Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Методы индикации энтеропатогенных (энтеротоксигенных) эшерихий в фекальных пробах телят

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ ПО

ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕШЯ ИМЕНИ К.И.СКРЯБИНА

¡¿а правах рукописи

ЁЕДОЕВА Залихан Михайловна

$Д{ 619:579.842.11:616-078

МЕТОДЫ ИВДИКАВДИ ЭНТЕРЙМТОГЕННЫХ (ЭНТЕРОТОКСИГЕННШ) ЭШЕРИХИЙ В ФЕКАЛЬЬйкХ ПРОБАХ ТЕЛЯТ

Тб.ОО^ОЗ - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 1990

Работа выполнена в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К.И.Скрябина

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук профессор

Подкопаев В.М.

Стадиальные оппоненты: доктор ветеринарных наук профессор

Конопаткин А.А. кандидат биологических наук Тугаринов О.А.

Ведущая организация: Ленинградский ветеринарный институт.

Защита состоится * Щ* <-¿¿¿3"1990 г. в ча-

сов на заседании сп^циалыйто'совета К.120.36.05 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им .К .{{.Скрябина (I09V72, Москва, ул.Академика Скрябина, 23; тел .377-93-83)

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ИВА.

Автореферат разослан

1990 года.

Ученый секретарь специализированного совета

Федосеева Т.Н.

СБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Июньский (1967 г.) Пленум ЦК КПСС определил в качестве одной кз первостепенных задач обеспечение нашего народа продовольствием. Для повышения производства i-jrco- молочной продукции, яиц и молочного кира необходима дальнейшая ускоренная интенсификация животноводстве, йа промышленной основ«.

В СССР и других странах мира значительная часть потерь в животноводстве обусловлена наличием инфекционных заболеваний, особенно среди молодняка сельскохозяйственных животных.

Колибактериоэ - наиболее часто встречающееся инфекционное заболевание молодняка, оно сдерживает рост поголовья скота, наносит существенный экономический ущерб (ЦИОН P.A.,1963; Подкопав в В.М., Шишков В.П., 1967; Полякова O.A. с соавт.,1973; Светоч Г.В., Шмидтов Н.В., 1977; Сидоров U.A. с соавт., 19ÖC и др.; Outetf^; iSni\?i<bnjt>.j£'tn- 1977; ¿еАнг. t/1979 и др.)

В последнее вреия большое вникание уделяют изучении кишечной формы колибалстериоза, вызываемой энтеротоксигенными эшер/.~ хияни, которые продуцирупг термостабильный и термолабильныЛ эч-теротоксин С .С. ,1965 ; ф '.(-& 1971; ¿м* ¿,1975).

Энтеротоксииы прикрепляются к рецепторам энтероцитов и вызывают нарушение калкево-катриевого насоса, что приводит к диарее.

По данным ряда авторов (Авдеева Т.А., 1978; Хазенсон Л.Е., Чайка HiA Д987;Ъи^м^ЧЬ} /йй ^^.1977; G?* -ге/зсс^же. 1978; Bibnj % S-. et.aJ I978;I9V9, ¿'¿oactvn. ^.£.,1978), одних энтеротоксинов эшерихиЯ недостаточно, чтобы вызывать диарею с летальный исходом.Для этого необходим фактор, который обеспечивает прикрепление эшерихиЯ к слизистой оболочке тонкого кишечника. Км являйся адгезивные антигены.

В настоящее время известно несколько типов адгезивных антигенов: К 99+, К 88, 987Р, 41, AI, А2, 71 и т.д.

Наиболее часто от гелят выделяют эшерихии с адгезивным антигеном К 99+.Работами ряда авторов доказана прямая зависимость между-наличием.адгезивного антигена у эшерихий и продукцией термостабильного эктеротоксина (Эароза В.Г., 1984; Полякова O.A. с. ' соавт* i986 чэ-, -¿лск/ога^ s 5>. /? гл >*■ ¿¡г

.v%~/<t«7ii XV. и*, с • ,<г .

