Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование технологии производства вакцины против бруцеллеза из штамма Br. Abortus 82

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИСОВДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТЮИКАЦИИ • ВЕТПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

ЗЕНОВ Николай Иванович

СОВЕЩЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТ® БРУЦЕЛЛЕЗА Ю ШТАММА ВН. АВОТТОЗ 62

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и имцунологкя

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против бруцеллеза, кампилобактериоза и иерсиниоза Российского Государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветпрепаратов и Государственном Щелковском биокомбинате.

\

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор Н.В.Щумилов

каццвдат биологических наук, Н.Д.Скичко

Официальные оппоненты: заслуженный деятель туки РСФСР,

доктор ветеринарных наук, профессор

A.В.Селиванов

кандидат ветеринарных наук

B.А.Ромахов

Ведущее учреждение - Российский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных

Защита состоится " 0К'*А2рЛ'1992. г. в ■/б'^шс. на заседании специализированного Совета Д 120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГ'НКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ,

Автореферат разослан н

Ученый секретарь ' Специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук

1992 г.

А.Козырев

\

?

...Л ; I. СК4АЯ -ХАРАКТЕРИСТИСА РАБОТ!

Актуальность темн. В обцем комплексе мероприятий по 6opi.T" с орулелле?ои крупного рогатого скота в прпи.тещетпенню: услоыт гироко применяют сухую вакцину из слпбопггл» тиногг-иногс стпку.ч < :\ производство которой составляет 2U мкн.лгл в год.

До настоящего времени изготовление вакцины против бруцеллг: ; из штамма Brucella abortus 82 производится in твердых питятелызя средах. Эта технолог;« требует больших производственных плогдлой, значительного количества стеклопосуды, ст'нь дефицитного агар-ар5 -pi и wioro ручного труда.

Одним из современных методоп культивировчния микроорганизмов является глубинная технология.

Результаты опытов исследователей Казанского ветинститута Кс-рунова В.П., ЛеуЕИной A.M., Камалова Х.Г. и др. (I3Ü0-I9M) по суспензионному культивированию бруцелл гатамш ОС с использованием питательной среды щ основе гидролизата лактальбуминя, внедрение технологии глубинного культивирования бруцелл стоила 19 (198-5-ГГ-;У.} свидетельствуют о перспективности разработки протопленного производства вакцины против бруцеллеза из итамма 62 Br.abortия глуй;:;:-ним методом. В то же время не полностью реяени вопросы концентрирования микробной суспензии при глубинном культивировании бруц-~г.-.

- концентрирование баккассы бруцелл штамма 82 методом центр::-$угирования(Камалов Г.Х. и др. 1984) трудоемок и зкодогичосг:: опасен;

- осаждение бакмассы бруцелл штамьп 19 импортной натриевой соли карбоксиметилцеллюлоэы требует валютное средства на ее закупку.

Наибольшее предпочтение по концентрированию микробных клеток

. vv -i..... »: ксслсДоьл1сли оадига использование

.: ïi-xti-: ы и«, в частности ультрафильтрации ( Uioliaela Н.й. '

liuia^-jx 1£оЗ; Лялин В.А. I960). Использование метода .... ! г.ф-..7.: трц,:;! для концентрирования бруцолл нам неизвестно.

cVpa-jo-i, пухл совершенствоьанлд технологии промышленно-: j 1;(:}кзио.чсг1;а сухой хивой противобруцеллеэной вакцины из ыташч f:2 состоят в основном из оптимизация процесса глубинного культи-i:.ipoi.miiia и метода концентрирования бруцелл.

Цель работы. Усовершенствовать технологию производства ьак-цины из стаиыа Brucella abortus82 в производственных условиях.

Задачи исследований. В задачи исследований входило:

1. Разработать промшденную технологию культивирования бруцелл l ¡йдцкой питательной среде в ферментерах для изготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма м-. abortus 82.

2. Изучить объективность натриевой соли карбоксиыетилцеллюло-„iu отечественного производства при осаждении микробной взвеси brucella abortus 82, выращенной глубинным методом.

3. Изучить возможность концентрирования микробной суспензии iii /цглл шташа 62 с использованием метода ультрафильтрации.

4. Подготовить и представить для рассмотрения и утверждения .исполнения к НТД по производству вакцины против бруцеллеза из игаыла 82 глубинным методом в жидкой питательной среде в (}ерыг_н-ïepax с использованием для концентрирования бруцелл натриевой со-~iî к.';рбокси«етилцелл1>лоэи отечественного производства и ультра-фпльтрацаошой установки.

