Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ ERYSIPELOTRIX INSIDIOSA (ERYSIPELOTRIX RHUSIOPATHIAE)

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА

Аспирант ТАРАСЕНОК Николай Иосифович

ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ ERYS1PELOTRIX INSIDIOSA (ERYSIPELOTRIX RHUSIOPATHIAE)

(t6.00.0s — ветеринар нал микробиология)

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москвл — Í 975

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ Б. И. ЛЕНИНА

Аспирант ТАРАСЕНОК Николай Иосифович

ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ ERYSIPELOTRIX INSIDIOSA (ERYSIPELOTRIX RHUSIOPATH1AE)

(16.00.03 — ветеринарная микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

Москва — 1975

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (директор — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, академик ВАСХНИЛ Я- Р. Коваленко)-

Материалы диссертации изложены на 137 страницах машинописного текста, из них: 3 стр. введение, 26—обзор литературы, 73 — собственные исследования, 10—обсуждение, 2 — выводы и практическое предложение, иллюстрированы 31 таблицей и 4 рисунками. Список использованной литературы включает 250 источников, в том числе 102 иностранных автора.

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук М. А. Сидоров.

Официальные оппоненты:

1, Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биол. наук, лрофессор Петр Иванович Притулнн.

2, Доктор ветеринарных наук Борис Андреевич Никаноров.

Ведущее учреждение — Витебский ветеринарный институт им. Октябрьской революции.

в 14 часов, на заседании специализированного Ученого совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (109472, Москва, Ж-472, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ-Ученый секретарь Совета ВИЭВ

кандидат биол. наук

В. В. КАЛУГИН.

ВВЕДЕНИЕ

В проблеме живых вакцин одним из существенных и менее изученных вопросов является изыскание путей длительной стабилизации биологических свойств вакцинных штаммов. Литературные данные свидетельствуют о том, что вакцинные штаммы также подвержены изменчивости, причем последняя нередко идет в сторону повышения вирулентности с утратой иммуно-генных свойств.

В настоящее время в нашей стране применяют две живые вакцины против рожи свиней: депонированную вакцину из второго матрикса Д, Ф. Конева и вакцину из Румынского штамма ВР-2. Первая из них является высокоиммуногенным препаратом, однако вызывает повышенную поствакцинальную реакцию. Штамм ВР-2 в результате пассажей на искусственных питательных средах утратил свою первоначальную вирулентность для свиней, но сохранил остаточную вирулентное!ь для мышей и голубей (В. Виноградник, 1952).

Указанная вакцина с успехом применяется в Румынии (И. Георгиу с соавт., 1958, 1962; Л. Паску с соавт., 1960), в Чехословакии (Ц. Новак с соавт-, 1963) и в ряде других стран.

В нашей стране эту вакцину начали использовать с 1958 г. и, по данным многих авторов, она дает хороший эффект (Г.'IV Божко, 1961; В. В. Журавлев, 1961; Л. В. Орвндас, 1961; А. Я. Голота, 1962).

■ В практических условиях, особено в специализированных хозяйствах, нередко на организм животных действует ряд неблагоприятных факторов, из которых большое значение имеюг транспортировка, нарушение микроклимата, в особенности переохлаждение и перенагревание, а также перегруппировка животных.

Было показано, что эти и другие воздействия требуют от организма высокого напряжения физиологических функции в процессе адаптации. Вследствие этого резко угнетается иммунологическая реактивность организма и у многих животных, привитых вакциной из штамма ВР-2, не создается напряженного иммунитета, В результате этого в том или ином хозяйстве образуются группы животных, не имеющих иммунитета и сре-

ди них возможно возникновение инфекционного заболевания (Я. Р. Коваленко, М. А. Сидоров, Н. Т. Татарпнцев, И. А. Яблонская, 1970).

До настоящего времени биологические своойства штамма ВР-2, стабильность уровня остаточной вирулентности и возможность реверсии в условиях его пассирования на искусственных питательных средах к в организме восприимчивых животных практически не изучались.

Представляет интерес изучение явления трансформации и возникновения мутационных изменений у вакцинного штамма ВР-2.

Исходя из вышеизложенного, перед нами были поставлены следующие задачи: 1. Изучить стабильность биологических свойств авирулентного штамма ВР-2 {серотип К) и вирулентного штамма № 1329 (серотип А) бактерий рожи свиней.

2. Определить перекрестное влияние продуктов метаболизма, а также экстрактов из убитых нагреванием культур на основные биологические свойства штаммов ВР-2 и № 1329.

3. С целью изучения остаточной вирулентности у вакцинного штамма ВР-2 провести серийные пассажи его через организм голубей, молодых белых мышей и обработанных пред-низолоном мышей и подсвинков,

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена в условиях лаборатории микробиологии и опытной базы ВИЭВ. Для исследования было взято 2 штамма возбудителя рожи свиней.

1. Вакцинный штамм ВР-2 (серотип К).

2. Вирулентный штамм № 1329 (серотип А)-

■Штамм ВР-2 (вакцинный штамм Румынской Народной Республики) получен нами из вакцины против рожн свиней, изготовленной Краснодарской биофабрикой 30 августа 1972 г., серия № 37, контроль № 37.

Штамм № 1329 — вирулентный,штамм бактерий рожи свиней получен из музея живых микробных культур ВИЭВ,

Исследуемые штаммы микроорганизмов по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и антигенным свойствам были типичны.

