^абрияо "Ударили" ^етаигродокоП сЗяаотз.

Научные руп овод п толп:

- ваяДиВД? юторпкаргих nays» додан? Сокш П.с.

- довтор ютаршарлая пауз, профессор Кснспатов С. 13«

С£п1г,адишз сппопсики доз тор го то pi нарт:: imyß,

префеооор £ор:оси5 0га Л.И.» , кшйгда? гсторипарнах naya,

Д0Ц0П2 I^OäJOa Г.Ma

йдуздя орпзшЕашш - ПогросавадезЕЗ гооударггстппЗ

51И2БрШ1Т0г"

£аьзта дпосорищпп соотостоя 15 декабря 1994 г э if «so. еп еаосДЕшш изсщяшшзпрогаплого совета Л.128.20. С? в 0а!хгт-йатербург20сО.гсзузарзг£51то11 аштат сэтерпарпсЗ шйщяпу по aupejí

19608$, Салят-ПэгацЗур', Чзршгогззая ул.,5.

S дкзсарташсЯ tssno оглокештыя s бпбяяотоао Ccisï-

Пэ-торб^ргегсЯ гсоудпротзеппоЗ пвадэсга гзтзргпроЗ.

йаяядапш.

Auíoptcpar ¡asocian 0 ноября 1994 у.

Учений созротор* СПЕЩШЗзЕПрОЕЭППОГО согэтг»

лоцгпг O.D.Fcsj;oia

- 3 т

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В уоловиях современной технологии содержа -ния, кормления и воспроизводства птицы в птицеводческих хо^И -отвах получили широкое распространенно инфекционные иаболеваиил, о вязанные с кишечной микрофлорой (Урбан В. П., Радчук H.A., 1975; Соколова Л.н1, 1909; Каманина И.А,,1989; Радчук H.A.,1991; Борноенкова Л.Н., Рсвдеотвенскад Т.Н., 199^). Они наносят хо -яяйствам. эдачительный ¡экономический ущерб воледотзии падежа и выбраковки птиц, снижения ее продуктивности, затрат на лечение (Боосарабов Б.&., 1978; Комемяка H.D., 1991).

Сельскохозяйственная птица содержится в крнтролируемнх уо -ловиях светового, температурно-глажноотного рёжит ппщехозяй -отва (Болотников Й.А., Конопатов В.В., 1993)/ направленных на адаптации к ореДе обитания. Однако интенсификация птицеводства изменила течение и клиническое проявление кояипаратгтфозних ин' -Секций, и, в чаотноотй, колибактериоза, возбудитель которого значительно усилил свои патогенные овойотва (Артемьева С.А., 1976). При этом колибактериоз протекает в форма ассоциативных заболеваний (Тулев В.В^ Др», 1990), сопровождаясь болашим отА ходом молсйняка. , W-.- ■ г

В последние годи выполнены значителвные пооледования по изучении вопросов диагностики, и профилактики колибактериоза птицы (%рашвили Т.К., 1986; Вахманина Й.'А., 1>оиевйГ.А.,1985; Радчук Н.А^, 1975, 1990'и Др.); Очншго вое вив недостаточно. изученными являются вопрооы раопровтранения #реДии птиц &и ■ теропатогенных эшерихий о фимбриальными едгезина«*, рель риальных адгезивиых антигенов эшерихий ■ в аоздиноввии» яо ■<*■

либактериоза а условиях промышленного птицеводства, требувтбя изучение свойств полиадгезивных штаммов кипенной палочки о цо -лью создания препаратов, профилактирущйх болезнь.

Е свете о еызоизл еженным преДотавляется актуалтым и цел© -сообразным квя в теоретическом тан и в практическом отношениях проведение Дальнейших исследований этой серьезной проблемы пти-цсводотва- . v.

Цель и задачи исследований. •

Цель исслеяоганий - изучить морфо-биологячесйие свойотва я антигенную структуру патогенных эшерихиЯ, выделенных от кур,оп-редвлйть имкуногенные совПо1в& адгезивных антагенов.

Для решения этой цели били поставлены следующие„задачи»

- изучить морфо-биологиче ские и культуральнке свойства'выделен-

... , • ных культур патогенных эгеерихцй от кур,*

- оценить патогенные И вирулентные свойотва изучаемых культур;

- определить адгезивные свойотва и адгезивные ¿нтигэны у О-серо-типированных культур; ^

- Изучить иммуногеиные овойотва адгезивных антигенов зшерихий в опытах на аурах в производственных условиях,'

- получить противоаДгезивные сыворотки на кроликах и на курах о использованием иммуноюдулятора и без него,'

- определить белковый спектр тпериммунных сывороток крови-

Научная новизна.

Изучевд антигенная структура в. coli , выделенных от кур из птицехозяйотв Ленинградской области» по 0- и адгезивным ак -тигенам. Установлено, что культур! о адгезивными антигенами были более вирулентными.

При иммунизации в производственных условиях кур эсаерихиямк о адгезивными антигенами в организме синтезировались антитела

против комплексного, 0- и адгезивного ант генов, что позволяет рекомендовать такие штаммы для изготовления вакцин 'Л имнунных - оицороток. ' '

Приготовлена анти&Дгёзнвная гипэриммуннгя колисаворотка а опытах на кроликах и курах в двух вариантах; без иммуномодуля . . тора и в сочетании с иммуномодулятороы "штцмздином" и. устной ■; лено, что при использовании иммуномояулятора антитела синтеги г : ровалиоь в два раза активнее.

