Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изоляция Л-форм микобактерий из молока коров неблагополучных и оздоровленных стад от туберкулеза

' Министерство.сельского хозяйства Российской Федерации ЙМЛСКИЙ .-ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ - - ..— —: — ________ ______ ______________________ На правах рукописи

ГАЛАТОВА

Лидия Васильев;«

ИЗОЛЯЦИЯ Л-ФОРМ МЙКОоаКТСГИЙ ИЗ МОЛОКА КОРОВ НЕБЛАГОПОЛУЧНЫХ И ОЗДОРОВЛЕННЫХ СТАД ОТ ТУБЕРКУЛЕЗА

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология,

ЗПМЗССТСПСГК!?, КОЯ ОГНЯ И ЦЦЦУНОЛСГМЯ

А В Т О Р Е Ф 5 Р А ?

диссертации на сенснанис учакой степени . кандидата ветеринаркж п.'г/г-:

Омск 1993

Работа выполнена в 1987—1992 годах в лаборатории кафедры ■микробиологии и вирусологии Семипалатинского зооветеринарного института и лаборатории кафедры эпизоотологии .Троицкого ветеринарного института.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Федосеев В. С.

Официальные оппоненты: 1. Доктор ветеринарных наук, профессор Ощепков В. Г.

2. Кандидат ветеринарных наук Ов-сянов Н. И.

Ведущее учреждение — Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхоз-академии.

Защита состоится « .7 » 1993 г. в 'СО

часов на заседании специализированного совета К 120.48.01 при Омском государственном ветеринарном институте.

Адрес: 644007, Омск-7, ул. Октябрьская, 92.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Б. М. БАРАБАНОВ.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темь?. Одним из важнейших условий увеличения производства высококачественных продуктов животноводства является совершенствование ветеринарных мероприятий по профилактике и ликвидации инфекционных болезней ^ особенно туберкулеза. Эта болезнь не-только приводит к большим потерям в животноводстве, но й представляет серьезную опасность для здоровья людей.

Основным методом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является аллергический. Однако по его результатам нельзя установить окончательный диагноз. Сенсибилизацию крупного рогатого скота могут обуславливать сапрофитные микобактерии, возбудитель туберкулеза птичьего вида и ряд других причин (О. Мартма. 1967, ¡982: А.'Шаров,-1980; К М. Колычев. 1983; А. С. Донченко с соавт., 1985; 2. Popluhar; H. Vrtiak, 1986; R.. S. Chavez и др., 1987; !. Brun, 1964).

Установлено, что возбудитель бычьего вида, находясь в организме в измененном состоянии — Л-форме, не вызывает патологоана-томических изменений, а обублавливает повышенную чувствительность к ППД-туберкулину для млекопитающих (И. Р. Дорожкова, 1976; M". М. Дыхнос соавт., 1982; З..Н. Глинникова, 1987; М. И. Герт-ман, 1988.

В настоящее время Л-формь) микобактерии выделены от многих видов животных и птиц как в неблагополучных, так и в благополучных хозяйствах. Изучен ряд их биологических свойств (П. Е. Савченко, 1980; К Г. Кириленко, 1980; В. С. Федосеев с соавт., 1979, 1980, 1985; А. К Байгазанов, 1986; М. И. Гертман, 1988; Б. Ф. Керимжано-ва, 1991 и др.).

Однако остаются невыясненными вопросы Л-форм микобактерии в диагностике, некоторые их биологические свойства и значение в эпизоотологическом процессе при туберкулезе крупного рогатого скота.

Особую актуальность приобретают вопросы возможности выделения Л-форм микобактерий в окружающую среду с пищевыми продуктами, особенно с молоком, частота их выделения, приживаемость в организме лабораторных животных. г

Цель и задачи работы. Целью нашей работы было изучение возможности изоляции Л-форм микобактерий из молока коров и определение их биологических свойств. В этой связи перед нами были поставлены следующие задачи:

— изучить распространенность Л-форм микобактерий у крупного рогатого скота неблагополучных и оздоровленных от туберкулеза хозяйств;

— установить частоту выделения Л-форм микобактерий из молока коров неблагополучных и оздоровленных от туберкулеза хозяйств в разные сроки лактации;

— определить основные биологические свойства Л-форм микобактерий, выделенных из молока коров неблагополучных и оздоровленных по туберкулезу хозяйств;

— изучить изменения в показателях нейраминовой кислоты и повреждения нейтрофилов у животных, зараженных Л-формами микобактерий туберкулеза.

