Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Лабораторная модель для оценки иммуногенности вакцин против ринопневмонии лошадей

На правах рукописи

Алексеенкова Светлана Валерьевна

ЛАБОРАТОРНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИН ПРОТИВ РИНОПНЕВМОНИИ ЛОШАДЕЙ

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией, иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003058118

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики респираторных вирусных болезней лошадей и крупного рогатого скота отдела вирусологии ГНУ «Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (ВИЭВ) Российской Академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель - заведующий отделом вирусологии ВИЭВ, доктор ветеринарных наук, Заслуженный деятель науки РФ, лауреат Премии Совета Министров СССР, лауреат премии Республики Саха (Якутия), профессор Константин Павлович Юров

Официальные оппоненты

1 Белоусова Рапса Васнльевна - доктор ветеринарных наук, профессор (ФГОУ ВПо «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина»)

2 Василий Николаевич Лазарев - кандидат биологических наук (ФГУ «Научно -исследовательский институт физико - химической медицины» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию)

Ведущее учреждение - ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ВГНКИ)

Защита состой гея« 16 »мая 2007 г в 14часов

на заседании диссертационного совета Д 006 033 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при ГНУ Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко (ВИЭВ) Российской Академии сельскохозяйственных наук по адресу 109428, Москва, Рязанский проспект д24 кори 1,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно -исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (ВИЭВ)

ВИЭВ

Автореферат разослан « » 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, про(

Н П Овдиенко

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Вирус герпеса лошадей 1 типа - возбудитель широко распространенной инфекции лошадей Основными клиническими формами заболевания, вызываемого ВГЛ-1, являются аборты, миелоэнцефалопатия, респираторный синдром, кератоконъюнктивиты

В последние годы герпесвирусная миелоэнцефалопатия в США и странах Европы получила широкое распространение, несмотря на масштабную программу вакцинопрофилактики болезни Неэффективность специфической профилактики неврологической формы ВГЛ-1 приводит к тому, что в период энзоотических вспышек заболеваемость лошадей достигает 90 %, смертность может составить до 50%

При этом нет единого мнения по вопросу патогенеза миелоэнцефалопатии ВГЛ-1 инфекции Предполагают, что сипмтомокомплекс болезни формируется в результате воспаления и тромбоза мелких кровеносных сосудов под влиянием образующихся цитотоксических иммунных комплексов, что приводит к гипоксической дегенерации клеток головного мозга Результаты иммуногистохимических исследований свидетельствуют о локализации вирусного антигена главным образом в клетках эндотелия артериол и капилляров (Edmgton at al, 1986), однако, при этом удалось подтвердить гибридизацией m situ и иммуногистохимическими методами инфекцию нейронов и астроцитов (Schmidt at al, 1994) Ряд авторов полагают, что вакцинация способна усилить формирование цитотоксических иммунных комплексов и повысить шанс проявления миелоэнцефалопатии в результате нарушения функции кровеносных сосудов головного мозга (Allen GP, Kydd JH, Slater JD, et al ,2002)

Другое мнение заключается в том, что в популяции лошадей появляются новые доминантные штаммы ВГЛ-1 с мутацией генов, кодирующих вирусную ДНК - полимеразу, ранее не регистрировавшиеся Новые эпизоотические штаммы ВГЛ-1 характеризуются также чрезвычайно важным свойством - способностью к преодолению видового барьера (известны случаи энцефалитов с летальным исходом у газелей, антилоп, зебр, жирафов) и высокой вирулентностью для естественновосприимчивых животных (Nugent et al, 2006) Как правило, интродукция ВГЛ-1 в гетерологнчную популяцию животных сопровождается летальностью до 100%

Представленные данные свидетельствуют об актуальности исследований, направленных на совершенствование средств специфической профилактики инфекции Учитывая экономический фактор, естественно восприимчивые животные (лошади) в экспериментальной работе могут быть испочьзованы в весьма ограниченном количестве Эффективное решение может быть достигнуто путем моделирования инфекционного

процесса на лабораторных животных для последующей работы по изучению напряженности вакцинального иммунитета

Проведённые ранее исследования на сирийских хомяках (Е Doll et al, 1953) показали, что ВГЛ-1 не обладает для хомяков (в отличие от лошадей) эндотелиотропными свойствами Интрацеребральная инокуляция адаптированного штамма КуД ВГЛ-1 хомякам вызывала энцефалит, характеризуемый репликацией вируса в нейронах и глиальных клетках По мнению большинства исследователей такая лабораторная модель имеет ограничение использования при выяснении ряда вопросов патогенеза и иммуногенеза инфекции ВГЛ-1

Рядом pa6oT(AR Avvan et al, 1990, A Kukreja et al, 1998, R Hasebe et al, 2002, A R J Frampton et al, 2004, N Virmani et al , 2005) было показано, что при экспериментальном заражении ВГЛ - 1 мышей линии BALB/c удается воспроизвести инфекционный процесс достаточно приближенный к естественному заболеванию лошадей

Моделирование на лабораторных животных иммунной реакции на различные препапаты герпесвируса лошадей с целью изучения особенностей иммунного ответа, обусловленного различной природой использованных вирусных препаратов, представляет значительный интерес Успешное решение ряда аспектов этой задачи позволяет существенно продвинуться в познании иммуногенеза при герпесвирусной инфекции лошадей, что обеспечивает перспективу создания более эффективных и безопасных средств специфической профилактики болезни

Цель работы - разработать лабораторную модель ВГЛ - 1 инфекции и изучить особенности формирования гуморальных реакций и устойчивости к ВГЛ-1 на введение различных вирусных антигенов Задачи исследования

• определтъ в ИФА, РН, РТГА возможность индуцирования гуморального иммунного ответа у мышей на введение инактивированного вируса, аттенуированного вируса и рекомбинантной плазмиды pIYT 1, содержащей в своем составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1,

• провести сравнительный анализ динамики формирования гуморального иммунного ответа у мышей линии BALB/c после введения рекомбинантной конструкции pIYT 1, экспрессирующей гликопротеин D ВГЛ-1, инактивированного ВГЛ-1 и вакцинных штаммов ВГЛ-1 «СВ/69» и «Rhinomune»,

• изучить антигенные свойства вакцинных препаратов при использовании различных схем иммунизации,

• изучить чувствительность мышей к ВГЛ-1 при различных способах заражения,

• провести селекцию вирулентного штамма ВГЛ-1 для последующей работы по изучению напряженности вакцинального иммунитета у мышей,

• изучить напряженность иммунитета у мышей в зависимости от природы антигена, дозы антигена, кратности иммунизации и способа контрольного заражения

Научная новизна исследования

Впервые изучены иммуногенные свойства рекомбинантной плазмиды р1УТ 1, содержащей в своем составе ген, кодирующий гликопротеин О ВГЛ-1, в сравнении с аттенуированным и инактивированным ВГЛ-1 на мышах линии ВАЬВ/с Установлено, что рекомбинантная плазмида р1УТ 1 вызывает образование специфических антител к вирусу в титрах, сопоставимых с реакцией на аттенуированный или инакгивированный ВГЛ-1 Антитела могут быть выявлены в РН, РТГА и ИФА Изучена динамика формирования иммунного ответа в зависимости от природы антигенов

Впервые разработана лабораторная модель неврологической формы ВГЛ-1 инфекции на мышах линии ВАЬВ/с Полученный селекцией штамм «ПП1/1» ВГЛ-1, патогенный для мышей в возрасте до 40 дней, вызывает у них геморрагический энцефалит с летальным исходом до 100% после интраназальной или инграцеребральной инокуляции

Впервые изучены абортогенные свойства типичного эпизоотического штамма «ПП1» ВГЛ-1, циркулирующего на территории РФ, для лабораторных животных Показано, что у беременных мышей линии ВАЬВ/с штамм «ПП1» после подкожной инокуляции вызывает гибель эмбрионов с последующей их резорбцией или рождение нежизнеспособного приплода

Впервые на модели неврологической и абортогенной форм ВГЛ-1 инфекции на мышах линии ВАЬВ/с изучена напряженность иммунного ответа в зависимости от природы антигенов, дозы антигенов, кратности иммунизации и способа контрольного заражения

Обнаружено усиление иммунного ответа при комбинированном введении рекомбинантной плазмиды рГУТ 1 и вакцинного штамма «СВ/69» Практическое значение работы

Проведенные исследования позволяют рекомендовать лабораторные модели неврологической и абортивной форм ВГЛ-1 инфекции для оценки иммуногенности вакцин методом контрольного заражения Полученный в ходе работы штамм нейровирулентный для мышей линии ВАЬВ/с может использоваться для изучения патогенеза ВГЛ-1 и эффективности антивирусной терапии

Разработаны (в соавторстве) «Рекомендации по получению рекомбинантных плазмид, содержащих гены гликопротеинов вируса ринопневмонии лошадей, и их применению с

использованием оптимальных доз для иммунизации восприимчивых лабораторных животных», утвержденные директором ВИЭВ в 2007 г

Разработана (в соавторстве) «Временная инструкция по ретроспективной диагностике ринопневмонии лошадей (выявление специфических антител) иммуноферментным анализом», утверждённая директором ВИЭВ в 2007 г