Для восстановления утраченной адгезивное™ антигенов при Длительном хранений культур эшерихий можно использовать неско -лько парееэвоп через жиДкуи питательнув среду (Минка или МЛБ). Практическая значимость. , верительное распространение среди патогенных эшерихий, вы -деляежх от кур, ку льтур с адгезивными свойствами и антигенами позволяет сделать вывед о необходимости внзоэния в ""Матодичео • кие указгния по бактериологической Диагностике колнбактериоза (эиераиоза) животных" (утверждены 12.12.31) исследования на аягезивнооть и ЬиерихиЯ, выделяемых от кур, с использованием коммерческих антиадгезивных сиворотоя Для животных.

Учитарая иммуиогеннкз овойства адгезивных антигенов ошери -?сий, при создании по®валентных инактивированных ко;ивакцич оледует учитывать штаммы, тапированные не толвко по 0- , не и адгезивным антигенам. . .•' - ; •

Аппобанкя работы. • -. . -

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафеДрц шкробцологии и вирусологии, кафедры бюхимии, кайедры болезней птиц, рыб и промысловые животных Санкт-Пвтер -бургского ветеринарного института при чтении лекций, проведении лабораториих понятий.

Материалы Диссертации долотены на 41 и А8 научных конфе|ён -циях молодых ученых, аспирантов и отудентов Санкт-Петербургского ветеринарного института Í199J, 1&У4 гг),1 на научной конференции профессорско-прст.одаватол ьсуого состава, научных сотрудников и аспирантов СПЙИ "Актуальные проблемы ветеринарии" (1994), на-П Международном конгресоо по патфизиологии (Киото, Япония,

Основные положения, вннооимыо на защиту. I. Определение.О-свротипов в. edil /циркулирующих в уололиях п'дщофабрш: Ленинградской областей изучение их'морфолога -чеоких, культуряльно-биохимичесюи» патогенных и шрулентных СВОЙСТВ-i' ■ ' ' ■■'.•■ . • |

2« Определение адгездоных свойств и изучение 0- и адгезивных

антигенов изучаемых кулвтур. 3. Приготовление формолквасцовой вакцины с адгезтшми штаммами й изучение ео влияния на иммуногенные показатели кур в про -' иэйодственчых условиях. Получение гипериммунных антиадгезив -ных сывороток на кроликах и на курах'с применением иммуно -модулятора "витмеДина" и без него.

■ С^ем и структура работы. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и включает .введение, обзор литературы, методы исследований, результаты собствешШХ исследований автора, выводы, рекомендации произгодству, список использованной литературы в количестве 219 источников, из них 119 - иностранных авторов. Работа иллюстри -ролана 16 таблицами и 3 графиками. •

matbhjajm'h ивтосн иссждотний ■

Работа выполнена в период с 1992 по 1994 г на кафеДре микро -биологии и иирусо л огни, кафеДро биохимии Сгнкт - Петербургского

ветеринарюго института, в об ла от ней ветеринарией ¿aöopn'rujwi и в условиях птицефабрики "Ударник" Лони.чгразокай оЗлес-га.

В рпытах использованы в кьчоотвэ' матертло» исследований йрЭ/ . Лики породи Шиаивдл'а 2-месячного возраста, белио мипи, цнплята . и куры-иэсушк^. В производственны* условиях птицефабрики иоМа-1 дования выполнены на 92 тыс голов, птицы. Подвергнуто изучении и. оерологачео^ой типизации 136 культур кишечной палочки, выдя ;' ленных из различных тканей и органов S птицефабрик Ленинградец о9 , области. : ■

Для выдолеиия культур использовали о? бедьщх и певших цыплят и кур кровь из оердцау печень, оелезенку, почкр. желчный пузир>, «остный и головней мозг. ПатологичзокпЦ катериал засева«, на, МПА, МПБ и на чашки о Дифференциальной орадой ЗнДо им лэрииа. , &сеянные чашки помещали к ы-дераишли в термостата при таипе

paiype 37°С в течение 24чаоов. Воли через й^чаоа'ррвт на oytav -.'дах отоутотвовал, то пооеаи выдергивали еще сутки. :

Из каадой чашки проверяли ж менее 10 характерных колоний по реакции агглютинации (РА) наотекла о поливалентной 0:>¿хощ -оысороткоЯ. В случае однотипности воех выделенных культур, см ► , , тих с одной чааки, дадвдейюему изучении подвергали одну кулг,_-• туру. Для отого отпивали по две типичные, имевших -4>орму ион лонии, каадуп в Две пробили о МПА для ДалЕиеЙЕвго изучения и ' п полукидкуо среду 0,3^ МПА для хранения. •.'/'• ' ; V У выделенных кулмуртю общепринятой методике изучали морфологические V обычной и электронной нихроскопиеЯ), тцнктариал» -низ (окраска подГряму), культурально-биохикичеокие овг"о«ю Kauffman f, , 1966," Braeten В.А. et al. Д9771, %pxRHO -

ва Х.К.,19бо; Радчук H.A., 1990). thmsaimosB«Meinwi..ify*»r»j>

проводили о огласи о оушествующей систематике, принятой подкомитетом хитачннх бактерий номенклатурного комитета Международной ассоциации микробиологов (1963), а также при поиски определи ~ теля Борги (1974), книги Кауфмана Э. (1966) "СемеЯотво кишечных бактерий". . : . . . ,

Сс'ролопмеокус типиэьцич выделенных культур проводили во.-гласно "Наотаялени* по применение агглитинируиших 0-коли енво -регоя", утвержденному Глагаым Управлением ветеринарии Ibcarpo -прома 0CGP, 16 иЦя 1йЮ г » И5-ба. - ^ v

Протеолитачаску» активность изучали по способности культур разжижать желатину к пептонизирогатьобозжиреиное молоко (В/1- . »arfls P.R. et al. ,1952; Heller S. ei *Ъ ,1977)ь

Лэмолитичеойуи активность культур устанавливали по рооту на МЛА о добавленном 5% Дефибротированной крови барана ( Брв -меев М.Н., 1975). .,■:■./ '

Подвижность бактерий изучали в полужидком МЛА (Hemeler «.V. et al. ,1967; Антонов Б.И., I9S6).