Учитывая важную роль (¡акторов вирулентности К-Ц-антигенов в патогенезе колибактериоза и то обстоятельство, что существующие бактериологический-метод лабораторной диагностики кишечной формы колибактериоза является трудоемким и длительным, разработка ус-

t

коренных методов индикации энтеротоксигенных эиерихий является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена разработке ускоренных методов определения экгеропатогенных эшерихий непосредственно в фекальных пробах, полученных от новорожденных телят с признаками диареи, и антител в сыворотках крови у тех se животных ..Для достижения указанной цели необходимо было решить следующее:

1. Испытать возможность применения О-коли сывороток для индикации живых культур эшерихий в непрямом варианте РИФ.

2. Получить антиадгеэйвнув сыворотку к антигену К 99+ эшерихий и испытать ее активность и специфичность.

3. С помощью антиецгезивной сыворотки идентифицировать эн-теропатогенные эшерихии с адгезивным антигеном К 99+ в фекальных пробах телят и антител к ним в сыворотках крови.

Провести в сравнительном аспекте бактериологическое исследование тех же проб фекалий.

Научная новизна. Проведенными исследованиями была установлена возможность индикации живых культур патогенных эшерихий в непрямом варианте РИФ. Исследованием при помощи реакции агглютинации, в реакции непрямой гемагглютинации, в непрямом варианте Pitó, РДП и встречном иммуноэлектрофорезе дана сравнительная характеристика по выделению энтеропатогенных эшерихий с адгезивном ' антигеном К 99+ в фекальных пробах. Установлена связь с наличием адгезивного антигена в фекальных пробах и антител в сыворотках ¡ крови больных телят. ■

Практическая значимость. Разработанные методики по индике- I ции живых культур эшерихий в непрямом варианте РИФ и выделение онтеротоксигенкых эшерихий с адгезивным антигеном К 99+ в фекальных пробах больных телят с помощью полученной антиадгезивной сыворотки*} позволят сократить сроки постановки прижизненного диагноза на колибактериоэ и тем самым предотвратить их массовый падеж.Научные данные работы используют в учебном процессе - в лекциях и на практических занятиях по теме:"Семейство кишечных инфекций .¿¡оэбудитель колибактериоза" в Московской ветеринарной академии и Горском сельскохозяйственном институте на ветеринарном ¿¡«культете. На основании полученных результатов исследования были разработаны "Методические рекомендации по индикации эшерихий v адгезилннм антигеном К 99* в фекальных пробах телят, больных кикечной Формой колибактериоза" и одобрена секцией "Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней животных" Охрасле-

вого научного комплекса по ветеринарии БАСНЮ (протокол $2 от 20 марта 1989).

Апробация работы. Материалы диссертации додожены и одобрено на научных конференциях ветеринарного факультета. Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии иа.К.И.Скрябина (1984, 1985), на заседаниях-кафедры микробиологии (1983, 1984, 1987), на 8-й конференции молодых ученых (1984), а так же на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, вирусологии и биотехнологии, эпизоотологии и лаборатория болезней молодняка сельскохозяйственных зшвотных ¡ША (1989).

Публикация. По теме диссертации опубликовано j статьи, в которых изложены основные положения выполненной работы.

Обгем и структура работы. Диссертация излогена на Об страницах машинописного текста к включает разделы: введение, обзор литературы, соаственкые исследования, обсуждение получению: результатов, выводы, практические предложения и приложения*а

" Работа содержит 16 хабякц, 3 фото гра£ wi .Б и Сл и о гр и ч еtu i й список включает <¡53 источника: аэ них ¿00 советских и ¿53 работ зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССВДОШШИЯ.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ.

Представленная работа является фрагментом теш» 4.03, п/атам * .037.01. по разработке ишунохкыических методов диагностики энтеритов, вызываемых экзотоксинами эшерихий.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской лъхчри-наряой академии им.К.И.Скрябина и в двух хозяйствах Московская области: в молочном комплексе "Щапово" Подольского района к опытном хозяйстве "Леоновское" Воскресенского района.