4. Научная новизна. Установлены физико-химические параметры ¡•ультиБированля бруцелл штамт 82 (кжме^итура, pii, пр. ия, рлст-

з

воренный кислород) в условиях глубинного культивировпиия в р • терах 13 производственных условиях.

Показана возможность концентрирования микробной суспензии бру-целл сЛямш Brucella abortus 82, выраженной глубтвшм методом, с использование!/! отечественной натриевой соли кярбоксимстш'ц^лл"-гози и метода ультра(}ильтрзцин.

Практическая значимость работы. Изготовление вакцины ил стпмп Brucella abortus 62 глубишкм методом с использованием для концентрирования микробной суспензии бруцелл отечественной натриевой соли карбоксикетилцеллюлозн и метода ультрпфильтрации позволит:

- повысить культуру производства, значительно сократить использование стеклопосуды (четвертей), почти полностью исключить контакт технического персонала с сырьем и с препаратом в целом;

- сократить численность персонала в цехе № 4 Щелковского биокомбината на 25 человек, освободить производственные площади на

1100 м2;

- заменить дорогостоящую агаровую среду на более депевун на основе перевара Хоттингера и увеличить при этом с одного и того гее объема питательной среди выход бакмассы бруцелл;

- отказаться от закупки по импорту натриевой соли карбокснме-тилцеллвлозк;

- сократить срок концентрирования бруцелл с 3-5 суток до 2 часов при применении ультра^ильтрационноЯ установки, что даст возможность более чем в 2 раза эффективнее использовать технологическое оборудование.

Внедрение. ¡Ъготсвлснио вакцины из стамма Brucella abortus 62 глубиннкм методом я ферментерах осуцествляется на Государственном Целковсксм биокомбинатс.

¡¡„ i~w„ ,Ш!Л 1Ч.ДЦ lUrOfOBJÎCIlJ ЫКЦИ1Ш ГЛубНгШШ Методом

- Lj lli них: ¿7,4 мяи.доэ о иак-льзоюишеи для концент-

l'.upoiuium и'длшиилшкй tuxpjuBolí соли кирооксшетшщеллюлозы и ü,6 млн.доз - уьтрацюшюй установки.

Вакцина, изготовленная гвуОштш методом ..¡ьсчала требованиям ТУ 10.19.69419 по контролю сухой живой ьакцшш против бруцеллеза крупного рогатчго скота из слабоагглытиютшого штампа brusella

abûrtua b2.

Апробация. Pfi\лы'аты исследовании доложен» и одо&х'ини на:

- эаееданшх Ученого Совета ВГШШ ветпрепа{»атов в составе годовых отчетов по научно-исследовательской работе лаборатории контроля и стандартнаащш препаратов против бруцеллеза, кашшлобакте-риоза и иерешшоза за 1990, 1991 гг. ;

- всесоюзных (uyqiiux конференциях: Велогож, Московская обл., октябрь 1990, Httjuiíí Новгород, декабрь 1990 г.

lia базе УзШШИ среднеазиатского отделения БАСХШШ проведена комиссионная проверка ишуногенаой активности В серий вакцшш из awuiua Ьх-. ubox-tuo Ь2 m шрекик свинках, приготовленной глубин ■ ним методом с использованием для концентрирования взвеси, бруцелл 1>«чг:ствеши(1 натрикьой СОЛИ КЛр^ОЬСШ.'.еТИЛЦёЛЛСЛООЫ И уЛ1Тр:ф1ЛЫ-раЦПОННОЙ yClailOBKll.

Публикация результатов исследований, lio материалам диссертаций опубликовано две работы. Получено иололии-лыюе решение на авторе к. • свидетельство. Утвередеао дополнение но глубинному кузьгкшфовашш бруцелл шгамма 82 с 'использованием для концетр.фоилшт бруцелл отечественной натриевой соли кчрОоксииегилцеллмозь н ульт{^а4иль'1-№ЦНО!ШОЙ ^СТаНОВКП.

1|6ььм.и сп'укууи диосщн'<»цци. ji.'.eci (iiaibir in нч ПЬ

СТрЛИНЦПХ МЯЮИНОПИСНОГО Т'''КСТ1 И ЯК.-r-li'-r ?»>',.•"»•!«'•,

туры, собственные исслодпялни.ч, ||,.»;г»"<чг.-'л .....

суждение литературы, пктгоди, np.-«Krit'r":i'!v 14 ■ ■; -1- — 1';-•', < «.,

торчтурн (12В OTWCTfcWntrx И Г->ПwY«-4t:::>" 'Г --j:'--▼ови«. Рябого иял»>ст1>и ропат И тж$яии-ч«и и " гч--,.....

