Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:К вопросу экологического подхода биологии патогенных микробов Бурятии

На правах рукописи УДК: 619:579.22

ргв од

1 8 ДЕК 2000

ЕТОБАЕВА Ирина Валерьевна

К ВОПРОСУ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА БИОЛОГИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРОБОВ БУРЯТИИ

16.00.03. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Благовещенск 2000

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и ВСЭ Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова в 1997-2000 г.

Йаучный руководитель:

заслуженный деятель науки РБ, доктор ветеринарных наук, профессор В.Ц. Цыдыпов

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук Ю.А. Макаров

кандидат ветеринарных наук В.П. Насибов

Ведущая организация:

Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится « » 2000 г. в ^ часов на

заседании диссертационного совета К 120.07.01 в Дальневосточном государственном аграрном университете (675005, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальневосточного государственного аграрного университета

Автореферат разослан «£

2000 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета , г

кандидат ветеринарных наук: ^

Н.М. Мандро

г? т.з-г -4 -

/70Э&> ГУ о „X ?

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность темы. Появление в наше время новых потенциально-патогенных микроорганизмов или повышение уровня патогенности уже существующих до степени констатации новой нозологической единицы, а также регрессия их до уровня, приближающего их к сапрофитам, - в значительной мере зависит от экологического состояния среды.

Проведение мониторинговых анализов окружающей среды с изучением характеристик патогенных и потенциально-патогенных микроорганизмов позволяет не только определить эпизоотическую ситуацию в эндемичных условиях Бурятии, но и предвидеть вероятную вспышку инфекционной болезни. В то же время изучение биологии и экологии возбудителя инфекции дает картину его потенциальной возможности вызвать инфекционный процесс и возможность найти методы и средства коррекции вирулентности микробов в их эконише.

В целях прогнозирования инфекционных болезней возникает необходимость всестороннего исследования микроорганизмов, обладающих определенным потенциалом патогенности. До сих пор этот вопрос остается недостаточно изученным в Забайкальском регионе.

Цель исследований. Провести мониторинговый анализ микроорганизмов, выделенных на территории республики Бурятия, в их сапрофитической и паразитической фазе существования.

Задачи исследований:

1. Провести бактериологический мониторинг объектов окружающей среды, животных и птиц, природоохраняемых и приграничных зон Бурятии.

2. Дать биологическую, экологическую характеристику полученным микробным культурам.

3. Определить персистентные свойства выделенных микроорганизмов и их зависимость с вирулентностью.

4. Определить динамику численности микроорганизмов под воздействием физико-химических факторов.

5. Установить наличие токсичности почв Бурятии к патогенным микроорганизмам.

Научная новизна. Впервые в условиях Бурятии проведены экологические исследования биологии патогенных бактерий. Определены параметры существования таких микробов в криоаридных почвах Забайкалья и их диагностическая значимость. Выявлены токсические свойства определенных типов почв. Изучены ветерипарно-медиципские аспекты персистентных характеристик микроорганизмов, обладающих определенным потенциатом патогенности, и их изменчивость под воздействием биотических и абиотических факторов.

Разработан ряд оригинальных методик, пригодных для изучения экологии возбудителей инфекционных болезней в окружающей среде.

Практическое значение. Результаты исследований внедрены в практику в форме следующих разработок:

1. Материалы исследований используются при проведении лекционно-практических занятий на кафедре микробиологии Иркутской СХА, кафедре эпизоотологии Бурятской государственной СХА.

2. Разработанные методики применяются в диагностической работе Республиканской ветеринарной лаборатории Бурятии.

3. Полученный научный материал о токсичных свойствах определённых типов почв республики Бурятии к сибиреязвенному микробу используется лабораторией Экологии возбудителей заразных инфекций Противочумного НИИ Сибири и Дальнего Востока и служит теоретической основой для разработки профилактических мер по борьбе с сибирской язвой в условиях Забайкалья.

Положения, выносимые на защиту.

1. При проведении бактериологического мониторинга особое внимание нужно уделять так называемым условно-патогенным микроорганизмам, обладающим определенным потенциалом патогенности.

2. Наличие у микроорганизмов, выделенных из различных объектов окружающей среды, высоких полиморфных персистентных характеристик указывает на их способность вызывать инфекционный процесс, а в некоторых случаях и гибель животного.

3. Влияние определенных биотических и абиотических факторов внешней среды способно вызывать повышение или регрессию потенциала патогенности уже существующих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

4. Определенные типы почв Бурятии способны ингибировать рост и размножение сибиреязвенного микроба.

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в данной диссертации, докладывались и обсуждались на Международной научной конференции, посвященной 125-летию Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Казань, 1998; Республиканской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Биология на пороге XXI века», Улан-Удэ, 1998; научно-практической конференции преподавателей, сотрудников и аспирантов Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова, Улан-Удэ, 1999; Международной научной конференции Дальневосточного государственного аграрного университета, Благовещенск, 1999.

Публикация результатов работы. По материалам диссертации опубликовано три работы, в печати находятся три работы.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах и состоит из введения, 2 глав, заключения, 8 выводов,

списка использованной литературы и 10 приложений, включая 19 таблиц, 15 рисунков. Библиография включает 193 источника, в том числе 35 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Исследования проводили с 1997 по 2000 год на кафедре микробиологии, вирусологии и ВСЭ БГСХА им. В.Р. Филиппова и в бактериологическом отделе научно-производственной ветеринарной лаборатории Бурятии.

В целях взятия материала для исследования были организованы научные экспедиции в Северную приграничную зону республики Монголия, в Кяхтинский район, в Иволгинский район, национальный парк «Тункинский» и в бассейн реки Ина Баргузинского заповедника республики Бурятия.

Для бактериологического исследования и определения токсичности почв были отобраны образцы почв Иволгинского района Бурятии: каштановая среднесуглинистая (пашня) - № 1-3; каштановая среднесуглинистая (целина) - № 4; каштановая среднесуглинистая (лесополоса) - № 5-6; а также Баргузинского района Бурятии: дерново-лесная выщелоченная - № 7-8; дерново-лесная насыщенная - № 9-10; дерново-лесная типичная - № 11-12; дерново-лесная карбонатная - № 13-14; дерново-луговая аллювиальная слоистая с погребенными горизонтами - № 15.

В лабораторных опытах использовали 74 штамма микробных культур, выделенных из разных природных источников, и музейные штаммы, хранящиеся в музее живых культур кафедры микробиологии, вирусологии и ВСЭ БГСХА им. В.Р. Филиппова: Вас. anthracis СТИ, Вас. anthracis шт.55, Вас. cereus, Вас. megaterium шт.89, Вас. mesentericus шт.70, Вас. mycoides шт.79, Вас. pseudoanthracis, Вас. subtilis Л2, Cor. diphtheriac mitis 203-АГ, Diplococcus lanceolatus шт.87, Diplococcus septicus шт. 160, E.coli 08, E. coli шт.25922, List, monocytogenes шт. 1219, M. luteus шт.2665, Sarcina, St. albus, St. aureus, S. dublin, S. pullorum Z-12, St. pyogenes aureus шт.209-р, St. pyogenes aureus R-209, S. typhimurium iiit.79, Y. enterocolitica.

На питательные среды, приготовленные заранее, производили частичные посевы из воды, почвы и паренхиматозных органов исследуемых животных. Для консервирования проб органов использовали стерильный 30%-ный водный раствор глицерина.

Изучение культуральных, морфологических, тинкториальных, биохимических, гемолитических и патогенных свойств выделенных микроорганизмов производили методами общей микробиологии [Биргер М.О., 1983; ГерхардФ., 1983].

Морфологические свойства выделенных бактерий изучали методом

световой микроскопии. Препараты готовили из суточных агаровых и бульонных культур микробов. Для световой микроскопии использовали микроскопы МБИ-6, МБР, осветитель ОИ-19.

Для изучения тинкториальных свойств микроорганизмов мазки окрашивали по Граму, Романовскому-Гимза, Козловскому, Пешкова, Трухильо.

Подвижность микроорганизмов определяли просмотром висячей и раздавленной капли, микроскопией в затемненном поле, посевом в полужидкий агар или в конденсат свежескошенного агара методом Щукевича.

Культуральные свойства изучали на следующих средах: МПА, МПБ, МППБ, МПЖ, глюкозно-глицериновом и кровяном МПА, средах Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева, Клиглера, висмут-сульфит агаре и молоке.

Протеолитические свойства микроорганизмов определяли путем установления способности разжижать желатин на МПЖ и свертывать молоко. Степень протеолиза и глубину расщепления белка определяли по образованию микроорганизмами индола и сероводорода с помощью индикаторных бумажек, пропитанных 12%-ным раствором щавелевой кислоты и 10%-ным раствором уксуснокислого свинца.

При определении каталазной активности микроорганизмов на предметное стекло наносили каплю 3%-ного раствора перекиси водорода и в нее вносили петлю испытуемой суточной агаровой культуры. Образование пузырьков газа свидетельствовало о наличии у микроорганизмов фермента катал азы.

В целях идентификации и дифференциации микробных культур изучали их биохимические свойства. При этом применяли систему индикаторных бумажек (СИБ) для идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae Горьковского НИИ эпидемиологии Минздрава РФ и дифференциально-диагностические среды Гисса.. Также для определения ферментативной активности микроорганизмов применяли пластины ММТ Е1 и ММТ Е2 (система мультимикротестов) для биохимической идентификации энтеробактерий Ставропольского научно-производственного объединения "Аллерген" согласно инструкции по применению.

Чувствительность микроорганизмов к различным антибиотикам определяли методом диффузии в агар с применением стандартных дисков, содержащих антибиотики [Чайковская С.М. и др.,1984].

При изучении патогенных свойств микроорганизмов, кроме постановки биопробы, выявляли гемолитические способности [Акатов А.К., Зуева B.C., 1983].

Химический анализ почв проводили по методикам, изложенным в «Руководстве по химическому анализу почв» под редакцией Б.В. Аринушкиной [1970].

Токсичность почв определяли, используя стерильные почвенные

образцы, качественным методом по наличию или отсутствию роста исследуемой культуры. Для этого обработку и стерилизацию почвенных образцов производили по методике Г.И. Ежова [1974]. При исследовании почв на токсичность учитывали активную реакцию среды (рН) [Мац Л. И. и др., 1972].

Определение антилизоцимной активности микроорганизмов проводили по методике О.В. Бухарина в соавт. [1984].

Для определения антиинтерфероновой активности микроорганизмов использовали ускоренный метод В.Ю. Соколова в соавт. [1992].