Материалы диссертации использованы в дополнении, подготовленном Референтной лабораторией МЭБ по ринопневмонии лошадей (эксперт К П Юров) для нового издания «Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines», раздел Equine diseases in list В, глава Equine rhinopneumonitis, Office International des Epizooties Основные положения, выносимые на защиту

- экспериментальные данные, характеризующие иммунный ответ у лабораторных животных - мышей линии BALB/c, на различные иммуногены ВГЛ 1 коммерческие вирусвакцины против ринопневмонии лошадей «СВ/69» и «Rhinomune», инактнвированный вирус и рекомбинантную плазмиду plYT 1, содержащую в своем составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1,

- антигенные свойства препаратов ВГЛ - 1 при использовании различных схем иммунизации,

- селекция вирулентного штамма ВГЛ-1 для последующей работы по изучению напряженности вакцинального иммунитета у мышей,

- рекомендации по контролю иммуногенной активности препаратов против ринопневмонии лошадей в лабораторных условиях

Апробация работы

Материалы работы были представлены на 2-м Московском международном Конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» Секция 2 -Биотехнология и сельское хозяйство (Москва, 2003), на Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (Москва, 2003), на Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005) Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно-производственном-совещании научных сотрудников ГНУ ВИЭВ им Я Р Коваленко (Москва, 2007 г ) Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов введение, обзор литературы, результаты исследования, обсуждение

выводы, практические предложения, список литературы и приложения Список литературы содержит 132 источника Диссертация иллюстрирована 5 таблицами, 18 рисунками 2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2 1 Материалы и методы В работе использовали штаммы ВГЛ-1 из музея отдела вирусологии ВИЭВ -эпизоотический штамм вируса герпеса лошадей 1 типа «ПП1», изолированный в 2000 г от лошадей при вспышке абортов и поражения центральной нервной системы в виде пареза задних конечностей и 2 вакцинных штамма штамм «СВ/69» - производственный вакцинный штамм ВГЛ-1 (получен К П Юровым) и штамм «Rhinomune», выделенный из коммерческой вакцины «Rhinomune» производства фирмы "Pfizer", США)

Рекочбинантная плазмида pIYT 1, содержащая в своем составе ген, кодирующий пшкопротеин D ВГЛ-1, была сконструирована в ходе совместной работы (Ткачев И 10 и др, 2003) сотрудников лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии микроорганизмов ВНИИСХБ и лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики респираторных вирусных болезней крупного рогатого скота и лошадей отдела вирусологии ВИЭВ Наращивание и очистку рекомбинантной плазмиды проводил научный сотрудник отдела вирусологии ВИЭВ И Ю Ткачёв

Для экспериментов in vivo использовали мышей линии BALB/c массой 3 - 25 г, предоставленных нам отделом разведения лабораторных животных ГУ Российский

онкологический центр имени Н Н Блохина РАМН

Для экспериментов in vitro использовали диплоидную культуру клеток почки кролика (RK-13), перевиваемую культуру клеток почки теленка (ПТП) из банка клеточных культур ВИЭВ

Иммунопероксидазные конъюгаты дня постановки иммуноферментного анализа и иммуногистохимического метода были любезно предоставпены ведущим научным сотрудником отдела вирусологии ВИЭВ Юровым Г К

Антиген для постановки РТГА был любезно предоставлен ведущим научным сотрудником отдела вирусологии ВИЭВ Ярных Е В

Необходимые для проведения работы растворы готовили из реактивов фирм «Biorad», «Sigma», «Promega» (США), «Pharmacia» (Швеция), «Fermentas» (Литва), а таюке отечественного производства фирм «Хеликон», «Биочот», «Литех» квалификации о с ч Культивирование вируса в культуре меток

Культуры клеток выращивали в среде Игла MEM с добавлением 2мМ глутамина, 5% сыворотки крови КРС для культур клеток, пенициллина по 100 ЕД/мл и стрептомицина по 100 мкг/мл Штаммы вируса «ПП1», «Rhinomune» пассировали, используя

диплоидную клеточную культуру почки кролика (RK.-13) Штамм «СВ/69» культивировали в перевиваемой клеточной культуре почки телёнка (ПТП) Титр вируса по инфекционному действию на культуру клеток оценивали по методу Рида и Менча Культивирование вируса в организме лабораторных животных

Для культивирования вируса использовали мышей (самки, самцы) линии BALB/c массой 3 - 25 г Мыши были раздеаены на равноценные группы, по 10 мышей в группе Мышам опытных групп вирус (штамм «ПП1») с инфекционным титром 7,0 Ig ТЦД50/МЛ, 6,0 lg ТЦД50/МЛ и 5,0 Ig ТЦД50/МЛ инокулировали интрацеребралыю, интраназально или подкожно Мышам контрольных групп вводили культуральную жидкость незаражённой культуры клеток аналогичным способом В течение 10 дней после заражения ежедневно проводили клиничесий осмотр мышей контрольных и опытных групп и фиксировали изменение их веса Мышей с симптомами заболевания подвергали эвтаназии, вскрывали и асептично отбирали головной мозг, лёгкие, печень, селезёнку, почки, сердце, матку для вирусологических исследований Из каждой пробы готовили 30 % суспензию на среде Игла MEM с добавлением пенициллина по 100 ЕД/мл и стрептомицина по 100 мкг/мл Наличие вируса в полученной суспензии проверяли в культуре клеток RK-13 по развитию характерного цитопатического действия Для заражения культуры клеток полученную суспензию центрифугировали при 2000g 20 мин и полученный супернатант использовали для заражения Титр вируса по инфекционному действию на животных оценивали по методу Рида и Менча Иммунизация лабораторных животных

Использовали самок мышей линии BALB/c весом 8 - 10 г Для иммунизации были использованы иммуногенные препараты различной концентрации вакцинный штамм «СВ/69», вакцинный штамм «Rhinomune», инактивированный 0,5% раствором формалина ВГЛ-1 (штамм «ПП1»), рекомбинантная плазмида, содержащая с своём составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1 Мыши были разделены на группы в соответствии с составом препарата, по 10 мышей в группе Иммуногенные препараты вводили подкожно Повторную иммунизацию проводили через 14 дней после первичной Кровь забирали из хвостовой вены через 14 дней после первичной иммунизации и через 7, 14, 21, 35, 49, 64 и 80 дней после повторной Сыворотки животных одной группы объединяли и определяли уровень антител в ИФА, РН и РТГА Контрольную сыворотку получали от неиммунизированных животных Потмеразная цепная реакция (ПЦР)

Идентификацию ДНК вируса в головном мозге мышей, зараженных эпизоотическим штаммом «ПП1» ВГЛ-1, проводили методом ПЦР Образцы для постановки ПЦР

обрабатывали по протоколам и с использованием коммерческих наборов фирмы «Лтех» Полученные суспензии диагностировали в ПЦР, используя праймеры (5' CTTGTGAGATCTAACCGCAC, 3' - GGGTATAGAGCTTTCATGGG), специфичные нуклеотидной последовательности фрагмента гена гликопротеина В вируса РПЛ по методу, предложенному Kinsawa et al (1993) Параметры ПЦР рассчитывали с помощью компьютерной программы "Vector NTI" и модифицировали экспериментально Праймеры синтезированы ЗАО «Синтол», Россия Реакции проводились с использованием реактивов и ферментов фирм «Fermentas» (Литва), «Promega» (Швеция) и «Литех» (Россия) Учет результатов реакции проводили на трансиллюминаторе при длине волны 312 им Гчстоюгическгш метод

Гистологические препараты были приготовлены из головного мозга мышей на 5 сутки после интрацеребралыюй инокуляции вирулентного для мышей штамма ВГЛ-1, полученного нами методом селекции, а также головного мозга мышей из контрольных групп Изучение морфологии органов у мышей проводили с применением окраски фиксированных срезов гематоксилин - эозином и пикрофуксином по Ван - Гизону Органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезжиривали в спиртах, заливали в парафиновые блоки, из которых готовили срезы толщиной 5—7 микрон и окрашивали гематоксилин - эозином или пикрофуксином по Ван - Гизону по общепринятой методике Им муногистохгишческчй метод

Изучение локализации антигена в головном мозге инфицированных мышей проводили с использованием иммуноцитохимического метода (непрямой вариант) В качестве отрицательного контроля использовали ткани мозга контрольных мышей Дополнительным контролем служили гистологические препараты, обработанные нормальной сывороткой лошади

Гистологические срезы готовили из парафиновых блоков по обычной методике Удаляли парафин со срезов в трех сменах ксилола, по 2 мин в каждой смене и трех сменах этилового спирта в концентрации 96%, 96% и 70% соответственно, по 2 мин в каждой смене Промывали срезы дистиллированной водой и добавляли 50 мкл 0, 3 % раствора перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы Затем срезы прогревали в дистиллированной воде при 37°С в течение 5-10 мин и помещали в 0,1 % раствор проназы Е в объеме 200 мкл на 1 - 2 мин с целью демаскирования антигена Ферментативную обработку останавливали, опустив стекла со срезами в дистиллированную воду, а затем в фосфатно - солевой буфер (ФСБ) (0,02М фосфатного буфера, 170мМ NaCl) В качестве блокирующего раствора использовали БСА в концентрации 0,2% в объеме 200 мкл Промывали срезы ФСБ 3-4 раза На следующем этапе для иммуномечения использовали