Патогенные и яирулентные свойотва проверяли на белых ш -шах маооой 16-16 г. Для этого готовой ьзвеоь (оуспенэию) ру -точных агаровых культур, выделенных из двух внутренних органов, в концентрации I млрд ткробных тел/мл. Заражение проводили вну-трибрвиинно в дозе 500 млн гакробнмх тел. Культуру прианаввли патогенной в случав гибели одной или более белых мышей в течение двух оуток после заражения ( Qlbbe R.B. ,1964; Картувика A.B., 197Ц Heeamura К. et al» . ,1985). .

Адгезивный свойотва культур изучали в РА о Дрожжернми клет -ками. Изучение адгезии к дрожжевым ^леткам (пищевые Дрожжи) проводили по методу Ki honen Т.К. et al. ,1986. Массу дрожжевых

клеток взвешивали а слегка подогретом фосфатном буферо, рН-7.I, центрифугировали 7 минут при 1000-об/мин, затек 0,01- мл пслучон-нсго осадка переносили н Другу в пробирку с новой порцией фоофат-нсго буфера доводили объем взвеси до 10 мл, получал при атом 0,1/2 взвесь клеток.

Определению адгезди з РА проводили в келедьноц вартенте на отекде. 3 качестве контроля попользовали для исключения опентан ной агглютинации Физраствор и фосфатный буфер. При наличии едге-зинов не позже чем через 30 сок в суспензии дрожжевых клеток о культурой, выращенной при Э7°С, появлялся четко выраженный аггче-тинат. В контроля* и.с культурой, выращенной при 18°С, реакции не наблюдали.

Соматические пили определяли при помощи электронной шкро -скопии ( IBM 100 СХ) методом негативчох-о контрастирования ( De (Jraaf F.K. , 1981; Hagaraja K.V. , I983J Кувууа М. et al., '1988). Для этого использовали 1% раотвор фосфорноволнфрамовой

кислоты ($i3K). ■ . • " ' '

■ * »

Для выявления пили культуры серотипа 015/Ш выращивали на жидкой ореда йшка 24 и Ф часов, бульонные культуры омешивали с физраствором а ооотношении 1:1. Stтем Одну каплв омеои наносили на формбар сетки ( IgOC .200 I>D ). Сетки подсушивали в еушильч ном шкафу. Сетки обрабатывали it раотяором 4Ш при помощи рас -пылителя в течение одной юнум. После этого, сетки, промывав дистиллированной водой,.подсушивали на воздухе и использовали для просмотра.' - • . • '■-. '•''._" 'Г-'

С целью выявления адгезивных антигенов у выделенных культур использовали МПБ, МПА, а также специаяьнуп плотнув.н яиЯКуп cpesy Минка (ГутковскиП А.А., 1990). Среду Минка готовили по рецепту (Методические указания, 1986) с заменой казаминовой киолотн nt -

лролизатом лаяталвбумтна» ,

Для обнаружения адгеэишых антигенов попользовали коммерчео кис антиан гезияние агглютинирующие cueojotkh» выпускаемые НИИ прикладкой микробиологии-г.Обнинск в соответствии о " Временник неставлениен г«о применении агглютинирующих оывороюк гад -гезилным гнтогеням оиерихий K8ß, К99, 967 р, F4I, А20 утвержденным Глазным Управлением ветеринарии Государственного arpo -промыаленного комитета СССР, 21 февраля X9Ö7 г«

4ормоякраоцощ в «акцину для авроэояьмоИ мисциняции птиц го товиля из адгезивных «ггаимои 09, 015, 076, 0III. Вакцинировали цнплят а возразта 10-13 дней на птацефобркке •''Ударник". Доза для аяроволБисй гакцинации - I мл/ir. После вакцинации оыво -ротку крови цппД1Т иослоДогали через различные ороки. Наличие 0- я йнтиа1гезигцнх а:1титед и их титр определяли в PA (oyiaah J.E. et ей. , 1996;' Harley Y.1U eí »11988; Gweniwod P.S.

,et al. ,£988).

t' ■ ' ' .-■

Общий белок сыворотки крови до и,после гиперишуниэации же -

водах и птиц ксследовали рефрактометрическим методом. Опреде *

ление концентрации белковых Фракций выворотки крови проводили, '

нбфелометричеоким методом по Оллу и Маккорду ,в модификации Кар -

лига. .'< • • . : •

Противоадгчзивкуо сыворотку К68 готовили путом ниперкимуни -заций кроликов о иммуномодулятором "витамедином" и без него. 1к1ериммунизаци«) кур о целы) получения противоадгезивней cu -воротки Ш также выполняли о иммуномодулятором и без него. Итеричмунизеци» кроликов и кур для получения актиедгезивнах оывороток проводи.^ по методике Соколова H.A. и Др. (1909) и

оогласно "Методиче'оким указаниям по изготовлению антиадгезишой

*

сыворотки Н99 и обнаружению адгезивного антигена К99 у¡патогенных эшарихий"(19бб г) и в нашей модификации. ч

Цифровые экспериментальные Данные подвергнут!*1 статистической обработке, й^зличия между относительны!« величинами .оценивались с помощью критерия Стьвдента. '.'

. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВШШХ КССЛЕ&ОЯАНМ '

I. Морфологические, культуральио-бяохимические свойства патогенных культур эшерихий . ' '

Выделенные культуры представляли собой грамотрицательные ' палочки от коккообразных относительно мелких палочек до тонких, длинных, прямых с закругленными концами, расположениями одиночно.и попарно. Размеры отдельных бактерий соотавлялг.в длину от 0<5 до 4 мкм, э Диаметре от 0, ^ д о 0,6 мкм. Вмазках, пригстов -ленных из внутренних органов, костного и головного м,озга, окра-неиных.ло Грану, часто наблюдали биполярност{.,

Срачи.необладавших адгезивнобтью 66 культур 51.£77,«¿7$) бы -

.'•ли подвижными, 5 0,57%) олабо подвижными, 10 ( 15,15#) бц - '

■ \

-•ли неподн'ж'ными. Среди 28 культур с ад'гезинами'23 (82,14$) являлись подвижными, 2 (7,14$) слабо подвижные И 3 (10,71?) не подвижные. Адгезивные овойотза обнаружили как ©речи подвижных, так и среди неподвижных культур, хотя значительно болыаа были подвижными (Р А0,05). ' . ,

На МПА культуры эшерихий через 20-24 часа образовывали вы -пуклыв колонии средней, величины, влажные, блестящие, прозрачные и непрозрачные в проходящем свете, круглые о ровными краями о серовато-голубым оттенком, по структуре гомогенны.

На плотной среде Минка эшерихии образовывали мелкие, круг -лне, сочные с ровными крями, приподнятые в центре;-прозрачные колонии. На. среде Зндо получали 3 типа колоний: первый тип представляли колонии темно-вишнезого цвета с металлическим блеском,

■

плоско приподнятое с ровными краями", сочные. Второй тип к£ло -ний был маиииэвР-красного цвета с напичием более светлой кай -• кы no пс-рифьрии, в центре приподнятое. 'Копоши Диаметром От I до 3 мм- Кологшг третьего типа находились в R -форме. На среде Леи» на колону.к .Сы.ти от те кн о-фи о лето во го до черного цвета, в центре приподнятые, по форма, величине и другим признакам сходные с тско*ыни, полученными на M1IA.

IIa МЛБ отмечали равномерное помутнение, на Днэ сероватый осадок, легко разбивавшийся при встряхивании. Некоторые штаммы На пбверхнос.ти среды образуют тонкую пленку и приотеночнйе кольцо. v ■ . , ;;",, ■ V. - •

На адкой сра?.о (4шка культуры также вызывали равномерное помутнение, на Дне пробирки отмечался ооадок серо-белого цвота.^ легко разбиваПЕкЙся при встряхивании. В некоторых случаях отме • чалоиь на поверхности среды приотеночноэ кольцо..

Определение биохимических свойств у патогейннх шкроорга -нкзмов служит одним иа важнейших признаков при их идентификации и пироко иополъзуетоя в микробиологической практике при Диаг ностике инфекционных заболеваний. '

Для исследуемых культур были характерны отрицательные реакции Фогес-'Проскауэра и положительная с метилротом, что пез -водил о отнести их к роду Escherichia.

Езе выделенные 136 культур кишечных палочек свертывали молоко на 1-2 сутки после посева- С целью дифференциации мнкро -бов подгруппы Baoterlunt coli от подгруппы Citrobecter

производили посев иа нитратный агар Симонса. Отсутствие роста, изменения цвета среды указывало на принадлежность испытуемой культуры к подгруппе Bacterium coli.

Все выделенные культуры Е. coli ферментировали с образо ванием кислоты и газа: глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, ара-

блиозу, «орбит, но ферментировали аДонит, ккогмт, часть культур облапала избирателей активностью в отношении сахарози. Дуль -чата, рамиоз^. Сахарозу, дульцит и раянозу фе^итиров&ли ооот ■ хнтствакно 55,88, "2,05 и СЬ, 91$ культур, .

Лы определения протеодитичеоких свойств Е. coli прово -Дили посев культур по уколу в отолбик' мяао-г.ептонной гкелсткни. Вое изучаете культуры росли по уколу без разкикения ср^н.

В результата проведанных нами исследований не отмечено-определенной стабильности биохимической активности у различных серологических вариантов кишечных палочек, что согласуется а Д'щ-ны:ю ряда агзтороа ( . Hemeley R. et ,1967; Новгородская

Э.М., IS'69; Михайлова. В.Е., 1983).

2. Патогеннооть, шрулентность, адгезивные свойства' культур эшери»;й Патогеннооть и вирулектнооть била изучена на белых мншах у адгезивных и неадгезивных культур эшерихий, принадлежа«! х к раз-личнич серологическим группам, ^взулматы исследований показали, что ь абсолютном ввоем большинстве культуры кишечной палочки обладали выраженными патогенными свойствами (Р<0,05). Однако культуры, имеющие'адгезивные антигены F4I, К99,' ¡(88, Ш + К99, . д5ыли более шрулентными и вызывали гибель мышей в течение пер •• внх суток, а Другие Линь через 1-4 дня. • -

В зависимости от 0-серологичезкой принадлежности культур наиболее выраженной вирулентность» обладали культуры эшерихий серологического типа 015 (о адгезинами), 078, 01 и 02, на втором месте культуры, принадлежащие к серологическому ти"У 09, 015 ( без адгезинов), на третьем - культуры, принадлежащие к серологическому типу 0HI.