Антикомплементарнуго активность микроорганизмов определяли по методу парциального гемолиза в геле [Брудастов Ю.А. и др., 1992].

Наличие фермента ДНК-азы у исследуемых культур определяли по методике, утвержденной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР [Карпов В., 1985] и модифицированной нами. К 50 мл. расплавленного и охлажденного до 50°С стерильного 1.5%-ного агара (рН 8.6) добавляли 100 мг. натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), предварительно растворенной в 10 мл. теплой стерильной дистиллированной воды, подщелоченной 4-6 каплями 10%-ного раствора едкого натра. Без добавления щелочи натриевая соль полностью не растворялась. Агар с натриевой солью ДНК стерилизовали текучим паром в аппарате Коха в течении 30 мин. Непосредственно перед разливом в чашки Петри к ней добавляли 10%-ный стерильный раствор хлористого кальция (СаС1) из расчета 0.4 мл. на 50 мл. среды. Приготовленную среду подсушивали в термостате 40-50 мин. 1.5 млрд. суточную взвесь исследуемых агаровых культур в 0.85%-ном физиологическом растворе наносили бактериологической петлей на полученную среду на расстоянии 10-15 мм. одна от другой. Данный метод позволял одновременно изучить на одной чашке Петри до 60 культур. После посева чашки инкубировали при 37°С в течение 18-20 часов. Для проявления зон деградации ДНК вокруг выросших колоний на поверхность питательного агара с бактериальным ростом наливали 3-5 мл 1Н раствора соляной кислоты. Через 2 минуты соляную кислоту сливали и учитывали результат, измеряя ширину прозрачной зоны вокруг выросших колоний. При ширине зоны просветления 4 мм. и более ДНК-азную реакцию считали положительной, менее 4 мм. - сомнительной, при отсутствии зоны - отрицательной.

Для изучения экологической характеристики микроорганизмов использовали температурную вариабельность, различные концентрации поваренной соли (NaCl) и разную активную реакцию среды (рН) по отношению к динамике роста микроорганизмов. Для этого производили посев испытуемых культур на МПБ с рН 5.8; 7.2; 8.0; с концентрацией NaCl 0,05%; 1.5%; 2.5% и 5.0%, и инкубировали в термостате при различных температурах: 4°С; 18-20°С, 37°С, 42"С. Через каждые 1, 3, 4 часа определяли оптическую плотность бульонных культур с помощью фотоэлектроколориметра КФ-77 при светофильтре 480 нм. с кюветой

рабочей длины 10 мм. Наблюдение вели в течение 24-48 часов [Гайдукова

H.Г., 1993].

При изучении действия на исследуемые культуры микроорганизмов дезинфицирующих веществ готовили растворы дезинфектантов, широко применяемые при обеззараживании рабочих поверхностей и посуды в лабораториях: 3%-ный раствор перекиси водорода, 3%-ный раствор карболовой кислоты, 2%-ный раствор хлорамина, 1%-ный раствор перманганата калия, 6%-ный раствор спирта-ректификата. Одновременно готовили 1-млрд. разведение микробов в физиологическом растворе. Из полученных взвесей делали контрольные высевы по 0.5 мл. на плотные питательные среды. В пробирки с оставшимися после контрольного высева

I.5 мл. взвесей микробных тел испытуемых культур, добавляли равное количество указанных дезинфицирующих растворов. Пробирки инкубировали при комнатной температуре, делая контрольные высевы на МНА через 1, 5, 10 мин. [Догель JI.3. и др., 1984]. У бактерий, подвергшихся воздействию дезинфектантам, определяли динамику персистентных свойств (АИА, ДНК-азную активность) по перечисленным выше методикам.

Воздействие магнитно-лазерного излучения на исследуемые культуры определяли с помощью терапевтического аппарата «Милта». Параметры ИК-лазерного излучения: длина волны - 0.83 мкм, импульсная мощность - не менее 4 Вт, облучаемая площадь - 4.0 см2, режим работы импульсный, с частотой импульсов - 50 Гц, магнитная индукция, создаваемая кольцевым магнитом - 35 мТл ± 10 мТл, экспозиция 1, 5 мин. Чашки Петри с 1.5%-ным МПА со свсжевысеянными в виде газона монокультурами подвергали облучению вертикально расположенным излучателем при расстоянии до облучаемой поверхности 10 см. Затем чашки помещали в термостат с температурой 37°С на 18-20 часов [Левин A.b., Гаткин Е.Я., Голубснко Ю.В. и др., 1988]. У облученных таким образом культур определяли динамику персистентных характеристик (АИА, ДНК-азную и гемолитическую активность) по перечисленным выше методикам.

Антагонистическое действие микроорганизмов на культуры List.monocytogenes, Y.enterocolitica, Salm.typhimurium, E.coli 25922, Bas.anthracis шт.55 и СТИ определяли несколькими методами: 1) метод агаровых блоков [Гаузе Г.Ф., 1958]; 2) метод штрихового посева; 3) антагонизм микробов определяли также методом «отсроченного антагонизма». Для этого использовали несколько модифицированную нами методику по P. Muriana и T. Klaenhammer: тест-культуру наслаивали не на живые суточные колонии микробов-антагонистов, а на убитые парами хлороформа.

Патогенные свойства штаммов изучали на белых мышах. Заражение животных производили взвесью суточной испытуемой культуры (на физиологическом растворе) внутрибрюшинно или подкожно в дозе 0,5 мл. в концентрации 500 млн. бактериальных клеток на 1 мл. Контрольным животным внутрибрюшинно . или подкожно вводили стерильный

физиологический раствор. За опытными животными вели наблюдение в течение 15 суток. Трупы погибших животных вскрывали, из паренхиматозных органов делали мазки-отпечатки, фиксировали спирт-эфиром в соотношении 1:1, окрашивали по Граму и просматривали под микроскопом в иммерсионной системе (х 90). Посевы из паренхиматозных органов производили на МПА, МПБ, среду Эндо и инкубировали в термостате при 37°С в течение 24 часов с последующей идентификацией культуры.

Идентификацию выделенных культур микробов проводили по определителям бактерий Берджи [1997] и Циона [1948].

При фотографировании использовали фотоаппарат «Зенит» и микрофотонасадку МФН-10.

Экспериментальный материал обрабатывата методом вариационной статистики по Стьюденту. Высчитывали среднюю арифметическую и её ошибку. Для определения достоверности разницы средних высчитывали критерий (Т). Затем, по таблице определяли уровень вероятности (р), соответствующий данному критерию.

2.2. Биологическая характеристика микроорганизмов, выделенных из объектов окружающей среды, животных и птиц

Из объектов окружающей среды, животных и птиц, наряду с непатогенными микроорганизмами, были выделены типичные культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов со свойствами, характерными для классических вариантов, в последствии эти культуры были идентифицированы, как гемолитические варианты кишечной палочки, протеи, клебсиеллы, сальмонеллы, иерсинии, листерии.

Так, нами было выделено 74 штамма микробных культур, из них 46 штаммов, по Грамму окрашивались положительно и были представлены как палочковидными бактериями - 21 шт., так и кокками - 25 шт. Грамотрицательных бактерий было 28 шт.: палочек и кокков, 27 шт. и 1шт.

При изучении культуральных свойств выделенных микробных штаммов были получены следующие данные: 58 шт. имели колонии Б-формы разных размеров с ровными краями; 10 шт. - колонии Я-формы со складчатой или шероховатой поверхностью и локонообразными выростами по краям колоний.

По результатам постановки биохимических тестов провели анализ ферментации углеводов с образованием кислоты исследуемыми культурами. Так, большинство штаммов ферментировали глюкозу, мальтозу, лактозу, в меньшей мере - сахарозу, маннит, дульцит, рафинозу, салицин.

Сероводород образовывали 28 шт., индол - 20 шт. Образование фермента каталазы было отмечено у 37 шт. исследуемых культур, фермента уреазы - 17 шт.

Незначительное количество культур обладали протеолитическими свойствами. Так, 22 шт. микробных культур разжижали желатину, 28 шт. свертывали молоко. На кровяной среде образовывали зону гемолиза 40 шт.

Были идентифицированы роды грамположительных бактерий: Bacillus, Bacterium, Carnobacterium, Corynebacterium, Enterococcus, Erysiopelothrix, Listeria, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Vagococcus.

Из грамотрицателыгых - роды: Citrobacter, Diplococcus, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Vibrio, Yersinia.

2.3. Биологическая характеристика штаммов музейных культур в условиях продолжительного хранения

При исследовании микроорганизмов, хранящихся в музее живых культур, были получены результаты, свидетельствующие о том, что в процессе длительного хранения многие микроорганизмы утрачивали свои персистентные характеристики, сохраняя при этом свои морфологические и культуральные свойства.

Штамм 89 Вас. megaterium имел ДНК-азную активность, а Вас. mycoides 79 и Вас. mesentericus 70, Вас. pseudoanthracis в процессе хранения сё утратили. Гемолиз на кровяном агаре все перечисленные культуры не вызывали, ЛИЛ. AJ1A, АКА не обладали. Вас. mesentericus шт. 70 образовывал каталазу Культура Вас. cereus обладала слабой гемолитической активностью.

У культуры Вас. cereus не было антикомплементарного фактора.

Вас. subtilis Л2 образовывал фермент каталазу, обладал сомнительной гемолитической активностью, имел АЛА. Штамм Вас. subtilis в наших опытах утратил ДНК-азную активность.

Cor. diphthcriae mitis 203-АГ слабо лизировал эритроциты барана, продуцировал каталазу, ДНК-азу.

Е. coli 25922 образовывал каталазу, не обладал гемолитической активностью. АЛА, АКА, АИА была слабо выражена. Е. coli 08 оставался вирулентным для телят, белых мышей и продуцировал ДНК-азу, антиинтерфероновый фактор.

Культура Listeria monocytogenes 1219 в процессе длительного хранения утратила свои персистентные характеристики и гемолитическую активность.

Штаммы Salm. dublin (enteritidis), Salm. pullorum Z-12, Salm. typhimurium 79 процессе хранения утратили свои персистентные характеристики. Отмечалась лишь слабая АИА. Хотя эти культуры теоретически должны были обладать АКА, АЛА, ДНК-азной активностью.

Шт. Sarcina проявляла АЛА, слабую ДНК-азную активность, гемолиз не вызывала, АКА, АИА не обладала.

Штаммы St. albus и St. aureus персистентные свойства не имели. Шт. St. aureus кроме гемолитической активиости другими свойствами не обладал. Шт. St. pyogenes aureus 209-R обладал АЛА, АИА, ДНК-азной активностью.