ЬЬучная новизна и практическая значимость. Впервые доказано, что выделение микобактерий туберкулеза в измененной Л-форме у лактирующих коров происходит длительно — до 100 дней. Установлено, что частота выделения Л-форм находится в прямой зави-'симости от срока лактации. Определена возможность использования показателей нейраминовой кислоты и повреждения нейтрофилов для определения инфекционного статуса животных, зараженных Л-формами микобактерий туберкулеза. Результаты исследований будут использованы в совершенствовании методов диагностики и мер борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота, а также в учебном процессе на кафедрах эпизоотологии и микробиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методика выделения Л-форм микобактерий из молока коров.

2. Биологические свойства Л-форм микобактерий , изолированных из молока коров неблагополучных и благополучных по туберкулезу хозяйств.

3. Показатели нейраминовой кислоты и повреждения нейтрофилов у животных, зараженных Л-формами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

— научно-методических конференциях Троицкого ветинститута, посвященных проблемам интенсификации животноводства в зоне Южного Урала, в 1990, 1991, 1992, 1993 гг.;

— научной конференции Свердловского СХИ, посвященной 50-летию института в 1990 г.;

— межкафедральном заседании Троицкого ветеринарного института в 1993 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 таблицами и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов и предложений для практики, списка литературы. Список использованной литературы включает 240 источников, в том числе 36 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы. Работа выполнена в 1987—1992 годах в лаборатории кафедры микробиологии и вирусологии Семипалатинского зооветеринарного института и лаборатории кафедры эпизоотологии Троицкого ветеринарного института, в хозяйствах Троиц-

кого района Челябинской области и Троицком мясокомбинате.

Эпизоотическое состояние хозяйств по туберкулезу изучали путем анализа документов ветеринарной отчетности и учета, и проведения послеубойной ветсанэкспертизы туш и органов убитого крупного рогатого скота. — _________________ ______________________ ________

Аллергические, патологоанатомические, бактериологические исследования проводили по общепринятым методикам: «Наставления по диагностике туберкулеза животных», утверждённой Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР в 1976, 1986 г.г.; «Методические рекомендации по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных», утвержденным Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарии имени Я. Р. Коваленко в 1992 году; «Методические рекомендации по выделению Л-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала», утвержденным Главным управлением лечебно-прсфи-лактической помощи в 1984 году; «Рекомендации по выделению Л-форм микобактерий туберкулеза от животных» — Федосеев В. С. с соавт., 1988).

Исследование молока проводили по методике А. П. Аликаевой (1950), объектов внешней среды — А. П. Аликаевой (1979) и К М. Колычева (1982).

При выполнении работы нами исследовано бактериологически 840 материалов от крупного рогатого скота, 387 проб молока, 165

проб объектов внешней среды. Всего из лимфоузлов, молока и объектов внешней среды выделили 359 бактериальных и 567 Л-фср/л культур микобактерий.

Изучение способности Л-форм к реверсии проводили на семидневных куриных эмбрионах (по методике В. С. Федосеева с соли т., 1988) методом пассирования и одновременным посевом их на пита-тсльных средах (три пробирки с полужидкой и три с яичной средой) с последующим выращияанием в термостате при температуре 37 и лабораторных животных.

Частоту выделения Л-форм микобактерий с молоком норов определяли по методу А. П. Аликаевой (1950). Адаптацию Л-форм микобактерий в организме лабораторных животных изучили на 1 2-чи морских свинках. Лабораторных животных заражали ну:!ьгурамя Л-форм микобактерий подкожно в область паха з дозе 1 мл и наблюдали в течение 30 дней. Убой лабораторных животных проводили в разные сроки после заражения (1, 10, 20 и 30 дней) с последующим бактериологически/л исследованием материалов на выделение бактериальных и Л-форм микобактерий возбудителя.