От'павших мние¡Г производили высевы из костного мозга, печени и сердца на плотную среду Минка и~ на МПА с целью выявления ад -гезивных снтигеио^..Ия шести культур, выделенных из печени мы -сей, пять культур дали,полстательнусРА.о моноопецифическими сыворотками, только в сдном случае выделена культура с адгезивным антигеном К99 из сердца. У культур из костного мозга нам не удалось обнаружить адгезивных антигенов. Наличие на поверхности'' выделенных культур,эшерихий адгегинов свидетельствует о роли адгезивных антигенов в патогенезе к пйтогеннооти (Соколова Н.А* и/ др.; 1989). 1; . . /"

Известно,-что^улиура •8иерйХкй,4;.>бла?ав!ика адгезннами,. спо 4 ообны присоединяться к различным клеткам. Нами проведены иооледо^р вания по обнаружений'адгезивных свойств у 9'1 патогенных культур кишечной пр.лочки, выделешнчх от кур с использованием 0,1а- взве -ей ДромквБНХ клеток. Из 94 культур, заращенных на плотной среде Киька.прь У1°С, 54 обладали четкой агглютинацией на стекле с дрожжевым клетка'«:, что хорошо обнеруживалооь визуально в те чение сднои шнуты. .Эги »с культуры, внраиэннне на среде Иинка -г пр: 1311С, адгезчшооть к дрскжевам клемсл не проявляли, что оо-глаоуетоя с метадичеакйии рекомендациями по обнаружение адгезив -ны:; своиотв и антигонов у патогенных эшерихий животных (1986). • Лучшая адгазизность была у культур после двух пересевов аа жид -кой и затем пересевом на плотную ореду 14шка.

Параллельно культурн били испытаны о МПА после Двух предвари -тельных перепевов (т МПЕ. Все культуры, выращенные на плотной ореДе Нинка при У7°С, которые дали положительную РА о дрожжевыми клеткаки, также били положительны при вирачаигании на ММ при У1 °С. Однако в нескольких случаях нам

'удалобь обнаружит! положительную РА с культурами кишечний nav.. лочки, выраще л х на iflA и при 18°С.

■ ^^ГГо.лученные Данные показали,, что 57,ЦЦ% выделенных культур обладали адгезивными свойотват.. Кишечные палочки, у которых ; обнаружены адгозины, относились к патогенным оероварам 078, 01,* 02, 0III, 015, О4, 09, 020, 0115, 0138. Из них 15 культур были серовара. 078, 9 r-льтур оеро^ра 01, по 7 культур - серовара .02 и 015, по 6 кул-тур - сер iv ¿a 09, OUI и по одной культуре ^ сероваров 08, 020, 0115 и 01: . V-. • ; .

В процеосе работЫ(выявлено, что отарые культуры, хранящиеся ' на НПБ более троххесяцев,1 не Давали положительной РА о Дрсис -кеяыми клетками. Для восстановления адгезивных ввойотв кисочной палочки были проведены па'ссаяи через НПБ иди жидкую вреду Km" jta» или черёз восприимчивых животных и установлено, что чорез несколько (2-5) паосажей через жидкую "бреДу кинка КуЛвтурн вов-отанавлилают свои адгезивные .овойотва.' . .д .

3. Антигетяая структура культур эибризий

В целях выяснения распространения различных.оерологачеоких Еариантов кипечных палочек на-« проведена серологическая идентификация всех 135 выделенных культур из птицехозяйста Ленинград-^ окой oújjaorá. Серологачэское/гипирозание культур "эие]зихий nj/o -веди ли о помощью поливалентных и моновалёнтных О-к о лисы вор ток.

Из 136 исолодованных культур кишечной палочки имеющимся набором 0-колиоывоpo'toK были типированы 94, что ооотавляет 69, Подавляюкое число тонированных культур отнесено к серовариантам 01 (II,76$), 02 (10,29$), 015 (8,08£), 078 (I9,II¡0, реже вы -делялиоь культуры серологического вар!анта 09 0,35%), 0III (6,61^, 08 (2,29$), в Двуз случаях серологичеоких вариантов 0115, 0138 и в одном случае 020.

- 16 -

Значительное количество выделенных культур были в Егформе р давали■ рпонтанну.1 агглютинацию о фиэраотвбром, что неипоз -воляло их эрологич(заки типировать. Это явление овязано о пк • роким применением антибактериальных препаратов « пг'цехозяй ->ствах о целью профилаь.ики бактериальных инфекций. : В отдельных птаце-озяйотвах области в ооногнок цирнулиру ■}ют не более Двух или тлех серологических типов патогенной ьи. » шечной 'палочки*. Так иг 30 типированных культур ид патматериа-ла птацефабрикн "Ударник" 15 культур отнесены к çeporpynne 07Ö • по 5 к рерогруппе 01.5 и 02. На птицефабрике "Ломоносовокая" бо : льшинсуво выделенных культур,принадлежало к сер группе,0| и 01 ' в услраиях птицефабрики 'Ч^оско-Зысоцкая" _ 09 и 01, птицефаб-: рики "Лаголово" - 01, 02 и 076,"птицефабрики мЛи'яйье"0III, 078, 08, птицефабрики "Взйскс-'лда.'1 02,.. 01, 0III. Следует отметить, что; нередко от одного'паваегр'йл^ .бол^от э цыпленка ш Делялц по два'-разных. серолргечооких типа кишечной~палочки, рао провтраненных s .данном хозяйств?. .'■., ;

Серологичейкий анализ показал,' что в течение опреДеЛвнног времени в мице'хозяйагве,- неблагополучном до коли''хктериозу мо. гут циркулировать несколько аэрологических типов кишечнрй палочки, которые о течением' времени'-могу т' заменятся другими ое • ротипаш, что'соглаоуетпя.с Данными Урбана В.П. . Рядчука H.A. (1875), ;зяапв:з: (1981), Аккузиной С.Г.. (199Г\ Черных М.Н. (1991), ' -, ; :