Шт. St. pyogenes aureus R-209 также имел АИА, АЛА, ДНК-азную активность.

Возбудитель кишечного иерсиниоза, Y. enterocolitica, образовывал каталазу, вырабатывал значительное количество ДНК-аз и имел АЛА, АИА. Эта культура была патогенна для белых мышей.

2.4. Персистентные характеристики микроорганизмов, выделенных из объектов окружающей среды, животных и птиц и микроорганизмов, пребывавших в условиях длительного хранения 2.4.1. Значение показателей персистенции исследуемых микроорганизмов

По нашим данным, 3 штамма бактерий рода Bacillus - Вас. brachisporus, Вас. myxodens, Вас. retiformis - из 12 имели невысокую АЛА, ДНК-азную активность. Музейная культура Вас. megaterium 89 обладала ДНК-азной активностью (3 мм.), а культура Вас. subtilis Л2 - АЛА (1.3-1.5мкг/мл). Дикая культура В. aurantiacum вырабатывала ДНК-азы в больших количествах (6 мм.) и продуцировала антикомплементарный фактор (табл. 1).

Из грамноложительных микроорганизмов (42 культуры) АЛА проявляло 42.9% (18 шт.), АИА - 11.9% (5шт.), АКА - 21.4% (9шт.), ДНК-азную активность - 28.6% (12шт.), гемолитическую - 21.4% (9 шт.).

У культуры Citrobacter регистрировалось наличие персистентных факторов. Она синтезировала антилизоцимный и антиинтерфероновый фактор, при значении последнего 1.12 уел ед., в незначительных количествах ДНК-азы, и обладала высокой гемолитической активностью (6 мм.).

Гемолитический вариант Е. coli 08 также обладал всеми перечисленными характеристиками, так значение АИА и ДНК-азной активности было (1.5 уел ед.) и (3.5 мм.), соответственно. Родственные ему культуры - дикий штамм Е. coli, музейный штамм Е. coli 25922, обладали лишь АЛА и АИА.

Патогенный штамм Pr. mirabilis и Y. enterocolitica вырабатывал все исследуемые нами факторы противорезистентной природы. Так, значение АИА, ДНК-азной и гемолитической активности у протея было, соответственно, (1.68 уел ед.), (3 мм.) и (7 мм.), а у возбудителя кишечного иерсиниоза ДНК-азная активность - 8 мм.

Факторы персистенции регистрировались чаще у стафилококков, стрептококков, а у сальмонелл, микрококков и листерий были выражены слабее.

Среди грамотрицательных микробов (18 шт.) АЛА была отмечена у 66.6% (12 шт.), АИА - 55.5% (10 шт.), АКА - 27.7% (5 шт.), ДНК-азная активность - 33.3% (6 шт.), гемолитическая - 44.4% (8 шт.).

При обзоре результатов видно, что АЛА была присуща как грамположительным, так и грамотрицательным микроорганизмам. Антиинтерфероновый фактор чаще синтезировали грам отрицательные

п

микробы, а АКА была незначительно выражена как у тех, так и у других. ДНК-азная и гемолитическая активности, рассматриваемые как факторы вирулентности, были выше у грамотрицательных бактерий.

Культуры, обладающие полиморфными значениями факторов персистенции - это Рг. mirabilis, Y. enterocolitica, Е. coli 08, Citrobacter были патогенными для лабораторных мышей. Более подробно этот факт рассматривается в следующей главе.

Таблица 1

Характеристика персистентных свойств исследуемых микроорганизмов

Вид микроорганизма АЛА, мкг/мл АИА, уел ед АКА, уел ед ДНК-азная активность, мм Гемолитическая активность, мм

1 2 3 4 5 6

В. aurantiacum - - + 6,0 -

В. cocciformis - - - - -

В. ochraceum - - - 1,5 -

В. proteus zenkeri + - + - -

В. stolanatum + - - - +

В. subtyphosum - - - - -

Вас. anthracis 55 - - - - -

Вас. anthracis СТИ - - - - -

Вас. brachisporus + - - + -

Вас. cereus ■ - - - -- сл.

Вас. megaterium 89 - - - 3,0 -

Вас. mesentericus 70 ■ - - - - -

Вас. mycoides 79 - - - - -

Вас. myxodens + - - 2,0 -

Вас. pseudoanthracis - - - - -

Вас. retiformis + - + 2.5 -

Вас. subtilis - - - - -

Вас. subtilis JI2 1,3- 1,5 - - - сл.

Cor. diphthcriac mitis 203-AT - - - 1,5 сл.

С. freundii + - + - -

Car. mobile + - - - -

Citrobacter + 1,12 - 1,0 6,0

Cor. vitarumen - + - - -

Diplococcus lanceolatus 87 - - - - -

Diplococcus septicus 160 - - - - -

Окончание табл. 1

1 2 3 4 5 6

E. coli + 2,8 - - -

E. coli 25922 + сл. + - сл.

E.coli 08 + 1,5 + 3,5 2 "

Edwardsiella tarda + - + - -

Enterobacter agglomerans + сл. + сл. 6

Enteroc. faecalis - - - - -

Erysiopelothrix + - + - -

K. ozaenae + - - - 4-

K. rhinoscleromatis + - - - f

List, monocytogenes + - - - -

List, monocytogenes 1219 - - - - СЛ.

Micr. Candidus + - - - -

Micr. halobius - - - - -

Pr. mirabilis + 1,68 + 3,0 7,0

S. dublin - сл. - - -

S. pullorum Z-12 - сл. - -

S. typhimurium 79 + сл. - - -

Sarcina 1,5-2,0 - - 2,5 -

St. albus - - - - -

St. aureus + - - - 4-

St. auricularis - - + - -

St. caseolyticus + - + - -

St. hyicus + - 4- 3,2 4-

St. kloosii - + - - -

St. lentus - - - 4- -

St. pyogenes aureus 209- p + 0,56 5,0 1,0

St. pyogenes aureus R- 209 2,0-3,5 + 2,5

St. saccharolyticus + - 4- - -

Str. acidominicus - + - - -

Str. bovis - + - 4- 4-

Str. milleri - - ' + - -

Str. sobrinus - - - - -

Vagoc. fluvialis • - - - - -

Vibr. fluvialis + - + - -

Y. enterocolitica + 1,12 - 8,0 -

Примечание.(+) - наличие фактора персистенции; (-) - отсутствие фактора ггерсистенции; (сл.) - следы.

2.4.2. Некоторые результаты изучения зависимости между показателями персистентных характеристик и вирулентностью

Нами в условиях эксперимента были заражены лабораторные мыши из расчета по 2 мыши на каждую культуру. Для сравнения, при заражении использовали штаммы микробных культур, обладающие и не обладающие персистентпыми свойствами. Исходя из полученных данных, штаммы культур с выраженными персистентпыми свойствами (АИА, ДНК-азная и гемолитическая активности) в 27.7% (3 шт.) случаев вызывали гибель мышей при р < 0.05.

Штамм Y. enterocolitica при наличии даже двух признаков, АИА, ДНК-азная активность, также вызывал гибель мышей. Штаммы исследуемых культур в 27.7% (3 шт.), не обладающие персистентными свойствами или при наличии одного признака в 27.7% (3 шт.), были непатогенными. У штамма 79 Вас. mycoides появилась ДНК-азная активность (р < 0.05) после пассирования через лабораторных мышей. Штамм Citrobacter вызывал гибель животных, а в дальнейшем, при выделении из паренхиматозных органов, утрачивал свои персистентные характеристики. АИА гемолитического штамма Е. coli 08 значительно увеличивалась при значении (1.5 ± 0.11 усл. ед.) до заражения и (11.0-11.5 усл. ед.) после заражения при р < 0.05, изменение гемолитической активности было незначительным (2.0 ± 0.05 мм.) и (2.5 ± 0.2 мм.), соответственно, а ДНК-азная активность отсутствовала.

Штамм Enterobacter agglomerans после заражения не выделялся. Штамм 1219 List, monocytogenes и штамм 79 S. typhimurium, не обладали персистентными свойствами ни до заражения, ни после. Данные штаммы находились в условиях длительного хранения и утратили свои персистентные свойства. Патогенный штамм Pr. mirabilis, в одном случае, утрачивал свои свойства, в другом - очевидно достоверное (р < 0.05) снижение гемолитической активности, (7.0 ± 0.02 мм.) и (4.13 ± 0.31 мм.), соответственно; и незначительное повышение ДНК-азной активности от (3.0 ± 0.05 мм.) до (3.63 ± 0.24 мм.). При выделении штамма St. hyicus, значения персистентных свойств микроба увеличились, так ДНК-азная активность до заражения была равна (3.2 ± 0.07 мм.), после заражения - (5.0 ± 0.01 мм.) и (7.25 ± 0.25 мм.), и появилась гемолитическая активность равная (0.88 ±0.13 мм.). Персистируя в макроорганизме, штамм St. pyogenes aureus 209-р утратил свою АИА, остальные характеристики у него незначительно повысились (р < 0.05). У патогенного штамма Y. enterocolitica после пассирования не были выражены ДНК-азная и гемолитическая активности, АИА значительно возросла (12.5 ± 0.5 уел ед.) и (13.38 ± 0.55 уел ед.) против значения до заражения (1.12 ± 0.05 уел ед.).

Из исследуемых штаммов микробных культур наибольшей вирулентностью обладали штаммы с высокой АИА, гемолитической активностью и незначительно выраженной ДНК-азной активностью. Так, штамм Citrobacter, Е. coli 08, Pr. mirabilis при значении АИА от 1.12 до 1.68

уел ед., ДНК-азной активности - 1.0-3.5 мм. и гемолитической активности -от 2.0 до 7.0 мм. вызывали гибель лабораторных мышей. У. ег^егосоИиса с высокой активностью ДНК-аз (8.0 мм.) и АИА (1.12 уел ед.), была также патогенна, а штаммы микробных культур, обладающие высокой гемолитической активностью (1.0-6.0 мм.), но с низкими показателями АИА (0-0.56 уел ед.), ДНК - азной активности (2.5 - 3.2 мм.) не вызывали гибель мышей.

Таким образом, можно сделать вывод о значимой роли факторов персистенции бактериальных клеток в возникновении и течении инфекционного процесса. По нашим данным, микроорганизмы, обладающие полиморфными персистентными свойствами приобретают все признаки несомненно патогенного микроба, способного вызвать инфекционный процесс. Не исключено, однако, снижение потенциала патогенности данного микроорганизма под воздействием факторов противоинфекционной защиты, определяемых индивидуальным иммунологическим статусом макроорганизма.