моноспецифическую поливалентную сыворотку лошади против ВГЛ-1 с титром антител в ИФА 1 6400 На срезы наносили рабочее разведение антител и инкубировали во влажной камере 30 мин при t 37 °С По окончании инкубации промывали ФСБ 3-4 раза На следующем этапе на срезы наносит иммунопероксидазный конъюгат В качестве конъюгата использовали аффинно очищенные антитела против иммуноглобулинов лошадей, полученные на кролике, конъюгированные с пероксидазой хрена Инкубацию проводили в условиях, аналогичных инкубации с сывороткой Срезы промывали ФСБ 3-4 раза и добавляли субстратную смесь В качестве субстратной смеси использовали коммерческий препарат Opti-4 CN™ Substrat Kit фирмы «Вю - Rad» (США) на основе хромогена 4 - хлоро -1 нафтола Окраску субстратной смесью проводили по протоколу фирмы - изготовителя Учет реакции проводили под микроскопом при х200 и х400 Серологические исследования

Для проведения серологических исследований использовали иммуноферментный анализ, реакцию нейтрализации и реакцию торможения гемагглютинации

Иммуноферментный анализ Для проведения экспериментальных исследований был использован непрямой вариант твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу герпеса лошадей 1 типа При постановке ИФА антиген (вирионы ВГЛ-1, очищенные ультрацентрнфугированием в 30 - 65 % градиенте сахарозы) адсорбировали на иммунологические планшеты (производства фирмы «Greiner - Ью», Германия) по 100 мкл в лунку в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,4 После адсорбции лунки планшет промывали 4-5 раз промывочным раствором Для промывочного раствора использовали ФСБ с добавлением Твина -20 (0,01М фосфатного буфера рН 7,4, 170мМ NaCl, 0,05 % Твина - 20) Готовили ряд последовательных двукратных разведений сывороток в ФСБ с добавлением Твина - 20 (0,02 M фосфатном буфере рН 7,4, 170 мМ NaCl, 0,05% Твина - 20) Реакцию проводили в объеме 100 мкл Инкубировали с исследуемыми сыворотками 1,5 часа при t +37-С Лунки планшет 3-4 раза промывали промывочным раствором и добавляли иммунопероксидазный конъюгат В качестве конъюгата использовали афинно очищенные антитела против иммуноглобулинов мышей, полученные на кролике, конъюгированные с пероксидазой хрена Инкубацию с конъюгатом проводили в условиях аналогичных инкубации с сыворотками По окончании инкубации лунки планшет промывали 4—5 раз промывочном раствором и проявляли реакцию внесением в каждую лунку субстратной смеси В качестве субстратной смеси использовали коммерческий препарат «ТМБ» на основе хромогена 3, 3',5,5' -тетраметилбензидина (производства фирмы «Бполаб», Россия) Окраску субстратной смесью проводили по протоколу фирмы - изготовителя Результаты ИФА оценивали на фотометре

«Multiscan®MCC/340» с вертикальным лучом при длине волны 450 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП, 450) Положительными считали пробы, коэффициент оптического поглощения которых, начиная с разведения 1 400 в 2 и более раз превосходил коэффициент оптического поглощения отрицательного контроля, но при этом был не ниже 0,200 оптических единиц (о е ) Уровень оптической плотности ниже 0,150 о е принимали за отрицательный результат

Реакция нейтрализации Нейтрализующую активность сывороток крови мышей определяли в реакции нейтрализации Сыворотку подвергали тепловой обработке при 56°С в течение 30 мин для инактивации белков системы комплемента РН проводили микрометодом с двукратными разведениями сывороток и постоянной дозой вируса (lOOTCDso/mi) В лунки культурапьных планшет ("Costar", США) вносили 0,03 мл сыворотки в двукратном разведении и равный объём вируса, инкубировали 1 час до внесения суспензии клеток RK -13(1 млн клеток/ мл в среде Игла МЕМ с добавлением 5% эмбриональной сыворотки КРС), учёт результатов реакции проводили на 3 сутки За титр антител исследуемой сыворотки принимали наибольшее ее разведение, которое сдерживало развитие ЦПД вируса Реакция торможения гемагглютинации Антигемагглютинины в сыворотках крови мышей выявляли в реакции торможения гемагглютинации по методу, предложенному К П Юровым, В К Сологуб (1979) Для предотвращения неспецифической гемагглютинации сыворотки мышей предварительно инкубировали с эритроцитами лошадей Статистическая обработка полученных результатов

Статистический анализ выполнялся с помощью пакета программ Microsoft Office ХР Professional, Statistica 5 0, "Statsoft Inc" для Windows

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 3 1 Изучение гуморального иммунного ответа в динамике у мышей в зависимости от природы иммуногена

Проводили сравнительный анализ динамики формирования гуморального иммунного ответа на инактивированный вирус, атгенуированный живой вирус и рекомбинантную плазмиду pIYT 1, содержащ>ю в своем составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1, разработанную совместно (Ткачев И Ю и др, 2003) сотрудниками лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики респираторных вирусных болезней крупного рогатого скота и лошадей отдела вирусологии ВИЭВ и лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии микроорганизмов ВНИИСХБ В последнем случае инокуляция

животным генно - инженерной конструкции должна была обеспечить иммунный ответ исключительно на один из поверхностных гликопротеинов ( gp D ) ВГЛ-1

В качестве препаратов для иммунизации использовали вакцинные штаммы «СВ/69» и «Rhinomune», инактивированный ВГЛ-1 (штамм «ПП1») и рекомбинантную конструкцию pIYT 1 Результаты эксперимента представлены на рис 1

Антигенную активность указанных препаратов оценивали на 7, 21, 35, 49, 64 и 80 сутки после двукратной иммунизации мышей с интервалом 14 дней В работе были использованы самки мышей линии BALB/c в возрасте 20 - 25 дней Тигр антител в сыворотках определяли в ИФА Отрицательным контролем служили сыворотки неиммунизированных животных

Период логарифмического нарастания титров антител наблюдали у мышей всех групп на 7 - 21 сутки после второй иммунизации Наиболее высокие титры антител вызывал вакцинный штамм «СВ/69» Рекомбинантная конструкция pIYT 1 обеспечивала формирование менее напряжённого иммунного ответа в сравнении с цельновирионнымн препаратами, но значительно более стабильного и продолжительного Стабильный уровень антител в крови наблюдали на 21 - 64 сутки после второй иммунизации Снижение титра антител при этом отмечали на 64 - 80 сутки, после введения других препаратов снижение титра антител происходило значительно раньше на 35 сутки для вакцинных штаммов, на 49 сутки для инактивированного вируса Сравнение двух вакцинных штаммов выявило относительно низкую иммуногенность вакцинного штамма «Rhinomune» в сравнении с «СВ/69» Это в определенной степени коррелирует с результатами исследований, проведенными на лошадях Neely et al (1978), указавшими не только на недостаточную иммуногенность вакцины «Rhinomune», но и на ее остаточную вирулентность В настоящее время вакцина «Rhinomune» рекомендуется только для профилактики респираторной формы ВГЛ-1 инфекции, но не рекомендуется для профилактики абортов и миелоэнцефалопатии (Allen, 2002)

3 2 Эффективность комбинированного введет/я вакцинных препаратов при испо чьзовании различных схем иммунизаиии

Известно, что предшествующий иммунитет может существенно влиять на

оп

0,55 0,5 0,45 ■ 0,4 0,35 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 0,1 0,05 О

7 21 35 49 64 80 сутки после двукратной иммунизации

- СВ/69

- Я Гипс/типе

Инактивиров энный ВГЛ-1

- р!УТ 1

- Контроль

Рис 1 Уровень антител у мышей на 7, 21, 35, 49, 64, 80 сутки после двукратной иммунизации в ИФА (разведение сывороток 1 .400)

По осям абсцисс - сутки после двукратной иммунизации, по осям ординат а) оптическая птотность (ОП) (разведение сывороток 1 400)

Препараты для иммунизации

• вакцинный шгамм «СВ/69» по 0,2 х 5,0 ^ ТЦД50/мл

• вакцинный штамм «Ипполите» по 0,2 х 5,0 ТЦД 50 /мт

• инактивированный 0,5% раствором формалина ВГЛ-1 (штамм «ПП1») по 0,2 х 7,0 ТЦД 50 /мл

• рекомбинантная конструкция р!\'Т 1 (1мкг/мкл) по 0,1 мл

интенсивность ответа на иммунизацию животного гомологичными антигенами Указанное обстоятельство имеет немаловажное практическое значение, поскольку большой процент естественно восприимчивых животных - лошадей имеют антитела к ВГЛ-1

В связи с этим мы изучали иммунный ответ у модельных животных - мышей на комбинированное введение инактивированного ВГЛ-1 и рекомбинантной ппазчиды р1УТ 1, используя различные схемы иммунизации Результаты эксперимента представлены на рис 2 Антигенную активность указанных препаратов оценивали после двукратной иммунизации мышей с интервалом 14 дней В работе были использованы самки мышей линии ВА1_В/'с в возрасте 14 дней Титр антител в сыворотках определяли в ИФА, РН и РТГА Отрицательным контролем служили сыворотки неиммунизированных животных На рис 2 показан уровень специфических антител в сыворотке крови мышей при исследовании их в ИФА, РН и РТГА на 7 неделе после повторной иммунизации Из