Нами проведены исследования по обнаружению адге.з/.зных антигенов у эщерихий, выделенных от кур и установлено, что из 54 культур с адгезивными свойствами, Давшими пол скительную РА с дро.чшгвымн культурами, 28 имели адгезивныз антигены и были типироЕаны выпускаемыми коммерческим! противоадгезивными сыво-

j

- 17 -

'роткайи. Наиболвше .¡количество культур (10) содержали 4и»гезин-КЗЗ (35,71*), соде^яли антиген «Г (14,28?;!), 3 антиген А20 ■ (1,0/71$).; и .одна культур содержала адг-эзин К99 (3,57$); таблица Г. ! . '

..'■,'. ' Таблица I'

• Тип" адгезивных'антигенов у патогенных , ЭИ8Т1ИХИЙ, вид единых от кур

' Количвотво j. исследованных культур. .3 тапированных по 0-антигену , ,'*■■■ Из^них . . ,

количество культур «Г адгезивными - • свойствами в -РА ■)Е>"'Д|юаяаввш;. клеткам 'г ' •" типированы в РА с антиадгезивными сыворотками

типы адгезивного Количеств антигена культур.

. 94 ' 1 . Ч' ' 54 ; . ' ; К88 ■ 10 F4I 4 ■ » «» К99 I < v А20 '.':•.-* ' ; 3 98?Р - " IÎ88 + F4I 2 КЗЗ + Н99. • 3 Г-41 + К99 '. " I . K8S + 937Р : I К88 + А20 . I K88+K99 + F4I I 1 КВ8 + F4I. + А20 I

• При анализе О-оерогрупповой принадлежиоста 28 иооледуемнх культур и способности экспреосировать фимбрии не установлено Четкой корреляции. Адгезины чаще обнаруживались у культур оше-рихий, выделенных от кур, относящихся к серогруппам 078, 015, 01, 02, OUI и 09. Культуры, оодеркавдие адгезии Н86, относи -лись практически ко всем выявленным нами оероварам 01, 02, 020 , 015 , 078, 0Ш (таблица 2).

Г 18 -

, ; Таблица ;¿

эщер хиЯ, имеювде ад.гезивдые антигены .и •s их иерогрупп jan принадлежность по О-антиге у

i \ :■'—> ; 1=% Адгезивные I ' : Серов&ри ■■■ (колич отво*.

антигены <■ - ' по 0-антигену серо вар)

1 11 I Г I i' I »I I - I , I .., I.' ■ ■ »■ 14 11 ■! I

К88 • : ! 2 з 2 I ;■■ I

■■ Ч ' I , 09 02 015 079 029 OUI ■ —А—;—-—-^---

-- .F« i ■ " ■ _3_ ' ' 01 015 5

Í' - А20 ; _2 JL Oí - 078

s : 987р

..... . , i ,..и..., ..... К88 t- F4I ' ... > ; ■ -л/'-' ' ' • 0Г5 . Oílí V ' V

+ К99 ' , - • 01-..' . 078 л • , ' ■

К99 + F*I -V - 078

K88 V 987? л i * • ' ui;-'^ - , '09 ■ "

m t A20 .01 ■ • "v

K88 + K99 i. Fiji I - 09' -

. K88 + f/(I + A 20 I . , . С ; '•'■' v"':ív" .■•:..- ' 1 -078

Всего: 28

' - 19 - ■ . .

Штаммы В.coli о адгезином К88 выделяли из печени (5? 67© .оердца (28,97$), косного мозга (17,852). Из 4 культур: F4I 2 обнаружили в печени и 2 • сердце. ítee 3 культуры А20 были вьйелеин ий печени, куль.-уру К99 обнаружили в оердце. Штаммы К83.+ F4I, ГС83 + К99. К88 + 987Р, К88 ► А20, КВ8 + К99 + F4I выделяли в единичных олучаях из печени. Ко8 + F4I и К83 К99 обнаружили также в оэрлце. Только в одном случае 1(88 + + А20 выделяли из костного мозга. . . ..

Наш установлено, что для выявления'адгезивных антигенов у патогенных Е» coli кур иопользоыть срезу Шняа говгда не обя зательно. Культуры, внраЩеннно на ореде Минка и. даидие-положите-льнув РА о анткадгвзивными сыворотками, Давали также псложителйа-1 нув реакцию РА при выращивании im МПА. Однако для выявления ми тигена К99, и F4I среда Минка была более эффективна, чем МИА.

; . Ч. Иммуногвядае овойотва адгезивных антигенов .

эиерихий в опытах на курах л производственных

> : ... УСЛОВИЯХ ,"-., .j- '

При анализе литературы н^ми не выявлено сообщений öd ивпол^. soBaraiH для приготовления вакцин против эвёрихиоза кур штаммов еперихий о: наличием адгезивных антигенов и иммуногенности такик • •вакцин по синтезу у вакцинированных птиц специфических антител против адгезивных антигенов. .Опыты в этом направлений имеют бо -льиой практический интерес. ' .

В нашей работе для приготовления формолкваоцбвой вахцинн, оо-Держакей адгезивные антиген«, Йнли выбраны 4 адгезивных штамма: 09/адгеэин+,0I5/F4I, 078/К99 и ОШ/адгезинЧ адгезин+ - куль -туры нетипированные имеющими коммерческими антиаягеэивнымн сыворотками). Взятые штаыда по своим морфологическим, тинкторвальк»» и культурально-биохимичэоним овойотвам были характэрнймтт для своего вида и обладали

выражэнныш вирулентными свойотвами для: цыплят и белых мкшей, ' агглютинировались ti юсиецифичеокими сыворотками по О-антигану до прсчельь-го титра.