2.4.3. Влияние магнитно-лазерного излучения на механизмы персистенции

Для изучения воздействия магнитно-лазерного излучения па персистентные характеристики микроорганизмов, мы провели эксперименты с использованием с частотой импульсов ИК-лазера - 50 Гц, магнитной индукцией 35 мТл ± 10 мТл и экспозицией 1-5 мин.

При магнитно-лазерном воздействии, создаваемым терапевтическим аппаратом «Милта», наиболее значительным было снижение АИА. Так, иерсинии и гемолитический штамм эшерихии утрачивали свою АИА и ДПК-азную активность, а гемолитическая активность эшерихий незначительно повышалась при значении (2.0-2.5 мм.) до опыта и (2.8-2.9 мм.) после воздействия лазером. ДНК-азная активность штамма Б!. Ьукив достоверно повышалась (р < 0.05) от (3.2 ± 0.07 мм.) до (4.3 ± 0.34 мм.), у этого же штамма, пассированного через белую мышь, выработка ДНК-аз снижалась с (6.8 ± 0.58 мм.) до (3.83 ± 0.51 мм.), к тому же, патогенный вариант 81. Иуюш утрачивал гемолитическую активность после 5 мин. экспозиции магнитно-лазерным лучом. При указанном режиме воздействия у золотистого стафилококка не регистрировалась АИА и гемолитическая активность. ДНК-азная активность падала до (3.6 ± 0.58 мм.) по сравнению с исходным значением (5.0 ± 0.11мм.).

Эффект магнитно-лазерного излучения на персистентные характеристики культур листерий, сальмонелл не выявлялся, так как эти культуры до опыта не обладали персистентными свойствами.

Полученные данные дали основание предположить явление ингибирования факторов персистенции воздействием магнитно-лазерными лучами.

2.4.4. Влияние химических веществ на механизмы персистенции микроорганизмов

Для изучения действия химических веществ на микроорганизмы, и их влияния на персистентные характеристики, мы использовали концентрации дезинфектантов, обычно применяемые при обеззараживании лабораторной и столовой посуды.

Исследования показали, что перекись водорода в концентрации 3% через 5 мин. полностью ингибировала рост гемолитического варианта Е. coli 08, через 1 мин. - Pr. mirabilis, через 10 мин. - С. diphtheriae mitis 203-АГ, St. hyieus, Y. enterocolitica, List, monocytogenes. При 10 минутной экспозиции сальмонелл, стафилококка и сибиреязвенного микроба, отмечен рост единичных колоний в первом случае и десятков колоний - в последующих. Бактерицидным действием по отношению к Micr. candidus перекись водорода в используемой концентрации не обладала.

3%-ный раствор карболовой кислоты уже при экспозиции 1 мин. приводил к полной гибели вышеперечисленных микроорганизмов. За исключением эшерихий, чей рост не отмечался через 10 мин.

Micr. candidus и Вас. anthracis 55 были устойчивы к воздействию данного дезинфектанта, однако у первого микроба через 10 мин. инкубации отмечен рост единичных колоний.

Действие 2%-ного раствора хлорамина уже через 1 минуту ингибировало рост коринебактерий, эшерихий, листерий, протея, сальмонелл, стафилококков, а через 5 минут шт. 25922 кишечной палочки, микрококка и иерсиний. Бактерицидный эффект по отношению к сибиреязвенному микробу не отмечался. Сходные результаты были получены в опытах с перманганатом калия. Так, при 10 мин. экспозиции сибиреязвенного микроба на чашках отмечен рост единичных колоний. 6%-ный спиртовой раствор не оказывал эффективного бактерицидного действия в отношении этих микроорганизмов.

Одновременно проводили изучение в динамике АИА и ДНК-азной активности микроорганизмов, подвергаемых воздействию химическими веществами.

Мутанты вакцинного штамма 55 Вас. anthracis, полученные под воздействием перекиси водорода, начинали продуцировать антиинтерфероновый фактор. Культуры Е. coli 08, E.coli 25922, Salm. typhimurium 79, Y. enterocolitica становились гиперпродуцентами этого же фактора. Сходные данные были получены для гемолитического штамма Е. coli при воздействии на него раствора карболовой кислоты и спиртового раствора.

Хлорамин в концентрации 2% вызывал увеличение значений АИА штаммов 25922 Е. coli и Y. enterocolitica, сходные данные получены для последнего при воздействии 1%-ного раствора перманганата калия.

6%-ный раствор этилового спирта, не обладая бактерицидным

действием на изучаемые культуры, оказывал в большинстве случаев стимулирующее действие на персистентные характеристики. Так, при его воздействии АИА E.coli шт. 25922 и гемолитического штамма E.coli, Рг. mirabilis и Y. enterocolitica увеличилась почти в 2-3 раза.

При изучении динамики ДНК-азной активности микроорганизмов, мы получили следующие данные: так, мутанты стафилококков, полученные под воздействием перекиси водорода, становились гиперпродуцентами ДНК-азы, иерсинии же наоборот выделяли ее в меньших количествах. Идентичное влияние оказывал и 6%-ный спиртовой раствор. Штамм Е. coli 08 утрачивал способность продуцировать ДНК-азу при воздействии разных дезинфектантов.

В итоге исследований получен высокий бактерицидный эффект в отношении иерсиний, эшерихий, сальмонелл, стафилококков, листерий, протея, микрококка и коринебактерий растворами карболовой кислоты - 3%, хлорамина - 2%, перманганата калия - 1%.

Перекись водорода обладала избирательным действием, стимулируя активную выработку противоинтерферонового фактора сибиреязвенным микробом, эшсрихиями, листериями, сальмонеллами и иерсиниями, и выделение ДНК-азы стафилококками.

Раствор этилового спирта незначительно ингибировал АИА эшерихий, выделенных из природных источников и золотистого стафилококка. Мутанты остальных культур были гиперпродуцентами как АИ фактора, так и ДНК-азы.

2.5. Физико-химическая характеристика почв отдельных районов Бурятии. Токсичность почв

Почвы экспериментальных участков содержали определенный набор химических веществ, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе достаточное количество ионов Са, Mg, К, Р. Их количественное содержание в различных почвах несколько варьировало, но трудно говорить о каком-либо перенасыщении почвы или наоборот недостатке какого-либо элемента, что ингибировало или стимулировало бы жизнедеятельность микроорганизмов.

Для бактериологического исследования и определения токсичности почв были отобраны образцы следующих типов почв Иволгинского района Бурятии: каштановая среднесуглинистая (пашня) - № 1-3; каштановая среднесуглинистая (целина) - № 4; каштановая среднесуглинистая (лесополоса) - № 5-6; а также Баргузинского района Бурятии: дерново-лесная выщелоченная - № 7-8; дерново-лесная насыщенная - № 9-10; дерново-лесная типичная - № 11-12; дерново-лесная карбонатная - № 13-14; дерново-луговая аллювиальная слоистая с погребенными горизонтами - № 15.

Проведенные исследования выявили значительную вариабельность органического компонента изученных почв. Количество гумуса в

каштановой среднесуглинистой почве варьировало от 1.36 до 3.46%, его содержание было минимальным в почве пашни и максимальным - в почве, взятой с лесополосы.

Процентное содержание гумуса в дерново-лесных почвах было, в основном, чуть выше 2%, составляя 1.38-2.34%, лишь в одном случае в дерново-лесной карбонатной почве содержание гумуса было 3.08%.

Значительно отличалась по этому компоненту от вышеописанных почв дерново-луговая аллювиальная слоистая почва с погребенными горизонтами, в ней распределение органических веществ по горизонтам было неравномерно. Если на глубине 3 см. количество гумуса невелико и составляет 0.48%, то на глубине 20-25 см. около 5.98%.

Исследование активной реакции среды исследуемых почв выявило, что они, в основном, обладали нейтральной или слабощелочной реакцией. Так, дерново-луговая почва имела нейтральную реакцию (рН 7.2), из дерново-лесных почв нейтральными были 37.5%, из каштаново-среднесуглинистых -20%, хотя один образец каштановой почвы, взятый с пашни, характеризовался слабощелочной реакцией (рН 7.75).

Таким образом, физико-химический состав почв варьировал в зависимости от типа почв. Данные о неорганическом и органическом компоненте почвы позволяли предположить, что патогенные микроорганизмы могли находить в некоторых почвах благоприятную среду для жизнедеятельности. Для проверки этого свойства мы провели лабораторные эксперименты по изучению роста микробов на почвенных образцах.

При посеве суточных агаровых культур исследуемых микробов на агаризованные почвы (культивирование при 37°С) мы наблюдали образование колоний штаммами Е. coli 25922, St. pyogenes aureus 209-p, Salm. typhimurium 79, Y. enterocolitica, List, monocytogenes 1219 во всех исследуемых почвах. Рост вегетативных культур вакцинных штаммов 55 и СТИ Вас. anthracis отсутствовал в разрезах 1, 4, 6 каштановой среднесуглинистой почвы, имеющей следующие характеристики: (рН 6.62, гумус-2.95%), (рН 6.54, гумус-2.1%),(рН 5.97, гумус-1.93%), соответственно. Для шт. СТИ также была токсична дерново-лесная выщелоченная почва - № 8 (рН 5.9, гумус-1.75%), а для шт. 55 - дерново-лесная типичная - № 11 (рН 5.7, гумус-2.34%) и дерново-луговая аллювиальная - № 15 (рН 7.2, гумус-0.48%).

Из литературных источников оптимальными для переживания и размножения сибиреязвенного микроба являлись почвы, содержащие более 3-5% гумуса с нейтральной или слабощелочной реакцией [Иванова Д.П. и др., 1985]. Рост возбудителя ингибировался в большей степени кислыми, чем щелочными условиями среды. Оптимум рН находился в узких границах в пределах от 7.1 до 7.5 [Найманов П.И., 1986]. Эти условия подтвердили наши опыты. По нашим данным, токсичным действием по отношению к вакцинным штаммам сибирской язвы обладали 40% изучаемых почв. Эти

почвы имели кислую реакцию среды (рН 5.7-6.62) и низкое содержание гумуса (1.75-2.34%). Дерново-луговая почва горизонта А при нейтральной рН проявляла токсическое свойство, возможно, из-за низкого содержания гумуса (0.48%). Угнетение размножения возбудителя инфекции в остальных почвах компенсировалось нейтральными и слабощелочными условиями среды (рН 6.85-7.75), хотя почвы имели низкое процентное содержание гумуса (1.36-3.08%). Очевидно, этот факт указывает на" экологическую пластичность сибиреязвенного микроба, обеспечивающую ему существование в среде с минимальным содержанием питательных веществ органического происхождения.