данных, приведенных на рисунке 2а видно, что титр антител в ИФА у мышей 2-ой группы, последовательно иммунизированных р!УТ 1 и инактивированным ВГЛ-1 выше, чем у мышей остальных групп Двукратное введение рекомбинантной конструкции также вызывало у мышей выраженный иммунный ответ, превышающий уровень положительного контроля У мышей 5-ой группы, иммунизированных пДНК, не содержащей смысловой ген, а также у мышей 7-ой - контрольной группы специфический иммунный ответ не обнаруживали Результаты исследования этих же проб в РН и РГГА коррелировали с данными ИФА В то же время данные РТГА показали большую эффективность иммунного ответа на последовательное введение рекомбинантной плазмиды и инактнвированного ВГЛ - 1 При этом титр антител к гемагглютинину вируса повышался в 1, 7 раза в сравнении с титром антител, выявляемых у мышей положительной группы, двукратно иммунизированных инактивированным ВГЛ - 1 (5,0 ^ ТЦД 50 /мл) На двукратное введение рекомбинантной плазмиды получали пониженный ответ к гемагглютинирующему антигену ВГЛ - 1 Самый низкий уровень антител был обнаружен у мышей 4 группы двукратно иммунизированных инактивированным ВГЛ-1 (4,0 ^ ТЦД 50 /мл) Уровень вируснейтрализующих антител был выше у 1 группы мышей, иммунизированных двукратно р!УТ 1 по сравнению с остальными группами Самый низкий уровень антител находили у мышей 3 группы последовательно иммунизированных инактивированным ВГЛ - 1 и р1УТ 1 (Рис 26)

Таким образом, у мышей, предварительно иммунизированных инактивированным вирусом был зафиксирован низкий уровень антител после введения рекомбинантной плазмиды Напротив, повышение уровня специфически антител было отмечено у мышей иммунизированных инактивированным ВГЛ - 1 на фоне специфического иммунного ответа, ранее сформированного рекомбинантной плазчидой

3 3Изучение нейропатогенных свойств ВГЛ-1 Для решения поставленных задач было необходимо воспроизвести у мышей инфекционный

процесс, характерный для естественно - восприимчивых животных, и провести селекцию

вирулентного штамма ВГЛ-1 для последующей работы по изучению напряженности

вакцинального иммунитета Для моделирования инфекции был выбран эпизоотический

штамм «ПП1» ВГЛ-1, изолированный от лошадей в 2000 г в период вспышки абортов и

поражения ЦНС в виде пареза задних конечностей

Мышей линии ВАЬВ/с различного возраста, используемых в качестве лабораторной модели, заражали шлрацеребрально по 20 мкл культуральной среды, содержащей ВГЛ-1 (штамм «ПП1») вттре 7,01$ ТЦД 50/1 мл В качестве отрицательного контроля

а) И ФА (разведение сывороток 1:1600).

6) РНиРТГА

титр антител

У

11.1

2 3 4 5 6 7 группы мьнией

ОРИ я РТГА

Рис. 2 Иммунный ответ у мышей на комбинированное введение различных препаратов а) ИФА { разведение сывороток 1 ; 1600); б) РН и РТГА

По осям абсцисс - группы мышеЛ; по осям ординат: а) оптическая плотность (ОП, усл. ед), б) титр антител, а) ИФА (разведение сывороток I : 1600); б) - РН и РТГА. Группы мышей 1) Мыши иммунизнрозаны двукратно рГУТ 1(1мкг/мкл) по 0,1 мл; 2) I иммунизация мышей р!У'Г. !(1мкг/мкл) по 0,1 мл; 2 иммунизация - ннактивированкым ВГЛ -1 по 0.2 х ¿,0 ТЦД 5о /мл; 3) 1 иммунизация мышей инактивированным ВГЛ -1 по 0,2 х 4,0 ^ ТЦД м /мл; 2 иммунизация - р[УТ,I(1 мкг/мкл) по 0,1 мл; 4) Мыши иммунизированы двукратно инактивированным ЗГЛ-1 по 0,2 х 4,0 1° ТЦД50 /мл; 5) Мыши иммунизированы двукратно р!УТ, не содержащей смысловой ген (I мкг/мкл) но 0,1 мл; 6) Положительный контроль. Двукратная иммунизация инакти в про ванным ВГЛ-1 по 0,2 х 5,0 1£ ТЦД 50 /мл; 7) Отри нагельный контроль. Введение физиологического раствора по 0,2 мл.

использовали мышей, которым инокулировали интрацеребрально по 20 мкл культуральной среды

В результате проведенных исследований была установлена нейропатогенность эпизоотического штамма «ПП1» ВГЛ-1 для мышей в возрасте от 1 до 8 дней Инкубационный период экспериментальной инфекции составил 24 - 48 часов Клинические признаки характеризовались снижением веса, отставанием в росте, повышенной нервной возбудимостью на внешние раздражители, нарушением координации движения на 4 - 5 сутки после заражения и летальным исходом на 5 — 6 сутки после заражения У контрольных животных не наблюдали признаков заболевания В течение 6 суток происходило отставание в росте зараженных мышей В культуре клеток ЯК-13 из тканей мозга мышей опытной группы с симптомами заболевания на 6 сутки п з изолировали вирус с инфекционным титром 4,5 ^ ТЦД 5о/мл, в других органах вирус обнаружить не удалось Результаты реизоляции вируса в культуре клеток ЯК-13 совпадали с данными ПЦР Интересно отметить, что культивирование штамма «ПП1» в организме мышей и его реизоляция в культуре клеток ЯК-13 сопровождались изменением характерного цитопатического действия, вызванного в культуре клеток исходным вирусом Исходный штамм «ПП1» ВГЛ-1 вызывал цитопатические изменения в виде гроздевидного скопления округлых клеток Цитопатические изменения, вызванные реизолированным от мышей вирусом, отличались появлением в цитоплазме клеток ЯК-13 многочисленных вакуолей разного диаметра и крупных симпластов Специфичность реизолированного вируса была подтверждена в реакции нейтрализации с использованием поликлонапьной сыворотки лошади моноспецифической к ВГЛ-1 Индекс нейтрализации 4,0 свидетельствовал о принадлежности реизолированного вируса к ВГЛ-1 При заражении мышей старше 8 дней процент заболеваемости снижался пропорционально возрасту животных Мыши старше 15 дней после интрацеребралыюй инокуляции штамма «ПП1» ВГЛ-1 не заболевали 3 4 Селекция штамма нейропатогенного для взрос пых мышей

Для повышения вирупентности штамма «ПП1» ВГЛ-1 для мышей старшего возраста провели последовательные пассажи вируса Для этого вирус из мозга мыши 4 дневного возраста с инфекционным титром 4,5 ^ ТЦД 50/ мл инокулировали и/ц по 20 мкл группе мышей различного возраста от 1 до 10 дней- В течение 10 дней наблюдения у животных признаков заболевания не наблюдали Часть животных на 5 сутки после заражения использовали для вирусологических исследований Реизолировать вирус из различных органов мышей в культуре клеток ШС-13 не удалось Таким образом, прямые пассажи не

приводили к повышению вирулентности штамма «ПП1» ВГЛ-1 для мышей старшего возраста

После проведения серии перемежающихся пассажей на мышах в возрасте от 4 до 40 дней и культуре клеток линии ИК-13 был получен нейропатогенный штамм, обозначенный «ПП1/1», адаптированный к росту в организме мышей в возрасте до 40 дней, вызывающий заболеваемость животных после интрацеребральной или интраназальной инокуляции Всего провели 11 пассажей на мышах и 22 пассажа в культуре клеток КК-13 Адаптацию вируса проводили по следующей схеме мышей в возрасте 4 суток заражали интрацеребрально по 20 мкл вируссодержащей культуральной среды Титр вируса при этом составил 7,0 ТЦД ¡о/ мл (100 ЛД50) В качестве отрицательного контроля использовали мышей, которым инокулировали и/ц по 20 мкл культуральной среды В течение 7 дней после заражения проводили наблюдение за мышами контрольных и опытных групп На 5 - 6 сутки после заражения часть мышей опытной группы с симптомами заболевания использовали для вирусологических исследований Для использования в следующем пассаже определяли титр вируса из тканей мозга мышей с наиболее тяжёлой формой заболевания После каждого пассажа на мышах проводили по 2 пассажа на культуре клеток ЛК-13 до восстановления инфекционного титра 7,0 1$ ТЦД 50/ мл Реизолированным в ЯК-13 вирусом заражали мышей более старших возрастных групп в следующем пассаже Наиболее счожным периодом адаптационного процесса было преодоление возрастного барьера 15 дней, количество заболевших животных при этом составило всего 5 % После 20 пассажа количество заболевших животных было постоянным и составляло 100 %

В процессе адаптации вируса у мышей на 3 - 6 сутки после интрацеребрального заражения наблюдали специфические неврологические расстройства На 3 - 4 сутки после заражения наблюдали снижение веса на 15 - 20 % от веса контрольных животных, повышенную нервную возбудимость на внешние раздражители, динамическую атаксию На 4-5 сутки появлялись клонические судороги в форме гиперкинезов Гиперкинезы проявлялись в виде ложных жевательных или плавательных движений, подергивания век и отдельных мышц головы, через несколько часов отмечали тонические судороги мышц плеча, контрактуру затылка На 5 - 6 сутки после заражения при полном сохранении волевого импульса у животных отмечали крайнюю ограниченность движений Вследствие усиления статического тонуса и затруднённого перехода его в динамический, инициатива к движению у мышей резко понижалась С прогрессированием болезни движения становились более ограниченными и медленными, в конечном итоге мыши «застывали» в одной позе, и не реагировали на внешние раздражения На б - 7 сутки заболевание заканчивалось летальным исходом

