Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Культивирование ротавируса крупного рогатого скота

ШН1С7ЕРСТВ0 СШСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА I ПРОДОВОЛЬСТВЛ 7КРА1ЕИ

. УКРА1НСШЙ ДЕРЕАЗНКЙ' АГРАРЕИЙ УШВЕРСИТЕГ " "! Г На правах рукогшсу

СОБКО 10512 Лнатол1йов!п

ШЬТИВЛЗАНЯЯ РОТЛВ1Р7С7 ВЕЛИКОI РОГАТО! ХЗДОБИ

1

16.00.03 - ветерзшарна м1кроб1олог1я, в(русолог!я, еп!зоотолог1я, и!колог1я 1 1мунолог1я

АВТОРЕФЕРАТ

дисертац! 1 на здсбуття наукового ступеня кандидата вегерииарнях наук

Ки1в - 1993

Робота виконана на кафедр! ц1кроб1олог11 та в1русодог11 Укра1нс1кого Державного аграрного ун!вэроитвту.

Науковгй кер1вник - доктор <Иолог1чшсс наук,

професор, член-кор. УААН 0нуфр1ев В.П.

0§1цШн1-олоненти - доктор ветеринарних наук,

член-кор. УШ Фуко П.П. - кандидат ветеринарних наун. Главацький В.П.- -'

Еров1даа орган1зац1я: - Хярк1вський зооветерянарний

1нстатут

Захисг дасертад!! в1дбудегься •*_"__1994 р,

р __годин • в Тк^а!пськоиу дбрхавпоыу аграрное ун!верси-

тет1 на заЫданн! спец1ал1зовано1 ради Д.120.71.03 за адресов: 252041, и.Ки1в-41, вуд. ПотахШа, 16, уч. корп. 12, ауд. 412.

Просимо взяги участь в обговорены I дисертацП при !! захиот! асЗо нед1сдаги Ваш в!дгук на автореферат за адресов: .252041, ц.Ки!в-41, вул. Геро1в Оборона, 15, УДАУ, сектор захисту дасертац{й.:

8 дисертащею и окна ознайоштись в <31<3д10тац1 Укра1псысого державного аграрного ув1верситету.

Автореферат роз!слааий-"_"___ 1994 р.

Вчвний секретар слвц1ал1зовано1 вчено!.радд, профеоор.

Бортн1чук В.Д.

I. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОЕОТИ

Актуального, теми. Берех1д тварпншщтва на прошслову основу створив иову еколог1чку ситуац!ю, яка вплинула на характер 1н$екц1йно1 патолог[{. В умовах кояцентрацП велико I К1лькост! тварин на обмежензх плотах, практично пост!йноа присуипстю молодняка - неМ^льш сприйнягливо! частини погол1в"я, створэаться специф1чя1 умовп дая широкого розповсшднення в!русних захворво-вань. Велшсу штому вагу серед цтс захворюЕанъ займаигь еятерпти-твлят в1русно1 ет1ояогП.

Ротав^русна Д1арея телят зай.чае особливэ Ысца в 1пфекд1йн1Э патологи новонародаеннх. Бона сгароко роздовсэдкека в твариншщь-кях господарствах б1льшост1 кра!н свхгу з розвинуткм скотарство:л /Коромислов Г.Ф. та ппи, 1980, В^Нср яе »г йt , 1974; Ои^еНатЙй е[ «I , 1979,- Ко/И В., 1979; 1Ш ПнЩ 113. с! а1. , 1976; ЯоЫа I «Ы.,1976; ТА г! 0^,1979/. .

Ротав!русна д!арея телят - це ¡нфекцШ'е захворншання ново-народаенях телят впгсм в!д I до 14 ДН1В, яке вгкликаегься рота-_ в1русом I характеризуешься ураженняц тонкого в1дц!лу кишечника, супроЕодауеться поносои, обезводнэнням орган1зму, похудпшям I часто закпгчуегься загибеллы. Захворввання широко розловсюдаено серед молодняка велико! рогато! худоби, наносить велик I еконош.ч-1Ц збитки за рахунок внсоко! смертности захвор1вшиг телят, в1д-ставання ТЕарин у рост1 та розвитку, вибраковки та зниження 1х племшно! цшнооп, а такою збьчкнзккя вартост1 зд!йсш)ваю1х вз-теринарних м1ропризмств. В США, наприклад, економ1чл! збитки вц ротав1русно! д1аре1 телят за 7-р1чний пер:од з 1970 року стаиовшщ щор1чно в}д 3,1 до 8,7 шш.дояар1Б / Цоибй^.Л, 1978/. В Англ 11 30 $ спадах¿в серед новонародаенах телят пов"язано з ротав!русною ¡нфекд1еа, при цьому захворюванхсть тварин складаз вщ 50 до 100 %, а летальшстъ - до 50 % вЦ числа затвор!вдлх телят /Я^г НШ, У.'оо&г ЬЛ, 1978/.

Вивчення ротав1русно! 1нфокцИ мае валике актуально значения, Ротав1руси з голов1пши ет!олог1чнши агентами гострих В1рус-них гастроэнтеритхв вс^х основнтс вид1в домаишх тварин. Вони викликають гастроеятерют I у д{тей.

Ротав1руси до недавяього часу ке були адгптоЕан! до розмно-ження в культур 1 га 1тин.