Таким образом, почвы Иволгинского района Бурятии: каштановая среднесуглинистая - №1, №4; №6 и почвы Баргузинского района Бурятии -дерново-лесная выщелоченная - №8, дерново-лесная типичная - №11, дерново-луговая аллювиальная слоистая с погребенными горизонтами - №15 оказались токсичными для сибиреязвенных микробов. На других возбудителей инфекции изученные типы почв токсического действия не оказывали, что при оптимальных экологических условиях давало возможность предположить их рост, размножение и резервацию в указанных типах почв.

2.6. Экологическая характеристика микроорганизмов

При проведении опыта изучали влияние температуры, рН и различных концентраций поваренной соли (NaCl от 0.05% до 5%) на динамику роста следующих микробных культур: Вас. anthracis шт. 55, Е. coli 25922, List, monocytogenes 1219, Salm. typhimurium 79, Y. enterocolitica - патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в жидкой питательной среде. Для колориметрического изучения роста указанных микробов производили их засев на МПБ, приготовленный на фосфатном буфере с разными значениями рН (от 5.8 до 8.0).

Вакцинный штамм 55 Вас. anthracis. Активная реакция в пределах от 5.8 до 8.0 и концентрация NaCl (от 0,05% до 5%) сдерживала темпы развития возбудителя, не препятствуя его размножению. Оптимальной температурой для развития возбудителя сибирской язвы было 37°С и 42°С. При низких ее значениях (от 4 до 18-20°С) лаг-фаза роста данного микроба затягивалась до 24 часов.

Штамм 25922 E.coli. Оптимальными условиями для развития Е. coli являлись: температура 4°С, рН 5.8 и низкие концентрации соли в среде.

Штамм 1219 List, monocytogenes. Низкие и высокие концентрации соли в среде сдерживали развитие данной культуры, при концентрации NaCl 1,5% наиболее интенсивный рост микробов отмечали при температуре 37°С в бульонной среде со слабокислой реакцией.

Штамм 79 Salm. typhimurium. Данные микроорганизмы могли размножаться в широком диапазоне значений активной реакции среды и

содержания солей, к тому же они толерантны к изменениям температуры.

Штамм Y. enterocolitica. Интенсивный рост данной культуры отмечался в нейтральной и кислой среде при 37°С. Повышенная и пониженная концентрация соли в МПБ незначительно подавляла темпы роста данного штамма по сравнению со средними значениями, но размножение возбудителя не прекращалось.

2.7. Антагонизм и антибиотические вещества

2.7.1. Антагонистические взаимодействия микроорганизмов

Высоким антагонистическим действием по отношению к патогенным бактериям обладали штаммы культур рода Bacillus, это штаммы Вас. cereus и Вас. subtilis JI 2. Так, они подавляли рост вакцинного шт. 55 Вас. anthracis, Е. coli 25922, List, monocytogenes 1219, S. typhimurium 79, Y. enterocolitica. Сенная палочка, Bac. subtilis, выделенная из внешней среды, оказывала подавляющее действие лишь на листерии, в отличии от своего музейного родственника. Шт. Вас. myxodens был токсичен по отношению к листериям, а шт. Вас. megatcrium 89 - сибиреязвенному штамму 55 и иерсиниям. Рост S. typhimurium 79 подавлялся антибиотическими факторами, выработанными В. ochraceum.

Патогенные культуры также обладали антагонистическим действием в отношении друг друга. Так, эризипелоидный микроб проявлял антимикробные свойства по отношению к иерсиниям, а возбудитель листериоза - по отношению к сальмонелле тифимуриум.

Бактерицидный эффект на вакцинный шт. СТИ Вас. anthracis имели культуры Diplococcus septicus 160, S. dublin, a патогенные штаммы Pr. mirabilis и St. hyicus угнетали рост шт. 55 Вас. anthracis.

Шт. St. kloosii и шт. Str. milleri в одинаковой мере подавляли рост List, monocytogenes 1219.

Таким образом, наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладали споровые культуры рода Bacillus, относящиеся к типичным сапрофитам. Было отмечено явление антагонизма и среди патогенных микроорганизмов, но оно было меньше выражено. По нашим данным токсичность патогенного агента реализовалась лишь по отношению к какому - либо одному патогенному или условно-патогенному микробу, в отношении других исследуемых микроорганизмов этот эффект не проявлялся.

2.7.2. Чувствительность выделенных микробных культур к некоторым

антибиотикам

Штаммы выделенных микробных культур, показали высокую устойчивость к применяемым антибиотикам. Так, 18 шт. оказались резистентны к левомицетину, 21 шт. - к эритромицину, 22 шт. - неомицину,

20 шт. - к тетрациклину, 21 шт. - к стрептомицину, 26 шт. - к олеандомицину, 26 шт. - к мономицину, 24 шт. - к полимиксину, 32 шт. - к бензил пенициллину.

Процент чувствительности к антибиотикам был не значительным, из всех исследованных штаммов микроорганизмов лишь рост 8 шт. ингибировался левомицетином, 12 шт. - эритромицином, 4 шт. -неомицином, 13 шт. - тетрациклином, 11 шт. - стрептомицином, 5 шт. -олеандомицииом, 7 шт. - мономицином. Высокой резистентностью к полимиксину и бензилпенициллину обладали все выделенные штаммы культур за исключением штаммов List, monocytogenes и St. aureus, соответственно. Остальные штаммы обладали промежуточной чувствительностью к антибиотикам.

По нашим данным культуры микроорганизмов, экзогенного происхождения, проявляли полирезистентность к исследуемым антибиотикам.

Возбудители желудочно-кишечных заболеваний были мало чувствительны к предложенным антибиотическим препаратам. Так, шт. Salm. typhimurium проявлял чувствительность лишь к эритромицину, а к остальным препаратам - промежуточную чувствительность. Шт. Е. coli обладал полирезистентностью. Патогенный вариант Pr. mirabilis в значительной мере был умеренно чувствительным к химиопрепаратам, рост культуры подавляли левомицетин, эритромицин, тетрациклин. Y. enterocolitica был мало чувствителен к предложенным антибиотикам.

Рост возбудителя листериоза ингибировался неомицином, тетрациклином, стрептомицином, мономицином, эго был единственный штамм чувствительный к полимиксину из всех выделенных культур.

Эризиопелоидный микроб проявлял множественную устойчивость, ни один из перечисленных антибиотиков не подавлял его роста в нашем опыте.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что микроорганизмы, выделенные из объектов окружающей среды, т.е. экзогенного происхождения, обладали незначительной чувствительностью к предложенным антибиотикам. Резистентные формы микроорганизмов, выделенные от животных и птиц, не утрачивали своей патогенности, не реагируя на антибиотики, они могли вызывать инфекцию такой же силы, как и чувствительные штаммы.

ВЫВОДЫ

1. Из объектов окружающей среды, животных и птиц, наряду с непатогенными микроорганизмами, были выделены типичные культуры патогенных и условно - патогенных микроорганизмов со свойствами, характерными для классических вариантов.

2. Наличие у исследуемых микробов полиморфных персистентных характеристик позволило предположить их выраженную адаптацию к

защитно-регуляторным системам макроорганизма. Такие микроорганизмы, по нашим данным, были способны вызвать инфекционный процесс и даже гибель животного. Не исключено, однако, снижение потенциала патогенное™ данного микроорганизма под воздействием факторов противоинфекционной защиты, определяемых индивидуальным иммунологическим статусом.

3. При исследовании микроорганизмов, хранящихся в музее живых культур, были получены результаты, свидетельствующие о том, что в процессе длительного хранения многие микроорганизмы утрачивали свои персистентные характеристики.

4. Проведенные исследования выявили явление ингибирования факторов персистенции патогенных и условно-патогенных микроорганизмов воздействием магнитно-лазерными лучами.

5. Исследуемые микроорганизмы проявляли устойчивость к применяемым дезинфектантам, а некоторые дезинфицирующие вещества избирательно стимулировали их персистентные характеристики.

6. По нашим данным, токсичным действием по отношению к вакцинным штаммам сибирской язвы обладали 40% изучаемых почв Бурятии. Эти почвы имели кислую реакцию среды и низкое содержание гумуса.

7. Наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладали споровые культуры рода Bacillus, относящиеся к типичным сапрофитам. Было отмечено явление антагонизма и среди патогенных микроорганизмов, но оно было меньше выражено. По нашим данным токсичность патогенного агента реализовалась лишь по отношению к какому - либо одному патогенному или условно-патогенному микробу, в отношении других исследуемых микроорганизмов этот эффект не проявлялся.

8. Микроорганизмы, выделенные из объектов окружающей среды, обладали незначительной чувствительностью к предложенным антибиотикам. Резистентные формы микроорганизмов, выделенные от животных и птиц, не утрачивали своей патогенности. Не реагируя на антибиотики, они могли вызывать инфекцию такой же силы, как и чувствительные штаммы.

Практические предложения

Разработана научно-обоснованная система мониторингового анализа объектов окружающей среды:

- материалы диссертации используются при проведении лекционно-практических занятий на кафедре микробиологии Иркутской СХА и кафедре эпизоотологии БГСХА им В.Р. Филиппова;

- разработанные методики применяются в диагностической работе Республиканской ветеринарной лаборатории Бурятии;

- полученный научный материал о токсичных свойствах определённых'типов почв республики Бурятии к сибиреязвенному микробу используется лабораторией Экологии возбудителей заразных инфекций Противочумного НИИ Сибири и Дальнего Востока и служит теоретической основой для разработки профилактических мер по борьбе с сибирской язвой в условиях Забайкалья.

1. Етобаева И.В., Петруев Д.Н., Цыдыпов В.Ц. Случай выявления возбудителя иерсиниоза //Материалы Международной научной конференции, посвященной 125-летию академии. - Казань, 1998. - 4.1. -

2. Етобаева И.В. Факторы персистснции некоторых возбудителей сапронозных инфекций, выделенных из микробных сообществ экосистем Забайкалья //Материалы науч.-практ. конф.: «Устойчивое развитие: проблемы охраняемых территорий и традиционное природопользование в Байкальском регионе». - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 1999. - С. 172-

3. Етобаева И.В., Петруев Д.Н., Рыгзынова О.Б., Цыдыпов ВЦ. Антилизоцимная активность микроорганизмов //Тезисы докл. Регион, науч. конф. «Биология на пороге XXI века». - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА, 1999.-С. 39-40.