Для изучения особенностей биологических свойств полученный адаптированный штамм с инфекционным титром 7,0 lg ТЦД 50/ мл инокулировали интраназально по 40 мкл группе мышей в возрасте от 28 до 40 дней Было установлено, что адаптированный штамм вируса после интраназалыгой инокуляции вызывал у мышей характерные неврологические расстройства с последующим летальным исходом, однако, инкубационный период при интраназальном введении был более продолжительным и составлял 4-5 дней Мышей, у которых наблюдали атаксию и клонические судороги на 6 -7 дни после интраназалыюго заражения использовали для вирусологических исследований В культуре клеток RK-13 из тканей мозга мышей опытной группы с симптомами заболевания изолировали вирус с инфекционным титром 2,5 Ig ТЦД so/мл, в других органах вирус обнаружить не удалось Специфичность реизолированного вируса была подтверждена в реакции нейтрализации Установленная нами возможность моделирования ВГЛ-1 инфекции при интраназальном заражении лабораторных животных имеет важное значение, поскольку у лошадей первичная репликация вируса происходит в верхних дыхательных путях, вирус проникает в эпителиальные клетки носовых ходов, становится клеточно-ассоциированным и гематогенным путем распространяется в места вторичной репликации, в частности головной мозг (Bryans, 1969, Scott et al, 1983)

3 5 Оиенка возможности использования адаптированного штамма «ПП1/1» дчя контроля иммуногенности вакцин против РПЛметодом контрольного заражения

Проводили гистохимические исследования для изучения особенностей патогенеза экспериментальной инфекции у мышей Результаты представлены на рис 3

Срезы для гистохимических исследований готовили из тканей мозга мышей в возрасте 28 дней, подвергнутых эвтаназии на 5 сутки после интрацеребрального заражения адаптированным штаммом «ПП1/1» В качестве отрицательного контроля использовали ткани мозга контрольных мышей Для ичмуногистохимнческих исследовании дополнительным контролем служили гистологические препараты, обработанные нормальной сывороткой лошади

Нейропатогенный адаптированный штамм «ПП1/1» ВГЛ-1 вызывал у мышей энцефалит, характеризующийся развитием васкулита лимфоидного типа (рис 3) В гистосрезах выявлены инфильтрация мелких кровеносных сосудов и периваскулярных зон лимфоидными клетками, тромбозы сосудов-и воспалительные процессы периваскулярных зон (рис За и 36), а также скопления лифоидных клеток под мягкой мозговой оболочкой (рис Зв) Иммуногнстохимические исследования показали, что вирусный антиген локализован в области периваскулярных зон и под мозговой оболочкой (рис Зг)

Необходимо отметить, что у лошадей патогистологическне изменения, общие для

Рис* 3 Результаты | него ич ;гкчки \ нсслсдоваиий

а - Васкуяит, инфичьтрация лимфоидными цдетками сосу дов и периваскулярной юны. Окраска по Ван - Гизону. (*200)

б - Васкулит. инфильтрация лимфоидными клетками сосудов и периваскулярной зоны. Окраска по Ван — Гизону. ( *400)

в - Скопления лимфсидных клеток в области мозговой оболочки. Окраска гематоксилин -эозином. (-<200)

г- Илшунохимическое окрашивание. Вирусный антиген локализован в области мозговой оболочки. (>-200)

всех случаев герпесвирусной миелоэнцефалопатии независимо от тяжести клинического проявления, представляют собой васкулиты с последующей гипоксической дегенерацией и некрозом в прилегающей нервной ткани Такие течения васкулитов характеризуются периваскулярными скоплениями мононуклеарных фагоцитов и нейтрофилов в области адвентициальной, медиальной и внутренней стенки сосуда, некрозом медиальной стенки сосуда, пролиферацией эндотелиальных клеток артериол и венул и, изредка, наличием тромбов в просвете сосуда (ЕсЗн^Юп е1 а1,1986)

Основные проявления инфекционного процесса, полученные нами в эксперименте на мышах, в большой степени отвечают показателям при естественном течении инфекционного процесса у лошадей Таким образом, полученные результаты позволяют предположить адекватность выбранной лабораторной модели и оценить возможность ее использования для разработки теста по контролю иммуногенности вакцин

3 б Определение оптимальной заражающей дозы адаптированного штамма дчя мышей

Дозу оптимальную для заражения определяли титрованием адаптированного нейропатогенного штамма, полученного после 33 пассажа

Вирус инокулировали мышам линии ВЛЬВ/с в возрасте 28 - 30 дней и 38 - 40 дней интрацеребрально по 20 мкл в титре 7,0 ТЦД 5 с/мл, 6,0 ^ ТЦД 5 о/мл, 5,0 ^ ТЦД 5с/мл, 4,0 ^ ТЦД 50/мл и 3,0 ^ ТЦД 50/мл В результате опытов установили, что минимальная летальная доза адаптированного штамма для мышей обета возрастных групп составляет 0,02 х 5,0 ^ ТЦД 5о/мл Заражение мышей вирусом с инфекционным титром 4,0 ^ ТЦД 50/мл приводило к развитию характерной клинической картины болезни с последующим выздоровлением, заражение мышей вирусом с инфекционным титром 3,0 ^ ТЦД 50/мл не вызывало признаков инфекции Таким образом, установлено, что оптимальной дозой для заражения является 0,02 х 5,0 ТЦД 5с/мл

3 7 Лабораторное испытание иммуногенности вакцинного штамма «СВ/69»

Для оценки иммуногенности вакцинного штамма «СВ/69» методом контрольного заражения использовали полученный после 27 пассажа штамм, вирулентный для мышей в возрасте до 30 дней Мышей в возрасте 14 дней однократно вакцинировали по 0, 2 х 6,0 1$ ТЦД 5о/1 мл и через 14 дней проводили ннтрацеребральное контрольное заражение адаптированным штаммом ВГЛ-1 В результате проведенных исследований было установлено, что вакцинация мышей предотвращала заболевание у 100% животных Таким образом, показана принципиальная возможность защиты мышей, вакцинированных «СВ/69», от заболевания, на основании чего разработан метод лабораторного контроля иммуногенной активности вакцин против РПЛ

3 8 Экспериментальная опенка имчхногенности вакиин при однократной и двукратной им uvнизании мышей против РПЛ

Для иммунизации мышей линии BALB/c в возрасте 12 - 14 дней использовали вакцинные препараты различной концентрации вакцинный штамм «СВ/69» в титре от 5,0 до 2,0 Ig ТЦД 5о/мл, вакцинный штамм «Rhinomune» в титре от 5,0 до 2,0 Ig ТЦД 50/мл, инактивированный ВГЛ-1 штамм «ПП1» в титре до инактивации от 7,0 до 5,0 lg ТЦД so/мл, рекомбинантная плазчида pIYT 1, содержащая с своём составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1 в дозе 50 и 100 мкг на животное

Иммуногенную активность указанных препаратов оценивали после однократной и двукратной иммунизации мышей с последующим контрольным заражением Определение дозы оптимальной для иммунизации проводили по результатам наблюдения и взвешивания мышей контрольных и опытных групп Результаты представлены на рис 5 и 6 Для двукратной иммунизации с шггервалом 14 дней использовали следующие схемы 1) двукратная иммунизация «СВ/69» по 0, 2 х 2,0 lg ТЦД so/мл, 2) двукратная иммунизация ннактивированным ВГЛ-1 по 0, 2 х 7,0 lg ТЦД so/мл, 3) двукратная иммунизация рекомбинантной плазмидой pIYT 1 по 100 мкг, 4) 1 иммунизация pIYT 1 по 100 мкг, 2 иммунизация - «СВ/69» по 0,2 х 2,0 lg ТЦД so/мл

Контрольное заражение адаптированным штаммом в дозе 0,02 х 5,0 lg TCD 50/мл проводили интрацеребрально через 14 дней после однократной или двукратной иммунизации

Эффективность иммунизации определяли по количеству мышей, устойчивых по летальности к заражению и по результатам иммунологических и вирусочогических исследований Титр антител определяли в ИФА и РН Элиминацию вируса на 2 и 4 сутки после контрольного заражения у иммунизированных животных определяли титрованием реизолированного вируса в культуре клеток RK-13

Результаты опытов показали, что оптимальной иммунизирующей дозой для вакцинных штаммов «СВ/69» и «Rhinomune» является 0,2 х 4,0 lg ТЦД 50/мл, для ннактивированного ВГЛ-1 - 0, 2 х 7,0 lg ТЦД 50/мл, для рекомбина1ггной плазмиды pIYT 1 -100 мкг Вакцинный штамм «СВ/69» в дозе 0,2 х 4,0 Ig ТЦД so/мл обеспечивал защиту от инфекции всех мышей в группе по заболеваемости Остальные иммуногенные препараты при использовании оптимальной иммунизирующей дозы создавали частичную защиту от инфекции Вакцинный штамм «Rhinomune» в дозе 0,2 х 4,0 lg ТЦД 50/мл и 0,2 х 5,0 Ig ТЦД s о/мл обладал для мышей реактогенными свойствами Мыши, иммунизированные «Rhinomune», отставали в росте и развитии по сравнению с контрольными животными Степень проявления реаетогенности зависела от кочичества антигена Мыши, отстающие в