Ротав^русз, ЯК1 враяають р!знюс тварин 1 лшдану, погано

розмнояулться в культур! кл!тин i всi спроби адаптащi клШчних !золят!в зак1нчувались невдачею. Це i до цього часу залишазться серйозноэ перешкодоэ на шляху да 1х детального вивчення, створзя-ня дiагностачках засоб1в та ефективних вакцинних препарат1в.

tora i завдаиня доол!джень. г/.етсшданого дссуйдасення являлась оитим1зац!я умов, вирощування ротав!русу велико! рогато! худоби в eoctí2hí3 niai I кл!тин, для яарощувашш його в великих масштабах.

Для II досягнення були визначен! сл!душч! завдаиня:

- вибрати один-два штаии ротав1русу велико! рогато! худоби як модел1 для досл!дкень;

- п!дШрати метод к1льк!сного визначення ш1сту poTaBipycy в кулыгуральиИ рИдтй;

- визначити найб1лыа чутливу до Bipycy шйтшшу систему;

- оцткшзувати уаюви шрощуваиня ротав1русу велико! рогато! худоби в чутлив!й пост!йн1й л!нИ юитин'.

Наукова новизна. Вперша доклздко вивчеп! факторп, як i впди-вавть на нако1шчення'ротав!русу в nocTiüfri2 лш! mí тин та вез-яачэн! оатшлальн1 умови його культивування.

Розроблекяй шкромегод титрування 1нд>екц1йно1 активност! ро-raBipycy велико! рогато! худоба по бляшках в посг(йн1й л!нП кл (тин Г/ОВК. 3 допоиогою методу бляшок по S- ознащ дана характеристика чотирьои в!тчизняшм еп!зоотичшш i одному референтному шташв! poiaBipycy велико! рогато! худоби.

Влготовдена•нова достойна лш!я кд1гин кяркд ембр!ону корови ПТК, яка по чутливост; до ротав1русу не. поступаеться лШI клхтив 110Ш.

Практична nimticTb роботи. Розробленяй регламент культивуваи ия poraBipycy велико! рогато! :судоби дозволив отридати необх!дну к!льк1сть BipycBMicTKoro датер!алу для изготовления екслеримен-талышх зразк!в вакцвни, д1агностшсуг.йв ! 1муноглобул1ну.

OoKQBHt положения, ао виносяться на захист. досл1дно-про;.ыс-ловий регламент культивування ротав1русу велико! рогато! худоба в стад!оиаргшх i обертових умовах, прл здШкеып якого викорисгс вувться розроблен! нами: •

- мшродгатод титрування 1кфекц1йно1 активност! ротав!русу В£ лико! рогато! худоби по бляшках в культур! кл!тин МОВК;

- нова поег1йна л!н1я кл!тин нирки ембрЮка корови;

- кл!тшта систейа, чутлива до ротав1русу велико! рогато! худоби;

- оптшальн! ум он и культикування ротав!русу велико! рогато! худоби.

Апробац1я робота. Основн!.положения дасертацН влкладэн! на коиференцИ acntpaHTiB I викладач1в ветеринарного факультету 7кра1нсько1 сiльськогосподЕрсъкоI академП, м.Кл!в, 193S р., на Всесоюзному спмпоз1ум! "Etoxlbiifl Ыльськогосподарськжх тварин i Продовольча програма", и.Ки!в, 1939 р., а такох на розлиреноиу за— с1данн! кафедр оп1зоотолог!1, г.йкроб1олог11 i в!русологН 7кра!н-ського Державного аграрного университету / груде га./ 1993 р./

Публ!кад11. За катер¡ала:.а Д2сертац!2них досл!дйень опубликовано 3 статей i одна монография.

Об"ем i структура дисертащ i. Длсертащйка робота викладена на III стор1нках машинописного тексту t складаеться ¡з введения, огляду л1тератури, влас них досшдаень, обм1ркуЕання результат1в досшдаень, büchoekib, списку Л1тератури t додатку. Робота 1лист-рована 17 таблкцями i 13 ыалзнками. Список л!тературя включав 157 джерел. •

2. BJIACHI Д0СЛ1Д2ЕШ1

Робота виконана в 1986-1990 рр. ва кафедрi м!кроб1ологП i в1русолог11 i в лабораторП вгрусолог;I ветеринарного факультету 7кра1нсько1 с1льськогосподарсько! академП. Електронно-м!кроско-п1чн1 досл}д~окня проводили в ceKTopi електронно! микроскоп:i,, а 1мукоферментний анал!з - в лабораторП д1агностики 7кра1нського науково-досл!дкого ветеринарного 1нстлтуту.

'2.1. пТАТЕР IЛЛИ I МЕТОДИ

Штама Bioycv. Характеристика ресЗерентних 1 еп!зоотичвпх шта-м!в ротаварусу велико! рогато! худоби, використаншс в робот i, приведена в таблпц! I.

Культура юйтин. В робот! використалн первинно-трипсия!зоЕа-ну культуру кл!тин гагркп e.uöpioziy корови - НЕК i пост1йн! лiнi Г кл!тпн: нлрки.ембр1ону корови - MDBK t UTK, легагь ewöpiona корови ЛЕК i нирки еибр!ону сеин! - СЕЕВ.