Для определения возможности индикации живых культур а иеиря-иом варианте РИФ были использованы 5 музейных штаммов К 29, К 30, Ä К 34, К 4k, полученных в НЕЙ вакцин и сывороток нк.а.й.Кеч-никова,а также втамм-продуцент адгезивного аитигена К 99* (0Ю1:К 99+ :Н), любезно предоставленный кандидатом биологических наук Тугариновкм O.A. (ВГНКИ) .В контрольных, исследованиях были . * использованы 5 культур с . г/'серогрупп: 0138, (ЮЗ.СНА!,. 0101, К 99*, выращенные при 18°С ( при такой температуре не продуцирует. адгезивный антиген), штаммы - //«у/, atmas, Морфологические, тиккториальные, кульгуралыше, ферментативные .свойства вше перечисленных культур определяли на питательных средах ДНА, ШБ, Зндо, Плосккрева, Гисоа с различными /гдевожаки ^Коз ера, Самой», Хза&йЛтжлтхше свойсгва а эмъпхяЗ.

изучали по методу Кербера ¡.S - формы эаерихий отбирали по методике Хоменко Н.А.Анхигенную структуру изучали в Ра и в непрямом варианте РИФ о помощьв коммерческих ü-коли сывороток, Имму-ксадсорОцию Ü-коли сывороток проводили по методу Юдиной И.С. '(¿öö^) в несколько приемов до тех пор,пока не прекращалась перекрестная реакция .с гетерологичными штаммами эшерихий.Наличие "фактора колонизации" у штампа-продуцента 010i:K 99* :Н определяли в реакции гемагглюхинации с эритроцитами барана в присутствии Д-ианнозв. Для повышенного накопления адгезивного антигена птамм-продуценг культивировали на 'специальной среде "минка" (минимальная казаминовая среда), усиливающей образование пили-а.чти-геиа.

Антиадгезивнуи сыворотку получали путем гипериимунизации кроликов породы шиншила живой массой 2^5-3,0 кг.Кшукизацио проводили по схеме Поляковой O.A., Евглевсхой Н.И., Соколовой. H.A. и др,(х98б). Вначале вводили формалинизираваннув культуру, а затем - кивую культуру с интервалами 3 дня.

Контролем служила сыворотка неиммунизированного кролика. Для получения моноспецифической сыворотки проводили шшуноад-сорбцию культурой, не содержащей адгезивного антигена. Штакм-адсорСект выращивали на агаре Хоттингера в течение I8-24 ч при

Активность антиадгеэивной сыворотки изучали в РА, в РДЛ, во встречном иммуноэлектрофореэе (Х.Фримель,1979), РИГА и РИФ непрямом варианте ..Специфичность сыворотки определяли во встречном нммуноэлектрофорезе в непрямом варианте PIй и в РНГА.Гомологичной культурой являлся штамм-продуцент ОЮХ:К 99+:Н, а в качестве гетерологичных культур применяли следующих се-рогрупп: 0138, 0139, 0141, ОШ, К 99+, выращенный при 18°С, штаммы .au<(vs, fy/AitC/vti«wt faf- enlett'6 t/^^S Аля постановки РНГА использовали эритроциты барана, которые в виде 5я'-ной взвеси хранили в течение б дней при 4°С.

Ставили РНГА в двух вариантах.Для обнаружения антигена ак~ роалиниэированиые эритроциты сенсибилизировали гаша-глоОулино-. вой Фракцией антиадгезивной сыворотки, которую выделяли водно-ыеханоловкм методом .При определении антител в сыворотках крови Сольных телят эритроциты сенсибилизировали К 99+ антигеном, полученным по .методу Каральник Б.В.(196б) .В непрямом варианте РИФ мазки фиксировали над пламенем к в метиловом спирте.

Для обнаружения энтерохокекгенных эшерихий с адгезивным антигеном в фекалиях больных телят с признаками диареи, исследовали пробы по 150-200 ил после центрифугирования их при

бвОО-вООО об/мин.В реакции использовали супернатанты фекальных проб.Сыворотки крови от больных телят инакгивировали при 5б°С в течение 30 мин и исследовали в разведениях I:ÍO до 1:1280.