росте через 14 дней после иммунизации «Юипошипе», не были устойчивы к контрольному заражению нейропатогенным штаммом ВГЛ-1 и переболевали, что выражалось незначительным угнетением и снижением веса с последующим выздоровлением Инактивированный ВГЛ-1 и рекомбинантная плазмида рП'Т 1 в максимальных дозах обчадалн наибольшей эффективностью

При серологическом исследовании у иммунизированных мышей выявляли специфические антитела к ВГЛ-1 На рис 4А показан уровень антител при исследовании их в ИФА из приведенных данных видно, что титр антител у мышей 1 группы, иммунизированных вакцинным штаммом <<СВ/69» в дозе 0,2 \ 4,0 ^ ТЦД 50 /1 мл выше, чем у мышей остальных групп У мышей 12 группы, иммунизированных плазмидой р1УТ, не содержащей смысловой ген, а также у мышей 13 - контрольной группы специфический иммунный огвет не обнаруживали Результаты иммуноферментного анализа были подтверждены в реакции нейтрализации

На 3 - 5 сутки после контрольного заражения у мышей 12 группы после введения пДНК, не содержащей смысловой ген и 13 - положительной контрольной группы развивались специфические неврологические расстройства снижение массы тела, повышенная нервная возбудимость на внешние раздражители, динамическая атаксия, гиперкинезы и тонические судороги На 4 - 5 сутки наблюдали парезы, у некоторых животных параличи задних конечностей с последующим летальным исходом всех животных в группе Эффективность вакцинации мышей на 5, 7 и 10 сутки после заражения показана на рис 4 Б Устойчивость мышей различных групп к заражению ВГЛ-1 коррелировала у них с титром антител, выявленных в ИФА и РН, из представленных данных видно, что иммунизация вакцинными штаммами ВГЛ-1 «СВ/69» и «Шипотипе» в дозе 0,2 х ТЦД ^ ТСЭ 50 /мл обеспечивает выраженный иммунный ответ и устойчивость по летальности к контрольному заражению всех мышей в этой группе Во всех остальных опытных группах вакцинация создаёт частичную защиту от инфекции Эффективность иммунизации на уровне 60 - 70% регистрировали у большинства мышей 2, 5, 7 и 11 групп в виде устойчивости к инфекции или заболевания в легкой форме с последующим быстрым восстановлением У мышей 3, 6, 8 и 9 групп, для которых эффективность иммунизации составляет 20 - 30%, поспе заражения развивались неврологические симптомы адекватные по степени тяжести положительному контролю У мышей 10 группы, иммунизированных р1УТ 1 в дозе 50 мкг, наблюдали летальный исход

всех животных после контрольного заражения на 7 сутки, однако, на 5 сутки эффективность иммунизации составляла 60 % в сравнении с положительной контрольной группой, в которой на 5 сутки все животные после заражения погибли

Результаты двукратной иммунизации показали, что комбинированное введение А} И ФА (разведение сыворотки 1 : 1600)

ОП, усл. ей

группы мышей

Б) Эффективность иммунизации в % по количеству живых мышей %

группы I

Рис 4 Оценка иммуногеиности вакцин при однократной введении

По осям абсцисс - группы мышей, по осям ординат: а) оптическая плотность (ОП. усл. ед.) (разведение сыворотки 1 : 1600); б) эффективность иммунизации в % по количеству живых мышей.

Группы мышей: 1) иммунизация "СВ/69" по 0,2 х 4,0 ТЦД 50/мл; 2) иммунизация "СВ/69" по 0,2 \ 3,0 ^ ТС О 5г/мл; 3) иммунизация "СВ/69" по 0,2 х 2,0 ТЦД л/мл; 4) иммунизация "ИЫпогшпе" по 0,2 х 4,0 {£ ТЦД 5С/мл 5); иммунизация "КЫпогтте" по 0,2 х 3,0 ТЦД к/мл; 6) иммунизация "Иипотипе" по 0,2 х 2,0 ТЦД 5(>/мл; 7) иммунизация инактивпрованным ВГЛ-1 но 0,2 х 7,0 ТЦД и/мл; 8) иммунизация инактивйрованным ВГЛ-1 по 0,2 х 6,0 ТЦД 5 с/мл; 9) иммунизация инактнвнроаанным ВГЛ-1 по 0,1 х 5,0 ^ ТЦД ж/мл; 10) иммунизация р1УТЛ по 50 мкг; 11) иммунизация рП'Т. 1 по 100 мкг; 12) иммунизация пД11К, не содержащей «смысловой» ген по 100 мкг (контроль); 13) введение

физиологического раствора по 0,2 мл (положительный контроль), 14) введение физиологического раствора по 0,2 мл (отрицательный контроль)

рекомбинантной конструкции pIYT 1 в дозе 100 мкг и вакцинного штамма «СВ/69» по 0,2 х 2,0 lg ТЦД so/мл оказалось лучшей стратегией вакцинации мышей, представленных в 4 группе (рис 6) Титр антител у мышей данной группы при исследовании их в ИФА в 1,6 раза выше, чем у мышей 1 группы, двукратно иммунизированных «СВ/69» и в 1,3 раза выше, чем у мышей 3 группы, двукратно иммунизированных рекомбинантной конструкцией pIYT 1 (рис 5А) Однако, полной связи между титрами вируснейтрапизующими антител и невосприимчивостью к вирусу не обнаружено При заражении вирулентным вирусом 90% мышей 4 группы оставались резистентными к заболеванию (рис 5 Б) Результаты, полученные в этом опыте на контрольных животных соответствовали результатам однократной иммунизации

Результаты определения элиминации вируса на 2 и 4 сутки после контрольного заражения у иммунизированных животных показали, что при эффективности ичмунизации90 - 100% вирус уже на 2 сутки не обнаруживается, при эффективности иммунизации 60 - 70% вирус рензолнровали в культуре клеток с инфекционным титром 2,5 lg ТЦД 5гУмл , на 4 сутки вирус не обнаруживали, при эффективности иммунизации 20 - 30% и у мышей положительной контрольной группы вирус реизолировали в культуре клеток с инфекционным титром 3,0 lg ТЦД so/мл на 2 и 4 сутки после заражения

3 9 Изучение вчняния ВГЛ-1 на беременность

Изучали абортогенные свойства штамма «ПП1» ВГЛ-1 на лабораторных животных -мышах линии BALB/c, используемых в качестве экспериментальной модели

Мышей в возрасте 10 недель со сроком беременности 14 - 20 дней, заражали подкожно по 0,2 мл вируссодержащей культуральной среды Титр вируса при этом составил 6,0 lg ТЦД 5о/мл В качестве отрицательного контроля использовали мышей, которым инокулировали подкожно по 0,2 мл культуральной среды В течение 14 дней после заражения за мышами проводили наблюдение В опытной группе у мышей, зараженных на более ранних сроках беременности (14-16 дней) наблюдали аборт в виде резорбции плодов, у мышей, зараженных на бочее поздних сроках беременности (17 - 20 дней), получали нежизнеспособный приплод В первую неделю жизни летальный исход наблюдали у 90 - 95% мышат Беременные самки после заражения клинических признаков инфекции не проявляли У мышей контрольной группы получали полноценный приплод

При повторном воспроизведении эксперимента на 3, 5 и 8 сутки после заражения по 3 беременные мыши из каждой группы использовали для вирусологических исследований В ПЦР на 3 сутки после заражения были идентифицированы фрагменты ДНК ВГЛ-1 в печени,

однако, в других пробах на 3 сутки, а также во всех пробах на 5 и 8 сутки после заражения вирус у мышей не обнаруживали. В культуре клеток РК-13 вирус изолировать не удалось.

ОП, усл. ей.

1 2 3 4 5 6

группы мышей

%

группы ыышей

Рис.5 Оценка иммуногенности вакцин при двукратном введении

По осям абсцисс - группы мышей; по осям ординат - а) оптическая плотность (ОП, усл. сд.) ИФА (разведение сыворотки 1 : 1600; б) эффективность иммунизации в % по количеству живых мышей.

Группы мышей: 1) иммунизация «СВ/69» по 0,2 х 2,0 ^ ТЦД л/мл; 2) иммунизация ннактивированным ВГЛ-! по 0,2 х 7,0 ТЦД 5(/мл; 3) иммунизация р!УТ. ] по 100 мкг; 4) 1 иммунизация р!УТ,1 по 100 мкг и через 14 дней 2 иммунизация «СВ/69» по 0,2 х 2,01ц ТЦД 5о/мл; 5) иммунизация р]УТ, не содержащей «смысловой» ген моЮО мкг (контроль); 6) введение физиологического раствора по 0,2 мл (положительный контроль); 7) введение физиологического раствора по 0,2 мл (отрицательный контроль).

