Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Структурно-биохимические особенности микобактерий и устойчивость их к дезинфицирующим средствам

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК,

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРКОЙ САНИТАРКИ, ГИГИЕНЫ И ЗК0Л0ГИИ

На правах рукописи

СУЛЕЙМЕНОВ МАРАТ КАШТБЕКОВИЧ

УДК 619:614.48:651.451.3

СТРУКТУРНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МЖОБАКТЕРИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ ИХ К ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИМ- СРЕДСТВА!»'

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1993

Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии Все' российского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук Куликовский A.B.

доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной пре' мии, заслуженный деятель науки РСФСР Закомырдин А. А. (ВНШВСГЭ); кандидат биологических наук Устинова Г.И. (ВИЗВ).

Ведущее учреждение - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля,стандартизац и сертификации ветпрепаратов (ВГНКИ)

Защита состоится " {О " tfJ&l/J^/б2 г. на заседали: специализированного ученого совета (Д.020.50.01) при Всероссийс ком научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе 5). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного > совета, кандидат биологических наук

Пименова Л. П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Микобактерии широко распросаранены во внешней среде, но особое положение среди них занимают микобактерии туберкулеза, вызывающие заболевание людей и животных.'Для успешной борьбы с туберкулезом необходимы глубокие всесторонние исследования свойств возбудителя, который является одним из наиболее изменчивых микроорганизмов.

Своеобразная биология роста и развития, высокая устойчивость микобактерии к действию природных, физических и химических факторов во многом обусловлены структурно-биохимическими особенностями организации микобактерий и в первую очередь строением и свойствами уникальной клеточной стенки и большим количеством разнообразных липидов, причем некоторые липиды (например, миколовые кислоты) характерны только для микобактерий (Авакян A.A., КацЛ.Н., Павлова И.Б.,1972; Вейсфейлер Ю.К.,1975; Коронелли Т.В.,1977; Лазовская А.Л.,1988; Imaeda Т. et al.,1968; Asselineau А.,1978).

Всесторонне изучение проблемы резистентности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам, включая вопросы структурных и функциональных основ механизма их действия на микробную клегty, имеет важное теоретическое и практическое значение. Увеличение удельного веса микроорганизмов, резистентных к различным классам дезинфицирующих веществ, обосновывает необходимость исследования структурно-биохимических особенностей микроорганизмов в связи с устойчивостью их к дезинфицирующим средствам.

Полученные с помощью современных методов исследования конкретные сведения о химическом составе, ультраструктуре ч физиологии бактериальной клетки помогут понять те сложные процессы, которые происходят в микроорганизмах после воздействия санирующих агентов и могут обеспечивать в каждом конкретном случае наиболее

целесообразный выбор дезинфицирующих средств, а также позволят управлять этими процессами и активизировать их (Поляков А.А., 1977; Дссанов К.Ш.,1979; Лярский П.П.,1983).

Зная в деталях процессы, которые происходят в клетках под действием дезинфектантов, какие структурно-функциональные изменения сопровождают эти процессы, учитывая особенности организации данного микроорганизма, молено определить наиболее "уязвимые" участки или "мишени" в микробной клетке. Одной из главных "мишеней" при действии антибактериальных веществ является цитоплазматичес-кая мембрана, выполняющая много важных функций, главная из которых - энергетическая. Именно в мембране локализованы ферменты, катализирующие разнообразные метаболические процессы (Рудзит Э.А., 1975; Куликовский A.B.,1979; Franclin N., Snow Т.,1975). Изучение устойчивости микроорганизмов к антибактериальным средствам, иссле- ' дование структурно-биохимических изменений, происходящих при этом в клетке, требуют получения мембранных препаратов бактерий.

Жирные кислоты играют важную роль в метаболизме клеток мико-бактерий. Они содержатся в большом количестве в клеточной стенке и цитоплазматической мембране, являются предшественниками при синтезе миколовых кислот (специфических липидов микобактерий). Моносахара имеют большое значение в различных синтетических процессах. Из них образуются ди-, три- и полисахариды, которые в комплексе с липидами образуют липополисахариды. Анализ количественного и качественного состава жирных кислот используется в идентификации и дифференциации микобактерий (Васюренко З.П., Синяк K.M., 1977; Коронелли Т.В.,1984; Minnlkln D.E., 1976).

Новые данные о структурно-биохимических особенностях бактерий, включая и микобактерии, помогут и в улучшении дифференциации,

идентификации микроорганизмов, поиске видоспецифических антигенов.