Изучение биологических свойств вакцинного штамма ВР-2 проведено при разных условиях культивирования, при пассировании его через организм экспериментальных животных, существенно различающихся по восприимчивости к данному штамму. 4

Во всех исследованиях, связанных с оценкой вирулентности пассажных линий штамма ВР-2 в отношении белых мы* шей, кроликов, голубей и подсвинков при подкожном, внутривенном, внутримышечном н внутрикожном заражении применяли суточные бульонные культуры, содержащие одинаковое количество живых бактериальных клеток.

В общей сложности исследовано 10 вариантов штамма ВР-2, различающихся по длительности пассирования его в различных условиях, .

300 пассажей штамма ВР-2 проведено па искусственных питательных средах, из них 100—на обычном мясопептонном бульоне, рН—7,2; 100—на бульоне с добавлением 0,5% сыворотки крови лошади, рН — 7,3; 100 —на бульоне с добавлением 0,5% сыворотки крови лошади, содержащем 20% куль-туралыюй жидкости из суточной бульонной культуры вирулентного штамма № 1329 (рН —7,3).

Многократные пассажи штамма ВР-2 проводили на белых мышах весом 16—17 г, а также на мышах, обработанных трехкратно предннзолоном, 4—6-суточных мышатах, голубях и подсвинках весом 25—30 кг, которым двукратно инъецировали лредннзолон.

На животных проведено 365 пассажей вакцинного штамма ВР-2, из них 330 пассажей на белых мышах, 30—на голубях и 5 пассажей на подсвинках.

В опытах на подсвинках изучали вирулентные и иммуно-1ен!1ые свойства вакцинного штамма ВР-2. При проведении опытов использовали 30 подсвинков возрастом 2—3 месяца, 4000 белых мышей, 80 кроликов весом 3,5—4 кг н 200 голубей.

Серологические исследования проводились нами с помощью иммунных сывороток, полученных путем гнпериммуни-зацпи кроликов антнгенамн, приготовленными из штаммов ВР-2, серогип N. № 1329, серотнп А и № 8, серотнп В.

С полученными типоснецифнческнми сыворотками были проведены серологические исследования вакцинного и других штаммов. Серотипироваппе проводили методами перекрестной РА и РП в геле.

Реакцию агглютинации ставили по общепринятой методике в пробирках. Антигены для реакции преципитации готовили методом горячей экстракции в дистиллированной воде (Ф-Эвальд, 1962) или горячей экстракции 1/20 н. НСЬ по методу Т. Сэнт-Ивакьи в модификации Ланцефильда и Г. Кучера (1962).

Титр специфических антител у свиней, вакцинированных против рожи, определяли с помощью пробы роста по Вельма-иу и Хойнеру (1957).

Для заражения мышей использовал» вирулентный штамм ЛЬ 1329 в дозе 0,5 мл, разведении 1 : 10000.

С целью изучения иммуиогенных свойств штамма ВР-2, подсвинкам суточную бульонную культуру с концентрацией 1 млрд/мл живых бактерий вводили однократно( внутримышечно) в дозе 1 мл. Через 5, 10, 15 и 20 дней после введения культур вакцинного штамма ВР-2 от всех подсвинков брали кровь из краниальной полой ^сиы, определяли титр антител в пробе роста.

Напряженность постзакцинального противорожистого иммунитета определяли путем заражения подсвинков по методу Гарса и Дельпи (1953) суточной культурой, а белых мышей путем подкожной инъекции.

Концентрированную суспензию бактерий рожи (дермотрон-пый штамм) вводили по 0,2 мл впутрикожно в три точки на боковой поверхности тела животного, по 1 мл — в ягодичную группу мышц и по 3 капли па конъюнктиву глаза. В 1 мл суспензии содержалось 5 млрд. микробных тел.

После заражения у животных измеряли температуру тела н учитывали клиническую картину.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологические свойства вакцинного штамма ВР-2, многократно пассированного на продуктах метаболизма вирулентного штамма № 1329

Для изучения феномена трансформации вакцинный штамм ВР-2 рожи свиней многократно пассировали на сывороточной среде, содержащей 20% стерильной культуральной жидкости нз суточной бульонной культуры вирулентного штамма

1029. Параллельно тот же штамм серийно пассировали на сывороточном бульоне без добавок (контроль).

Культуральную жидкость вирулентного штамма № 1329 получали по следующей, методике. Из суточной бульонной культуры вирулентного штамма № 1329, выращенной при 37°С в бульоне с добавлением 0,5% сыворотки крови лошади, готовили мазки и исследовали на чистоту. Чистую культуру фильтровали через стерилизующий фильтр Зейтца, полученный фильтрат собирали в стерильные флаконы и хранили при + 4° С- ■

Затем из фильтрата готовили мазки, проверяли на стерильность путем высева не менее 3 мл на сывороточный бульон и МПА, инкубировали при 37° С в течение 10 суток. При наличии стерильной среды, фильтрат проверяли на безвредность путем подкожного введения его 10 белым мышам весом

г16—17 г по 1,0 мл. Срок наблюдения за животными составлял ;10 суток.

Стерильную культуральную жидкость добавляли в коли- честве 20% в бульон с 0,5% сыворотки крови лошади и определяли рН среды,

В процессе серийных пассажей культуральные а тинктори-. альные свойства штамма ВР-2 существенно не изменились. -Начиная с 5 пассажа, в отличие от контроля, в культурах штамма ВР-2, пассируемого на среде с продуктами метаболиз-,.ыа из вирулентного штамма № 1329, появились коккообразньге ■л нитевидные формы. Следует отметить, что с 12 пассажа штамма ВР-2 на данной среде преобладали коккообразные формы микроба, такое состояние сохранилось и до конца • опыта.