Патогенные и сенсибилизирующие свойства Л-форм микобактерий изучили на лабораторных животных (кроликах, морских свинках) путем заражения их культурами Л-форм.

Идентификацию выделенных бактериальных и реверсированных из Л-форм культур микобактерий проводили с помощью биохимических и биологических методов, согласно «Методическим рекомендациям по бактериологической идентификации микобактерий» (Минздрав СССР, 1980, 1990 г.).

Целью наших исследований было изучить значение ППН и нейра-миновой кислоты как дополнительных тестов в диагностике туберкулеза. Исследование проводили методом заражения лабораторных животных (кроликов и морских свинок) культурами Л-форм мико-бактерий и их ревертантами, кроликов — внутривенно, морских свинок — подкожно в дозе 1 мл. Кровь для исследования у зараженных животных брали до постановки опыта и через 1,10, 20, 30, 60* 90 .дней.

В опыте использованы Л-формы и йх ревертанты следующих видов микобактерий: М. bovis, М. avium, М. scrofulaceum, М. terrae. В качестве контроля — бактериальные культуры эталлоного штамма Во* -^8.

Показатели повреждения нейтрофилов (ППН) определяли по методу Фрадкина. Сущность ППН заключается в том, что в больном организме отмечается повышенная чувствительность лейкоцитов-к антигену возбудителя, при контакте с которым происходит повреждение лейкоцитов. Для определения нейраминовой кислоты использовали дифениламиновую проб-у (А. А. Титаев, Э. Г. Ларский с соавт., 1964). Концентрацию нейраминовой кислоты отражали в единицах инстинкции ФЭК. Повышение сиаловых кислот в сыворотке-крови связано с системой защиты организма и является одним из неспецифических факторов его резистентности.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

3.1. Краткая характеристика эпизоотического состояния хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота за 1985—1989 гт.

Пораженность скота в резные годы была различной, в 1985 году — 9,4%, J986 — 9,0%, 1987 — 17,4%, 1988— 15,8, а в 1989 — 12%. Наиболее неблагополучны по туберкулезу совхоз «Каменский» (50,3%), колхозы «Южный Урал» (33,8%), им. В. И. Ленина (28,9%).

Аналогичные результаты аллергических исследований скота на туберкулез. Особенно резко возросла выявляемость больных животных: от 10,9 до 33,7%, в частности, в совхозах «Кособродский»— 33,7%, «Ключевский» — 18,2%, в колхозах им. В. И. Ленина — 27,5% и им- XXI съезда КПСС — 21,5%.

Большое значение в постановке диагноза на туберкулез придается бактериологическому исследованию, которое позволяет подтвердить диагноз и определить вид возбудителя. В Троицком районе за анализируемый период (1985-Г-1989 гг.) бактериологически исследовано 290 проб патологического материала. Всего выделено бактериальных культур 83 (28,6%), из них М. bovis — 48 (57,8%), нетуберкулезные микобактерии — 35 (42,1 %).'

Одновременно нами исследованы объекты внешней среды на возможность контаминирования возбудителей туберкулеза. Исследованием 112 проб, взятых из помещений, пастбищных участков и

6

мест водопоя, выделено 52 культуры микобактерий, в том числе 9 культур М. bovis 17,3%, 43 (82,7%)— атипичных микобактерий.

Таким образом, хозяйства Троицкого района на протяжении ряда лет неблагополучны по туберкулезу крупного рогатого скота. Объекты внешней среды, инфицированные возбудйтёлём~~ту5"ёр-~ кулеза, служат фактором передачи инфекционного агента и поддерживают неблагополучие хозяйств по туберкулезу.

3.2. Нзонг.цш: Л-форм микобактерий из патологического

ОТ ¡'РУСОГО рОГг*ТОГО СКОТ?*

Из 171 матермалоа от коров с туберкулезными, изменениями выделено 153 культуры микобактерий, из них 51 (33,4%) — в виде Ji-фср//. (52,■ 4 ' * (,а ^ % ' rquu^ax ДГТПН-

чались одновременно бактериальные культуры и Л-формы.