В последние годы интерес ученых привлекает изучение экологии бактерий во внешней среде, но исследований в этом теоретическом разделе микробиологии, которые должны проводиться на уровне микробной популяции, пока недостаточно (Шапиро Д.А.,1988; Павлова И.Б., Куликовский A.B., Ботвинко И.В. и др.,1990). Отсутствуют конкретные сведения о строении бактерий в популяции, об их изменчивости в процессе роста, о факторах, обеспечивающих взаимодействие клеток в колониях, а также о первичном закреплении (адгезии) на субстрате.

Исходя из вышеизложенного, целью данной работы явилось изучение структурно-биохимических особенностей микобактерий (мембранного аппарата, липидного и углеводного состава, морфологии клеток в условиях естественного роста в популяции), роли их в устойчивости микобактерий к дезинфицирующим средствам.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

1.Разработать способ получения нативных мембран микобактерий и исследовать их характеристики.

2.Изучить действие дезинфектантов (катамина АБ, ДП-2 и кальция гипохлорита нейтрального марки Б) на оксидазы и дегид-рогеназы микобактерий.

3.Изучить методом газожидкостной хроматографии состав жирных кислот и углеводов микобактерий.

4.Изучить морфологию различных видов микобактерий в условиях их естественного роста в популяции.

Научная новизна. Разработан способ получения мембран микобактерий, в которых сохранена активность ферментов дыхательной цепи. Исследовано воздействие катамина АБ, кальция гипохлорита нейтрального марки Б (КГН-Б), ДП-2 на оксидазы и дегидрогеназы

- Б -

микобактерий. Изучен качественный и количественный состав моносахаров и жирных кислот микобактерий. Получены новые данные о морфологии поверхностных структур различных видов микобактерий в условиях их естественного роста в популяции.

Практическая значимость. Показана возможность использования мембранных препаратов микобактерий в качестве чувствительного биохимического теста при оценке эффективности антибактериальных препаратов. Способ получения нативных мембран микобактерий включен в "Методические рекомендации по изучению механизма действия антибактериальных соединений", утвержденные ученым советом Казахского научно-исследовательского ветеринарного института 20 мая 1992 года.

Апробация работы. Результаты работы доложены ка:

1) конкурсе научных работ института биохимии им. А.Н.Баха (Москва, 1987; 2-е место);

2) конференции молодых ученых КазНИВИ (Алма-Ата, 1987);

3) конференции молодых ученых института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (Пущино, 1988);

4) конференции профессорско-преподавательского состава Целиноградского СХИ (Целиноград, 1988);

5) конференции молодых ученых ВНМВС (Москва, 1989; 1-е место);

6) конференции "Экологические проблемы ветеринарной санитарии" (Москва, 1993);

7) межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (Москва, апрель 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ. Одна

работа находится в печати.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на

страницах машинописного текста, иллюстрирована ^ таблицами,^ рисунками, сканограммами. Состоит из оглавления, введения,

обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, приложения. Список использованной литературы содержит^^сточни-ков, из которых работ исследователей содружества независимых государств и 7$ работ зарубежных исследователей.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Экспериментальная работа по теме диссертации проводилась нами в 1987-1990 г.г. в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВС, лаборатории функциональной биохимии мембран института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР. Раздел работы, посвященный изучению состава жирных кислот и моносахаров микобактерий выполнен совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Московской медицинской Академии (ММА) им. И.М.Сеченова.

В работе использованы паспортизированные лабораторные штаммы микобактерий, полученные из ВГНКИ: М. bovis (шт. N 8), М. avium (шт. Юсковец), М. fortuitum, М. phlel. Микобактерии М. tuberculosis (шт. H37Rv), М. smegmatis, М. scrofulaceum, М. kan-sasll предоставлены сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова. Micrococcus luteus (lysodelktlcus), шт. Флеминга и Staphilococcus aureus, тт. 209 Р получены из лаборатории функциональной биохимии мембран института биохимии им. А.А.Баха. Микрококк и стафилококк мы использовали для сравнения характеристик мембранных препаратов микобактерий с таковыми стафилококка и микрококка. Все использованные в работе культуры бактерий обладали типичными культурально-морфологически-ми свойствами.

Бактерии указанных видов культивировали на стандартных, пи-

тательных средах: микобактерии - средах Левенштейна-Йенсена, Со-тона (для получения мембран), Финн-II (для исследования жирных кислот и моносахаров); клетки микрококка и стафилококка выращивали на мясопептонной среде следующего состава: мясная вода (1:2), 1Z пептон, 05% NaCl, pH 7,2.

Культуры микобактерий M.phlel, M.fortultum, M.kansasil,M.B-5, М. srnegmatls, М. scrofulaceum использовали после 7-суточной инкубации, М. avium - после 12-суточной, а М. bovis, М.tuberculosis -пссле 20-суточной инкубации на среде при 37°С. Стафилококк и микрококк использовали в виде суточной культуры, выращенной при 37°С.