Таким образом, в матке присутствие вируса не было установлено на 3, 5 и 8 сутки после заражения Рядом работ (Кикге^ ^ а1, 1998 и др) было показано, что у заражённых беременных мышей вирусная инфекция плаценты и/или зародышей может отсутствовать, что зависит от биологических свойств некоторых штаммов ВГЛ-1 Предполагают, что аборт у мышей в таких случаях связан с нарушением функционирования кровеносных сосудов плаценты и является следствием непрямого действия вируса (Кикге^ е; а1,1998)

3 12 Оценка напряженности иммунитета на моден1 ВГЛ-1 аборта у мышей после введения разтчных вакцин

Для имунизацин мышей линии ВАЬВ/с (самок) в возрасте 20-22 дней использовали инактивированный ВГЛ-1 (штамм «ПП1») по 0,2 х 7,0 ^ ТЦД 5</мл, рекомбинантную конструкцию р1УТ 1 по 100 мкг и плазмиду ргеСМУ, не содержащую смысловой ген по 100 мкг

Иммуногенную активность указанных препаратов оценивали после трехкратной иммунизации мышей с интервалами 14 дней с последующим контрольным заражением Через 2 месяца после первичной иммунизации во все группы к самкам были подсажены половозрелые самцы

Контрольное заражение 1, 2 и 3 групп ( самок) ВГЛ-1 (штамм «ПП1») проводили подкожно по 0,2 х 7,0 ^ ТЦД 50/мл через 30 дней после третьей иммунизации Мышей 4 группы использовали для отрицательного контроля Эффективность иммунизации определяли по количеству живых мышат в каждой группе Титр антител в сыворотке крови самок, полученной до заражения, исследовали в ИФА Сохранность новорожденных мышей от самок, иммунизированных рекомбинантной конструкцией р1УТ 1, инактивированным вирусом и для контроля плазмидой ргеСМУ, не содержащей «смысловой» ген, составила 14,71%, 32,35% и 2,94 % соответственно

ВЫВОДЫ

1 Разработана методика лабораторной оценки антигенных и иммуногенных свойств различных препаратов вируса герпеса лошадей 1 (ВГЛ-1) Найдена лабораторная модель -мыши линии ВАЬВ/с для оценки антигенных свойств и напряженности иммунитета

2 Охарактеризован иммунный ответ у мышей линии ВАЬВ/с на различные иммуногены ВГЛ 1 коммерческие вирусвакцины против ринопневмонии лошадей «СВ/69» и «КИтотипе», инактивированный вирус и рекомбинантную плазмиду р1УТ 1, содержащую в своем составе ген, кодирующий гликопротеин О ^Э) ВГЛ-1

3 Антитела, индуцированные у мышей рекомбинантной плазмидой pIYTl, специфически распознают белок с молекулярной массой 80 кДа, соответствующий gD ВГЛ-1 и определяются в тестах внруснейтрализации, РТГА и ИФА в титрах, сопоставимых с реакцией на атгенуированный или инактивированный ВГЛ-1

4 Разработана лабораторная модечь для изучения нервно-паралитической и абортогенной форм инфекции ВГЛ -1 на мышах

5 Получен (методом перемежающихся пассажей) штамм вируса РПЛ «ПП1/1», адаптированный к мышам линии BALB/c, вызывающий у 6-ти недельных мышей при интрацеребральной или интраназальной инокуляции симптомы поражения центральной нервной системы, характерные для герпесвирусной миелоэнцефалопатии лошадей Эпизоотический штамм «ПП1» ВГЛ-1 вызывает у беременных мышей гибель эмбрионов после подкожной инокуляции

6 Вакцинный штамм «СВ/69», в оптимальной иммунизирующей дозе, обеспечивает полную защиту мышей от экспериментальной инфекции вирулентным штаммом ВГЛ -1 Вакцинный штамм «Rhinomune», инактивированный вирус (штамм «ПП1»), рекомбинантная конструкция pIYT 1 создают частичную защиту от инфекции

7 Комбинированное введение рекомбинантной конструкции pIYT 1 и цельнозирионных вакцинных препаратов (инактивированного или атгенуированного ВГЛ-1) повышает гуморальный иммунитет у мышей и устойчивость их к контрольному заражению

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны (в соавторстве) «Рекомендации по получению рекомбинантной плазмиды, содержащей гены гликопротеннов вируса ринопневмонии лошадей, и их применению с использованием оптимальных доз для иммунизации восприимчивых лабораторных животных», утверждённые директором ВИЭВ в 2007 г

Разработана (в соавторстве) «Временная инструкция по ретроспективной диагностике ринопневмонии лошадей (выявление специфических антител) иммуноферментным анализом (ИФА)», утвержденная директором ВИЭВ в 2007 г

Материалы диссертации использованы в дополнении, подготовленном Референтной лабораторией МЭБ по ринопневмонии лошадей (эксперт К П Юров) для нового издания «Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines», раздел Equine diseases m list В, глава Equme rhinopneumonitis, Office International des Epizooties

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Алексеенкова С В Лабораторная модель для изучения иммуногенных свойств вакцинных препаратов против ринопневмонии лошадей /Алексеенкова С В , Ткачев И Ю, Юров Г К //Вет Патология -2003 - 1 (5) 120-121

2) Алексеенкова С В Получение генетических конструкций, несущих полные гены поверхностных гликопротеинов вируса герпеса лошадей 1 для создания ДНК-вакцины / Ткачев И Ю , Юров Г К , Шмаров М М , Народицкий Б С, Алексеенкова С В , Юров К П // Материалы 2-ого Московского международного Конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» Секция 2 -Биотехнология и сельское хозяйство - 2003 - С 233

3) Алексеенкова С В Эффективность комбинированного введения рекомбинантной плазмиды, содержащей в своем составе ген, кодирующий гликопротеин Б ВГЛ-1 и инактивированный ВГЛ-1 /Алексеенкова С В , Ткачев И Ю, Юров Г К, Юров К П // Материалы 2-ого Московского международного Конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» Секция 2 - Биотехнология и сельское хозяйство - 2003 - С 247 - 248

4) Алексеенкова С В Иммунный ответ лабораторных животных на рекомбинантную плазмиду, содержащую в своем составе ген, кодирующий гликопротеин О герпесвируса лошадей 1 (ВГЛ-1) н инактивированный ВГЛ-1 / Алексеенкова С В , Ткачёв И Ю, Юров Г К, Юров К П // Иммунология -2005 -26(6) 351 -353

5) Алексеенкова С В Нейропатогенность полевых штаммов герпесвируса лошадей 1 типа для белых мышей /Татаурова А В , Юров К П , Алексеенкова С В //Материалы Международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний»

Казань -2005 -2 329-330

6) Алексеенкова С В НеПропатогенные штаммы возбудителя ринопневмошш -вирусного аборта лошадей /Татаурова А В , Юров К П, Алексеенкова С В // Ветеринария -2006 -3 20-23

7) Алексеенкова С В Эффективноств иммунизации мышей линии ВАЬВ/с при интрацеребралыюм заражении ВГЛ 1 /Алексеенкова С В , Юров Г К , Ткачёв И Ю, Юров К П // Иммунотогия -2006 -27(6) 361 -363

Подписано в печать 09 04 07 Формат 60><84 1/16 Печать лазерная Объем1,75упл Заказ 2/67 Тираж 100

Актуальность темы

Вирус герпеса лошадей 1 типа - возбудитель широко распространённой инфекции лошадей. Основными клиническими формами заболевания, вызываемого ВГЛ-1, являются аборты, миелоэнцефалопатия, респираторный синдром, кератоконъюнктивиты.

В последние годы герпесвирусная миелоэнцефалопатия в США и странах

Европы получила широкое распространение, несмотря на масштабную программу вакцинопрофилактики болезни. Неэффективность специфической профилактики неврологической формы ВГЛ-1 приводит к тому , что в период энзоотических вспышек заболеваемость лошадей достигает 90 %, смертность может составить до 50%.

При этом нет единого мнения по вопросу патогенеза миелоэнцефалопатии ВГЛ-1 инфекции. Предполагают, что сипмтомокомплекс болезни формируется в результате воспаления и тромбоза мелких кровеносных сосудов под влиянием образующихся цитотоксических иммунных комплексов, что приводит к гипоксической дегенерации клеток головного мозга. Результаты иммуногистохимических исследований свидетельствуют о локализации вирусного антигена главным образом в клетках эндотелия артериол и капилляров (Edington at al., 1986; Whitwell and Blunden, 1992), однако, при этом удалось подтвердить гибридизацией in situ и иммуногистохимическими методами инфекцию нейронов и астроцитов

Schmidt at al., 1994; Schultheiss at al., 1997). Ряд авторов полагают, что вакцинация способна усилить формирование цитотоксических иммунных комплексов и повысить шанс проявления миелоэнцефалопатии в результате нарушения функции кровеносных сосудов головного мозга (Allen GP, Kydd JH, Slater JD, et aL, 2002).

Другое мнение заключается в том, что в популяции лошадей появляются новые доминантные штаммы ВГЛ-1 с мутацией генов, кодирующих вирусную ДНК - полимеразу, ранее не регистрировавшиеся. Новые эпизоотические штаммы ВГЛ-1 характеризуются также чрезвычайно важным свойством -способностью к преодолению видового барьера (известны случаи энцефалитов с летальным исходом у антилоп, зебр, жирафов) и высокой вирулентностью для естественновосприимчивых животных (Nugent et al, 2006). Как правило, интродукция ВГЛ-1 в гетерологичную популяцию животных сопровождается летальностью до 100 %.