Из 284 материалов без патологоанатомических изменений получено 214 (75,3%) культур, в том числе Л-форм — 157 (73,3%), бактериальных — 44 (20,6 %). В 1 3 (6,1 %) случаях выделены бактериальные культуры с Л-формами. Всего из 455 исследованных материалов изолировано 124 бактериальных и 208 (56,7%) Л-форм культур микобактерий. В 35 (9,5%) Случаях встречались бактериальные культуры и Л-формы.

от реагирующих на туберкуикк норе-, из

неСадгопснг/чиык хозгЛста

Нами проведено бактериологическое исследование 1 27 проб молока от реагирующих на туберкулин коров трех неблагополучных хозяйств.

Тзбг.'чца 1.

Результаты бактериологического исследования молока от ризгир'/ющего на туЗерхуяик

крулггего реггтего «юга |::с-роз| неблагополучный по туберкулезу хозяйств

Количество проб Выделено В том числе

Хозяйства культур микобак- Л-формы оакте-риальные культуры

терий " j % " 1 о/ /0

Учхоз Ново-Троицкий 22 15 2 13,4 13 36,6

к-з им. 22 съезда ^КПСС 76 28 20 71,5 8 28,5

к-з «Южный Урал» 29 18 6 33,4 12 66,6

127 61 7 28 46,0 33 54,0

Полученные результаты указывают на активное микобактериаль-ное выделение с молоком. Всего из 127 проб бактериальных культур выделено 33 (54,0%), Jl-форм — 28 (46,0%). Микроскопически Л-формы были представлены теми же морфологическими структурами, что и из лимфоузлов, однако колонии были более компактны. При пассировании 28 культур Л-форм микобактерий на специальной полужидкой и плотных средах реверсия в исходное бактериальное состояние получена у 7 (25,0%). Изучение видовой принадлежности 7 культур — ревертантов позволило их отнести к атипичным, из них М. avium — 1, М. smegmatis — 1 и микобактерий биохимически слабо активных — 5. _ . .

Таким образом, микобактерии, находясь в организме в Л-форме, могут выделяться с молоком, а также при определенных условиях реверсировать в исходное бактериальное состояние, что имеет определенное значение в микробиологической диагностике туберкулеза.

3.3. Изоляция Л-форм микобактерий из молока коров в разные сроки после отела

Целью наших исследований явилось изучение частоты выделения Л-форм микобактерий из молока коров в зависимости от благополучия поголовья по туберкулезу и сроков отела животных с дальнейшей идентификацией изолированных культур. По результатам изучения эпизоотического состояния хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота для проведения дальнейших исследований подобраны: совхоз «Ключевский» и колхоз «Нижне-Санарский» Троицкого района. Совхоз «Ключевский»-на протяжении ряда лет является неблагополучным по туберкулезу. Колхоз «Нижне-Санарский» благополучен с 1983 года.

В совхозе «Ключевский» за анализируемые (1985—1989) годы реагирующих животных выделяли постоянно. Наибольшая выявляе-мость была в 1987 году (18,2%).^В 1988—1989 годах выявляемость реагирующих животных снизилась до 1,1%. Результаты аллергических исследований постоянно подтверждались послеубойной экспертизой туш и органов на Троицком мясокомбинате. Наивысшей выявляемость была в 1985 году — 20,3, в 1989 году отмечено снижение до 8,4%.

Бактериологически во все сроки исследования из патологического материала наряду с атипичными микобактериями выделяли возбудителя бычьего вида. Из 35 исследованных проб материала бактериальные формы микобактерий выделены в 18 (51,4%) случаях, из них М. bovis в 12 случаях что составило 66,6%. Атипичные микобактерии идентифицированы как М. avium — 2 (11,1 %), М. smegmatis — 1 (5,5%) и М. terrae — 3 (16,8%).

В колхозе «Нижне-Санарский» ежегодно наблюдалось выделение реагирующих животных, в 1987 году из 5284 исследованных животных выделено реагирующих 3,9%, в последующие годы коли-

чество реагирующих уменьшилось, в частности, в 1989 году — до 0, 07%.

В обоих хозяйствах микобактерии выделены, кроме бактериальных культур, в измененной Л-форме, в совхозе «Ключевский» — в 12 (34,4%), в колхозе «Нижне-Санарский»— 21 (70%) случаях.