Первикно-трипспн!зовану культуру юптин НЕК готували за тра-дшцйною методикою прий!ят1й у ЫрусслогН. Пост1йн1 лйШ mitiik п!дтримували шляхом регулярних nepeciaiE через Kosii 4-7 дн1в. Для в!докремлвння кл!тин В1Д скла, при nepecisi,, використовували

Таблица I

Характеристика шташв ротав1русу велико! рогато! худоби

Назва штаму

¡Звдаи отриманий Культури юйтпн Титри Bipycy ¡i в якому роц! ¡i к!лък!сть па- ¡e,™^

casi в

Тivesvaí " Референта! штами

/ Т / BIEB, 1982 LIA - 104 6,0

СНЕВ - 5

и I/rtCCtV " MBA, 1987 НЕК

/L / LIDBK 6,0

ЕШзоотичи! ШТаМЯ

Б1лорусыа£й Б!лоруськи2 НЕК - 5

/Б / НД1ЕВ, IS83 MDBK - 10 6,2

Московский LIBA, 1937 НЕК - 5 5,6

/и/ MDBK - 6

Ровенський В^русолопчна НЕК - 8

/Р / ла^атор!я MDBK - 16 6,3

Датв!йськи2 НЕК - 3

/ Лат / Í.IDBK - 8 6,0

nisirpiTy до 37°С сумiи 0,25 % розчину трипсину i 0,02 % розчпну версену. Культури кл1тнн вирощували в культуральних скляяих посудинах в стац!онариих i умовах очертания при 37°С до утворення су-Ц1льного ионоыару. Ростов! середоввда готували на ochobí середо-Ешца 199, ГЛА 1 1гла з 10 % сироватки кров! велико! рогато! худо-СЗе. Bel погиЕНi середовида utстили по 100 шг/см3 стрептомицину i 100 ОД/сы3 пен!цил!ку.

Для тривалого зсЗер^гашш культур кл!пш внкоркстовувалк редкий азот.

Вирошгвання bIctcvi Штам ротав1русу збер iгели у виглдд1 куль-турально! piamffl в замороженому стан! при uiHyc 20°С. По «еойх1д-кост!, аде не р!дте одного разу в три-ш!сть м!сяц1в BipycHl штамп "освЬхле". Шгеы ротав!русу "7¡v¿«vAf " вирощували в культур! кл1тен СЕЕВ, .а " LiVcof/v еп!зоотичк! отами - в культур! кл!тин MDBK.

Культургльну в!руснаявну р!дину рсзыорожували Шелл внесения розчину трипсину " Dlfec " /США/ в кондентрацП 10 мкг/см3 i вит-римували при Б7°С протягом 30 хв.- Перед заражениям культуру кл1-тин, вирощену в культуральних посудинах i3 утвореним кл!тикнш мокошаром /на 3-4 день шеля поЫву/ промизали трич! розчкком Хенкса з аникЯотиками. Pi дину зливали i в культуральну посудину вносили п1дготоЕлену культуральну eyenensin Bipycy. Х'оза заражения - 0,1 TTUIgQ ado 0,1 БУО на юптину. Адсорбц1ю проводили в умо-вах обертання ado в сгагцонаршк - при 37°С протягом I години. ГПсля адсорбщI культуральну суспекзito Bipycy зливали 1 в культуральну посудину вносили п1дтримуюче середовще з трипсином "DifCO" в копцентрацп 2 мкг/см3. Посуд помчали в CTaiuonapHi або обер-тов! /шбидк1сть обертання 12 об/год/ уыови при 37°С.

Як контроль викоркстовувалась не1ж[цкоЕгна культура Mi тин. Китопатичний ефект /ППЕ/ враховувгли за чотирихрестоЕОю системою за допомогощ евгаового микроскопу. При появ1 ЩЕ на три-четири хреста культуральн1 посудпни заыо^зояували при uiHyc I4-20°C i збер1гали до огпдувчого насажу. Для 1д8ити31кацП ротав1русу в культуральноку середовшги використовували метода електронно-шкро-CKoni4iioro доиидмжя, а також 25епрямий ТЕердофазний 1муноперО-ксидазний тест./Сюрш В.Н.,- 1986/. ¡муноперокеддазний тест /15А/ такси використовували з метою визкачения. титру potaBipycnoro антигену.

Контроль матер1ал1в на наявкгсть сторонах BipyciB /контаг.'Л-itaHTiB/ зд1йснювали за допомогою электронно! м!кроскопН. Елект-ронну MiKpocKoniro негативно контрастованих 2 % розчином фосфорно-вольфрамово! кислоти препарат!в проводили на MiKpocKoni ЕВМ-ЮО Л при iнструментглькому зб(льсеЕя1 50 000 раз(в.

BipycBMicTKy культуралыгу р!дину контролавали на бактер1йну забруд!!еи1сть шляхом nociBy на м"ясопептонний бульйон, м"ясопеп-тонний агар, середовще KiTT-Tspoigii. Посгви 1нкубували при 37°С i при к 1:гкат1пй те.'.шератур! протягом 7-10 дн1в.

Досл^ди,проведен! з метою опгп,"Лзац1 i умов кульгивуванкя ро-тав1русу,зд1ПскЕЕали в культурi клiтин MDBK або ПТК, вироеено! в скляних матрасах об"емом 50 см3 або в npodipKax. ДДя косного ва-piaKTy використовували не меш His по три культуральних посудини. Коли ЩЕ охоплвЕав 6i льшэ 75 f ioii тин, культу pa льш посудини помчали в морозильник при MiHyc 20°С, розморожували i матер 1ел

Б

кояного вар 1 airiy пом!щали в одну посудину, п1сля чого трет! ти-трували уЛкроыетодом бляшок.

Титрування ротав1русу по ЦЦЕ проводили в культур1 клггин МОВК, вирощен1й в пробирках. Суспензии Btpycy обробляли трипсином, а в П1ДтрЕмувчв середовице, призначете дая приготування роз-вэдень, додавали, трипсин в концентрац1I Ю глкг/см3. В подалшому титрування i облiк результат1в проводили за методикой, описаною Сергеевым В.A. i Собко 53.А. /1990 р./. Титр ш^екцШгост! Bipycy розрадсоЕували за методом Рида i'"екча i виражали в тканинних цито патичних дозах - ТЦД^/см3.