2. CuKTBHifiliK IfcJCJ.H^

2.1. Для культиркрор^нил ';;.;.•: >г- о.")

и2 глубшшмм методом использовали ^ерм»нт")и >{hj i«: "^лг-нтролгкс" $ерментзйшин" (Швеция) с объемами 3G0-750 л, скяб?-чки:>«и система-ми автоматического контроля и управления основных технологически-: параметров культивирования (температура культивировчния и стерилизации, рН, рОг,, ипмерени«- расхода воздуха, скорости вращения мешалки, подача пеногаситмя и титр-чцтов).

Для производства вакцшгы использовали эталонную серию птанчг Brucella abortия 82 3 022, который характеризуется следующими свойствами: находится в SB $ормо, умеренно выделяет сероводород, растет на среде с фуксином и тионином, нечувствителен к пеницн"-лину и эритритолу. Выращивания культуры вакцинного штамма С?. проводили в жидкой питательной среде, состоящей ил перевара Хаг-тингера, глицерина, глюкозы, дрояяевого экстракта, сыворотки круг.-ного рогатого скота, поваренной соли. Содержание аминного азстг л питательной среде - 150-170 мг£, рН - 6,9-7,1. Стерилизации питательной среды осуществляли через стерилизугяцие фильгргтластшш.

Культивирование бруд^лл в жидкой питательной среде ocynnci яг.л • ли при температур« 37- ¡г'УС, рН в пределах 6,9-7,4 подцержирл-м л:> счет титрамтов: .'/8 ристпора гидроокиси натрия и р-створя сошной кислоты, pfJ^ в пределах 20-40$ поддерживали за гл"т подати воздуха и числа оборотов мешалки.

для определения оптической концентрации бруцелл при засеве и в процессе накопления, применяли оптический стандарт мутности riiilHCK, СЭК-50Ц и волоконно-оптический преобразователь плотности СВОИ).

Для концентрирования суспензии бруцелл исиолъзовнли натрие-ьуи соль карбоксиметилцеллюлозы импортного и отечественного производства в виде I-2& раствора и полупромьиленную ультра^ильтра-ционную установку па основе полых волокон УШ-б,0.

{¡зучение культурально-ыорфологических, биохимических и биологических свойств бруцелл штамма Ь2 в образцах вакцины, изготовленной глубинным методом проводили по методикам, рекомендованным СА0-В03 и согласно инструкции по изготовлению н контролю вакцины против бруцеллеза из штамма и2, утиорщшюП 1УЬ СССР от 26.В.74г. и 17 1049.&9-Ь9, утв. ГУБ СССР 03.03.b9 г.

Полученные результаты обрабатывались общепринятыми методами математической статистики.

2.2. Результаты исследований.

2.2. Оптимизация основных параметров (количество засевного материала, pli, рОо, продолжительность) периодического глубинного культивирования бруцелл ытам.ма 62

Дли отработки основных параметров глубинного кулыиьированил оруцелл итаила 82 в производственных усливиях было проведано более 200 культивирований. Данные основных параметров 17 -ти т< хно-логичеекпх кул1тивир0ваний бруцелл прпь.-деш.: в тоблице I.

Установлено, чго накопление бруцелл на 19-24 чае к/льти! ипо-ьания не зависит от исследованной з'.севн'/й кенц-'-нтр.'.ь.и игеКУЛ!'.-;'..

В диапазоне 1 ,о-г.',0 млрд.микробных клгтек .'- i .......г ,.><.4;

среды, о чем emue-rt.льствует крайне h/ei,:;.: .. ■ '.г i:;vj.. :...,;

Таблиц,.! I

Показатели основных параметров глубинного культивирования бруцелл штамма 62

Доза посевной культуры иирд/см ) Продолж. культив. Ро2 {%) Подача • Ражим работы рн Расход рантов тит- Расход пенога- Накопление микроорган, бруцелл (млрд/см )

пыта (час) воздуха (л/мин) мешалки (об/мин) HCl (л) с% аОН (л) сателя (мл)