Биохимическую активность пассируемых вариантов штамма ВР-2 лсиышаалн путем засева культур после каждого 20-го пассажа на среды с сахарамн. При этом изучали способность различных вариантов штамма ВР-2 ферментировать уг-, леводы и многоатомные спирты, свертывать молоко, образовывать !шдол и сероводород.

Результаты опытов показали, что штамм ВР-2 (исходный), пассированный на МПБ, ферментировал глюкозу, декстрин, галактозу и маниозу; вариант штамма ВР-2, пассированный 60 раз на продуктах метаболизма вирулентного штамма . № 1329, кроме глюкозы, декстрина и маннозы расщеплял с образованием кислоты без газа мальтозу, лактозу, галактозу и гжозит, а также свертывал молоко н образовывал сероводород. Штамм ВР-2, пассированный на бульоне с добавлением 0,5% сыворотки крови лошади, кроме глюкозы, галактозы и декстрина разлагал с образованием кислоты без газа маннозу и мальтозу, не свертывал молоко и не образовывал сероводород.

Вирулентные свойства вакцинного штамма ВР-2, серийно пассированного на культуральной жидкости вирулентного штамма ,\ь 1329, изучали на белых мышах, кроликах и голубях, Суточную бульонную культуру вводили белым мышам весом 16—17 г подкожно в область спины в дозе 0,5 мл (500 млн. живых бактериальных клеток), кроликам—внутривенно 2 млрд. микробных клеток (объем инокулята 2 мл) и .голубям внутримышечно в дозе 1 мл (1 млрд. бактериальных клеток).

Одновременно проверяли вирулентность и штамма ВР-2, . пассированного на сывороточной среде. Контролем в данном . опыте служил штамм ВР-2 (исходный) не пассированный.

Культуры штамма ВР-2, пассированные 20, 60 н 80 раз на

1 7

сырогктгоинг""' прде о продуктами метаболизма вирулентного' ттячмя >Гв 1329, вызывали гибель 80% белых мышей и 100% голубей и не вызывали никакой реакции у кроликов. Вариант штамма ВР-2, пассированный па сывороточном бульоне без добавок, вызывал гибель 20% белых мышей, 50% голубей. Кролики признаков заболевания не проявляли.

Штамм ВР-2 (исходный) не пассированный, который служил в наших опытах контролем, вызывал лереболевание всех, белых мышей и голубем.

В следующем опыте изучали вирулентные и пммуногепные свойства штамма ВР-2 исходного, а также варианта этого же штамма, многократно пассированного на продуктах метаболизма штамма № 1329, на подсвинках, неиммунных к роже, живым весом 25—30 кг.

Опыты показали, что подевпнкн, инфицированные исходным штаммом ВР-2, прореагировали на заражение слабой общей и местной реакцией.

Животные, которым вводили вариант штамма ВР-2, многократно пассированный на культуральиой жидкости из штамма № 1329, прореагировали однотипно резко выраженной положительной реакцией (местной и общей) с генерализацией процесса. Титр антител у подсвинков, инфицированных вариантами штамма ВР-2, к 20 дню достиг иммунной зоны (1,25%).

У подсвинков, которым с целью вакцинации вводили штамм ВР-2, пассированный 60 раз на среде, содержащей 20% стерильной культуральиой жидкости из штамма Кв 1329, отмечено повышение общей температуры тела до 41°, которая удерживалась в течение первых двух суток. На месте введения культуры образовывалось багрово-красное пятно в диаметре до 5—6 см, слегка возвышающееся над поверхностью кожи. Штамм ВР-2 исходный не вызывал никакой поствакшшальной реакции у подсвинков.

Контрольное заражение показало, что подсвинки, вакцинированные исходным штаммом ВР-2, а также вариантом этого-же штамма, пассированным 60 раз на среде, состоящей из стерильной культуральиой жидкости штамма № 1329, приобретают иммунитет высокой напряженности к 21 дню.

Титр антител в пробе роста к моменту заражения достиг иммунной зоны (2,5%).

В реакции агглютинации штамм ВР-2, пассированный на продуктах метаболизма штамма № 1329, отклонился от серо-типа N в сторону серотипа А, который, как известно, является вирулентным для животных.

Таким образом, вакцинный штамм ВР-2 рожи свиней,, многократко пассированный на среде, содержащей 20% сте--8

рнльной культуральной жидкости из суточной бульонной культуры вирулентного штамма «\а 1329, изменяет морфологические и антигенные свойства, резко повышает биохимическую активность и вирулентность не только для лабораторных животных, ло и для подсвинков, хотя и обладает высокой нмму-ногенностыо для подсвинков.

Действие экстрактов из убитых вирулентных бактерий

штамма «№ 1329 на биологические свойства вакцинного штамма ВР-2

Для изучения взаимодействия авирулентной культуры штамма ВР-2 с продуктами метаболизма вирулентного штамма № 1329 п организме лослрлимчнвого животного по методике, предложенной Грпффнтсом, белым мышам весом 16—17 г вводили подкожно 0,5 мл убитой нагреванием суточной бульонной культуры штамма № 1329, смешанной с 0,5 мл суточной бульонной культуры авирулентного штамма ВР-2- Параллельно проводили пассажи штамма ВР-2, который вводили белым мышам в смеси с 0,5 мл чистого бульона для контроля.

Аналогичные опыты, в которых использовали убитую нагреванием культуру штамма ВР-2, провели ц со штаммом № 1329.