Титрування Bipycy методом бляшок. Титрування 1н$екц1йност1 ротав^русу велико! рогато! худоби методом бляшок здгйснюевлк в nocTitoiE' лип! iuiiTmi 1.1 DBK або ПТК, вирощешх в скляних матрасах об"емом 50 см3 або в 24-лунковкх пол1стеролових планшетах $1рш " " /Дан!я/.

Постановку ыакроштоду блшок зд12скавали за методикою, описано! iwiib Ё. ))1 . 1з сл1БаЕтораш /1979/.

• Еаки був розроблешк м!крометод титрування !нфекц1йност! ро-. TaBipycy бляшкаки. Методика його описана у розд!л! 2.2. Антирота-BipycHy сироватку до ротавгрусу штаму " Hiv&ivn I " отримували на кролях шляхом ix ri пер1мун!защ! концентрозаним i очищении антигеном з маслянш,! Ед"юванто.\; за схемой розробленсю на кафедр! м!к-роб!ологН ! в!русолог1! ветеринарного факультету УСТА. '

Отриыан! результати були опрацьован! отатистично за методи-каш^як! -описан! Лакигии Г.5. /1980/.

2.2. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСНДШЬ

роз собка м! крокет оду титрування ¡кэдкц1кно! активноот! рота-Bipycy велико! рогато! худоби в культур! клкин бляшками. При оп-тим!зац!1 регламенту кудьтийування ротавгрусу вякикла mo6xiz-н1сть точного визначення титру Bipycy в ведший к1лькост! проб. 3 шею метоп 'був розроблений ы1крометод титрування ротав!русу в культур: юйтин бляшками. Для постановки шкр омет оду культуру кл!тин Ц О ВК або ПТК, вирощену в 24-лушових пол!стеролових пла: шетах, дворазовооЗяолiскували розчином ЗСенксу. Готували десяти-кратн! розведання Bipycyi попередньо обробленого трипсином, на п!дтримувчому середовищ! з трипсином у концентрад1i 10 мкг/см3. Кожним розведаннш Bipycy заражали культуру в«2 лунках 24-лунко-вих панелей. Доза заражения - 0,05 см3 на лунку. Шсля 60 хвилин

но! адсорбцп при S7°C в атмосфер! 5 % COg культуральну суспенз!» Blpycy зливали, ni с ля чого в когну лунку вносили по I см3 I % агарового покриття.

Для приготування 100 ом3 агарового нокриття брали:

- 25 cu3 4 % агару /"Ш^ео", С1к/, п!д!гр!того до 44°С. /Агар готували на 6!дистильоеен!й вод! i стерил!зували автоклаву-ванням при тиску 0,5 атм протягом 30 хв./;

- 0,2 CÍ.Í3 розчину лошцшйну /100 тис. ОД/см3/ i сгрепгом!одну /100 тис. :.эт/си3/;

- 0,2 см3 7,5 £ розчину б!карбонату натрхю;

- 1,0 см3 розчику, що uicTHTb 10 мг/сц3 ОБЛЕ — декстрану 500 ООО /" PhaiinúC'id ИЬеЩя/;

- 0,1 cu3 розчииу, п;о nicTKTb I (¿г/с:.!3 трипсину /"OiftO"

CEA/;

-3,1 см3 Ю-кратко! концентращП розчину Ерла;

- 68,6 см3 середовища ГДА з 1гла з глотанiном.

рН середози^а 7,6 - 7,8.

0бл1к результат!в проводили через 96 годин ¡ккубацп !h$íko-

вано! ротав!русои гштинно! кулвтури в атмосфер! 5 % СОп при 37°С.

¡ШтинниЗ моионар п)д агаровтл покриттям фшсуаали 10 /Гсор:.'лл i -

ном протягом- 40-60 хвилин, додаючи його в козну лунку по дек!лька

краплин. Пот iи агароБв покриття видаляли,а кл!тини фарбували I %

розчкном генц!анв!олету протягом 10-15 хвилин. Шсля цього п1дра-

ховували к!льк!сть блязок в кояному розведенн!.

Титр Bipycy визначили за формулов

Т = Л'_ ,„ к БЗГО/С!.13;

1 0,05/tt t О, К ГоЩ, / х 10 к да: / & к<-1 к+2

^ - зaraльна сука bcíx врахованих бляшок; 0,05 - доза зарахення в си3;

Ю~к - те найданше десятикратне розввдення, при якому ще спос-тор1газться 4iTi«e розшкування бляшок, що знаходяться в лунках, яке дозволяв врахувати !х к i лькi сть;

- число лунок в в!дпов!дошх розведешгях 10~К, lVü4i. в яких проводить обл!к к!лькост! бляшок /20/.

Результата отрпман! при пор1вняльнозд титруванш ротав1русу штаму " LivccíV" макро- i ьмкроыетодом не кали сутгеЕо! досто-BipHoi р!зн:щ! /р ¿ 0,05/. Середши титр Bipycy при титрувакн!

шкролютодоы складав 2,53 х Ю6 БУО/см3, а мшроматодом -2,28 х 10° БУО/см3.

Це свгдчить про те, цо кiкромегод не уступав какрометоду по чутдивост! Í ТОЧПОСТ Í, ТОд! ЯК ВИГ1ДН0 в1др13НЯ8ТЬСЯ В1Д остан-кього еконошчн1стз, продуктивна ста i простотою виконання.