х 2,7 24 20-40 0-S6 152-266 6,95-7,4 5 - 150 45

о ^ 'S w , •-i 22 20-40 17-81 150-255 7,00-7,22 5 - 150 45

3 2,8 19 20-40 13-73 157-310 7,00-7,30 3,5 - 150 60

4 2,4 24 20-40 16-150 28-330 6,95-7,36 3,0 - 100 37

ó 2,8 20 20-40 12-104 156-295 6,85-7,3 5,0 1,5 150 60

ó 2,0 19 20-40 14-103 156-290 6,85-7,22 5,0 1,5 100 ¿0

7 3,3 20 20-40 12-130 170-330 7,15-7,29 7,5 - 200 60

Ú 3,2 20 20^0 10-130 170-334 7,12-7,20 6,0 - 20и 65

9 2,0 22 20-40 16-139 162-270 6,9-7,24 3,0 - 200 42

10 3,ö 24 20-40 16-130 149-280 7,13-7,4 с,5 - 200 31

II 7,0 20 20-40 28-105 190-273 6,Ы-7,14 2.5 I, I 2и0 п

12 7,0 23 20-40 15-94 154-264 6,ь5-7,24 5,0 200 47

13 3,9 19 20-40 11-147 166-285 7,12-7,31 8,0 - ССО о С

14 Т U » ^ 24 . 20-40 20-100 Ю2-2Ыз 6,съ-7,29 3,0 , о ICO 'с-i

15 4,15 21 20-Ю 15—121 164-250 ó,99-7,2o D,0 - ICO 4 ó

16 2f 2 21 20-40 23-210 170-255 0,97-7,19 * 1 ^ I»-.,

17 2,55 24 20-40 22-120 I87-ÓC0 7,и0-7,17 4.2 - IС с

X 3,52+0,88 21,4+1,11

Примечание: температура культивирования 37-3tíJG; питательная ср-_-:;а: oCü л -

1-15,17; оОО л - опыт 16; аминкый азот - I60-I7C мг"; р.-. - c,j-7,0o

и

( К -0,Со). Средняя заеевная доза инокулята по 17 культивированиям составляет 3,52^0,88 млрд.бруцелл на I см3 среды: Накопление бруцелл на 6 час культивирования составляет 14,4+1,4; 12 час -33,4+7,15; 18 час - 47,2+7,5 и в конце культивирования -54+10,39 млрд/см3.

Автоматическое поддержание концентрации водородных ионов в пределах 6,9-7,4 не оказывает существенного влияния на конечное накопление бруцелл, о чем свидетельствует низкое значение коэффициента корреляции ( Н =0,1). Так, накопление бруцелл по 17 культивированиям составила: 7 опытов - 45; 6 опытов - 60 и 4 опытам -34 млрд/сыэ. Следует отметить, что культивирование бруцелл штамма 82 осуществляется при рН выше 7,0. Концентрация водородных ионов выше 7,15 отмечается в период с 3-4 часа по 16-18 час. культивирования, соответственно и расход титрантов для поддержания рН составляет: в период с 3 по 18 час. от 2-х до 8 л 5% раствора соляной кислоты и после 18 часов - 1-3 л раствора гидроокиси натрия на 300 л бактериальной суспензии.

Определение лимитирующего уровня растворенного кислорода по фазам роста культуры бруцелл производилось графическим методом. Для чего уровень р0^ баксуспензии доводился до 100%, затем выключалась подача воздуха на аэрацию и фиксировалось во времени снижение р0£. Сначало это снижение шло по линейному закону, затем наблвдалась точка перегиба. В этой точке строилась касательная, которая отсекала на оси р0£ значение, являющееся лимитирующим уровнем растворенного кислорода для данной фазы. Установлено, что оптимальное значение р0^ при глубинном культивировании бруцелл штамма 82 составляет:

0-6 час культивирования - поддержания р0^ в этот

перюд подача воздуха составила от II до 51 л/мим (0,14-0,2 л па I л питательной среди) при скорости вращения мекалки от 117 до 187 об/мин;

7-12 час - 25-30^ (подача воздуха от 51 до 91 л/мин (0,02-0,Зл на I л среды), скорость вращения мешалки от 190 до 255 об/мин);

13-18 час - 35-45^ (подача воздуха от 102 до 124 л/мин (0,3-0,4 л на I л среды), скорость вращения мешалки от 232 до 300 об/мин);

после 18 часов до окончания культивирования - 20-25^ (подача воздуха от 39 до 95 л/мин (0,2-0,3 л на I л среды), скорость вращения мешалки от 178 до 265 об/минК

Средняя продолжительность культивирования составляет 21,4+1,11 час. Окончанием культивирования служит резкое снижение потребления растворенного кислорода. Температура культивирования 37-38°С поддерживалась в автоматическом режиме.