Приготовленной вакциной были вакцинированы 5579S гмцлят d В05-■ расто Ю - 12 оуток аэр^эольным методом с помокыз аппарата . САГ-2 при расходе вакцины I мл/м3. Спустя IV 30 и ^-79 дней , после вакцинации у цыплчт брали кровь для анализа на наличка • • титра антител. CoMawit кие и антиадпезивные антитела проверяли, с применением РА.

Через две надели тигр 0-ангитеД сыворотки крови был '1:80. йтри антиадгезивных ан тцтел против FW и К99 бь. р 1:6 и против адгезика, принадлежащего серодарам 09 и OUI - I:'». Через ме ояц после вакцинации титр 0-антител ооотавлял X: Эй титр против •всех адгезивна* антигенов'был " фуотя 78-79 Дней_после'вак4 цинациа ентиадгезивные ¿нтитела на обнару«ивалкр.т, но имели ме«* то' О-^нтитрла/их титр была нивким - 1:10. ..•' "" - ■

Для .приготовления 2. оерии фор^олквасцолой ватины'были зы « брвяы адгездйные штаммы 0I5/FW,' 078/К99 и 0Ш/аД.ззин+, вой три культуры былц 4-иратно перэоеяны на жидкой ср-де Мияка. Приготовленной вакциной был привит 36201 цыплсйок в возрасте 13 суток. Кровь для исследований получали от пти;г в возрасте ?2,ЧяKl еу'ток. ■

. Д ;Через ,9'Дт1ей после вакцинации титр О-ентйтеЯ -ротив всех итацмов был равен 1:40, 'а для адгезивных антигенов 1:8 - 16» 4s-рез 28 дней титр адгезивных антител у всех штаммов был j-ахек 1:32 и соответственно 0-антнтел 1:160. Спустя 34 дня пог ле вакцинации титр адгеэишах антител для Г41 был 1:8-16, а для 0111/ адгеэин4" - 1:8. Тигр против втех О-антигенов бнл 1:80.

Результаты эт. .с экспериментов показали, что в сыворо ;ах кроаи вакцинилочаннн" цыплят содержались антиадгезивныа аити -;.,тела не только против и К99, но и против адгезина нетипиро-aatmoro коммерческими оывороткаш штаммов 09/адгезин* и 0111/ адгезин. Кри з ом установлс.ю, что адгезивные итаммы после нескольких переоевов на жидкой среде Минка лучше проявляли антигенные и иммуногенные свойства и после иммунизации. такими

. M

Штаммами у вакцинированных ь^.ь чт титр антиадгезивных антител был значительно выше. .

При количественной оценке результатов фракционирования белков оыворотки крови иммунизированных цыплят отмечено повышение концентрации глобулинов на 9 и 28 о'утки после кммунизаши птиц' поливалентной адгезивной формолквасцовой вакциной против коли.,-бактериоза в основном за счет гамма-глс^линовой фракции. Как -оямальной концентрация этой фракции бел/аоыворотни крови была на 28 день' после иммунизации цыплят. - ^ г >

Учитывая, что антитела представлены в основном гамма-глобу -линовой фракцией сыворотки крЪви.можно полагать, что изменения белкового спектра сыворотки крови йтиц в результате применения, ^ Вакцина носяу иммуногенный характер; овязанные о выработкой специфических антител. • . •

5. Получение антиаДгвэивной оыворотки ' на кронах и яа курах

НротивоаДгезивные оыворотки К83 готовили путем гипериммунизации кроликов культурой из штамма E.coll , содержащей адгезивный антиген K88/0I5 о пооледувщим адсорбированием гомологичной культурой." Цыплят иммунизировали культурой с адгезивным анти -геном т/015.

Вшериммунизацию адгезивными антигенами проводили на.кроликах и ра цыплятах в -цух вариантах: без имиуномодуляторе и о иммунсмодул,.1>ором "витамадином". Животных шперикыуни зироцаля согласно методическим указаниям (1986 г) и в нашей м Чификации".

Установлено, что тит^ антител полученной сыворотк-» против , комплексного антигена эйрихиИ, 0- и адгезивного ант гена у кри^у лика, Пферкмм^нижрова"чого без инмуномидулятора, составили соответственно 1:1600, . .800, 1:200," а у кролика при гипврим -мукизацир о использованием витамсдина титр антител сыворотки был соответственно 1:3200, 1:1600, 1:400. ..■'■.

1 Титры антител сыворотки против комплексного а. игена, 0- и адгезивного антигена у кур, гапериммунивирсванных без ттамани-на, были соответственно 1:1600, 1:400, 1:100, а с мур, лммушн жированных оонетанно о витамаШ;лом.титры «оставили соответетвен» но ^ЭЗОО, 11100-800, 1:200. , - г'

Иммунизацил к-ролик.ов и кур аопровоалалаоь определенным пе рераопроделением белковых фракций сыворотки кроьц. В чаотнооти,-

^ О^МбЧОИС ГГОрЬШвНИв КОНЦвН^рЭЦИИ ГвММв***

лобулиновой

Фракции оыворотхи крови кроликов. Причем, если кон1,->нтрация этого белка оыворотки кровц животных, иммунизирование бев витаме-Дина, пошоилась на 0,то в олучае приненв1 :я иймуноиоду-лятора повышение этоц Фракции белка составило 0,Г'» т% (Р<0,05). | У гопериммунлэирсванных, цыплят обеих групп осечено повышение концентрации рб^его Оедка, альбуминов и гамма-глобулинов он* . воротки крови. При стом.концентрация гамма-глобужнов в ¿ыворот-ке крови цыплят второй группы, то есть на фоне иопсльзор-'ния ви-танеДина, оказалась шше, по равнении о таковой у цыплят, им -. мукиеироианных без иммуномсшулятора,на 41, ?3% (Р< 0,05).