Отриматая ново? постШно! Jitnti кл1тин штоке ембо1она короед /ПТК/. 1з перв1шно-тршсин1зовано1 культура кл1тен ниркя euípioiia коровл /ЕЕК/ шллхоц посл1дови2х nepeciBÍB була отримана постШна -iíhíя kbíthh ПТК. Для цього культуру кл1тин НЕК перемяли через 10 дшв 1нкубування, а через 20 Д1пв був проведений другий суб-■ nacas. Субкультуру другого пасаяу тривалий час /35 Rió/ 1нкубува-ли при 37°С Í3 частковоа або повнои 2а;.шюа ростового середовида через 5-В д1б: На 14 добу п1сля другого субпасажу були пошчеп! окреш осередка irpojiiijapauii еп1тел!отропних кл1тин. На 35-у добу субкультуру перемяли з кое^щенгои posciay 1:3. Юйтинний моно-шар поипстю здормувався па четверту добу i на 90-95 % складався 1з еп1тел1отропЕих кл1тин. II i с ля цього паса:-: i культури кл1тин проводили ноги i 3-4 дн i г коеф1ц!ентом розс!ву 1:3. Починаючи з 47 пгсану KoeJiuieHT розс!ву складав 1:5.

Як ростове серадовища шкористовузали су;л!а сервдовгаца ГЛА з 1гла /Иокровського заводу dionpenapaTiB/ з додеваккям 10 % сиро-ваткп кров! велико! рогато! худоби, 100 ОД/си3 пешцилшу i 100 икг/см3 стрептоы1щгау. рН середовища 7,0-7,2.

Достойна.л!н1я кл1тин нирки ембргону корови /ПТК/ характеризуемся наступними властивостямн: моношароьг. культура кл!тин,яка представлена ештзл10П0д!бници кл! тиками, що розм1щуються в один шар, строк формування моношару в стац10нарних i в обертовия уиои-вах - 3-4. sni при кооф!д1ент1 po3ciEy 1:4 - 1:6} добре фарбуаться за Романовським-Пмза; пек i юйтин ч1тко виражен!.

11ос1вна доза кл1тии для. 1,5 дАх ыатрас!в - 80-100 ТИС .Ю^-ГЕН/СШ3. ■

üocTififiy лшш юйтин ГГГК з ycnixou застосовували:

- для пасакування poiaBipycy велико! рогато! худоби итаму

» Ь'шс.оЬ"»t а також еп13'оотичши штам1в "Ровенський", "Б1лорусь-' кий", "Московський". В nopiBHHBHi з лШеп кл!тин М D ВН опосте-р i га ли (Илып ранн! строки наступання ЦЦЕ;

- дда титрування 1вфекц1йност1 ротав1русу велино1 рогато1 худоби методом бляшок; •

- для характеристики референтного штаыу ротав!русу " L i/VCcC/ "

1 ег^зоотичних шгам!в Б, М, Р 1 Лат за 3- ознакою /розм!р бля-шок п1д агаровим покриттяц/.

Штамов! вШ.инност! ротав!русу велико! рогато! худоби за 3- ознакою в лшН юптин МРВК 1 НТК. Результата вквчення шта-мовнх в!дмшностей за З-ознакоа подан1 в габлиц1 2.

Таблиця 2

Середня плица бляшок, зформованих штамами ротав!руеу велико! рогато! худоби в л1н11 юптин ?,Ш ВК 1 НТК

ЕЗ { } МРВК | ПТК

пп 1 ! ¡середняопло-¡ща, шг ■ ¡стендартн! !в1дхилення юереддяршю-!ща, ы!г I стандартн! 1в1дхилення

I 9,6 ± 0,2 5,2 ± 0,2

2 Лат 9,3 ± 0,2 4,0 ± 0,2

3 Р 8,9 ± 0,2 5,3 ± 0,2

4 Б 8,6 * 0,2 4,9 * 0,2

5 и 7,6 ±0,1 3,4 ±5,2

В л!нп кл1тин МОВК шташ I I Р, Б, М; Лат 1 Б, М; Р 1 Ы; Б ! М ймов!рно в!др1зшышсь одна в!д другого за розм!ром бляшок. В л!н!1 кл1гин ПТК ймов1рно в1др1знялись'одна в!д другого шташ I I Лат, Б, К; Лат 1Р, М;Р 1Б;Б £ М.

Штами I, , Лат 1 Р форыували б1льш крупи! бляшки, яор!вняко !з штамами Б 1 М. Сэредшй розшр бляшок, як1 форьувалися в л 1 н 11 кл!глн 1! О Ш, був лзайге в 2 рази б!льпшы, в1г в НТК.

Моделями для подальыих досл!дЕень по онтим!зац!1 режим1в культивування ротав1русу буливибран! штами " Ца/со///" 1 "Ровен-ський", ао'о "ЕЬюруський", як! в!др!зняються м!ж собою за ступенем адаптацП до культури кл!тин.

0птишзад}я •умов вирощування_ротав!русу велико! рогато! худоби в постгйнШ л!н1! кл!тин. 0птш.1!зац!ю умов вирощування рота:-в1русу зд1йснювали експерикентальним шляхом з врахуванпям л1тера-турних даних.

. На першому етап1 проводили пошук найб!льш чутливо! до в!ру-су культури кл!тин.