' Параллельно проводили бактериологическое исследовании тех же проб фекалий, которые разводили от Ю1 до I06 степенях .Из каждой пробы делали посевы методам Дригая^сксго на агаре Ундо. У всех изолированных культур определяли Шлчяе адгезивного антигена К У9*. Определяли корреляцию между наличием адгезивного антигена К 99+ и продукцией термостабильного энтеротоксина по методу Роыаненковой Н.И. и др.(1980) на ыыыатах-сосунках.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение морфологических, тинкториельяых, культуральных ферментативных и биологических свойств у культур эшерихкй Известно, что в процессе хранения культуры ¿"й могут переходить в, В. "-форму, поэтому J7 -формы отбирали но методу Хоменко H.A.(197lJ[. В результате изучения морфологических, куль-туральных, тинкториальных, ферментативных свойств било установлено, что культуры i. сов,' К 29, К 30, К 34, К 40, К 44, rraiw-продуцент 0Ю1:К 99+:Н и эшеркхии серогрупп 008, 0141 и OÍOI хорошо окрашивались всеми анилиновыми красителями и по. Грану -. отрицательно. На МПБ образовывали обильный осадок к равномерное помутнение, На МНА слабовыпуклые, полупрозрачные колонии сероватого цвета с ровными краями среднего размера, которые на среде Эндо приобретали красный цвет с Характерным металлическим блзско*

Все культуры ферментировали глюкозу, лактозу, ман-

ниг, дульцит и. сахарозу до кислоты и газа.Не усваивали мочлвину, продуцировали индол, не образовывали сероводород и не разжмаля желатину.

Культуры исследуемых зшерихий были патогенными для белых беспородных мышея. В результате исследований установлено, что данные культуры обладали типичными свойствами эшерихиЛ.

На следующем этапе исследований определяли принадлежность этих культур к.О-группам. В РА исследуемые культуры с 0-к.оли сыворотками 08 и 09 вступали после автохлавирования. Это позволило считать, что они содержат термостабильный А-антигеи (кан-'сульный).-

_ Параллельно живые культуры этих серогрупп исследовали с О-коли сыворотками в непрямом варианте РИФ. Результаты представлены в" таблице йХ., -

Таблица ¿I

Интенсивность свечения эшерихий, обработанных К - и-О сыворотками в непрямом варианте РИФ

К-сыворотки (разведение 1:80) "[^"ßO?0™ if 29 *}к~ 30 "]к~34 ] К 40~ ¡~К~44 ~ ~ |~08 ~ ; 0У~ "

Сыворотки

Кульщзы___

ií 29 _ +

К 30 _+__ _ +

К 34 - _+•_ _ +

К 40 - - ' - + _ +

К 44 - - ' - + +

Из таблкцы И видно, что живые культуры как с К-сывороткамм в разведении 1:В0, так и с О-сыворотхами в том же разведении да-ейлк специфическое свечение. Однако следует отметить, что свечение наблюдали .и в мазках.из контрольных серогрупп 0138, 0x39, 0141, 0Ю1, Исходя из полученных данных можно предположить, что применение О-колл сывороток в непрямом варианте РИФ для индикации яибых культур эшерихий будет оправдано при условии,.если ис-польвовать строго моноспецифические сыворотки. С этой целью были отобраны О-коли сыворотки к наиболее часто выделяемым от телят серогруппам 015 , 018 , 020 , 026 , 0П&.Сыворотки к этим серогрул-п&м проверили в пробирочной РА-с 30 штаммами эшерихий, которые считаются патогенными для молодняка сельскохозяйственных тавотных* О-коли сыворотки агглютинировали как гомологичные, так и гетеро-- логичные серогруппы эшерихий.Так, сыворотка 015 с гомологичный .итаммом проявляла активность с интенсивностью в 4 креста, с ге-терологичкьси штаммом 0101 в 3 креста, серогруппой OÍI7 - в 2 креста.