4. Етобаева И.В., Петруев Д.Н., Цыдыпов В.Ц. Чувствительность к антибиотикам иерсииий, листерий, сальмонелл и возбудителя рожи свиней, выделенных в Бурятии //В тр.: Международной науч. конф. Дальневосточного государственного аграрного университета. -Благовещенск, 1999.-в печати.

5. Етобаева И.В., Цыдыпов В.Ц. Антиинтерфероновая и антилизоцимная активности патогенных бактерий, выделенных в Бурятии //В тр.: Международной науч. конф. Дальневосточного государственного аграрного университета. - Благовещенск, 1999,- в печати.

6. Етобаева И.В. Выживаемость некоторых патогенных бактерий в почвах Бурятии //Тезисы докл. Всероссийского науч.-практ. Молодёжного симпозиума ИГУ «Экология Байкала и Прибайкалья». - Иркутск, 2000. -в печати.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

С.58.

173.

Подписано в печать 21Л 1.00. Формат 60*84 1/16 Тираж 100 Заказ SCO

Издательство Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им.В.Р.Филиппова 670024. г.Улан-Удэ. ул.Пушкина, 8

Вопросы эволюции патогенных микроорганизмов и возникновение инфекционных заболеваний привлекают внимание многих ученых. Однако, во всех этих трудах речь идет о завершенных паразитах, промежуточные этапы паразитизма не обсуждаются.

Особенностью большинства потенциально-патогенных микроорганизмов является высокая частота их обнаружения в окружающей среде, что отражает сохранившиеся у них черты сапрофитизма, а так же своеобразие «экологической ниши» - естественного постоянного и основного места пребывания микроба в окружающей среде [Калина Г.П., 1983а].

Если для патогенных микроорганизмов экониша - больной организм, то для условно - патогенных они еще не выявлены или предполагаются.

Практически же выявление экониши помогает установить связь того или иного микроба с определенным животным организмом, его возможность и частоту попадания в организм из пищевых продуктов, почвы, воды.

Возможно, что у потенциально патогенных микроорганизмов в процессе эволюции утрачивается связь с первичной эконишей и происходит формирование экониш 2-го и 3-го порядка. Происходит это под воздействием экологических факторов окружающей среды, к которым этот микроорганизм приспосабливается.

Такие микроорганизмы могут проявлять себя как сапрофиты, или как микроорганизмы, обладающие определенным потенциалом патогенности.

Потенциально-патогенные микроорганизмы не просто сапрофиты, случайно под влиянием создавшихся условий приобретающие временную патогенность, а стабилизированные на данном этапе эволюции звенья эволюционной цепи с присущим каждому из них уровнем потенциала патогенности. Особенностью таких микроорганизмов является высокая динамичность процессов катаболизма, определяющая амплитуды колебаний потенциала патогенности.

Не исключены появления и в наше время новых потенциально -патогенных микроорганизмов или повышение уровня потенциала патогенности уже существующих до степени, доступной для констатации новой нозологической единицы, а также регрессии их до уровня, приближающего ППМ к сапрофитам [Калина Г.П., 19836].

Актуальность работы.

Проведение персистентных мониторинговых анализов с изучением характеристик патогенных и потенциально-патогенных микроорганизмов позволяет не только определить эпизоотическую ситуацию в эндемичных условиях Бурятии, но и предвидеть вероятную вспышку инфекционной болезни. В то же время изучение биологии и экологии возбудителя инфекции дает картину его потенциальной возможности вызвать инфекционный процесс и возможность найти методы и средства коррекции вирулентности микробов в их эконише.

В целях прогнозирования инфекционных болезней возникает необходимость всестороннего исследования микроорганизмов, обладающих определенным потенциалом патогенности. До сих пор этот вопрос остается недостаточно изученным в Забайкальском регионе.

Цель исследований. Провести мониторинговый анализ микроорганизмов, выделенных на территории республики Бурятия, в их сапрофитической и паразитической фазе существования.

Задачи исследований:

1. Провести бактериологический мониторинг объектов окружающей среды, животных и птиц, природоохраняемых и приграничных зон Бурятии.

2. Дать биологическую, экологическую характеристику полученным микробным культурам.

3. Определить персистентные свойства выделенных микроорганизмов и их связь с вирулентностью.

4. Определить динамику численности микроорганизмов под воздействием физико-химических факторов.

5. Установить наличие токсичности почв Бурятии к патогенным микроорганизмам.

Научная новизна. Впервые в условиях Бурятии проведены экологические исследования биологии патогенных бактерий. Определены параметры существования таких микробов в криоаридных почвах Забайкалья и их диагностическая значимость. Выявлены токсические свойства определенных типов почв. Изучены ветеринарно-медицинские аспекты персистентных характеристик микроорганизмов, обладающих определенным потенциалом патогенности, и их изменчивость под воздействием биотических и абиотических факторов.

Разработан ряд оригинальных методик, пригодных для изучения экологии возбудителей инфекционных болезней в окружающей среде.

Практическое значение. Результаты исследований внедрены в практику в форме следующих разработок:

1. Материалы исследований используются при проведении лекционно-практических занятий на кафедре микробиологии Иркутской СХА, кафедре эпизоотологии Бурятской государственной СХА.

2. Разработанные методики применяются в диагностической работе Республиканской ветеринарной лаборатории Бурятии.

3. Полученный научный материал о 4 токсичных свойствах определённых типов почв республики Бурятии к сибиреязвенному микробу используется лабораторией экологии возбудителей зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока и служит теоретической основой для разработки профилактических мер по борьбе с сибирской язвой в условиях Забайкалья.

Положения, выносимые на защиту:

1. При проведении бактериологического мониторинга особое внимание нужно уделять так называемым условно-патогенным микроорганизмам, обладающим определенным потенциалом патогенности.

2. Наличие у микроорганизмов, выделенных из различных объектов окружающей среды, высоких полиморфных персистентных характеристик указывает на их способность вызвать инфекционный процесс, а в некоторых случаях и гибель животного.

3. Влияние определенных биотических и абиотических факторов внешней среды способно вызывать повышение или регрессию потенциала патогенности уже существующих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

4. Определенные типы почв Бурятии способны ингибировать рост и размножение сибиреязвенного микроба.

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в данной диссертации, докладывались и обсуждались на Международной научной конференции, посвященной 125-летию Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Казань, 1998; Республиканской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Биология на пороге XXI века», Улан-Удэ, 1998; научно-практической конференции преподавателей, сотрудников и аспирантов Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова, Улан-Удэ, 1999; Международной научной конференции Дальневосточного государственного аграрного университета, Благовещенск, 1999.

Публикация результатов работы. По материалам диссертации опубликовано три работы, в печати находятся три работы.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах и состоит из введения, 2 глав, заключения, 8 выводов,

ВЫВОДЫ

1. Из объектов окружающей среды, животных и птиц, наряду с непатогенными микроорганизмами, были выделены типичные культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов со свойствами, характерными для классических вариантов.

2. Наличие у исследуемых микробов полиморфных персистентных характеристик позволило предположить их выраженную адаптацию к защитно-регуляторным системам макроорганизма. Такие микроорганизмы, : по нашим данным, были способны вызвать инфекционный процесс и даже гибель животного. Не исключено, однако, снижение потенциала : патогенности данного микроорганизма под воздействием факторов противоинфекционной защиты, определяемых индивидуальным иммунологическим статусом.

3. При исследовании микроорганизмов, хранящихся в музее живых культур, были получены результаты, свидетельствующие о том, что в процессе длительного хранения многие микроорганизмы утрачивали свои : персистентные характеристики.

4. Проведенные иследования выявили явление ингибирования факторов персистенции патогенных и условно-патогенных микроорганизмов -воздействием магнитно- лазерными лучами.

5. Исследуемые микроорганизмы проявляли устойчивость к распространенным дезинфектантам, а некоторые дезинфицирующие вещества избирательно стимулировали их персистентные характеристики патогенных микробов.

6. По нашим данным, токсичным действием по отношению к вакцинным штаммам сибирской язвы обладали 40% изучаемых почв ; Бурятии. Эти почвы имели кислую реакцию среды и низкое содержание гумуса.

7. Наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладали споровые культуры рода Bacillus, относящиеся к типичным ; сапрофитам. Было отмечено явление антагонизма и среди патогенных . микроорганизмов, но оно было меньше выражено. По нашим данным токсичность патогенного агента реализовалась лишь по отношению к-какому-либо одному патогенному или условно-патогенному микробу, в ; отношении других исследуемых микроорганизмов этот эффект не проявлялся.

8. Микроорганизмы, выделенные из объектов окружающей среды, обладали незначительной чувствительностью к предложенным антибиотикам. Резистентные формы микроорганизмов, выделенные от -животных и птиц, не утрачивали своей патогенности. Не реагируя на ; антибиотики, они могли вызывать инфекцию такой же силы, как и . : чувствительные штаммы. |

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана научно-обоснованная система мониторингового анализа объектов окружающей среды:

- материалы диссертации используются при проведении лекционно- ;;;■; практических занятий на кафедре микробиологии Иркутской СХА и кафедре -эпизоотологии БГСХА им В.Р. Филиппова;

- разработанные методики применяются в диагностической работе;:; Республиканской ветеринарной лаборатории Бурятии;

- полученный научный материал о токсичных свойствах определённых типов почв республики Бурятии к сибиреязвенному микробу используется лабораторией экологии возбудителей зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока и служит теоретической основой для разработки профилактических \ мер по борьбе с сибирской язвой в условиях Забайкалья.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени накоплено значительное количество фактов, свидетельствующих о возможности автономного существования возбудителей инфекционных заболеваний вне организма, в том числе о роли почвы, воды, растений, как сред обитания или временного «переживания» микроорганизмов патогенных для животных и человека. Результаты проведенных нами исследований дают возможность судить о влиянии некоторых экологических факторов: температуры, реакции среды, физико-химического состава почв, органического компонента, токсичности, антагонистического воздействия микрофлоры на патогенные микроорганизмы, а именно на изменчивость их персистентных-характеристик под воздействием физико-химических факторов.

Из объектов окружающей среды, животных и птиц, наряду с непатогенными микроорганизмами, были выделены типичные культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов со свойствами, характерными для классических вариантов, в последствии эти культуры были идентифицированы, как гемолитические варианты кишечной палочки, протеи, клебсиеллы, салмонеллы, иерсинии, листерии.