Белых мышей убивали эфиром через 48—72 часа. Из трупов выделяли чистую культуру и проводили следующий пассаж. Всего проведено 60 пассажей штамма ВР-2 и 60 пассажей штамма Ла 1329 на продуктах метаболизма штамма ВР-2 и № 1329.

Экстракт из убитых бактерий вирулентного штамма . .\*э 1329 получали следующим образом. Из суточной бульонной культуры вирулентного штамма № 1329, выращенной при 37° С на сывороточном бульоне, готовили мазки и исследовали однородность культуры. Чистую культуру бактерий рожи свиней высевали в количестве 4 мл на матры с МПА и инкубировали лрп 37° С в течение суток. Конденсат сливали, а колоши: бактерии смывали стерильным физиологическим раствором {15—20 мл). Агаровую культуру собирали в стерильные флаконы, определяли густоту азвеси по оптическому стандарту мутности () млрд/мл) и проверяли на чистоту. После этого бактериальную взвесь выдерживали в водяной бане при температуре ТО"* С в течение 30 минут. Проверяли стерильность высевом на среды. Стерильный экстракт из убитых бактерий использовали в опытах.

Белых мышей весом (6—17 г для использования в опыте •многократного пассирования штаммов ВР-2 и № 1329 полу-

чал» от заведомо здоровых животных, выращенных в условиях--питомника. Предварительно часть животных исследовали бактериологически для исключения носительства ВасЬ типвер-исит,

В процессе серийных пассажей штамма ВР-2 с продуктами , метаболизма и белками вирулентной культуры штамма № 1329 н штамма № 1329 с продуктами жизнедеятельности . авирулентной культуры штамма ВР-2 в организме белых мышей культуральные, морфологические и тпнкторнальные свойства существенно не изменились-

Исследование биохимической способности пассированных бактерий показало, что вакцинный штамм ВР-2 после 60-го пассажа на белых мышах {с одновременным введением экстракта бактерий штамма № 1329) разлагал с образованием кислоты без газа кроме сорбита, глюкозы, мальтозы, рафинозы и. маниита, также маннозу, глицерин, лактозу и декстрин, свертывал молоко и выделял сероводород.

Штамм № 1329, пассированный 60 раз на мышах (с одновременным введением отвара бактерий штамма ВР-2), кроме мальтозы, галактозы, глюкозы и лактозы, разлагал с образованием кислоты без газа маннозу, ксилозу и декстрин, свертывал молоко и обильно выделял сероводород.

Штамм ВР-2, пассированный 60 раз на мышах (с одновременным введением МИБ) существенно ке изменил биохимической активности. Штамм ВР-2, после 60 пассажей на белых мышах (с одновременным введением отвара бактерий штамма № 1329) убивал 100% белых мышей весом 17 г в дозе 0,1 мл, кролики- погибали после внутривенной инъекции 1,5 млрд. бактерии, а голуби от дозы 800 млн. бактерий гибли через 48 часов.

Штамм ВР-2, пассированный через белых мышей в смеси с ЛШБ, вызывал гибель голубей, переболевание белых мышей и не вызывал никакой реакции у кроликов.

Штамм № 1329 после 60 пассажей на белых мышах {с одновременным введением отвара бактерий штамма ВР-2) не изменил существенно своих свойств.

По данным реакций агглютинации и преципитации в геле вариант штамма ВР-2 60-го пассажа в среде с убитыми бактериями штамма № 1329 на белых мышах отклонился от типа. N в сторону серотипа А.

В связи с тем, что штамм ВР-2, пассированный 60 раз на белых мышах (с одновременным введением экстрактов из. бактерий штамма № 1329), оказался вирулентным для лабораторных животных, а в реакциях агглютинации и преципитации 10 ' ■

в агаровом геле отклонился ог серотнпа N к серотипу А, представлял ннтерес изучить вирулентность к пммуногенностъ его для подсвинков.

Установлено, что штамм РР-2, пассированный 60 раз на белых мышах в смеси с продуктами метаболизма штамма № 1329, вызывал положительные (общую и местную) реакции у подсвинков, без генерализации процесса.

При изучении динамики антителообразования у подсвинков, зараженных данным вариантом штамма ВР-2, оказалось, что титр антител в пробе роста уже к 15 дню достиг иммунной зоны (2,5%).

Результаты изучения пммупногенных свойств штамма ВР-2, пассированного 60 раз на белых мышах в смеси с продуктами метаболизма показали ,что штамм ВР-2 исходный и этот же штамм, пассированный 60 раз на белых мышах в смеси с продуктами метаболизма штамма № 1329, не вызывали никакой реакции на вакцинацию. Титр антител в пробе роста у животных этих групп к 20 дню достиг иммунной зоны (2,5%). Однако следует отметить, что при контрольном заражении, с целью проверки напряженности иммунитета через 21 день после вакцинации, вирулентной культурой штамма 01? вместе с невакцшшроваииымн (контрольными) подсвинками заболели рожей и животные, которых вакцинировали штаммом ВР-2, пассированным 60 раз па белых мышах в смеси с экстрактами из бактерий штамма № 1329. Из двух подсвинков этой группы генерализованной формой рожи заболело одно животное (выделена гемокультура) и одно животное — с явлениями гипертермии и выраженной местной реакцией на месте введения культуры.

Таким образом, вакцинный штамм ВР-2 рожи свиней, пассированный 60 раз па белых мышах (с одновременным введением экстрактов из бактерии вирулентного штамма Кв 1329)^ вызывает гибель 100% белых мышей, кроликов,' голубей и утрачивает иммуногепность для подсвинков.