В работе использовали дезинфектанты: катамин АБ, ДП-2, КГН-Б. Препарат ДП-2 представляет собой композицию на основе трихлоризо-цианурозой кислоты: трихлоризоциануровая кислота - 50%, триполи-фосфат натрия - 30%, карбонат натрия - 19,6%, сульфанол - 0,4%. Содержание активного хлора (ДВ) - 42,2%. Катамин АБ (алкилдиме-тилбензиламмонийхлорид) относится к катионным детергентам. КГН-Б-хлсрсодержащий препарат (содержание активного хлора по ДВ 30%). Это современные препараты, выпускаемые отечественной промышленностью крупнотоннажно.

Мембраны микрококка получали путем лизиса бактерий под действием лизоцима (Островский Д.Н.,1973), мембраны стафилококка -путем деструкции клеток ультразвуком с последующим фракционированием (Джемухадзе Г.К.,1982).

Получение мембранных препаратов микобактерий проводили, подбирая различные виды деструкции (ультразвук, обработка прессом типа Хьюза, обработка стеклянными микрошариками диаметром 0,2 мм) с последующим фракционированием. Учитывая большую гидрофобность микобактерий, клетки предварительно обрабатывали в гомогенизаторе типа Поттера-Эльвейма. Контроль полученных мембранных препара-

тов проводили: а) определением эндогенного дыхания (полярографи-чески); б) исследованием активности мембраносвязанных ферментов (оксидаз, дегидрогеназ, цитохромов); в) исследованием инфракрасного спектра (ИКС). В полученных мембранах микобактерий определяли содержание белка по 1оту Н. еЬ а1.(1951). В работе с мембранами использовали буфер следующего состава: 0,04 М трис-НС1 буфер с 0,001 Ме304, рН 7,4. Ионы магния добавляли в буфер для стабилизации мембран. Схема получения и анализа мембран микобактерий представлена на рисунке 1.

клетки

деструкция: 1)пресс;

2)ультразвук;

3)микропарики;

центрифугирование

20000 е 15 минут

осадок (клеточные стенки,неразрушенные клетки)

надосадочная жидкость

осадок (мембраны)

центрифугирование 144000 % 60 минут

инфракрасная определение определение определение спектроскопия белка активности эндогенного

ферментов дыхания

Рис.1. Схема получения и исследования мембран микобактерий

Инфракрасные спектры снимали с суспензий мембран, нанесенных тонким слоем на германиевую пластинку. Измерения проводили на инфракрасном спектрофотометре UR-10 (Германия). Активности окси-даз определяли на полярографе LP-7 (ЧСФСР) с использованием полярографической ячейки (ШольцК.Ф., Островский Д. Н., 1975). Дегид-рогеназные активности определяли спектрофотометрически по методу Ells А., (1963) по скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофе-нола (ДФИ). Исследования проводили на спектрофотометре СФ-26 с регистрирующей приставкой при длине волны 600 нм. Определение активности цитохромов проводили на дифференциальном спектрофотометре "Hitachi-557" (Япония) по методике Лукояновой М.А. (1985).

Состав тарных кислот и моносахаров микобактерий исследовали методом газожидкостной хроматографии на хроматографе "Hewlett Packard" серии 5880 А (США), снабженном пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой с метилсиликоновой неподвижной фазой. Идентификацию компонентов выполняли с помощью стандартных смесей метиловых эфиров жирных кислот и моносахаров. Содержание эфиров жирных кислот и моносахаров определяли в процентах с помощью управляющей микро-ЭВМ.

Образцы клеток микобактерий для просмотра в сканирующем электронном микроскопе готовили по методике Павловой И.Б., Тара-букиной Н.П. (1983). Электролитические сеточки с образцами микобактерий напыляли платиной (толщина напыления 50 нм) на установке Е-102 (Япония). Препараты просматривали в электронном микроскопе "Hitachi-800" со сканирующей приставкой "Hltachi-8010" (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Полученные результаты исследований обрабатывали вариационно-статистическим методом (Садовский Н.В., 1975).

- 10 -РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение мембран микобактерий и их характеристика Все три использованных нами метода деструкции микобактерий позволяли получить нативные мембраны с сохранившимися ферментативными активностями. Но деструкция с использованием пресса и дальнейшее фракционирование позволяли получить мембраны с наиболее высокими ферментативными активностями. Поэтому в дальнейшей работе с мембранами микобактерий мы использовали этот мэтод получения мембран. В таблице 1 приведена сравнительная характеристика мембран бактерий.