Сыворотка 018 проявляла активность в 4 креста с гомологичным О-антигеноы и серогруппами 026 и 0147 в 3 креста, 04, 033, .0Ю1 к 0138 образовывали агглютинат в 2 креста, слабо агглвтинировала здерихии серогруппы 0Ü7. Сыворотка 020 с гомологичным штаммом . проявляла активность в 4 креста, на 3 кроста агглютинировала эяерихии серогрупп 015 и 0115, с интенсивностью 2 креста - серогруппы 026, 0142 и 0147. Сыворотка 026 имела перекрестные реысцкл с серогруппами 015, 0x47 в 3 креста, 02, 035,0il7, 0135 -в 2 креста, слабую активность с 0П5 и хорошо выраженную реакции с гомологично!; культурой. Сыворотка 0ÍI9 вступала в реакцию агглютинации с гетерелогичаыми серогруппами Ol, 018 и'0П7

(интенсивностью в 2 креста).Таким образом, из их числа были подобраны штамм-адсорбенты.После трех приемов ишуноадсорбции получили мокоспецифические сыворотки с активностью в РИФ 1:40, которые позволили определять патогенные эшерихии в непряксм варианте РИФ.

Получение антиадгезивной сыворотки к антигену

К 99*, изучение ее активности и специфичности

Диагностическую сыворотку получили путем гиперимиуниэации кроликов .Иммунизировали здоровых кроликов эталонный штаммом (0Ю1:К ЭЭ"1":!!) .Штамм-продуцент культивировали на жидкой и плотной среде "минка".

Фактор колонизации определяли в РГА с эритроцитами бараял в,присутствии Д-манноэн, через 3 часа в опытных лунках наблюдали образование агглютината в виде перевернутого зонтика с просветленной жидкость».Иммунизации проводили в два цикла, вначале вводили подкожно формалкнизкрованную культуру 0,3; 0,5 мл, затем внутривенно живую культуру в дозах 0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл с интервалами 3 дня- -

Через б дней после последней инъекции получали кровь, которую отстаивали, .сыворотку сливали и центрифугировали. Длл получения моноспецифической сыворотки, проводили иммуноадсорбци» гомологичной культурой, не' содержащей адгезивного антигена.

Активность и специфичность «нтиадгезивной сыворотки проверяли в РА, встречном иммуноэлектрофорезе, РДП, РИГА и непрямом варианте РКФ. В РА устанавливали активность титрованием с гомологичным тташои. Сыворотка была активна в титре 1:1280. встречном иммуноэлектрофорезе сыворотку разводили 1:2; 1:4, 1:У, 1:16, 1:32, х:64. Сыворотка в разведении 1:64 с антигенов, оора-зоаывала преципитат в виде одной четкой полосы. Для контроля на специфичность исследовали супернатанты культур эшерихий 0138, 0139,0101, 141 и К 99+, выращенных при 18°С. При этом во всех случаях результаты были отрицательными, не было обнаружено образования преципитата. В РДП антиадгезивную сыворотку использовали в тех же разведениях. При получении антигена куль-, туру выращивали методом шуттелирования в колбе с жидкой пита-'тельной средой "минка" в течении 24 часов при 37°С. Затем центрифугировали и к осадку добавляли 0,5 мл '¿'Л мочевины на фосфатном буфере, прогревали при 60-65° в течение 30 мин, центрифугировали при тех-же режимах, что и в первом случае; надоса-дочную жидкость использовали в качестве антигена. Аятнадгеэив-ная сыворотка в титре 1:64 к концу первых суток образовывала с

антигеном хорошо выраженный преципитат.Сыворотка обладала строгой специфичностью, так как с супернатантами гетерологичных культур и с культурой эшерихий К 99*, выращенной »три 18°С, не давала положительной РДП.

При определении активности анткадгеэивной сыворотки в РИГА урптроциты сенсибилизировали гаша-глобудиновой фракцией. В РИГА было установлено, что уровень иммукотел достигал титра 1:640.

В непрямом варианте Р1й мазки готовили из гомологичной куль туры.Ыазки фиксировали метиловым спиртомтнад пламенем.

На первом зтапе обрабатывали мазки антиадгезивной сывороткг л 93* в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:10.Результаты представлены п таблице

Таблица 2

Сопоставление интенсивности свечения мазков, зафиксированных двумя методами и обработанных непрямым вариантом РИФ антиадгеэквной сывороткой К 99*

Интенсивность ¡'Всего !__Оценка_в_крестах ______

свечения Гиесле-! ~ 1 - -у - ~ Метод !• довано! -и- ! • ^ фиксации_______! мазковJ_____\______!____;___

Метиловый спирт 30 - I 29

Фиксация над

пламенем 30 - . 29 г

Контроль культур-Яар- ■mfyli'e»'*"'0

Метиловый спирт 5 - .