Изучение биологических свойств вакцинного штамма ВР-2, серийно пассированного через организм молодых белых мышей

24-часовой культурой штамма ВР-2, выращенной в сывороточном бульоне, заражали 4—6-суточных мышат (подкожно в дозе 0,1 мл). Через 48 часов мышей убивали, выделяли из кроен сердца чистую культуру и проводили следующий пассаж. Всего проведено 50 пассажей.

В мазках из 24-часовых культур в сывороточной среде (окраска по Граму) обнаруживали длинные нитчатые формы микроба. В дальнейшем начали появляться коккообразные

формы, расположенные в виде коротких и более длинных цепочек, Отмеченные морфологические изменения в процессе дальнейших пассажей (к 31.—33 пассажу), в результате адаптации бактерий к организму постепенно исчезли.

Культуры штамма ВР-2, многократно пассированные на молодых белых мышах, на сывороточном бульоне давали скудный рост (выход бакмассы был ниже почти в два раза по сравнению с исходным вариантом). В процессе серийных пассажей изменений в тннкторнальных свойствах не отмечено.

Биохимическая активность штамма ВР-2, многократно пассированного на молодых белых мышах, резко усилилась. Данный штамм кроме декстрозы, мальтозы н глюкозы, расщеплял с образованием кислоты без газа лактозу, сорбит, маннозу и галактозу, свертывал молоко на 3—4 сутки и обильно образовывал сероводород. Также был отмечен рост на МПЖ по уколу в виде «ламповой щетки». Разжижения желатины не наступало.

Вирулентность пассированного 50 раз вакцинного штамма ВР-2 проверяли на белых мышах весом 16—17 г., кроликах и голубях,

Суточная бульонная культура штамма ВР-2, пассированного 50 раз через молодых белых мышей в дозе 0,5 мл, разведении 1 : 10000, при подкожном заражении вызывала гибель всех мышей весом 17 г и голубей при внутримышечном введении им 600 млн. живых бактериальных клеток, кролики погибали на 3 день после внутривенной инъекции 1,5 млрд. бактерий.

Следовательно, многократное пассирование вакцинного штамма ВР-2 через 4—6-суточпых мышат повышает вирулентность рожистых бактерий для белых мышей, кроликов и голубей.

Чтобы выясннть является ли повышение вирулентности вакцинного штамма ВР-2 при пассировании его на молодых белых мышах стабильным или временно наведенным, связанным с культивированием в этих условиях, был осуществлен перевод культуры моднфицироианного штамма ВР-2 с мышат на белых мышей весом 16—17 г. Следует отметить, что бактерии рожи свиней хорошо выделялись из кровн сердца и костного мозга в течение 10 пассажей (срок наблюдения) на белых мышах, вызывая гибель на 2—3 сутки после заражения.

По данным реакций агглютинации и преципитации в агаровом геле, зариант штамма ВР-2 50-го пассажа на мышатах отклонился от типа N в сторону серотнпа А. 12

Биологические свойства вакцинного штамма ВР-2, многократно пассированного через организм белых мышей, обработанных преднизолоном

В данном опыте авнрулентный вакцинный штамм ВР-2, многократно пассировали через организм белых мышей, обработанных преднизолоном. С этой целью белым мышам весом 16— 17 г в течение трех диен вводили внутримышечно по 0,2 мл преднизолона химического завода Гедеон-Рихтер А. О. Будапешт—Венгрия. Одновременно с последней третьей инъекцией иредиизолопа мышам вводили подкожно суточную культуру штамма ВР-2 в дозе 0,5 мл (400 млн. живых бактерий). Через 48—72 чьса мышей убивали эфиром, выделяли из крови сердца и костного .мозга чистую культуру и проводили следующий пассаж. Одновременно проводили пассажи штамма ВР-2 на чистых животных аналогичного веса. Всего проведено 50 пас-сажен штамма ВР-2 через мышей, обработанных преднизолоном, п 50 пассажей — через интактных мышей,

В процессе серийных пассажей штамма ВР-2 через белых мышей, подвергшихся воздействию преднизолона, а также через организм интактных мышой, культуральные, тинкториаль-ные и морфологические свойства существенно не изменились.

Результаты изучения биохимической активности вариантов штамма ВР-2 показали, что исходный штамм ВР-2, который поддерживался путем пассажей на обычном МПБ, ферментировал с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, галактозу и декстрозу; сероводород не образовывал, молоко не свертывал.

Этот же шгамм, пассированный 50 раз через интактных белых мышей, кроме глюкозы и декстрозы расщеплял с образованием кислоты без газа лактозу и маннозу, свертывал молоко и образовывал сероводород.

Вариант штамма ВР-2, многократно пассированный через обработанных преднизолоном белых мышей, кроме декстрозы, мальтозы и глюкозы расщеплял с образованием кислоты без газа лактозу, сорбит, ннулнн, маннозу .свертывал молоко н выделял сероводород. Кроме того, данный вариант на МПБ с добавлением 10—15% желатины при засеве уколом (температура выращивания 16—20' С) дал характерный рост, напоминающий «ламповую щетку».

Вирулентные свойства вариантов штамма ВР-2 изучали на белых мышах, кроликах и голубях. Было установлено, что суточная бульонная культура штамма ВР-2, пассированного через мышей, обработанных преднизолоном, в дозе 0,5 мл в разведении 1 : 100000 вызывала гибель 100% белых мышеи весом

16 —17 г в течение 3—5 суток, кролики погибали после внутри— пенной инъекции 1,5 млрд. бактериальных клеток, а голуби от~ дозы 600 млн, бактерий погибали через 48 часов. Штамм, пассированный 50 раз на штактпых белых мышах, вызывал гибель всех белых мышей в дозе 0,5 мл в разведении 1 : 10000, гибель голубей от дозы 600 млн. бактериальных клеток- Кролики при введении в вену 1,5 млрд, бактерий гнбли на 3—4 день.