Таблица 1.

Характеристика мембранных препаратов бактерий (п - 7; г - 0,95; Р^. 0,005)

Вид бактерий Выход мембранного белка из 1 г сырой биомассы (мг) Активность ферментов (наномоли окисленного субстрата в минуту на м;1 белка)

оке ид азы дегидрогеказы

НАДН малат лактат НАДН палат лактат

M.phlei 3,9 506,2 0,8 1.8 940,2 4,8 8,9

М.В-5 4,2 490,4 1.0 1.6 876,4 4,7 8,7

M.fortultum 4,1 482,6 0,7 1.4 790,8 4,9 8,2

М.bovis 3,7 474,4 0,8 1,4 820,4 4,6 8,4

Staph.aureus 4,3 220,4 42,2 30,4 420,6 148,6 120,4

Micrococcus 4,1 370,6 70,4 32,2 780,0 264,2 220,3

luteus

Как видно из данных, представленных в таблице 1, для микобактерий характерна высокая активность НАДН-оксидаз и НАДН-дегид-рогеназ. При использовании в качестве экзогенных субстратов мала-та и лактата дегидрогеназкые и оксидазные активности оказались низкими. Повторяемость этой закономерности для всех трех использованных методов выделения мембран микобактерий позволяет считать, что небольшие активности при использовании вышеуказанных субстратов яеляются не следствием воздействия процесса разрушения, а отражают особенности набора переносчиков дыхательной цепи микобактерий.

Отсутствие эндогенного дыхания и данные инфракрасной спектроскопии свидетельствуют о том, что конечный продукт содержит изолированные мембраны.

Нами получены мембранные препараты М. phlei, М. В-5, М. bovis, М. fortultum. В дальнейшей работе при исследовании действия дезинфектантов на мембраносвязанные ферменты микобактерий мы использовали мембранные препараты микобактерий М. В-5, М. phlel. Такой выбор сделан по следутопдам причинам:

1)эти штаммы микобактерий являются быстрорастущими сапрофи-тами и безопасны в работе;

2)по устойчивости к нагреванию, различным химическим препаратам превосходят большинство микобактерий, а штамм В-б используется как тест-культура при контроле дезинфекции при туберкулезе.

Во всех мембранных препаратах, полученных с использованием разных методов деструкции клеток, анализ дифференциальных спектров поглощения цитохромов показал наличие цитохромов а и §2 с максимумами поглощения при 602 и 627 нм соответственно,цитохрома в при 560 нм и цитохрома с - при 550 нм, что коррелирует с данными Prasad А. et al.,1976.

Изучение действия дезинфицирующих средств на оксидааы и дегидрогеназы микобактерий

Исследовали действие катамина АБ, КГН-Б и ДП-2 на оксидазы и дегидрогеназы микобактерий. Эти ферменты являются одними из ключевых в дыхательной цепи микобактерий. Кроме того, можно количественно регистрировать степень ингибирования при воздействии на них различных химических веществ. Это особенно важно на наш взгляд, так как в последнее время мембранные препараты бактерий используются при тестировании лекарственных препаратов, обладающих антибактериальным действием (Островский Д.Н. Д'апрельянц А.С.,Лукоянова М.А., 1983; Скопинская С.Н.,1984;).

Учитывая что активности оксидаз и дегидрогеназ микобактерий при использовании в качестве субстратов малата и лактата были низкими, исследовали действие дезинфектантов на НАДН-сксидазу и НАДН-дегидрогеназу.

Установили, что катамин АБ ингибирует активность этих ферментов в небольших концентрациях (10-15 ют/мл), что подтверждает данные литературы, согласно которым ферменты дыхательной цепи являются одной из главных мишеней при действии ПАВ на бактерии (Джемухадзе Г.К.,1982; Helenius А., Simons К.,1978).

При воздействии небольших концентраций ДП-2 и КГЛ-Б (до 2 мг/мл для ДП-2 и 1 мг/мл для КГН-Б) наблюдали небольшое увеличение НАДН-оксидазной активности, а при более высоких концентрациях препаратов происходит ингибирование активности фермэнта.

Обнаружено, что полное ингибирование НАДН-оксидазы у M.phlei происходило при воздействии ДП-2 при концентрации 4 мг/мл; КГН-Б - 2,4 мг/мл. Для микобактерий М.шт.В-5 эти данные составили следующие значения: ДП-2 - 2,8 мг/мл; КГН-Б - 1,5 мг/мл.