Так, нами было выделено 74 штамма микробных культур. Из них 46 . штаммов, по Граму окрашивались положительно и были представлены как палочковидными бактериями - 21 шт., так и кокками - 25 шт. Грамотрицательных бактерий было 28 шт.: палочек и кокков, 27 шт. и 1шт., соответственно.

При изучении культуральных свойств выделенных микробных штаммов были получены следующие данные: 58 шт. имели колонии Б-формы разных размеров с ровными краями; 10 шт. - колонии Я-формы со складчатой или шероховатой поверхностью и локонообразными выростами по краям колоний.

Были идентифицированы роды грамположительных бактерий: Bacillus, Bacterium, Carnobacterium, Corynebacterium, Enterococcus, Erysiopelothrix, Listeria, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Yagococcus.

Из грамотрицательных — роды: Citrobacter, Diplococcus, Edwardsiella,

Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Vibrio, Yersinia.

По результатам постановки биохимических тестов провели анализ ферментации углеводов с образованием кислоты исследуемыми культурами. Так, большинство штаммов ферментировали глюкозу, мальтозу, лактозу, в меньшей мере - сахарозу, маннит, дульцит, рафинозу, салицин.

Сероводород образовывали 28 шт., индол - 20 шт. Образование фермента каталазы было отмечено у 37 шт. исследуемых культур, фермента уреазы - 17 шт. Наличие ферментативной активности, а в особенности, наличие фермента каталазы расценивалось рядом авторов, как потенциальная возможность вызвать микробами инфекционный процесс [Сомов Г.П., 1985а]. Незначительное количество культур обладали протеолитическими свойствами. Так, 22 шт. микробных культур разжижали желатину, 28 шт. свертывали молоко. На кровяной среде образовывали зону гемолиза 40 шт.

В условиях макроорганизма биологические свойства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, позволяющие им выживать в присутствии гуморальных и клеточных эффекторов, не определены. Очевидно, в преодолении возбудителями иммунологических барьеров, существенная роль принадлежит комплексу их фенотипических свойств, направленных против факторов потивоинфекционного иммунитета, к числу которых можно отнести AJIA, АИА, АКА [Соколов В.Ю., Тарасевич A.B., 1992], немаловажна и роль вирулентных свойств, ДНК-азной, РНК-азной и гемолитической активностей [Чистякова И.С., 1985; Ермолаева С.А. и др., 2000].

При исследовании микроорганизмов, хранящихся в музее живых культур, были получены результаты, свидетельствующие о том, что в процессе длительного хранения многие микроорганизмы утрачивали свои персистентные характеристики.

Соответственно литературным данным, Вас. megaterium шт. 89 имел ДНК-азную активность, а Вас. mycoides 79 и Вас. mesentericus 70, Вас. pseudoanthracis в процессе хранения её утратили [Юсупова Д.В. и др., 1972]. Гемолиз на кровяном агаре все перечисленные культуры не вызывали, АИА. АЛА, АКА не обладали. Вас. mesentericus шт. 70 образовывал каталазу Культура Вас. cereus обладала слабой гемолитической активностью.

У культуры Вас. cereus не было антикомплементарного фактора, а по данным Ю.А. Брудастова в соавт. [1996] этот штамм его продуцировал.

Вас. subtilis Л2 образовывал фермент каталазу, обладал сомнительной гемолитической активностью, имел АЛА согласно литературным источникам [Бухарин О.В. и др., 1985]. По данным Л.В. Юсуповой [1972] Вас. subtilis активно вырабатывал ДНК-азы, а в наших опытах он утратил ДНК-азную активность.

Cor. diphtheriae mitis 203-AT слабо лизировал эритроциты барана, продуцировал каталазу, ДНК-азу.

Е. coli 25922 образовывал каталазу, не обладал гемолитической активностью. АЛА, АКА, АИА была слабо выражена. Е. coli 08 оставался вирулентным для телят, белых мышей и продуцировал ДНК-азу, антиинтерфероновый фактор, что в принципе не противоречило результатам других исследователей [Гриценко В.А. и др., 1994].

Культура Listeria monocytogenes 1219 в процессе длительного хранения утратила свои персистентные характеристики и гемолитическую активность. Опыты О.В. Бойко [1998] доказывали, что возбудители листериоза, выделенные из внешней среды и из организма животного, обладали разной АКА, не имели АЛА. По нашим данным они этими свойствами не обладали.

Штаммы Salm. dublin (enteritidis), Salm. pullorum Z-12, Salm. typhimurium 79 процессе хранения утратили свои персистентные характеристики. Отмечалась лишь слабая АИА. Хотя эти культуры теоретически должны были обладать АКА, АЛА, ДНК-азной активностью [Нечмирёва Т.С., 1972; Чайникова И.Н. и др., 1997]

Sarcina проявляла АЛА, слабую ДНК-азную активность, гемолиз не вызывала, АКА, АИА не обладала.

По материалам многих ученых факторы персистенции были широко распространены среди стафилококков [Траценко А.Ф. и др., 1986; Дерябин Д.Г., 1994; Бухарин О.В. и др., 1996]. А по нашим данным St. albus и St. aureus персистентные свойства не имели. St. aureus кроме гемолитической активности другими свойствами не обладал. St. pyogenes aureus 209-R обладал АЛА, АИА, ДНК-азной активностью. St. pyogenes aureus R-209 также имеел АИА, АЛА, ДНК-азную активность.

Возбудитель кишечного иерсиниоза, Y. enterocolitica, образовывал каталазу, вырабатывал значительное количество ДНК-аз и имел АЛА, АИА. Эта культура была патогенна для белых мышей [Габрилович И.М. и др., 1994].

Из грамположительных микроорганизмов (42 культуры), выделенных из объектов окружающей среды, АЛА проявляло 18 шт., АИА - 5шт., АКА -9шт., ДНК-азную активность - 12шт., гемолитическую - 9 шт.

Среди грамотрицательных микробов (18 шт.) АЛА была отмечена у 12 шт., АИА - 10 шт., АКА - 5 шт., ДНК-азная активность - 6 шт., гемолитическая - 8 шт.

Бактерии рода Bacillus - Вас. brachisporus, Вас. myxodens, Вас. retiformis имели невысокую АИА, ДНК-азную активность. Дикая культура В. aurantiacum вырабатывала ДНК-азы в больших количествах и продуцировала антикомплементарный фактор.

У культуры Citrobacter регистрировалось наличие персистентных факторов. Она синтезировала антилизоцимный и антиинтерфероновый фактор и в незначительных количествах ДНК-азы, и обладала высокой гемолитической активностью.

Дикий штамм Е. coli обладал лишь АЛА и АИА.

Патогенные штаммы Pr. mirabilis и Y. enterocolitica вырабатывали все исследуемые нами факторы противорезистентной природы.

Факторы персистенции регистрировались чаще у стафилококков, стрептококков, а у сальмонелл, микрококков и листерий были выражены слабее.

АЛА присуща как грамположительным, так и грамотрицательным микроорганизмам. Антиинтерфероновый фактор чаще продуцировали грамотрицательные микробы, а АКА была незначительно выражена как у тех, так и у этих. ДНК-азная и гемолитическая активности, рассматриваемые как факторы вирулентности, были выше у грамотрицательных бактерий.

Для изучения зависимости вирулентности от факторов персистенции, нами в условиях эксперимента были заражены лабораторные мыши из расчета по 2 мыши на каждую культуру. Для сравнения, при заражении использовали штаммы микробных культур, обладающие и не обладающие персистентными свойствами.

Так, штамм Enterobacter agglomerans после заражения не выделялся. Штамм 1219 List, monocytogenes и штамм 79 S. typhimurium, не обладали персистентными свойствами ни до заражения, ни после. Данные штаммы находились в условиях длительного хранения и утратили свои персистентные свойства. Патогенный штамм Pr. mirabilis, в одном случае, утрачивал свои свойства, в другом - очевидно достоверное снижение гемолитической активности и незначительное повышение ДНК-азной активности, что не противоречит литературным данным [Бикмухаметова А.В., 1974]. При выделении штамма St. hyicus, значения персистентных свойств микроба увеличились и появилась гемолитическая активность. Персистируя в макроорганизме, штамм St. pyogenes aureus 209-р утратил свою АИА, остальные характеристики у него незначительно повысились. У патогенного штамма Y. enterocolitica после пассирования не были выражены ДНК-азная и гемолитическая активности, АИА значительно возросла.

Из исследуемых культур наибольшей вирулентностью обладали штаммы микроорганизмов с высокой АИА, гемолитической активностью и незначительно выраженной ДНК-азной активностью. Так, штамм Citrobacter, Е. coli 08, Pr. mirabilis при высоком значении АИА , ДНК-азной активности и гемолитической активности вызывали гибель лабораторных мышей. Культура Y., enterocolitica с высокой активностью ДНК-аз и АИА, была также патогенна. А штаммы микробных культур, обладающие высокой гемолитической активностью, но с низкими показателями АИА, ДНК-азной активности не вызывали гибель мышей.

По нашим данным, микроорганизмы, обладающие полиморфными персистентными свойствами приобретали все признаки несомненно патогенного микроба, способного вызвать инфекционный процесс. Не исключено было, однако, снижение потенциала патогенности данных микроорганизмов под воздействием факторов противоинфекционной защиты, определяемых индивидуальным иммунологическим статусом макроорганизма.

Для изучения воздействия магнитно-лазерного излучения на персистентные характеристики микроорганизмов, мы провели эксперименты с использованием терапевтического магнитно-лазерного аппарата «Милта» с частотой импульсов ИК-лазера — 50 Гц, магнитной индукцией 35 мТл ± 10 мТл и экспозицией 1-5 мин.

Полученные данные дают основание предположить явление ингибирования факторов персистенции воздействием магнитно-лазерными лучами [Усвяцов Б.Я., Кирилличев А.И. и др., 1997; Куляш Ю.В., Лепилин А.В. и др., 1998]. Что раскрывает возможность для поиска эффективных методов терапии и профилактики микробных инфекций.

Так, гемолитический штамм кишечной палочки и иерсинии утрачивали ; свою АИА и ДНК-азную активность, а гемолитическая активность эшерихий " незначительно повышалась.

У штамма St. hyicus пассированного через белую мышь, выработка ДНК-аз снижалась, к тому же, патогенный вариант, вызывающий гибель мыши, утрачивал гемолитическую активность после 5 мин. экспозиции магнитно-лазерным лучом. При указанном режиме воздействия у; золотистого стафилококка не регистрировалась АИА и гемолитическая активность. ДНК-азная активность падала.