Суточная бульонная культура исходного штамма ВР-2 в дозе 0,5 мл перазведенной культуры вызывала переболевапие белых мышей, гибель 50% голубей при внутримышечном введении 600 млн, бактерий и не вызывала никакой реакции у кроликов после ннъекцнц им 1,5 млрд. бактерий.

В реакциях агглютинации и преципитации в агаровом геле варианты штамма ВР-2, многократно пассированные на обработанных преднизолоном и интактных белых мышах, снизили агглютннабнльные свойства с гомологичной сывороткой типа N и реагировали с сывороткой типа А,

Ввиду того, что штамм ВР-2, пассированный 50 раз на белых мышах, обработанных преднизолоном, вызывал гибель 100% белых мышей, кроликов, голубей и отклонился от присущего ему серотипа N к серотнпу А, представлял интерес изучить его вирулентные и иммуногенные свойства для подсвинков.

Анализ полученных данных показывает, что подсвинки, зараженные штаммом ВР-2, пассированным 50 раз па белых мышах, обработанных преднизолоном, заболели с характерной для рожи клинической картиной, с явлением генерализации инфекционного процесса. При этом отмечалось повышение общей температуры тела до 41,5—41,6° и появление багрово-красных припухлостей различной величины и формы на различных участках тела. Из кровп, полученной из краниальной полой вены, па 4 сутки после заражения выделена культура возбудителя рожн.

В опыте изучения нммуиогенных свойств штамма ВР-2 суточной бульонной культурой после проверки ее на чистоту, вакцинировали подсвинков по методу, описанному выше. От вакцинированных подсвинков брали кровь нз краниальной полон вены через 5, 10, 15 и 20 дней и определяли титр антител в пробе роста.

Установлено, что у подсвинков, вакцинированных штаммом ВР-2, многократно пассированным на белых мышах, обработанных преднизолоном, па месте введения культуры образовывалось багрово-красное пятно в диаметре до 4 см, возвышающееся над поверхностью кожн. Общая температура тела у животных этих групп резко повышалась — до 40,5—41,0. Тем, I4

пературная и кожная реакции удерживались до 2—3 суток, затем наступало улучшение общего состояния и выздоровление-Титр антител в пробе роста у подсвинков, вакцинированных, данным вариантом штамма ВР-2, к 20 дню достиг высокой иммунной зоны (1,25%).

Напряженность иммунитета у подсвинков испытывали через 21 день после вакцннашш путем заражения их вместе с не-вакцинированными животными" вирулентной культурой бактерий рожи свиней и учшывалп реакцию на заражение-

Установлено, что к 21 дню после вакцинации у подсвинков-сформировался достаточно напряженный иммунитет.

Изучение биологических свойств вакцинного штамма ВР-2, серийно пассированного через голубей

С этой целью суточной бульонной культурой штамма ВР-2,. выращенного на МПБ с добавлением 0,5% сыворотки крови лошади, заражали двух голубей внутримышечно в дозе 1,0 мл. Гибель голубей наступала на 2—3 сутки после заражения. Из крови сердца выделяли чистую культуру и заражали следующих двух голубей. Всего па голубях проведено 30 пассажей штамма ВР-2.

В процессе серийных лассажсн штамма ВР-2 через организм голубей существенных изменений культур ал ьно-морфологических и тпмкториальных свойств ire отмечено.

Результаты изучения биохимической способности штамма ВР-2 показали, что исходный штамм ВР-2 расщеплял с образованием кислоты без газа только глюкозу, маннозу, галактозу и декстрин. Этот же штамм, пассированный 30 раз через голубей, кроме перечисленных выше Сахаров, расщеплял с образованием кислоты без газа декстрозу, галактозу, лактозу,, мальтозу и инулин, свертывал молоко и образовывал сероводород.

Следовательно, пассажи вакцинного штамма ВР-2 через голубей приводят к резкому усилению ферментативной активности штамма, существенно не изменяя при этом культуральные,. морфологические и тннкториальиые свойства.

У многократно пассированного через голубей штамма ВР-2' исследовали вирулентность путем введения различных разведений суточной бульонной культуры в дозе 1,0 мл внутримышечно голубям и в дозе 0,5 мл подкожно белым мышам весом. 16—17 г. Каждым разведением культуры заражали по 4 мыши и.4 голубя.

В качестве контроля использовали штамм ВР-2, исходный.

Исходный штамм ВР-2 в дозе 1,0 мл неразведенной культуры вызывал гибель 25% голубей в течение 3 суток. Этот же штамм, пассированный 30 раз через голубей, вызывал их гибель на 4—5 сутки при введении культуры, разведенной I :100000.

В следующем опыте мы определяли вирулентность штамма ВР-2. пассированного 30 раз через голубей для белых мышей. Анализ исследований показал, что штамм ВР-2, 30 раз" пассированный через голубей, в разведении 1 : 100000 вызывал гибель белых мышей на 3—4 сутки после заражения.

При изучении вирулентных свойств данного варианта штам-маВР-2 па кроликах оказалось, что при введении им в вену 1,5 млрд- бактерий развивался сепсис со смертельным исходом на 3—4 день. Итак, многократное пассирование вакцинного штамма ВР-2 через голубей приводит к усилению внрулентно-I сти для лабораторных животных.