При воздействии дезинфектантов на НАДН-дегидрогеназу полное ингибирозание активности фермента происходило у М. рЬ1е1 при концентрации ДП-2 5,8 мг/мл; КГН-Б - 1,3 мг/мл. У микобактерий шт.В-5 эти величины составили 5 мг/мл (ДП-2) и 0,5 мг/мл (КГН-Б).

Анализируя полученные нами результаты можно сделать заключение, что НАДН-оксидаза и НАДН-дегидрогеназа М. рЬ1е1 оказались более устойчивыми, чем таковые у М. В-5. КГН-Б оказался препаратом, который ингибирует активности дыхательных ферментов микобактерий в меньших концентрациях, чем ДП-2. Эти результаты полностью коррелируют с бактерицидной способностью данных препаратов, изученной Путиной Т.Г.(1989).

Исследование .тарных кислот и моносахаров микобактерий Учитывая важную роль этих соединений в биологии микобактерий, их возможную роль в устойчивости этих микроорганизмов во внешней среде, нами проведено исследование качественного и количественного состава гарных кисл от и моносахаров микобактерий методом газожидкостной хроматографии.

В исследованных образцах микобактерий идентифицированы жирные кислоты с алифатической цепью насыщенные прямоцепочечные от миристиковой (14:0) до гексакозановой (26:0). Из ненасыщенных жирных кислот доминирующей была октадеценовая (18:1) кислота (таблица 2 ; п - 7; г - 0,95; Р^. 0,05)

Для всех изученных видов микобактерий характерным явилось высокое суммарное содержание туберкулостеариновой и октадеценовой кислот, которое составило 25-50% от общего содержания изученных жирных кислот.

Таблица 2.

Содержание отдельных жирных кислот у микобактерий (в процентах)

Кисло- М.tuber- М. bo- М.avi- М.smeg- М. phlei M.for- М.кэл- M.scro-

та culosis vis um matls tultum sasli fulaceura

14:0 0,7 0,6 2,6 2,4 3,0 5,6 2,1 0,7

15:0 0,6 0,7 0,5 0,2 0,4 0,3 0,5 0,2

16:1 2,8 2,4 3,8 8,0 4,3 5,9 1,3 2,9

16:0 31,7 26,8 27,2 20,6 36,5 24,0 31,3 22,4

17:0 1,9 4,0 0,4 0,2 0,6 0,2 2,1 0,3

18:2 1,3 0,3 1,8 1,5 5,0 0,2 0 10,1

18:1 16,3 12,2 18,8 31,1 21,1 17,6 21,.'3 43,8

18:0 8,9 11,4 5,1 2,6 6,3 1,9 10,0 10,8

10СНз18:0 22,0 26,9 17,8 14,3 10,3 24,5 16,3 0

22:0 0,4 0,7 1,4 0,4 1,1 2,8 2,3 0,1

24:0 1,4 2,9 6,7 2,3 2,6 9,4 4,i) 0,3

26:0 3,6 3,7 1,8 0,8 0,6 0,3 0,0 0

18:1+

10СН318:0 38,3 39,1 36,6 45,4 31,4 42,1 38,1 43,8

(26:0)

(24:0) 2,7 1,3 0,3 0,4 0,2 0,03 0 0,4

(22:0)+

(24:0) 1,8 3,6 8,1 2,7 3,7 12,2 6,8 0,4

Примечания: 1) первая цифра оаначает число углеродных атомов в молекуле кислоты, вторая - число ненасыщенных двойных сЕязей;

2) жирные кислоты: 10СНз18:0 - туберкулостеаркнозая,

14:0- миристиновая, 15:0 - пентадекановая, 16:1 - гекс&дэценовая, 16:0- гексадекановая,17:0 - гептадекановая, 18:2 - гептсцэциловая,

18:1 - октадеценовая,18:0 - октадекановая, 22:0- докозановая, 24:0 - тетракозановая, 26:0 - гексакозановая.

Как видно из результатов исследований, представленных в таблице 2, наибольшее сходство по составу жирных кислот с М. bovis имел вид М. tuberculosis. Это подтвердило ранее полученные данные о близком сходстве их белковых спектров с высоким значением коэффициента корреляции (г-0,95) (Бадукшанова Н.М.,1985). Характерным для микобактерий туберкулеза явилось высокое содержание гексако-зановой кислоты (26:0). Процентное содержание тетракозановой кислоты' (24:0) у этих микобактерий было меньше, чем гексакозановой. Культура М. bovis отличалась наибольшим процентным содержанием туберкулостеариновой и гептадекановой кислот.

Для оценки патогенности микобактерий предложено использовать отношение суммы ненасыщенных и насыщенных кислот, которое ниже у большинства патогенных видов и имеет наивысшее значение у сапро-фитов. В связи с тем, что в процессе роста микобактерий образование туберкулостеариновой кислоты происходит из октадеценовой, суммарное содержание этих кислот оказывается постоянным (Na^deakar А.К.,1982).