Бактерицидное действие химических веществ имеет огромное ; практическое значение, так как этот факт учитывают при использовании " химического вещества в качестве дезинфектанта. При бактериальном действии химический агент вызывает гибель клеток. В последнее время появились публикации о том, что некоторая часть штаммов ряда бактериальных популяций приобрела устойчивость к действию дезинфектантов в рекомендованных для дезинфекции концентрациях и ; экспозициях [Красильников А.П., Гудкова Е.И., 1993; Саямов С.Р., 1996].

К тому же имеются сведения о том, что под воздействием мутантов микроорганизмы становились гиперпродуцентами ДНК-азы, а-гемолизина, коагулазы и протеазы [Joenje M. et al, 1974]. Так, мутанты St. aureus, -потерявшие-экстрацеллюлярную нуклеазу, одновременно теряли способность синтезировать плазмокоагулазу и ß-гемолизин. При реверсии к исходному штамму все три свойства восстанавливались [Omenn G.S., Friedman J., 1970].

Одновременно проводили изучение в динамике АИА и ДНК-азной активности микроорганизмов, подвергаемых воздействию химическими веществами.

При изучении динамики ДНК-азной активности микроорганизмов, мы получили следующие данные: так, мутанты стафилококков, полученные под :: воздействием перекиси водорода, становились гиперпродуцентами ДНК-азы, иерсинии же наоборот выделяли ее в меньших количествах. Идентичное влияние оказывал и 6%-ный спиртовой раствор. Штамм Е. coli 08 утрачивал способность продуцировать ДНК-азу при воздействии разных дезинфектантов.

В итоге исследований получен высокий бактерицидный эффект в : отношении иерсиний, эшерихий, сальмонелл, стафилококков, листерий, протея, микрококка и коринебактерий растворами карболовой кислоты - 3%, хлорамина - 2%, перманганата калия - 1% [Догель JI.3. и др., 1984; Самойленко И.И., Васильева Е.И. и др., 1983; Самсонова А.П., Левашев B.C., 1993]. Перекись водорода обладала избирательным действием, стимулируя активную выработку противоинтерферонового фактора сибиреязвенным : микробом, эшерихиями, листериями, сальмонеллами и иерсиниями, и выделение ДНК-азы стафилококками.

Мутанты вакцинного штамма 55 Вас. anthracis, Е. coli 08, E.coli 25922, : Salm. typhimurium 79, Y. enterocolitica полученные под воздействием перекиси водорода, начинали продуцировать антиинтерфероновый фактор. Сходные данные были получены для гемолитического штамма Е. coli при воздействии на него раствора карболовой кислоты.

Раствор этилового спирта незначительно ингибировал АИА эшерихий, выделенных из природных источников и золотистого стафилококка, а при его воздействии на E.coli шт. 25922 и гемолитический штамм E.coli, Рг. mirabilis и Y. enterocolitica АИА микроорганизмов увеличивалась почти в 2-3 раза.

Хлорамин в концентрации 2% вызывал увеличение значений АИА штаммов 25922 Е. coli и Y. enterocolitica, сходные данные получены для последнего при воздействии 1%-ного раствора перманганата калия.

Таким образом, масштабы распространения устойчивых к дезинфектантам вариантов бактерий, а по некоторым дезинфицирующим веществам и их избирательное стимулирование персистентных характеристик патогенных микроорганизмов, диктует необходимость принятия мер по торможению дальнейшего нарастания устойчивых к дезинфектантам вариантов, разработке доступных и экономичных методик : дезинфекции. Прежде всего должен быть установлен реальный надзор за циркуляцией их устойчивых вариантов с применением методик, определяющих персистентные возможности бактерий.

Из литературных источников оптимальными для переживания и -размножения сибиреязвенного микроба являлись почвы, содержащие более 3-5% гумуса с нейтральной или слабощелочной реакцией [Иванова Д.П. и др., 1985]. Рост возбудителя ингибировался в большей степени кислыми, чем щелочными условиями среды. Оптимум рН находился в узких границах в пределах от 7.1 до 7.5 [Найманов П.И., 1986]. Эти условия подтвердили наши опыты. По нашим данным, токсичным действием по отношению к вакцинным штаммам сибирской язвы обладали 40% изучаемых почв. Эти почвы имели кислую реакцию среды (рН 5.7 - 6.62) и низкое содержание: гумуса (1.75 - 2.34%). Дерново-луговая почва горизонта А при нейтральной рН проявляла токсическое свойство, возможно, из-за низкого содержания гумуса (0.48%>). Угнетение размножения возбудителя инфекции в остальных почвах компенсировалось нейтральными и слабощелочными условиями среды (рН 6.85 - 7.75), хотя почвы имели низкое процентное содержание гумуса (1.36 - 3.08%). Очевидно, этот факт указывает на экологическую пластичность сибиреязвенного микроба, обеспечивающую ему существование в среде с минимальным содержанием питательных веществ органического происхождения.

Почвы Иволгинского района Бурятии - каштановая среднесуглинистая ; и почвы Баргузинского района Бурятии - дерново-лесная выщелоченная, дерново-лесная типичная, дерново-луговая аллювиальная слоистая с погребенными горизонтами оказались токсичными и на них не росли сибиреязвенные микробы. На другие возбудители инфекций изученные типы почв токсического действия не оказывали, что при оптимальных экологических условиях давало возможность предположить рост, размножение и резервацию этих микроорганизмов в указанных типах почв. Вышеизложенные данные имеют значимость при разработке профилактических мероприятий в частности при сибирской язве.

При инкубировании микроба сибирской язвы в среде с нейтральной рН происходило быстрое отмирание вегетативных форм и интенсивное накопление спор. Активная реакция в пределах от 5.8 до 8.0 и концентрация : NaCl (от 0,05% до 5%) темпы развития возбудителя, не препятствуя его" размножению [Родзиковский А.В., 1989].

Размножение эшерихий ингибировалось щелочными нежели кислыми условиями среды, оптимальными условиями для развития Е. coli являлись: температура 4°С, рН 5.8 и низкие концентрации соли в среде.

Листерии были весьма чувствительны к смещению реакции среды в щелочную сторону. Низкие и высокие концентрации соли в среде сдерживали развитие данной культуры.

Интенсивный рост Y. enterocolitica отмечался в щелочных условиях ; при 37°С. Повышенная и пониженная концентрация соли в МПБ незначительно подавляла рост данного штамма по сравнению со средними значениями."

Высоким антагонистическим действием по отношению к патогенным бактериям обладали штаммы культур рода Bacillus, это штаммы Вас. cereus и Вас. subtilis Л 2. Так, они подавляли рост вакцинного шт. 55 Вас. anthracis, Е. coli 25922, List, monocytogenes 1219, S. typhimurium 79, Y. enterocolitica. Сенная палочка, Вас. subtilis, выделенная из внешней среды, оказывала подавляющее действие лишь на листерии, в отличии от своего музейного родственника. Шт. Вас. myxodens был токсичен по отношению к листериям, : а шт. Вас. megaterium 89 - сибиреязвенному штамму 55 и иерсиниям. Рост S. -typhimurium-79 подавлялся антибиотическими факторами, выработанными В. ochraceum.

Патогенные культуры также обладали антагонистическим действием в отношении друг друга. Так, эризипелоидный микроб проявлял-антимикробные свойства по отношению к иерсиниям, а возбудитель листериоза - по отношению к сальмонелле тифимуриум.

Бактерицидный эффект на вакцинный шт. СТИ Вас. anthracis имели культуры Diplococcus septicus 160, S. dublin, a патогенные штаммы Pr. mirabilis и St. hyicus угнетали рост шт 55 Вас. anthracis.

Шт St. kloosii и шт Str. milleri в одинаковой мере подавляли рост List, monocytogenes 1219.

Таким образом, наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладали споровые культуры рода Bacillus, относящиеся к Г: типичным сапрофитам. Было отмечено явление антагонизма и среди патогенных микроорганизмов, но оно было меньше выражено. По нашим данным токсичность патогенного агента реализовалась лишь по отношению к какому-либо одному патогенному или условно-патогенному микробу, в отношении других исследуемых микроорганизмов этот эффект не проявлялся.

Культуры, выделенных микроорганизмов, показали высокую : устойчивость к применяемым антибиотикам. Процент чувствительности к антибиотикам был не значительным, ряд микроорганизмов был чувствителен :;. ; к тетрациклину, эритромицину, стрептомицину, и незначительное количество - к левомицетину, мономицину, олеандомицину, неомицину.

Высокой резистентностью к полимиксину и бензилпенициллину обладали все выделенные культуры за исключением штаммов List, monocytogenes и St. aureus, соответственно.

Возбудители желудочно-кишечных заболеваний были мало чувствительны к предложенным антибиотическим препаратам. Шт. S aim. -typhimurium проявлял чувствительность лишь к эритромицину, а к остальным препаратам - промежуточную чувствительность. Шт. Е. coli обладал полирезистентностью. Патогенный вариант Pr. mirabilis в значительной мере был умеренно чувствительным к химиопрепаратам, рост культуры подавляли левомицетин, эритромицин, тетрациклин. У. enterocolitica был мало чувствителен к предложенным антибиотикам.

Рост возбудителя листериоза ингибировался эритромицином,.:: тетрациклином, стрептомицином, мономицином, это был единственный штамм чувствительный к полимиксину из всех выделенных культур.

Эризиопелоидный микроб проявлял множественную устойчивость, ни один из перечисленных антибиотиков не подавлял его роста в нашем опыте.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что микроорганизмы, выделенные из объектов окружающей среды, обладали незначительной чувствительностью к предложенным антибиотикам. Резистентные формы микроорганизмов, выделенные от животных и птиц, не утрачивали своей патогенности. Не реагируя на.:; антибиотики, они могли вызывать инфекцию такой же силы, как и чувствительные штаммы [Бриан J1.E., 1984].

Этот аспект имеет значение в свете изыскания новых антибиотических препаратов для лечения инфекционных заболеваний, поскольку очевидна тенденция «привыкания» отдельных микроорганизмов к классическим препаратам, применяемым для подавления их роста. С другой стороны, большое внимание при разработках следует уделить тому факту, что применение «ударных» доз антибиотических препаратов, вызывает массовую гибель как болезнетворной, так и естественной микрофлоры организма при ;: которой происходит освобождение в больших количествах эндотоксинов, вызывающих осложнения [Красильников Н.А., 1958].

Анализируя представленные литературные данные и результаты собственных исследований, можно прийти к выводу, что при определённой совокупности физико-химических, экологических характеристик, может

139 происходить не только резервация возбудителей болезней животных и человека в объектах окружающей среды, но и приобретение ими свойств несомненно патогенного микроба.