Для исследования антигенных свойств бактерий рожи свиней использовали реакцию агглютинации и реакцию преципитации в агаровом геле.

В реакции преципитации, так же, как и в реакции агглютинации, исходный штамм ВР-2 реагировал с типоспецнфической сывороткой N. После 30 пассажа на голубях этот же штамм дал полосу преципитации не только с сывороткой типа N. но и с сывороткой типа А.

Обобщая результаты исследований можно заключить, что серийные пассажи штамма ВР-2 через голубей существенно не изменяют культурально-морфологических и тинкториальных свойств, однако усиливают при этом биохимическую активность н вирулентность, а также изменяют антигенные свойства штамма.

Изучение вирулентных и иммуногенных свойств вакцинного штамма ВР-2, пассированного через подсвинков, обработанных преднизолоном

В опыте было использовано 11 подсвинков живым весом 25—30 кг. Подсвинку весом 25 кг вводили предннзолон химического завода Гедеон-Рихтер А. О. Будапешт—Венгрия, внутримышечно, с внутренней " стороны правого бедра в дозе 250 мг.'мл, а через 6 часов инфицировали суточной бульонной культурой штамма ВР-2, центрифугированной при 3000 об/мни. в течение 20 минут с концентрацией бактерий 5 млрд/мл по 1 мл внутримышечно, но 0,2 внутрикожно на боковой поверх-

ности тела и по 3 калл» на конъюнктиву глаза. Через 10 часов, повторяли введение нреднизолоиа в той же дозе.

У всех зараженных животных ежедневно два раза измеряли температуру тела, учитывали интенсивность местной (кожной) реакции и генерализацию рожистых пятен. У свиней с генерализацией рож 1 ютых пятен брали кровь из краниальной полой вены и высевали на МПВ для выделения чистой культуры. После 24-часовон инкубации при 37° С культуру проверяли на чистоту роста и проводили следующий пассаж. Всего проведено пять пассажей штамма ВР-2 на подсвинках, обработанных двукратно предннзолоном.

Результаты опыта показали, что подсвинки, обработанные предннзолоном н инфицированные штаммом ВР-2, уже с первого пассажа реагировали с характерной для рожи общей и местной реакцией и явлением генерализации инфекционного процесса-

Таким образом, введение вакцинного штамма ВР-2 неиммунным к роже подсвинкам, обработанным предннзолоном, сопровождается значительным повышением реактогенностн ¿вирулентных рожистых микробов, что проявляется характерной клинической картиной заболевания.

. После пятого пассажа штамма ВР-2 на подсвинках, обработанных двукратно предннзолоном, были изучены его. вирулентные и нммуногенные свойства для подсвинков по ранее описанным методикам.

От подопытных подсвинков кровь получали через 5, 10, 15 и 20 дней после заражения 1! вакшшацнн для определения титра антлтьл в пробе роста.

Изучение вирулентных свойств штамма ВР-2 показало, что данный вариант вызывал заболевание зараженных животных с явлениями местной и общей реакции и генерализацией процесса. •

У животных, которым с целыо вакцинации вводили штамм ВР-2, пассированный 5 раз через подсвинков, обработанных предннзолоном, отмечено повышение общей температуры тела. На месте введения культуры образовалось багрово-красное пятно в диаметре до 3—4 см, возвышающееся над поверхностью кожи.

Напряженность иммунитета у подсвинков испытывали через 21 день после вакцинации путем заражения их вместе с-невакцинированными подсвинками вирулентной культурой бактерий рожи свиней и учитывали реакцию на заражение.

Установлено, что у животных, иммунизированных штаммом ВР-2, пассированным 5 раз через подсвинков, обработанных предннзолоном, сформировался достаточно напряженный иммунитет.

1Г

Контрольные (невакцинпрованные) подсвинки прореаги-•ровалн однотипно положительной реакцией на заражение с генерализацией процесса.

Резюмируя результаты данного опыта можно заключить, что при пятикратном пассировании штамма ВР-2 через организм подсвинков, обработанных предннзолоном, наблюдается резкое повышение его вирулентности, однако иммуногенность для этого вида животных сохраняется.

Вариабильность признака вирулентности у возбудителя рожи свиней

С целыо изучения гетерогенности популяций бактериальных кулыур по вирулентным свойствам нами было исследовано девять различных вариантов вакцинного штамма ВР-2 п одна бульонная культура вирулентного штамма А1? 1329, Для этого получали 24-часовые культуры на сывороточном бульоне к рассеивали их на поверхность МПА в чашках Петри. Через 48 часов инкубации при 37г С бактериологической петлей отсевали па сывороточный бульон по 50 колонии различных вариантов возбудителя рожи свиней.

Субкультурами, полученными от отдельных клонов, заражали белых мышей весом 16—17 г. За животными вели наблюдение в течение 10 суток. Учитывали сроки гибели животных, а также заболевших и непроявивших клинических признаков заболевания.

Результаты проверки вирулентности бактерий рожи свиней показали, что из 50 отвитых колоний исходной популяции авнрулентного штамма ВР-2, 11% вызывали гибель всех зараженных мышей, 23%—вызывали заболевание и гибель половины зараженных и 66% не обладали выраженной вирулентностью. Если же исходную популяцию бактерий штамма ВР-2 многократно пассировали в среде с продуктами метаболизм« вирулентного штамма № 1329, а также через мышей, обработанных предннзолоном, то штамм ВР-2 вызывал гибель мы-шей'прн введении им 0,5 мл суточной бульонной культуры. Анализ культур, полученных из 50 колоний цельной популяции по признаку вирулентности, показал, что 52—53% клеток популяции в дозе 0,5 мл суточной бульонной культуры убивали белых мышей, 28—30% клеток популяции убивали половину .зараженных, а 17—20%—вообще не вызывали гибели белых мышей. По соотношению вирулентных и авирулентных особей в популяции эти два варианта штамма ВР-2 практически ■ не •отличались от вирулентного штамма № 1329. Так, у модифицированных вариантов штамма ВР-2 соотношение выража-.18

,лось 53 : 30 : 17 и 52 ; 28 : 20%, а у вирулентного штамма № 1329 ,эю соотношение было 56 : 16 : 28%.