В подальшому вивчали вплив на накопичення в!русу в чутливЫ пост!йн1й л1н!1 хл1тин:

- умов заражения кл1тинно! культури /дози заражения, заморо-

яування 1 осв!тлення пос1еного в!русу, адсорбцП/;

ч - умов пкубувакня /температуря I тривалост!, рН Шдтримую-чого середовица, Е1ку ¡пдлковано! культуре кл1тин/;

- обробки трипсином;

- культивувашщ в стащопарних 1 в умовах обертакня.

Виб1р чутливо! юптинно! л!кН. При вибор! чутливо! культу-

ри кл I тин враховували строки проявления ИЕ 1 накопичення в!русу в 5-7 сер Шггх па саза::. Визкачалз чутиппсть посИйних лппй кл1тгк иОВК , ЛЕК 1 НТК. В результат! поргвняльного винчения выявилось, що л1н!1 хл1ткн ЛЕК I СНЕВ не чутлив! до ротав!русу велико! рогато! худоби штацу " Цк'сеС* разом з тим, штам:' "Т|у£'и'й£ " владось адалтувати до кл1тин СНЕВ, в результат! 7 послхдоенкх пасаз1в в присутност! трипсину. Ротав1рус атам " Т\чи\й1п накопичувався у лшП юптин СНЕВ в високих титрах Ю7'5 - Ю3'5 ТЦД^д/см3. В подальшому цей штам буЕ використаний ■ при отримакн: ротавхрусного антигену для Г1пер1.мук13£ц1! лабора-торких ТЕарИН.

Еайб1льп чутливк.ж ¿г культур клхтин виявились Л1нп МОЕК I ПТК. В цих культурах к/лтин ротав^рус птем!в " Цксо£л' " ! "Ровекськй", при стационарному культивуванн!, накопкчувались в титрах 6-7 Ц ТЦД50/см3. ЦПД в 60-70 % моношару кл1тпн виявля— лась через 18-43 годин.

Визкачения оптимально! дози заражения. Для вавчекня впливу дози зар^кення на репродукц!в ротав!русу штаму " Ь\ucoiv " провели по 5 посл|довких пасан!в в1русу в культур! кл!тин МОВК з мтиипстю заражения в1д ОР01 до 10 БУО/кл!тику.

Таблица 3

Вплив дози заражения на репродугаив ротаЕ^русу

тоза заиа^ення, \ ЁУ0/кл!гиЕа па с саза I титр 1Н5екщйН0СТ1, ЕУО/смз /х!0^/

1 1 \ * ! У 1 4 | 1

10,0 '. 7,7 0,006 - - -

1,0 4,5 0,7 0,6 0,7 1,1

0,1 17,7 1,3 С,6 5,4 ' 7,1

0,01 5,3 • 2,9 5,4 7,7 7,3

0,001 10,5 о ъ 4,8 - -

Результате, ягл представлен! в таблищ 2, показудгь, .що при серШншлу цаса."уБан;ц в!русу з киогшистю заражения 1,0-10,0

БУО/клгдшу було Екявлеко значне знииення паколнчення 1н£екц12-них в iрусекс частинок. Було такси псг/Лчено, що при дозах заражения 0,01 - 0,001 БОЕ/юптшу ЩЕ в 50-75 % кл!тин моноиару наступив через 48-120 годин п!сля заражения, водночас, при дез í 0,1 ' Е03/кл1тину - через 18-24 годлни.

2 кетою вивчения влливу мпежшност 1 зарадзння, на накопичення ййекцШнэ: ротав^руслих частинок при разових масових розплод-ках, вiрусон 5-го пасаку /з дозою заражения 0,1 Е70/кл!ткну/1н-ф1кували nocTliíjiy лшЬ кл!тин I.!DBK доза?,¡и 1,0 1 10,0 БУ0/кл1 тину . Титрп tn$eKi;i2HOCTi poiaBipycy даного пасаку склали в!дпо- ' в1дно 2,2 i 2,66x10^ БУО/см3, то приблизно на 0,5 ¿$ перевицуе титр початкового Bipyciioro штер1алу /5-го пасаку/.

Таким чином, при серШному пасаяувашп ротав1русу найб1льш дощлън! дози заражения 0,1-0,01 ЕОЕ/кл!тину. При разоЕИХ вироб-ничих розплодках Bipycy з метоа'пщшщення його накопичення необ-х1дко застооовувати дози зарагення 1,0-10,0 БОЕ на кл1тину.

Вплшз CTpoKiB. температура ¡ккубуваняя i в!ку культури кл1-тин на накопичення ротав1русу. Визначали накопичення poîaBipycy штай1в " Lîvcc£/v" i "Б1лоруськийп в л1ы!I кл1тин Ц О ВК при íh-KytíyEEimi в диапазон! температур 36-£9°С.максимально накопичення йкГ:еки.Шшго Bipycy було при температур! !нкубувакня 36-37°С. При шднлг.еин! тешератури до 38-29°С вих!д Bipycy зменпився в' 10 pa3Í3.

При вивченн! диншл1ки репродукдИ ротав!русу штаму "Li/vcOÎ/v* було встановлено, що при на с та га i ДНЕ в 50-100 % кгптин 1н$1кова-кого моношару вих1д шфекц!йного Bipycy. досягав р1вня 1,79-2,97х хЮ® БОЕ/см3 i не'залегав в!д строк1в 1нкубування /18-48 годин/.

При вивченн! вплкву BiKy культури кл!тин /в д1апазон! - 24 - доби/ було показано, цо накопичення ротав1русу дещо Еище при використанн! культури гайтин S-4 денного BiKy.