100-200 кл пеногасителя (пропинола Б-400) на 300 л бактериальной суспензии (О.ОЗ-О.О1^) практически устраняет пенообразование в процессе культивирования бруцелл штамма 82 глубинным методом,

2.2.2. Концентрирование бруцелл штамма 82, выращенных глубинным способом

Для концентрирования бакмассы бруцелл после культивировшия были взяты натриевая соль карбоксиметилцеллюлоэы ( НаКМЦ) импортного и отечественного производства и ультрафильтрационная установка УШ-6,0. Предварительные испытания по использованию НаКМЦ импортного производства для концентрирования бруцелл показали, что время осаждения бакмассы непосредственно в ферментере составляло при рН 6,9-7,4 - 8-II суток. Учитывая сообщения о действии НаКМЦ как анионного флокулянта при рН выше 7,0 (Тесленко

.».il., i-.w-i), aocMuiUiii задачу проверить осаждение бакмассп ору-цльл t. 2 при pii в пределах 7,0-0,0.

Установлено. что н аКЫЦ, пак импортного (Швеции), так и отс-4cOTboiuu.ro пр.кзвоцстьа (марки: ь5/о00"0"; 70/450"0й и tib/C"0" Iwl' ныаоол--^ активны при подтигривке суспензии до

pli ?,7-7,(.' - ô" ргсгвором гидроокиси натрия. 1-2$ расгьора tiaiù.l из расчета 0,2;'' сухого ьениства к общему объему суспензии кон-центрпруьт взвесь бруцелл в 5-7 раз непосредственно в ферментер. при температуре T~t>°C, pli - 7,7-7,Й за 3-5 суток, что позволяет использовать в 2 раза эффективнее технологическое оборудование п сравнению с осаждением без подтитроьки. Однако концентрировании бруцелл в течение З-о суток при культивировании всего 20-22 час:, сдерживает возможность более эффективного использования фермен- , тационного оборудования.

Для выяснения возможности одного из наиболее окоиомкческ'.го и перспективного метода концентрирования микробных клеток, в частности применение проююи:шюй ультрофил: здющиэшюй устпном:. УПВ-6,0, были проведены исследования по иснользопшш со для концентрирования бруцелл штамма 62.

Установлено, что использование промьсиош^й ул^трафильтраци онной установки УПВ-6,0 позволяет концентрировать суслишь» бруцелл штамма Ь2 в 5-6 раз за 2 часа. Такой истод каицси-грир'-'Ь t-1шя бруцелл штамма 62 в отлична or использования 1ьтр;: .вой соли КЫЦ, позволяет ь 2-2,0 раза интепеивп.е i:c;iu;:i зовать уохнз-логическое оборудование и производственные илегздш б- . уь;.ни.— ния численности обелужлвзьдцего ПерСОНаЛЗ .

2.2.3. ¿Ьучсние культурально-мор!ОЛОГИЧ1 СКИХ, биуьы:.. . .

!! биологических свойств бруцолл с-гзкмч о?., н':р... .:< мых глубинным методом

Длл изучения культуралыю-мор|ологических и Сн1г..,„>!ч.1:.....

свойств бруцелл штамма 82 были отобраны образцы 10 .ь! е.. .: бруцеллезной вакцины, изготовленных глубишшм м-л-одси: па ы>. серий вакцины с использованием для ссазгдения отич<.згьс-||ИоИ л .и и а сирин - с использованием для концентрированна л.лшаса.: ;• . •{ильтроционной установки. В качестве контроля сл\ъ;-.н: е..;,;.: . . пини, изготовленная в четвертях на псченочно-шртен^ьс;:.: .м • > 1 с переваром Хоттингера и серия эталонного до&мш -V 1С'..

Результаты исследований представлены в таблиц-, 2.

Из таблицы ВИДНО, ЧТО культуры бруцелл, шргц. 1 л; 1 мгтодсм и концентрированные с использовл!«. м >;г. •• ^и-.ия. а а и метода ультрафильтрации умеренно образуй? сгроьидород, ¿ид.! положительную пробу с акрифлавинсм. И; л скръеке по Уаит-Вилеьл колонии находятся в типичной Ей -<|орк-.-, иологятслыю агтлкгти ровились с антибруцеллезиими 3 и П-еивсроткаш. Двухмиллиарл икс взвеси бруцелл дают хороший рс;сг на среде с фуксином и тл нином (в рааведении 1:530000). При добавл« чкд латриллл л с.с.ли (' аидпошшнллина бил зарегистрировал! рост ку.м,: ^:л; I.! с; : :•• л е •,

иентряциеЯ препарата 0,5; 5,0; 10,0 и 50,0 :,Д. Г:..а..: » I.....

бруцелл В концентрации I или. и 100 '/¡:с.млк;х1л:;л; кл г, л а »*-з 0,1 яд на с|е-ду, еолар-калль эрлтритол (I ш/ш) п.блгдллл ошклшой реет при высеве I млн. и от 07 "о Т'ло к. ланий ¡мм 100 тыс.