Нам обнаружено,что в отличие от М. tuberculosis и М. bovis в клетках атипичных микобактерий содержание тетракозановой кислоты выше,чем гексакозановой, а отношение этих кислот было меньше 1.

'Клетки М. avium характеризовались высоким содержанием мирис-тиновой и тетракозановой кислот, низкими значениями туберкулостеариновой кислоты, а сумма докозановой и тетракозановой кислот в 4,5 раза превышала таковую у М. tuberculosis. Полученные нами сведения по составу жирных кислот М.avium, как и данные нуклео-тидного состава да и состава белковых фракций могут служить дополнительным критерием в дифференциации этого вида от М. tuber-

- 16 -

culosis (Бадукшанова H.M.,1985).

При исследовании М. kansasii установлено, что концентрация тетракозановой кислоты была больше гексакозановой (4,5 и 0,6 соответственно), а между миристиновой и пальмитиновой кислотами выделялся компонент, характерный для этого вида.

У клеток М. smegmatis на хроматографе между пентздеканозой и гексадеценовой кислотами определялся компонент, который у других видов микобактерий практически отсутствовал.

Атипичные микобактерии значительно отличались по количественному содержанию ряда жирных кислот от микобактерий туберкулеза. Сумма тетракозановой и доказановой кислот у них (за исключением М. scrofulaceum и М. smegmatís) была больше, чем у микобактерий туберкулеза; отношение гексакозановой кислоты к тетракозановой было низкое.

Исследование углеводных компонентов показало, что у всех изученных видов микобактерий присутствуют следующие моносахара: арабиноза, манноза, галактоза, глюкоза, рамноза и миопнозитол. Результаты по исследованию моносахаров микобактерий представлены в таблице 3.

Все изученные микобактерии содержали незначительное количество рамнозы (от 0 у U. phlel до 5,4% у М. scrofulaceurr). Большую часть углеводов микобактерий составляла глюкоза - от 13,4% у

М. tuberculosis до 69,7% у M.kansasli. Микобактерии М.

i

tuberculosis отличались пониженным содержанием глюкозы - 13,4%, что является наименьшим значением среди исследованных уккроорга-низмов. Для микобактерий 1-1II групп по Раньону (М. kansasii, М. scrofulaceum, М. avium) характерно пониженное содержание арабино-зы, галактозы, миоинозитола по сравнению с другими видами микобактерий. Быстрорастущие микобактерии (IY группа по Раньону): И.

рЫе1, М. ГогШИш, М. вте^а^в по сравнению с другими исследованными видами микобактерий содержали почти вдвое меньше рамнозы.

Таблица 3. ' Содержание моносахаров в клетках микобактерий (П - 7; г - 0,95; Р < 0,05)

Моносахар 1 2 3 4 5 6 7 8

арабиноза 27,2 12,7 17,2 6,9 4,1 38,2 22,2 21,0

рачноза 0,7 1.3 1,5 0,4 5,4 0,4 0 1,2

манноза 24,3 28,0 22,2 12,5 41,1 8,5 18,4 16,0

галактоза 18,6 13,6 13,5 5,2 9,5 16,0 11,3 20,3

глюкоза 13,4 32,8 37,1 69,7 31,0 23,2 35,2 32,7

миоинози-тол 15,5 11,6 8,4 5,3 8,9 13,7 12,9 8,8

Примечание: 1 - М. tuberculosis; 5 - М. scrofulaceum;

2-М. bovis; 6-М. smegmatls;

3 - М. avium; * 7 - М. phlel; 4-М. kansasii; 8 - М. fortultum.

Количественный и качественный состав жирных кислот и моносахаров микобактерий наряду с другими биохимическими показателями (состав белковых фракций, содержание нуклеиновых кислот и другие)

может служить в качестве одного из признаков, дифференциации и идентификации микобактерий.

используемых при

Исследование популяции микобактерий в сканируютн электронном микроскопе

Использование оригинальной методики выращивания бактерий с последующим изучением в сканирующем электронном микроскопе позволило изучить морфологию клеток микобактерий в популяции в естественных условиях без нарушения архитектоники колоний.

Методом сканирующей электронной микроскопии нами Пкло выявлено, что независимо от патогенности, возраста, вида не. поверхности колоний микобактерий выявляются покровы. Но их форма и степень развития в большей или меньшей степени различны у разных видов микобактерий.