Представленные данные свидетельствуют об актуальности исследований, направленных на совершенствование средств специфической профилактики инфекции. Учитывая экономический фактор, естественно восприимчивые животные (лошади) в экспериментальной работе могут быть использованы в весьма ограниченном количестве. Эффективное решение может быть достигнуто путем моделирования инфекционного процесса на лабораторных животных.

Проведённые ранее исследования на сирийских хомяках (Е. Doll et al,

1953) показали, что ВГЛ-1 не обладает для хомяков (в отличие от лошадей) эндотелиотропными свойствами. Интрацеребральная инокуляция адаптированного штамма КуД ВГЛ-1 хомякам вызывала энцефалит, характеризуемый репликацией вируса в нейронах и глиальных клетках. По мнению большинства исследователей такая лабораторная модель имеет ограничение использования при выяснении ряда вопросов патогенеза и иммуногенеза инфекции ВГЛ-1.

Рядом работ (A.R. Awan et al., 1990; A. Kukreja et al., 1998; С. Walker et al., 2000; R. Hasebe et al., 2002; A.RJ. Frampton et al., 2004; N. Virmani et al., 2005; P.M. Smith et al., 2005) было показано, что при экспериментальном заражении ВГЛ - 1 мышей линии BALB/c удается воспроизвести инфекционный процесс достаточно приближенный к естественному заболеванию лошадей.

Моделирование на лабораторных животных иммунной реакции на различные препапаты герпесвируса лошадей с целью изучения особенностей иммунного ответа, обусловленного различной природой использованных вирусных препаратов, представляет значительный интерес. Успешное решение ряда аспектов этой задачи позволяет существенно продвинуться в познании иммуногенеза при герпесвирусной инфекции лошадей, что обеспечивает перспективу создания более эффективных и безопасных средств специфической профилактики болезни.

Цель и задачи исследования

В связи с этим целью работы было разработать лабораторную модель ВГЛ - 1 инфекции и изучить особенности формирования гуморальных реакций и устойчивости к ВГЛ-1 на введение различных вирусных антигенов.

В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

1) Определить в ИФА, РН, РТГА возможность индуцирования гуморального иммунного ответа у мышей на введение: инактивированного вируса, аттенуированного вируса и рекомбинантной плазмиды pIYT. 1, содержащей в своём составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1;

2) провести сравнительный анализ формирования гуморального иммунного ответа у мышей линии BALB/c после введения рекомбинантной конструкции pIYT.l, экспрессирующей гликопротеин D ВГЛ-1; инактивированного ВГЛ-1 и вакцинных штаммов «СВ/69» и «Rhinomune»;

3) изучить антигенные свойства вакцинных препаратов при использовании различных схем иммунизации;

4) изучить чувствительность мышей к ВГЛ-1 при различных способах заражения;

5) провести селекцию вирулентного штамма ВГЛ-1 для последующей работы по изучению напряженности вакцинального иммунитета у мышей;

6) изучить напряжённость иммунитета у мышей в зависимости от природы антигена, дозы антигена, кратности иммунизации и способа контрольного заражения.

Научная новизна исследования

Впервые изучены иммуногенные свойства рекомбинантной плазмиды pIYT.l, содержащей в своём составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1, в сравнении с аттенуированным и инактивированным ВГЛ-1 на мышах линии

BALB/c. Установлено, что рекомбинантная плазмида pIYT.l вызывает образование специфических антител к вирусу в титрах, сопоставимых с реакцией на аттенуированный или инактивированный ВГЛ-1. Антитела могут быть выявлены в РН, РТГА и ИФА. Изучена динамика формирования иммунного ответа в зависимости от природы антигенов.

Впервые разработана лабораторная модель неврологической формы ВГЛ-1 инфекции на мышах линии BALB/c. Полученный селекцией штамм «ПП1/1» ВГЛ-1, патогенный для мышей в возрасте до 40 дней, вызывает у них геморрагический энцефалит с летальным исходом до 100% после интраназальной или интрацеребральной инокуляции.

Впервые изучены абортогенные свойства типичного эпизоотического штамма «ПП1» ВГЛ-1, циркулирующего на территории РФ, для лабораторных животных. Показано, что у беременных мышей линии BALB/c штамм «ПП1» после подкожной инокуляции вызывает гибель эмбрионов с последующей их резорбцией или рождение нежизнеспособного приплода.

Впервые на модели неврологической и абортивной форм ВГЛ-1 инфекции на мышах линии BALB/c изучена напряжённость иммунного ответа в зависимости от природы антигенов, дозы антигенов, кратности иммунизации и способа контрольного заражения.

Обнаружено усиление иммунного ответа при комбинированном введении рекомбинантной плазмиды pIYT.l и вакцинного штамма «СВ/69».

Практическое значение работы

Полученные результаты являются основанием для составления рекомендаций по контролю инактивированных и вирус-вакцин против ринопневмонии лошадей, а также испытанию на реактогенность аттенуированнных штаммов и вакцин на их основе. Предлагаемый метод с использованием лабораторной модели существенно снижает затраты биопреприятий при производстве вакцин против ринопневмонии и позволяет, вследствие его доступности, проводить контроль на любой стадии производства препарата. Кроме того разработанная методика может быть использована в научных исследованиях: полученный в ходе работы штамм, нейровирулентный для мышей линии BALB/c, может быть использован для изучения патогенеза и в частности иммуногенеза инфекции ВГЛ-1, а также при испытании препаратов для антивирусной терапии.

Разработаны (в соавторстве) «Рекомендации по получению рекомбинантной плазмиды, содержащей гены гликопротеинов вируса ринопневмонии лошадей, и их применению с использованием оптимальных доз для иммунизации восприимчивых лабораторных животных», утверждённые директором ВИЭВ в 2007 г.

Разработана (в соавторстве) «Временная инструкция по ретроспективной диагностике ринопневмонии лошадей (выявление специфических антител) иммуноферментным анализом (ИФА)», утверждённая директором ВИЭВ в 2007 г.

Материалы диссертации использованы в дополнении, подготовленном Референтной лабораторией МЭБ по ринопневмонии лошадей (эксперт К.П. Юров) для нового издания «Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines», раздел Equine diseases in list В, глава Equine rhinopneumonitis, Office International des Epizooties.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на 2-м Московском международном Конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ». Секция 2 - Биотехнология и сельское хозяйство (Москва, 2003), на Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (Москва, 2003), на Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно-производственном совещании научных сотрудников ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (Москва, 2007 г.). Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, результаты исследования, обсуждение выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы содержит 132 источника, из них

выводы

1. Разработана методика лабораторной оценки антигенных и иммуногенных свойств различных препаратов вируса герпеса лошадей 1. Найдена лабораторная модель - мыши линии BALB/c для оценки антигенных свойств и напряженности иммунитета.

2. Охарактеризован иммунный ответ у мышей линии BALB/c, на различные иммуногены ВГЛ 1: коммерческие вирусвакцины против ринопневмонии лошадей «СВ/69» и «Rhinomune»; инактивированный вирус и рекомбинантную плазмиду pIYT.l, содержащую в своём составе ген, кодирующий гликопротеин D ВГЛ-1.

3. Антитела, индуцированные у мышей рекомбинантной плазмидой pIYT.l определяются в тестах вируснейтрализации, РТГА и ИФА в титрах, сопоставимых с реакцией на аттенуированный или инактивированный ВГЛ-1.

4. Разработана лабораторная модель для изучения нервно-паралитической и абортогенной форм ВГЛ -1 инфекции на мышах.

5. Получен (методом перемежающихся пассажей) штамм ВГЛ-1 «ПП1/1», адаптированный к мышам линии BALB|c, вызывающий у 6-ти недельных мышей при интрацеребральной или интраназальной инокуляции симптомы поражения центральной нервной системы, характерные для герпесвирусной миелоэнцефалопатии лошадей. Эпизоотический штамм «ПП1» ВГЛ-1 вызывает у беременных мышей гибель эмбрионов после подкожной инокуляции.

6. Вакцинный штамм «СВ/69», в оптимальной иммунизирующей дозе, обеспечивает полную защиту мышей от экспериментальной инфекции вирулентным штаммом ВГЛ1. Вакцинный штамм «Rhinomune»; инактивированный вирус (штамм «ПП1»); рекомбинантная конструкция pIYT.l создают частичную защиту от инфекции.

7. Комбинированное введение рекомбинантной конструкции pIYT.l и цельновирионных вакцинных препаратов (инактивированного или аттенуированного ВГЛ-1) повышает гуморальный иммунитет у мышей и устойчивость их к контрольному заражению.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны (в соавторстве) «Рекомендации по получению рекомбинантной плазмиды, содержащей гены гликопротеинов вируса ринопневмонии лошадей, и их применению с использованием оптимальных доз для иммунизации восприимчивых лабораторных животных», утверждённые в 2007 г.

Разработана (в соавторстве) «Временная инструкция по ретроспективной диагностике ринопневмонии лошадей (выявление специфических антител) иммуноферментным анализом (ИФА)», утверждённая в 2007 г.

Материалы диссертации использованы в дополнении, подготовленном Референтной лабораторией МЭБ по ринопневмонии лошадей (эксперт К.П. Юров) для нового издания «Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines», раздел Equine diseases in list В, глава Equine rhinopneumonitis, Office International des Epizooties.