Вплив Pïï п!дтристючого середовица на накопичення poTaBipTCy. 3 метою визиачення . оптимального значе1шя рН пвдтримуючого се-редовща було проведено три поаявдовних nacaai poîaBipycy, штаму "Ua/соЫ i один пасаж штаму "Б1лоруськЕй" при р!зних значениях рН /диапазон рН 6,6-5,0/. На протяз1 1нкубуЕашя 1н51ковано1 культури KopeKitiD piï шдтршзуючого серекоЕкда не' проводили.

Було встановлено, що при культивуванн! ротав!русу штаму « íl/vcof* « оптимальний рН середовища.7,0-7,4, а для итаму вБ!лоруський" - 7,0-7,8. '

Умовп адсорбцИ ротав!русу. Вивченз наш тривал1сть адсорб-цп Bipycy - 15 - 90 хвшшн при температур i I8°C i 37°С не ешш-вала на накодичення ротав!русу штам!в " Liivcc£<v" i "Б1лоруський" При заражешп культури юнтин без адсорбдН /внесения Bipycy без-посередаьо в пгдтрпмуюча середовда/ поява ЕДЕ затриыувалось на 6-24 години. Накопичешя !н$екщйного ротав1русу було на толу ж pÍBHi, що i при зараженн! з адсорбц!ею. Таким таном при культиву-ванн! poiaBipycy тривалнй i трудоь'Лсткий етап адсорбцИ ысвно ви-клзчити.

Перед заражениям моношар юптин обпол4скуать збалансованим роз чином сол1 з ыетоз вилучегаш ¡HritíiTopiB, hkí зашкодзують ре-продукцп poiaBipycy. Встановшш такоа, що для максимального на-копзчення poiaBipycy штаму " Li ncoi^" достатньо сполоснути моно-иар юитин перед заражения;.! 1-2 рази. Титр пйекц1йност1 Bipycy при цьому шдвищувався в 10 pasiB.

Такоа було Есгановлепо, щообпол1скування коношару культури кл i тин п!сля адсорбц!! Bipycy дае мсшпшсть значно шдвидити вих1Д !нйекцгйиого ротав!русу ита\Нв "lÍNCCÍ*" i "БморусышЗ" на 0,6-1,0 tg Б70/см3.'

Заноролсузання i осв!Тлення суспекзЛ посгвного Bipycy. Вкв-чалк вплив процедури замороауЕання /в1Д I до 10 раз1в/ i осветления низысоавцдк^ним центркфугуванням Bipycnoí суспензП на накопкчекня poraBipycy в пйЛковашй культур! хслхтин. В результат! проведение дослав Естановшш, що при серейному пасажуван-hí осв1Тлення EipycHoro шокуляту не вплигае ка накопячення рота-Bipycy. Кратн1сть заморобувания вирусного ¡нокуляту iaKos не впливала на накоппчення Bipycy, i тхлыш Ю-кратне заморохування викликало зшпенкя вгссоду ротав1русу на 0,5 ТЦДдд/см3.

Вплив трипсину на репродуица ротав1русу. Вивчали вплив трипсину на репродукц!и ротав1русу велико! рогато! худоби штаму " Ll/v C-ob» " в культур i клётик !.'. О ВК . 3 Ц1еа метоо вихористовува-ли pi3Hi концентрацН трипсину /" Difco ССА/ душ обробкд bí-русного шокуляту i для внесения фермента в ¡пдтримуюче середо-вище /таблица 4/. Заражена культура юптин трипсином 1нкубуЕа-лась при 37°С протягом 30 хвилин.

Результата^пргдстаЕлзнi ,в таблиц! 4, показують, що оптимальна концентрац!я трипсину в п!дтрииуючому середовищ 2,5 мкг/су3, а для обробжи BipycEoro iнокуляту 10-20 мнг/см3. Таким чином,

Таблиця 4'

Вшшз трипсину на репродукцию рогав1русу штаму " I ¡УС-О^" в культур! кл!тин М О БК

Конце нтрац!я трипсину в шдтримуючому середовищ1,

МКг/сМ3 _

Титр 1нфекц1йноот1 ротав!русу, БГО/см3 /хЮ /

концентрацТя трипсину при ойробц! в1русу перед заражениям, мкг/см3

1 5,0 I 10,0 ! 20,0 I 50,0

4

I

I 100,0

!__

О • 1,0 2,0 5,0 10,0 20,0

0,13 0,42

1.2 2,2

2,5

3.1 5,3 4,8 1,1

1.2

2,7 5,7

I,6 0,7 4,6 1,1

* - но визначали

трипсин значно вшшваэ на репродукщю рогав1русу, в тому числ! I адзптоЕаного до культура шптин.

СтацЮнарке 1 голерне культивування. При пор1вкянн! стац[о-карного 1 ролерного способ Iв культиЕування ротав1русу штам1в " 11*001*" 1 "РОЕенськпЗ" в культуры-кл!тин М О ВК , були ствер-дгеп1 дан! ¿итератури. Тйк при ролерному культивуванн! накопп-чешш вирусу в 10-100 разхз б1льше нЬа при стац10нарному.

3. В И СНОВКИ

1. Отршана постИна л!н1я клггин ВТК ¡з первшшо! культура хл1тин пирки ембр10на корови, яка за чутлив!стю до цитопато-гешгах тта;л1в ротав^русу велико? рогато! худоби аналогична

!.' О ЕК.