Фиксация над

пламенем 5 -

На данных таблицы видно, что антиадгезивная сыворотка в титре 1:10 давала специфическое свечение в 4 креста, причем результаты были аналогичными в мазках, фиксированных над пламенем и метиловый спкртом. Анхиадгезивная сыворотка в непрямом варианте РИФ обладала высокой специфичностью, так как клетки в мазках »./ ^«v/ '/v^ ¿v/. Win/

¿16 ¡'.пели специфического свечения, на черном фоне они вывлядели н гиде тусклых теней.

исследования фекальных проб телят на обнаружение auiepi xiu'i с адгезивный антигеном К 99+ . ¿еквлыше пробы отбирали or телят х-Ю-дневного возраста с «ркзкал&ш: е:; .Ьыло отобрано ВО проб фекалий, в том числе с5

ог (Зольных и 15 проб от здоровых телят. От тех же телят параллельно брали пробы крови.Лекальные пробы на обнаружение эшерихий с адгезивным антигеном К 99* исследовали в РКГА, в непрямом варианте РК$, во встречном иммуноэлектрофорезе и в РДЛ.

3 РИГА эритроциты сенсибилизировали гамма-глобулиновой фракцией антиадгезивной сыворотки. В качестве антигена применяли су-пернаханш фекальных проб больных телят, полученные путем центрифугирования при 6 тыс.об/мин в течение 40 мин. При исследовании 65 проб фекалий, в 29 (44,6*.) пробах были получены положительные результаты, т.е. установлено образование специфического геиая '.тлютината.Параллельно от этих же телят исследсвали в РНГл. сыворотки крови: эритроциты сенсибилизировали предварительно оттитрованным в реакции гемагглютинации антигеном (етшш-продуценг 0101:К 99+:К).

Сыворотки инактивкровали при 56°С в течение 30 минут, разводили нормальной кроличьей сывороткой в последующих разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:30, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280 (табл.3).

Таблица 3.

Результаты РИГА'сывороток крови телят для обнаружения антител к антигену К 99+

Кол-во ¡Возраст! _Разве^ение исследуемых сывороток _ _ !

пробесывВ: ЦнГ\ Ио ¡Хйо]Ло |2:5о]хТ160>:32о]х7мо"|1:12Бо |

30 3-5 30х 30 2? 14 6 - - -35 5-10 35 35 35 35 27 19 18 5 -Итого 65

х - количество животных

Из результатов таблицы видно, что при исследовании 30 проб сывороток, полученных от телят 3-5-дневного возраста, титры антител в разведении 1:10, 1:20 были обнаружены у всех ЗС телят, в разведении 1:40 - у 27 телят и 1:160 - у б телят.Зо II группе ИГ) 35 телят 5-Ю-дневного возраста происходило нарастание титра антител. В разведении 1:Ь0 у всех телят были обнаружены иммуно-тела, в разведении 1:640 - у 18 телят и 1:1280 - у 5.Таким образом , у хелят 5-Ю-дневного аоораста нами было отмечено нарастание титра антител, установленное с помочь» РНГА.

В непрямом варианте РК-г мазки готовили из нативиого чате-¡.пала при положительной реакции, из этих проб проводили последовательные разведения Ю1, 10*", 10^, 1о\ из каждого разведения готовили мазки .и ю ^егтямс\<у варианту РК4>.

При исследовании 65 проб фекалий от больных телят в 30 пробах было обнсрузгено специфическое свечение эаерцш!, сывороткой против адгезивного антигена К^99+ свечение установлено в мазках из разведений 10^", Ю^, Ю"*. В мазках наблюдали специфическое свечение в 3-4 креста. Отрицательные результаты были получены в фекальных пробах от 35 больных и 15 здоровых телят.

Постановка-реакции встречного иммуноэлектро-•фореза (И34) и диффузионной преципитации (РДП)

В КЭ4> исследовали супернатанты из фекальных масс от больно* телят. Учет реакции проводили через Зч.Зти же супернатанты были исследованы в РДП по Оухтерлони.Учет реакции проводили в течение 3 дней, к концу первых и в начале вторых суток обычно появлялись четкие линии преципитации.Контрольные исследования прово дили с нормальней кроличьей сывороткой и фекальными пробами, полученными от здоровых телят.Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблице. 4.