Морфология покровов колоний микобактерий варьирует незначительно. Зачастую они имеют вид сферических вздутий различной величины. Поверхность покровов может быть бугристой, складчатой, гладкой. Отдельные клетки микобактерий можно наблюдать в участках, где нарушена целостность покрова или по краю колонки.

Установлено, что наиболее сильно развиты покровы у патогенных видов микобактерий. Поверхности микроколоний покрыты плотным покровом. Но если его поверхность у М. bovis была складчатая, бугристая, то у М. tuberculosis - более гладкая.

Покров на поверхности микроколоний М. avium в основном гладкий, волнистый. Он менее развит по сравнению с таковыми у М. bovis и М.tuberculosis. По периферии колоний видны отдельные клетки, имеющие характерное ветвистое строение.

Клетки М. fortultum обычно имели неправильную форму. Они были закрыты общим покровом, однако хорошо просматриваются их кон-

цевые отделы в виде множественных вкраплений в общее гомогенное покрытие, что указывает на меньшую толщину покрова в отличие от такового у М. avium, М. bovis, М. tuberculosis.

Поверхность покровов М. phlel была гладкой. Под покровом хорошо просматриваются очертания клеток. В местах, где нарушена целостность покровов и по периферии колоний бьши видны клетки, находящиеся в ассоциации.

По данным литературы покровы энтеропатогенных микроорганизмов имеют общие детерминанты с полисахаридами гликокаликса кишечника человека и животных. Это позволяет микробным клеткам прилипать (адгезироваться) на специфическом субстрате макроорганизма. Такой способ взаимодействия клеток микроорганизма с клетками хозяина называется специфической адгезией (Павлова И.Б., Куликовский A.B., Ботвинко И.В. и др.,1990).

Кроме того, известен также и неспецифический способ адгезии, когда бактериальные клетки могут прилипать к поверхности твердого субстрата и формировать на своей поверхности покровы, обладающие защитной функцией от абиотических факторов внешней среды.

Очевидно, что покровы на поверхности колоний микобактерий, отличаясь большой гидрофобностью (что связано с большим содержанием в клетках липидов), играют важную роль в устойчивости микобактерий к неблагоприятным факторам и в процессе адгезии.

' С целью изучения морфологии клеток для удаления покрова мы использовали катамин АБ (в концентрации 3-5%), так как известно, что катионные ПАВ растворяют липиды (Рудзит Э.А., Ермаченко В.А., Нещадим Г.Н. и др.,1981). После воздействия катамина АБ происходит снятие покровов. Хорошо просматриваются палочковидные, овальные клетки, находящиеся в ассоциации. Можно наблюдать в отдельных местах остатки покрова.

В фрагментах колоний микобактерий после снятия покровов можно наблюдать участки с гетероморфным ростом. В этих участках наблюдаются шаровидные или овальные крупные и мелкие клетки. ,

Анализ данных литературы позволяет заключить, что диссоциация является одним из естественных процессов, создающих гетерогенность микробной популяции (Пешков М.А.,1955; Милько Е.С.,Егоров Н.С.,1991).

Результаты исследований позволяют заключить, что наблюдаемый гетероморфный рост в колониях микобактерий и имеющий различную степень проявления, является отражением изменчивости, а следовательно, высокой приспособляемости бактерий в зависимости от условий их существования.

Наблюдаемая нами спонтанная Ь-трансформация у микобактерий, проявлением которой является гетероморфный рост в микроколониях, по нашему мнению, способствует выживаемости микобактерий во внешней среде при действии на них разнообразных факторов.

ВЫВОДЫ

1.Разработаны способы получения мембранных препаратов микобактерий, основанные на различных видах деструкции (пресс, ультразвук, стеклянные микрошарики) с последующим фракционированием путем центрифугирования.

2.Полученные мембраны являются нативнкми, с сохранившимися ферментативными активностями. Метод получения мембран микобактерий с использованием для деструкции клеток пресса, позволял изолировать мембраны с наиболее высокими знзиматическими активностями.

3.Установлено, что в полученных мембранных препаратах микобактерий ферментативные активности малат-, лактатоксидаз и ма-

лат-, лактатдегидролгеназ оказались низкими. Для мембран микобак-терий характерны высокие активности НАДН-оксидаз и НАДН-дегидро-геназ.

4.Катамин АБ инактивирует активность НАДН-оксидазы и НАДН-дегидрогеназы микобактерий в концентрации 10-15 мкг/мл, ДП-2 и КГН-Б - 3-6 мг/мл. Ингибирование ферментов М. phlel происходит при больших концентрациях дезинфектантов, чем таковых М.В-5.

5.Полученные по предложенной методике мембраны микобактерий можно использовать для изучения мембранотропного действия антибактериальных препаратов, а также для тестирования химических веществ, обладающих антибактериальным действием.