Таким обралем, кульгур 1 бруц.и .ч, к;, л; 1 л:л;р\ч мча глуг.иши^ .'Л'.аабем, "г-огч.тетьчп ла у.чр.акгь-..м ь.мр :ллнпой на агаров.:й

Результаты проверки культурально-морфологических и биохимических свойств культур бруцелл, выращенных глубинным методом и концентрированных с помощи натриевой соли карбоксиыетилцеллшозы (НМД) и ультрафильтрационной установки УПВ-6,0

Проба на диссоциации ' ' Чувствительность к

"!? Номер ¡1° 5й "проба окраска ' сыворотки фук-тио- ' пенициллину эритритолу (I мг/см3)

п/п серий • (мы) с ак-риф-лави- ном - по .Уаит-Билсону г 1:50 н 1:10 си- ^ ну ] 1:50 тыс. тыс. 0.5 5.0 10,0 50,0 вд вд Конт-г р°льйлн. и.к. 100 м.к, контроль •1млн. 100 м.к. м.к.

I 0Ц7(КМЦ) 4 +3 типичная 44 • 43 44 42 44 44 43 42 44 спл. 76 ' спл. НО

2 0П9(КМЦ) 5 +3 скорма 44 44 44 42 44 44 43 41 44 рост с.р. 82 рост с.р. 90

3 015ККМЦ) 5 44 _ 44 44 44 42 44 44 43 4 44 с.р. 67 с.р. 100 £

4 0152КМЦ 5 +3 тт 44 44 44 42 44 44 43 42 44 с.р. 90 с.р. 105

5 0170 КМЦ 4 ' +4 л 44 +4 44 42 44 44 43 42 +4 с.р. 75 с.р. 123

6 0294УФ 5 43 п 44 42 44 42 44 44 43 42 44 с.р. 95 с.р. 134

7 0392 УФ 5 44 44 43 44 +2 44 44 43 42 44 с.р. 98 с.р. 117

8 0428 УФ 4 44 +3 ¿4 ±2 ¿4 ±4 ¿3 ±2 ±4 с.р. 73 с.р. 90

9 0443 УФ 5 +3 44 .43 44 4 44 44 43 4 44 с.р. 108 с.р. 130

10 0391 УФ 4 - '44 м 44 43 44 4 44 44 43 42 44 с.р. 80 .с.р. 135

II 02Ичетв. 4 43 и 44 44 +4 4 44 44 42 4 44 с.р. 100 с.р. 70

12 шт.сер.022 4 4 — 4 4 44 4 +4 44 42 4 44 с.р. 92 с.р. 92

Примечание: оценка в крестах

питательной среде в четвертях и эталонного штата ВгисеШ. и- . tua 82 серии 022.

Ifa биологических свойств бруцелл, выращенных глубиитл г- / дом, изучали выживаемость их в образцах вакцины через 3,6,0 .. 12 мес. хранения и иммуногенность.

Для анализа и оценки жизнеспособности бруцелл в ыкцш-к-, » готовленной глубинным методом, с применением для концентрпр:,и.лы.. бакмассы бруцелл натриевой соли карбоксиметилцеллюл.. зы 4,п. . го и отечественного производства и метода ультрафнльтрчции ih-ji - ■ ■ зовалиь результаты, отражающие содержание живых' бруцелл ь ^-ц...,..-вакцины 32 серий через 3,6,9 и 12 мес. с момента определения и, исходного количества.

Результаты выживаемости бруцелл в образцах вакцины np.\v' лени в таблице 3.

Из таблицы следует, что через 12 мес. хрансш'.л i p.-.« ,i.t ¡., цент живых клеток, по отношении к исходному 'телу, устиН'-Ул-.иь -при выпуске препарата, составил 93,3+3,0",? - при оса^ценни отечественной ИДЦ, 89,1+10,2$ - при концентрировании на yjit.i-pv-фильтрационной установке и 91,4^5, Й? - при оса-»цении пппорт й КМЦ. Сравнением средних количеств живых микробных рс ток п., и,-сериям препарата не позволило установить м-дцу ними опч.и:-..- » ски дсстсвершгк различий (р < 0,05).

Таким образом, вакцина из штамма 82, изготсышш и :.а ¡\ логин глубинного культивирования бруцелл в р^акглр-, а хранения ее в лиофилизированном вице по (¡лаксинх в ,,<.; . >• j. • 1,, та особой tutcvjm при 4-Iù°C сохр-шясг »¡кокс-; oi- ; : г. ло жнвпх бруцелл но кае-Jù чьм Mi с.

(Ьмуногощу» активность вакцины из аг:»кма i:rj.: .-1 l:i Av. 1 ...