Результаты исследования проб фекалий на наличие адти$ного антигена К 99+ во встречном иммуноэлекгрофорезе и РЛП

¡~к-л-в- - - - Ез-н1х:

Чяинриовпн^ ппп« ¡исследо- ¡реагировали ;

наименование проб ! ванных _ -положительно,'! в №

\ проб I число I

' Зстрёчны! йммуноэлёктрофорёз

ФекалиЕ от больных телят 65 19 29,22

ёекалий здоровых телят ¿5 -

Положительный контроль с супер-

натантами гест-штаммом 010х:К 99 :Л 4 4 100

Кммуноэлектрофорез с контрольной сывороткой Фекалий от больных телят 65

Фекалий от здоровых телят 15 -

Контроль с супернатантом тест-

штамма выраженного при 18 С 4 - -

РДП с антиадгезивной сыв.ороткой

Фекалий от больных телят .65 15 23,.О

Фекалий от здоровых телят ¿5 -

Положительный контроль с . '

гест-штаммом (37°с) 4 4

I ! 2 ! 3

РДП с контрольной сывороткой

Фекалий от больных телят 65 - - ■

Фекалий от здоровых телят 15 - '

Контроль с супернатактом .

тест-штамма, выраженного при 18 С 4

Из таблицы видно, что при исследовании 65 проб фекалий' наибольший процент 29,22 было .выделено в реакции ИЭФ, что почти вдвое больше, чей в РДП; это говорит о большей чувствительности реакции ИЭФ.

Определение эшерихий в фекальных пробах с поыоцьэ непрямого'варианта РИ4

Из суперкатантов фекальных проб готовили мазки и на первой ступени обрабатывали адсорбированными О-коли сыворотками: 0X8, 015 , 020 , 026 , 0И9 в разведении 1:10, на второй ступени использовали антикроличью люминесцкрующую сыворотку в рабочем разведении .В 65 исследованных пробах фекалий больных телят в 8 пробах (12,3&) было обнаружено специфическое свечение.При исследо- . вании 30 изолированных культур с теми же О-коли сыворотками типи-ровались'8 культур, из них 5 были отнесены к серогрупие 0119, 2 - к с.ерогруппе 026 и I культура к 020. Таким образом, из 78 культур от больных телят только 8 (1,2£) были серотипированы по О-антигену. . .

Бактериологическое исследование фекальных проб телят, больных кишечной формой колибакгериоза

С целью подтверждения результатов исследований, полученных в ?НГА, непрямом варианте.РИФ, в реакции встречного шшуноэлекв-рофореза и РДП нами было проведено полное бактериологическое исследование тех se фекальных проб, ^азво^или 80 проб фекалий, от здоровых телят последовательно Ю", 10^, Ю"*, 1о\ Ю5, Юь, Ю7, Ю® и высевали на среду Эндо. После 24 часов роста отбирали* типичные колонии. Енло выделено 78 культур .При изучении морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и Отологических свойств 30 культур (38было отнесены к энтеро-патогенным. Эти культуры имели адгезивный антиген К 99*, обладали гемолитическими свойствами, продуцировали^ - гемолизин и были патогенны для белых ыьяаей. Выделенные от здороькх телят 25 культур (32,05«) были отнесены к £ <у/ехэгЛ/л ¿a- . 23

:■. Phire

(2;.',49$) - к ¿'. ¿¿aize Они не имели адгезивного антигена, не обладали гемолитическими свойствами и были не патогенны для белых кыпеИ. При «¡следовании <-<?Л , изолированных из фекальных проб в непрямом варианте РКФ с антиадгезивной сывороткой, все 30 культур давали специфическое свечение, в РА только 28 культур образовывали агглютинат с той же сывороткой (95,8$ совпадающих результатов).