6.Показано, что все изученные виды микобактерий имеют индивидуальный состав жирных кислот. В исследованных образцах идентифицированы жирные кислоты с алифатической цепью насыщенные прямо-цепочечные от миристиновой (14:0) до гексакозановой. Из ненасыщенных жирных кислот у микобактерий доминирует октадеценовая. Ми-кобактерии туберкулеза отличаются повышенным содержанием гексакозановой кислоты.

7.Установлено, что различные виды микобактерий имеют количественные различия по изученным моносахарам: арабинозе, маннозе, галактозе, рамнозе, сахарозе, миоинозитолу. Преобладающим моносахаридом у микобактерий была глюкоза (от 13,4% у М. tuberculosis до 69,7% у М. kansasli). Все изученные виды микобактерий характеризовались небольшим количеством рамнозы (от О у М. phlel до 5,4% у М. scrofulaceum).

8.Выявленные различия в составе жирных кислот и моносахаров микобактерий могут служить в качестве дополнительного признака при дифференциации микобактерий.

9.Изучение колоний микобактерий с помощью сканирующей элект-

ронной микроскопии показало наличие покрова на поверхности колоний, что подтверждает полученные ранее данные по другим видам микобактерий. После снятия покровов хорошо просматриваются клетки, находящиеся в ассоциации, наблюдаются участки гетерсморфного роста.

Предложения для практики

1.Предложен способ получения мембран микобактерий о сохранившимися ферментативными активностями, пригодный для тестирования химических соединении, обладающих антибактериальным действием. Он включен в "Методические рекомендации по изучению механизма действия антибактериальных соединений", утвержденные ученом советом Казахского НИШ 20 мая 1992 года.

2.Выявленные количественные и качественные различия жирных кислот и моносахаров микобактерий можно использовать в качестве дополнительных признаков при дифференциации и идентификации микобактерий.

Описок работ, опубликованных по теме диссертации

1.Досанов К.Ш., Сулейменов М.К., Нуркисаева Л.Н. Действие гипохлорита кальция на ультраструктуру и дыхательную активность микобактерий. - Совершенствование мер борьбы с бруцеллезом и туберкулёзом сельскохозяйственных животных.- Сб. науч. трудов Каз-НИВИ.-Алма-Ата-1986.-С.186-191.

2.Капрельянц A.C., Сулейменов М.К., Эль-Регистан Г.И., Островский Д.Н. Фенольные липиды - стабилизаторы мембран бактерий.// Мат.советско-болгарского симпозиума.-София.-1987.-С.55.

3.Досанов К.Ш., Сулейменов М.К., Нуркисаева Л.Н., Ли Л. А. Действие катионных ПАВ на мембраны бактерий.- Проблемы экологии в

ветеринарной медицине.// Всес. науч.-практ. конф.,Воронеж,1989.-М.,1989.-С.123.

4.Досанов К.Ш., Сулейменов М.К., Дермичева С.Г. Структурно-функциональные изменения микобактерий после воздействия препарата ДП-2.- Сб. науч. трудов КазШШИ.- Алма-Ата.-1990 (в печати).

5.Воробьев A.A., Куликовский A.B., Бадукшанова Н. М., Сулейменов М.К. , Яотоцкая P.A. Использование физико-химических и электронно-микроскопических методов в дифференциации микобактерий. //Доклады ВАСХНИЛ.-1991.-N5.-С.48-52.

6.Сулейменов М.К., Бадукшанова Н.М., Досанов К.Ш. Исследование состава жирных кислот микобактерий методом газожидкостной хроматографии. //Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана.-1991.-N12.-С.65-70.

7.Сулейменов М.К. Бактериальные мембраны как модель для изучения механизма действия дезинфицирующих средств.-Проблемы ветеринарной санитарии. //Сб. науч. трудов молодых ученых.- М.,1992.-Т.1.-С.65-70.

8.Сулейменов М.К. Исследование состава моносахаров и жирных кислот микобактерий.- Проблемы развития животноводства и кормопроизводства Северного Казахстана в современных условиях. //Науч.-практ. конф.: Тез. докл.- Петропавловск,1992.- С.69-71.

9.Досанов К.Ш., Дермичева С.Г., Сулейменов М.К., Нуркисаева Л.Н. Экология микобактерий при воздействии хлорсодержащих препаратов. - Экологические проблемы ветеринарной санитарии. // Науч.-практ. конф.: Тез.докл. - М.,1993.- С.36.

Москва, ВНЙИВСГЭ, 1993 г. 3aK.N ¿/'S/? Тир. 80 экз.