лдоязаемость бртцелл з вакцине из гтамка Ьг. аЬотгиз £2 при разллчкь-х способах концентрирования бакмассы

Среднее количество живых микробных клеток

г-окцектриро ванне бактериаль- К-во серий млрц .мик.кл.см3/^

ной массы исходное 3 мес. 6 мес. 5 мес. 12 мес.

Натриевая соль 225,4 223 0 223,5 220,0 211, ,0

КМЦ (отечественная) 12 38'6-2;1 98,7+1,0 97,3+1,9 93,3+3,0

Ультрафильтрация 10 225,5 217,7 97.9+1, е 214,3 96,2+3,4 204,6 91,8+47 2С0, ,5 89,1+10,2

Натшевая соль 177,9 179,3 172,5 163,3 163. ,1

КМЦ (импортная) 10 101,0+3,9 97,0^;0 92,2+5,0 91,4+5,2

ей, полученной глубинным методом изучали в epumui-it.i о .. • , кул; тури бруцелл вакншшого ыгасл ЬУ. серил 0;:,.' л .:< ¡.а. :. -мготоглонной на твердой питательной сруу в ппбцЛи' .

№слгдоваяи гЗДектпыюсть & серии елкцш-.u чеу з Г! - К: со дня изготовления: 4 гурии вакцины, полученной глмУзал з'1!.! с гско.чьасглишег, злп озз"з:~п!ш ьзг'. зл б р. ..л ; ■ . Я лЬУЦ и -> серии ¡пкнлнн, полум: пнMi r.vc,!-;;. . • овзнном для 1гопцпгл'.1р';в п:пл зрмулл умлр :лз;, е.. .. .: ло&кл. для отм; цмл; ¿ело гмлзз IL-5 ьзузллл еззл з;. ::.,,. зрзнзьеу!Л!1 Через о :г;сз:;-- сссле елллллзьлл i - .

ноте лггзммч Br. abortus &i..i Bl:i].a в yc.i'oi!.!. У Л ;. .. i . Результаты проверки приселен; з и тазл.зи; 1.

Результаты проверки пммуногеннеп ai;-.!!bi!<..:v.i лр .

серии влкщтьп пз и:тм.!:.;д Brucella авзгЬ-.еУ в с,п..;: н . морских свинки:

КуЛЬТИВПрОВаНПе И МеТОД ¡1иЛНЧл;П><-

КОНЦеНТрИрОЕаННЯ бруцелл серий

Глубинны!! метоп - оео;;;аенпе отечественной ИаКМЦ -1

Глубинный мете-! - к-музлтрмль: У," i

■ i arareiv i: i;::i1:-.ч" нон ерлзз n

'"-лвортлх * i

л:\..uннзл с-лзз; ОЛЛ I

lb 'теблил': ез.'мму '¡¡'О /л1,:';,,: ; ¡пл-ту-;:..>: -v.-.- 'лзз;

л .rLТе : n i;p..-:; ! з . ■ , л.. . . , ' зл ; Л' . : з з >

. ТЛ1Л. !'г ■ , ;; :;;.; :,,..' , . , , ..........

: ; ЛгЛ;; :>: в '3 "3, . : 1 3 ■ J з'. . - . , ,

р.Лч'Н ЛЛГЗ L33 ':аГЗ'.Л'еС" 3 3 [.- .. . ... ; . Л !..;'

' )Г,'-3'П') л ,ТУ-Т ;!Г>.'.!.:.." з ............ мл з

" '• ••• •"-•.; ит|ирогбли и» ультрофильтрчциошюй установке.

• > пстзгт ли г.; v; 7-ТГ)у»г требованиям НТД на вакцину и согла-' " • -.'i с дошит, отркшцнми число иммунных животных в группах,

> г.нки:*-эталонной культурен Оруцелл вакцинного штамма 82 и вак-!ипгоювленнзй на Trejv:ot1 питательно» среде в четвертях -- 72,'rf и 71,-1,П.

. б и а с л ы

I. Установлены основные параметры периодического глубинного

• л тлгирогашш бруцелл штата В.г. abortos 82 в жидкой пнта-т 4 ™¡ шв среде в ферментерах: рели чина дозы засевного иатериала

),[) ¡шрд.бруцолл/см3), концентрация водородных ионов (рН ' .- 7. 5), уровень растворенного кислорода (20-4550, продолжитель-'•■■■rv, куп> тивнропашш (20-22 часа), температура культивирования .У0;:.

Гипозап-i эффективность натриевой соли карбоксиметилцеллю-*-ir сточ! "ерппоП, так и импортной для осаждения бруцелл при ' ,и в раствора с концентрацией 0,256 сухого веще-

■" " t-ób'.My блГО^ПГКК'ИИ.