Таким образом, в совхозе «Ключевский» диагноз на туберкулез подтвержден патологоанатомическими и бактериологическими исследованиями. В колхозе «Нижне-Санарский» причиной аллергических реакций на туберкулин служат М. avium и нетуберкулезные микобактерии (М. terrae, М. smegmatis).

Молоко для исследлвания брали ежедневно в течение 10 дней з три периода. Первый период — с 1 по 10 день после отела, второй

— с 45 по 54 день и третий — с 91 по 100 день. Молоко обрабатывали по методу А. П. Аликаевой (1950). Посаа обработанного молохэ проводили в 3 пробирки на яичную среду Лезснштсйна и з 3 — со средой для выделения Л-форм (таблица 2). Материалы таблицы свидетельствуют, что в благополучных хозяйствах из молока коров микобактерий в Л-форме чаще выделяли в первые 10 дней после отела — 28 (56,0%), через 45—54 и 91—100 дней микобактерии в измененной форме выделены в 40% случаев. Бактериальных культур больше получено также в первые 10 дней после отела — 7 (14,0%), к 45—54 дню — 4 (8,0%) и к 91—100 дню — 2 (5,0%).

В неблагополучных хозяйствах микобактерии в Л-формах изолировали довольно часто во все сроки исследования, в первые 10 дней

— 36 (72,0%), через 45—54 дня — 21 (52,5%), к 91—100 дню — 17 (56,0%).

Бактериальных культур, как и в перво.м случае, выделено больше в первые 10 дней после отела — 8 (16,0%), к 45—54 дню — 5 (12.5%) и к 91 — 100 дню — 4 (13,3%).

Впервые 1—10 дней после отела Л-формы выделены в 72% случаях, в дальнейшем отмечеко некоторое снижение, которое к 1 00 дню состазило 56,6%.

Таким образом, частота выделения микобактерий как в бактериальной, так и в Л-форме находилась в прямой зависимости от эпизоотического состояния хозяйства, а благополучных хозяйствах — от срока взятия молока после отела (таблица 2).

~У изолированных из молока Л-форм микобактерий изучали способность к реверсии в исходный вид и определяли видовую принадлежность. В нашем случае пассирование культур Л-форм прозедено на семидневных куриных эмбрионе* по методу Ф. С. Федосеева с соавт. (1989) на плотную яичную среду. Пассироза.чие проводили трижды. Реверсия Л-форм лликобачтерий, изолированных из молока коров благополучных хозяйств в первые дни после отела, на среде Левенштейна получена в 5, на куриных эмбрионах — в 7 случаях из 12 изученных культур.

В последующие сроки исследования (45—54 дня) реверсия на питательных средах получена в 2-х, соответственн о на куриных эмбрионах — в 4 случаях, через 91—100 дней — в 3 случаях.

"У 9

Таблица 2.

Частота выделения Л-форм микобактерий из молока коров в разные сроки после отела

Результаты исследований в сроки (дни)

1- -10 45—54

Хозяйства " 0 со Выделено Реверсировано о са Выделено Реверсировано

и 1) т X \0 * 0 Бактер. культур Л-формы Левеншт. Курин, эмбрион. и <и у с о Бактер. культур Л-формы Левеншт. Курин, эмбрион

п % п % а % п % о а с п о/ /о п % п /о п о/ /0

Благополучные 50 7 14 28 56 5 17 7 25 50 4 8 20 40 2 5 . 4 8

Неблагополучные 50 8 16 36 72 5 14 8 22,2 40 5 12,5 21 52,5 1 4,7 5 11.4

\

Продолжение таблицы 2.

91 — 00 -

Хозяйства о СП Выделено Реверсировано

и О т г \о ^ о Бактер. культур Л-форм Левей шт. Курин, эмбрион.