: Аналогичные данные были получены при изучении других вариантов штамма ВР-2.

Следовательно, вариабильность признака вирулентности популяций возбудителя рожи свиней обусловлена определенными закономерными соотношениями особей, обладающих высокой и низкой вирулентностью, а также авнрулентных.

Изучение иммуногенных свойств авирулентных клонов различных вариантов вакцинного штамма ВР-2

Для этого суточные бульонные культуры штамма ВР-2 пос-. ле проверки их на чистоту использовали в качестве жнвых вакцин. Одновременно готовили вакцину из авирулентных клеток штамма № 1329. Полученными вакцинами иммунизировали белых мышей весом 16—17 г путем однократной подкожной ,инъекции в дозе 0,5 мл.

Напряженность иммунитета к роже контролировали через .20 дней после введения вакцин методом прямого заражения вирулентной культурой штамма № 1329. Суточную бульонную культуру штамма № 1329 вводили в разведении 1:10000 по 0,5 мл подкожно.

Результаты опытов показали, что живые вакцины, полученные из авнрулентных клеток клонированных вариантов штам-,.ма ВР-2 и вирулентною штамма № 1329, обладают высокой . пммуногенностью.

ВЫВОДЫ

• 1. Популяция вакцинного штамма ВР-2 рожи свиней по признаку вирулентности гетерогенна и состоит из авирулент-_ных, слабовирулентных и вирулентных особей, соотношение которых соответственно составляет 66:23: И %.

2. Вакцинный штамм ВР-2 рожи свиней, многократно пассированный в питательной среде с добавлением стерильной . культуральнон жидкости вирулентного штамма № 1329, а также на белых мышах (с одновременным введением экстрактов из убитых бактерий штамма № 1329), изменяет свои морфологические, биохимические, антигенные свойства и повышает вирулентность для лабораторных животных и подсвинков. Соотношение вирулентных, слабовирулентных и авирулентных особей в популяции модифицированных вариантов этого штамма : выражалось 53: 30 : 17 и 58 : 28 : 14%. Повышение вирулентно--сти и изменение других биологических свойств штамма ВР-2 ■ связано с явлением трансформации'

3. Многократное пассирование штамма ВР:2 через организм белых мышей путем одновременного, введения культуры бактерий в емесп с экстрактом бактерий вирулентного штамма ЛГа 1329 приводит к повышению вирулентности и утрате его нм-муногенностн для подсвинков,

4. Серийные пассажи вакцинного штамма ВР-2 через организм молодых белых мышей I! голубей вызывают усиление биохимической активности, отклонение серотипа N к серотнпу А и повышение вирулентности для белых мышей весом 17— 18 г., кроликов и голубей, что объясняется селекцией вирулентных особен, имеющихся в популяции. Количество вирулентных, слабо вирулентных и авирулеитных клеток в популяции модифицированного штамма изменяется в сторону преобладания вирулентных и выражается соотношением 46: 12:42 и 56:24 ; 20% соответственно,

5. Многократное пассирование штамма ВР-2 на белых мышах, обработанных предннзолоном, способствует усилению биохимической активности, отклонению серотипа N в сторону серотипа А, повышению вирулентности для лабораторных животных н подсвинков. Повышение вирулентности штамма ВР-2 в данных условиях связано с селекцией вирулентных особей, имеющихся в популяции. Соотношение вирулентных, слабови-рулептных и авирулеитных клеток в популяции этого варианта составляет 56 : 18 : 26%.

6. При пятикратном пассировании штамма ВР-2 через организм подсвинков, обработанных предннзолоном, наблюдается резкое повышение его вирулентности, однако нммуноген-ность для этого вида животных сохраняется.

Практическое предложение

Исходя из того, что популяция вакцинного штамма ВР-2 по признаку вирулентности гетерогенна, необходимо периодически контролировать ее вирулентность и иммуногенность. С этой целью через каждые 2—3 пассажа матриксов штамма ВР-2 на искусственных питательных средах проводить их клонирование по предложенной нами методике и определять соотношение в бактериальной популяции авирулеитных, слабовн-рулентных н вирулентных особей. В.случае, когда вирулентные особи составляют 10—12 и более процентов всей популяции, проводить отбор авирулеитных клонов для проверки иммуно-генных свойств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Изменчивость свойств вакцинного штамма ВР-2 рожи свиней. Ж- «Ветеринария», 1974, 2, 50—51.

2. Изменчивость возбудителя рожи свиней. Ж. «Доклады ВАСХНИЛ», 1974, 10, 39—40.

3. Вариабилъностъ вирулентности бактерий. Ж. «Ветеринария», 1975, I, 40—41 {в соавторстве).

Материалы диссертации доложены на заседании Ученого совета ВИЭВ, декабрь 1974 г.

Ответственный за выпуск—доктор ветеринарных наук М. А. Сидоров.

Зак. 389 Тир. 150

Типография Московской ордена Трудового Красного Змменл ветеринарной академии имени К. И. Скрябина