О целю подтверждения корреляции адгезивного антигена и ТС-энтеротоксина у изолированных из фекальных проб зшерихий были отобраны 5 культур, которые культивировали на среде Филькен-втейна ГС-энтеротоксин, присутствие которого определяли анальной пробой на ми:а£-сосунках по методике Романенковой Н.И. в соавт. (1У80)(1абл.5)

Таблица 5

Биологическая активность супернатантов культур, выделенных из фекальных п^об больных телят на мышах-сосунках

Исследуемые

супевнатанты

культур

'Количество

'.мыие.т-

'сосунков

! Количество ! павиих

! Средний хоэФФпциеьл ! дилахации х.;г;и "К"

16 19 21 гъ

25

Контроль

0,102+ 0,002 0,111+ 0,001 0,108+ 0,002 0,122 + 0,004 0,108+ 0,005 0,065 + 0,012

Из данных таблицы видно, что коэффициент дилатации "К" составляет значение больше, чем 0,09, то есть результаты сио-пробы были положительными. В контроле с питательной средой результаты были отрицательными.

Для подтверждения полученных результатов 30 культур эшерихий, давших специфическое свечение с антиддгезквноК сгвс-рот-кой и непрямом варианте, также были исследованы в РГА в присутствии Д-танчозы; РГА была положительна со всеми исследуемыми культурами. '

ВЫВОДЫ

1. Разработано применение О-коли сывороток в титре (1:40) при индикации культур зиерихий в непрямом варианте РК<>, что значительно позволяет сократить сроки серологической типизации.

2. Получена высокоактивная сыворотка к адгезивному антиге- • ну К 99+, которая позволила выявлять энтеротоксигенные эшерихии

с помоцьв РНГА и непрямом варианте РИФ при исследовании фекалий телят, больных кишечной формой колибактериоза.

3. Фиксация мазков из культур эшерихий с адгезивным антигеном К 99+ для непрямого варианта как метанолом, так и флам-бнрованием над пламенем обеспечивала прикрепление микробных клеток и их четкое свечение.

• Непрямой вариант РИФ является вксокоспецифичным и чувствительна методом, который позволяет ускорить лабораторную диагностику кишечной формы колибактериоза до I дня вместо 6-7 суток по общепринятому методу.

5. При исследовании сывороток крови больных телят 10-дневного возраста в РЯГА для определения антител к адгезивному антигену К 99* были выявлены антитела в больших титрах ( 1:640,

I:1280).Уровень антител 1:640 следует считать диагностическим.

6. Установлена ЮО^-ная взаимосвязь между наличием адгезив-ности и энтеротоксигенностьи культур эшерихий,изол1фованных из фекалий проб телят, больных кииечной формой колибактериоза.

7. При сравнительном изучении иммунохимических и бактериологических методов исследований фекалий больных телят результаты были идентичными 95,8$ случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основании полученных результатов были составлены "Методические рекомендации по индикации эшерихий с адгезивным антигеном К 99+ в фекальных пробах телят, больных кишечной формой колибактериоза", которые 3.03.89г. одобрены и рекомендованы для опубликования секцией"Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней животных" Отраслевого научного комплекса по ветеринарии ЗАСХНИЛ.

2. Полученные результаты рекомендуем использовать в учебном процессе на ветеринарных факультетах при изучении курса микробиологии по теме:"Семейство кииечннх инфекций.Возбудитель котибактзриоза".

список

реЛог, опубликованных по теме диссертации

1. Бедов на 3.11. Сравнительные исследования патогенных зшерихид

а РА к РИФ непрямом варианте .Ветеринария: ?2С—1934.1*»—С .64/ЬЬ.

2. Бедоева З.Ц. Получение адсорбированных типовых О-коли сывороток для установления эаерихий в непрямом варианте РИФ. Теоретические основы профилактики, инфекционных и инвазионных болезней тавотныхЗетерикария: РК.-1986-*2 .С,50-52.

- 3. Бедоева З.М.Идентификация знтеротоксигешшх эиерихиа с адгезивным антигеном К 99*в РИГА н непрямом варианте РИЗ. Ветеринария: И-1990.*г.С.28.

Л - 11822 Подписав» в печать 27.03.©0г. Формат 60х84Д6 Згааз 545 Тирся 100

Косхвг. ТкЕэграфк: ЖСХШ1Л