■ , Кащ'-итрпгог.шдк; бы;насси бруцелл объемом 300 л в 5-6 раз •'••< 2 чос возможно ссуг.-.-ствлять на ультрафильтрационной

.....¿Ш-6,0.

.4 •;v.m-¡c. оть m». д.; троОоьишям НЦД, стабильность сохра-.j,V;4"CKitx, биохимических и биологических • .. p,i¡icr, i'-:, ¡денных глубинным способом с примо-

.....т. •• - .г- f n¡ot ■•;■■■:.■' '¿и/цекл натриевой соли карбохеиметил -

:• ;■ ) .' •':п.гр..г.пошпй установки:

..... т 7 с i т характеристикам штамма

йгигвИа аЬоПиэ

- количество живых 5}>уце.*. г 1..цьч ¡] ; - • <;• •оживляет от 60 до 10О&;

- ииыуногешьая активность ьикцшц; е...' ....-ли , л ,^ •. . ,

5. Га основе разработанных технологически л щ. дл .. ил отепление сухой живой вакцины ил ¡.твима глусиши.» и.-» •.• аз:окгн ранее использовавиегоси в биологачс-сиой ¡[реыи^лё,.; .е - и производства препарата на агаровых питательных средах.

6. Усовершенствование технологии изготовления .¡,,

¡32 интенсифицирует производство при у личин;» . ■

к? го и того же объема питательной среды бактериальной ык:оы ч 1,4 раза), обеспечивает экологическою безопас ность и еке! 1.!-' скую эффективность производства.

7. Замена импортной натриевой соли клрбоксиисгнлцеллылози 11а е:ечгствешгуи позволило отказаться от закупки ее за рубе-.оа. Изменение улы'рафильтрационной установки дало' возможность в 2 р.,;.. 1 .\! |ок'П!внее использовать технологическое оборудование.

Экономический эффект при производстве 20 млн.дез ьаымьи ; .. '■иш.'чи иероцгм составляет 925 тыс.рублей-(в ценех 1У90 I иа).

3. ИРАКТИЧЕСКШ ЦРЕаИсаЫКЯ

¡'.:)/.:•.!:• ЬЫПеЛЛеНеЮГ ИС^Лецог; ШИй по.а.т.. ::Ы I! )

• ¡.см глубинней ТОЙЛОЗОГИИ изготовление -ли.- л 1 -

I ИНН ЩГ'.а!' 1фуНке[\; ¡-ПаГ.ПЧ) е!...;. И'; М

"ЯПе-. : На её,(,,,_.¡пни ьр-.-ь, '.¡еШе .'I р^ ¡р

Ь'-р^Ц.! И: : И , е !_• П.; ! '1,'е;: Глаее.е; а е . 1 ■.;...

е-е 1 е.. 0:\л> .' .ее.ЬО! е. , ь.ы 1-: <: : .л .■ . :

'■ :ч\: п гоп1рсд;е с'/.х0Г1 живой вакцины против бруцеллеза ТИН-ИПЧКИ О КХЯМт 82.

\ 1льт, онуелшсндшж по ш-яе диссертации

: • 1 ти-.ции волоконно-оптического преобразователя

.-а-:," 1сул г тпинраьлнпн бруцелл. /Н.В.Мельник, Н.Д.Скичко, '• •' : е.А.Гч&ш, А.С.Трзйтш. //Теория и практика злектро-•!••:'.; ксседоР'итй кислотных систем: Теп. докл.Всесоюз.ко14. * ..кгл-'рп 19:0. - Вллмо-, 1990. С.29.

'"'|Гсо1> ко|нцштрироиомия бруцелл гстамма 82 /Н.Д.Скичко, • '«•н-т, Р.В.Мелышк, А.С.ТроЙшш, Е.М.Мураипсина, А.В.Каськов.

.¡- •• -.итс.инос решение по заявке па авт.свидетельство К 4001638/11! ' : Г-Ю -т 12.2.90.

Управляемое глубинное периодическое культивирование бруцелл '•исв 19 и 82 в биореакторах. /Н.И.Зенов, Н.В.Мельник, Н.Д.Скичко. 11,Губам, А.В.Каськов. //Современные проблемы иммунологии, био-- н ¡тн ии. генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине: ; • .¡••л:'-.Рс-сек-э.кон^. й~7 декабря 1990, Нижний Новгород, 1990.

!1оди тепло в печать 33.03.32. Саказ 6:25 .'.Г"« Тлрая 120

а:т,а. 1 ;ц»ггар;1Я РД.СП