2. Визначен1 оптимальн! уыови накоаичешщ двох штам!в рота-вв!русу велико! рогато! худоба в пост13них л!н1ях кл!тин МОЕК

I ПТК:

.- перед !нокуляц{ез дворазовеобяол1скування кл1тинного моношару збалансованшл сольовим роз чином;

- введения трипсину в концентрацН 2-5 :,кг/см3 в п¡дтримую-че серадоЕЗДз;

- рН п1дтриму»чого середовища 7,0-7,4;

- обробка BtpyoBiiicTKoro матер 1алу трипсином у к!нцев1й коя-шнтрацН 10-20 мкг/см3 п1сля одного циклу заморожування-в1дтаю-вання ;

- доза заражения 0,1-0,01 БУО на кл1тину;

. - культизування при 37°С в обертових умовах до зруйнування 50-75 % моношару кл1тин.

При вказаних умовах штам " Li t/totfi " максимально накоюту-вазся/7,7-8,4 РоТЦ^о/см3/ че :н, а штам "Ровэнський"

3. При масових розплодках Bipycy необх1дно використовувати MHOsHHHicTb заражения /1,0-10,0 БУО на юптину/, вносячи sipyc-ний 1нокуяят безпосередньо в полизне середовище.

Шдвищення виходу Bipycy, крш того, досягаетъся за рахунок Boro адсорбцП на клхтинах / 30 хвилин/ з посл1дуючим ввдаленням BipycHoi р1дини i однораз овшсбг.олiскуванням моношару п1дтримуи-чим середовищем.

4. Розроблений мiкрометод тигруванпя ротав!русу велико! рогато! худоби по бляшках, який В1др1зняеться В1Д 1снувчих еконо-MiiHicra, простотою виконання i дозволяе отримати Б1дтворююч1 результаты.

5. Популяцп БЕвчених итаи1в ротав1русу Еелико! рогато! худоби В1др1зняаться один В1Д другого за S- ознаков.

Розроблеы! "Доыпдно-лромксловий регламент культивування porasipycy велико! рогато! худоби" в nocTiiöiifi л1нхi юнтин К О ВК" i "Cnocid титрування poiaBipycy велико! poraioi худоби м1кроыетодом бляшок". Затвердкен! 22.II.1993 року Вченоа радоэ факультету ветеринарно! медицина Укра!нського державного аграрного ушверситету.

Кстодичн! рекомендацп по одерхащп сцроватки Kponi плод ¡в свиней, ¡3 спзц^лчнеы сироватковим фактором росту для кл4тин-них культур. Затверджеш иетодичноа Kowicieio Укра!нського науко-во—досл1дкого ветеринарного шституту I листопада 1983 року.

Перед ¡к po6iT, як: були опублп<ован1 за темоа дисертацП

>

I. Божко A.B., Котелевич З.А., Собко И.А., Никитин O.A. Экспериментальная ротавирусная диарея // Актуальные вопроси ветеринарной вирусологии. Тез. докл. научно-таоретичзской кокференцда

через 24-48 годин /6,2-7,0

ПРАКТКЧН1 ПРОПОЗЩП

молодых ученых. - Владимир., I9S0. - С. 29-40.

2. Разработка средств диагностики и профилактики ротавируснсй инфекции крупного рогатого скота / Онуфриев В.П., СкибицкиЗ

B.Г., Мисысевич C.B., Гопка Л.Й., Собко H.A. // 'Груда 7 съезда Украинского микробиологического общества. - Киев-ЧэрноЕ'вд, 1939. -С. 214.

3. РСК, РШ и электронная микроскопия при обнаружении ротавиру-сов у новорожденных телят / СкибицкиЗ В.Г., Собко D.A., Пос-тоЗ В.П. и др. // Совершенствование ветеринарного обслуживания аивотноводства в условиях интенсификации: Тез. докл. Все-' сопзн. научн. Ko;igj. - M.- Махачкала, 1937. - С. 6-7.

4. Скибицкий В .Г., Гопка Л.И., Собко Ю.А., Иванченко Г. А. Оптими-зацкя биотехнологии выращивания ротавирусов // Диагностика, профилактика и лечение болезней животных в специализированных хозяйствах: 'Груды УСХА.. - К., 1992. - С. 5-9.

5. Скибицкий В.Г., Собко ¡O.A. Злектрошо-ыикросколпчесное изучение ротавируса крупного рогатого скота /иташ Тиверваль/, репродуцированного в гетерологической системе клеток // Ветеринарные проблемы промышленного животноводства: Тез. докл. каучн. - произв. Kong. - Белая Церковь, 1925. - С. 74.

6. Сергеев В. А., Собко 1С .А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии. - К.: TpoxùЯ, IS20. - 152 с.

7. Собко В.А., Огбу Огбанайя, Гопка Л,И., Борзова В.А. Микрометод титрования бляшками шфекциогаюсти ротавируса крупного рогатого скота // Весник с.-х. науки - 1989. -.'59. - С. 151153.

Э. Собко U.A., СкибицкиЗ В.Г., Миськевич C.B., Онуфриев В.П. Модификация микрометода реакции связывания комплемента при диаг-• ностике ротсвирусной диареи телят // Совершенствование вете-'рипарного обслуживания животноводства в условиях интенсификации: Тез. докл. Всесоюзн. научн. конф.- м.- Махачкала, 1937.-

C. 12-13.

9. Штаммовые различия ротаЕируса телят по размеру бляшек в культуре клеток МО ВК /Собко Ю.А., Огбу Огбанайя, Ганим А., Гоп-

' ка Л.Й., Онуфриев В.П. // "Биохимия с.-х. аивотных и продо-■ в'ольствэотая программа: Тез. докл. Всесоюзн. симпозиума. -К 1989. - С. 137-138. U&K iSr.ycv- /УМ,.

- -