Таким образом, сравмтельный анализ иммунологических, био -

' химических характеристик гипериммунных сывороток, полученных от животных.о иополвзованиом витамсДина и без него пойазал, , 4t¡5,;Избранный нами в работе иммуномодулятор имеет высокую эф -фе^тивнооть'при иммуногенезе- (

В Н В О Д Ы !

I. Колибактйриоз в ряде птицефабрик Ленинградской области имеет широкое распространите. ' '■

Серологичеокой типизацией-, 136 патогенных культур Е. coil f B PA d'помощью набора 0-коли сыворбток типированы 94 кулв -туры. Чаше ¿cera,выдецялись патогенные штаммы кийочной палочки, принадлежащие оеролйгичй'бкйм вариантам 01, 02, 015, 078. В отдельных птицехозяйствах циркулирует одновременно 2-Эсврологи ческих варианта патогенной Е. coll . !

■ 3. Биологической пробой на белых нашаХ'при внутрибрюиинноН за -• ражении. установлено, что адгезивные*' fry л ьтуры нимечной палочки являются более патогенными. , _ 4. Свойотвом адгезии обладают не тол ж о под ткные .патогенные

культуры кишечной палочки, выделенные от кур, ро и неподвижные культуры, которые также имели адгезивные антигены'. Адгезивные свойства'определяв в РА-о 1% взвебью дрожжевы* клетой. Среди 94 оеротипированных по 0-антигенукультур 54 имели адгезины. Для выявления адгезинов кишечной палочки, выдел^ндах от кур, использовать'среду Минка не всегда обязательно. %чше адгззив -ность была у культур после Двух пересевов на жидкой, а затем на плотной среде (МПА или Минка). При старении культур, храня -иихся на МПБ, они теряют адгезивные свойства и для их восстановления необходимо культуры многократно пересевать через жидкие питательные среды или через восприимчивых животных.

.. - 24 - ,

г

5. Из 54 культур с адгезивными свойствами 28 были типированы -¿¿ком^ёрч^екими ан ладгезивными сывороткаш, при о том 35,70

из J3IX otj)Oüj¡/mcь к К88, 14,28# - к F4I, 10,70 - к 420, 3,57|-у К99. 8 культур осдер^чЛи по'2 адгезина, из них"2 к^лмурЦ им^р : ли адгезшш КШ + F4I, 3 культуры К86 + К99, I кул гура К83 + А20. Две культура однов. эменао содержали Э.антигена ~дгезии: ^88 + К99 + Г4/ и К88 ч F4I + А20.

; 26 из культур с ьдгезинами не были типированы комморчес -«ими антиадгезивными сыворотками и принадлежали к Другим вариантам.' Í". • I

При'анализе.О-серогрупповой принадлежности и^оледуемих культур и способности зкспрессировать фимбрии не установлено четкой • корреляции. 15 культур с аДгезинами были выДеленьГ из печени, 8 '■ культур- из сердца и 5 - из коотного мозга. Культуры, выращенные при 37 °С в течение 48 »{асов, давали б.олее четкуо Л о коммерческими антиадгезивныш сыворотками. .. •

6. Подивалентная фориолишсцовая'вакцина против колибактериоза кур, пщготовленная, из адгезивных штаммов ршерихий,являлась

высоко иммуногенной для цырлят при-аэрозольной вакцинации из , расчета I мл на I м^ помещения.' - л . ,, а

Через 9, 28 и 34 Дня после вакцинации татры противоадгезив -ных антител были соответственно 1:8-16, 1:32, 1:о-16. В оыворотке крови Цыплят до вакцинации концентрация Тамма-глобулинов была равна 0,54 т%,-а через 9, 28 и 34 Дня после вакцинаций составила соответственно 0,87, 2,52 и 1,12 т%.

7. Полученная гипериммунная сыворотка на кроликах при ш «униза-цг:1 их культурой зшерихцй с адгезивными антигенами К88 в опы-

, те без иммумомолулятора (витанеДич) и и сочетании с нммуномгхлу-

лятором давала чет. ую положительную реакцию агглютинации с roi . мологичным ко.:п eKCHUh' 0- и адгезивными антигенами. Титр анти-• тол л pi иммунизации без шмуномодулятора ооставил соответственна 1:6СЮ, 1:800 и 1:200, а от кролика при сочетании с иммуномоду -лятором соответственно 1:32п0, 1:1600 и.1:400. .

Шпериммунная оыворотка, полученная от кур при иммунизации без иммуномодулят^ра культу ригЦэшерихий о ад го этом Г4Г, имела Титр антател п]эотиг. KotMoKoioi ^ антигена 1:1600, против 0-анти-гена.- 1:400 и адгезивного -;I:iûO, а от кур о применением им -Муномодулятора соответственно 1:3200, I:W'6-800 п 1:200.

Таким образом, йммуномодулятор "витамечин" отиЦуЛирув* иммуногенез и может бить использован в процессе получения гиперим -мунных сывороток.

л РВтшЙАЦИй ПР0ИЗШСТВ7 .

Г. Рёакцию. агглютинации о применением коммерчеоких противоадге-эйвных сывороток можно успешно попользовать при Диагностике колибактериоза у кур как экспресс-метод.

2. Для приготовления вакцин против колибактериоза Кур рекомен -Дуем пршенять культуры эверихий с учетом не только 0-серо-'

групповой принадлежности, но' и наличия адгезивных антигенов.

3. Учитывая иммуногенные свойства адгезивных антигенЬв эиериХий и опыты по созданию коливакцин только из очищенных адгезивных

пили, считаем целесообразным расширить исследования в этом на -правлении по создании поливалентных вакцин из адгезивных пили, очищенных от клеток. .