о а * с п % п % п % п %

Благополучные 40 2 5,1 16 40 — — 3 1 7

Неблагополучные 30 4 13,3 17 56,6 1 . 5,8 3 17

ZI

Неблагополучные Благополучные Хозяйства

NJ о ы питат. среда Пассировано культур | всего:

NJ NJ курин. эмбрион

ю - - 1 1 1 М. bovis 1 —10 дней

NJ oj 1 1 1 М.avium in-tracellulare

1 1 1 ю - - М. scrofula-ceum

ы — о M. terrae

SJ к, 1 NJ - - M. fortui-. tum

- -. 1 1 1 1 M. aviumin-tracellulare 45—54 дней

1 1 1 NJ ^ - ' M. scrofula-ceum

1 1 1 1 1 1 M. terrae

U) NJ -*■ - - 1 M. fortui-tum

NJ М | ю - - M. smegma-tis

- 1 - 1 1 1 M. aviumin-tracellulare 91 — 100 дней

- - I 1 M. fortui-tum

NJ - 1 - - 1 M. smegma-tis

1 1 1 1 1 1 M. terrae

а с-

S

ГО

э 2

3

«

S о

¡3

о х

о>

к О "О О

и

тз 01

ы Я tr о

о "О

о

я

X

тз

га

w •<

а о-

-I

и н sr

S й о

X н

5

■е

5

Ж а JZ

s

X ■<

а

tr

н

•<

TJ

I

TJ № Ш (В "О -н tu х н О и

о 5

го о

о

е\ ы х н

о

"О

Хс

о> • а

п

г

Из изолированных 25 культур Л-форм микобактерий из молока >ров неблагополучных хозяйств реверсию на куриных эмбрионах блюдали в первые сроки изолирования (1^0 дней) в 8 случаях.

Видовую принадлежность бактериальных культур и культур-:вертантов, выделенных из молока коров, изучали в разные срони еле отела и в различных хозяйствах по эпизоотической обстановке.

Из данных таблицы 3 видно, что 17 культув-ревертантов, выде-¡нных из молока коров благополучных хозяйств, во все сроки ис-едования отнесены ,к атипичным микобактериямт в том числе . scrofulaceum — 4, M. fortuitum — 4, M. smegmatis —3 и M. terrae —

Из молока коров неблагополучных хозяйств получено 23 культу-i-ревертантов, по результатам идентификации к M. bov?s отнесе-— 1 (в первые сроки после отела), и 22 культуры — к атипичным ^икобактериям.

Обращает внимание то, чтбв благополучных хозяйствах реверсия исходное бактериальное состояние чаще наблюдалось у Л-форм чкобактерий, выделенных из молока в первые дни исследований — культур, через 45—54 дня — 4 культуры й 2 культуры через 91 —

0 дней. А •

Из данных таблицы 3 видно, что в первые 10 дней послеотела у >ров выделены культуры микобактерий: М. scrofülaccmn . fortuitum — 2, M. terrae — 6, через 45—54 дней — M. scr оЬНлсо.ь-о 2, M. smegmatis — 2, M. fortuitum — 1, и через 91 —100 дней /л fc-tum — 1, M. smegmatis — 1.

В неблагополучных хозяйствах в первые 10 дней после о>" [ентифицированы возбудитель бычьего вида, во все остйл'■■'.■ оки исследования — атипичные микобактерии. В первые 10 /V-ей щелены М. avium — intracellular — 5, M. fortuitum — 2, M. terrai: -через 45—54 дней — M. avium — intracellular — 1, M. fortuitum — M. smegmatis — 1 и через 91—100 дней M. avium — intrasellulare —

1 M. fortuitum — 1, M. smegmatis — 2.

Таким образом, нами впервые доказано, что выделение миио-ктерий в измен спи ой Л-фсрме у лактирующих коров происходит 1Ительно — до 100 дней. Частота выделения Л-форм находилась прямой зависимости от срока лактации.

3.4. Вирулентные и сенсибилизирующие

свойства Л-форм

Вирулентные свойства изучили у Л-форм и культур-ревертантов кобактерий, выделенных из молока коров в разные срсжи после злов. Исследования проводили на морских свинках и кроликах, едварительно лабораторных животных исследовали ППДЛубер-чином для млекопитающих (25 ТЕ).

В опыте использованы культуры Л-фор/А и их ревертанты: M. Ьо-, М. avium, M. scrofulaceum M. terrae. J •

нтролем служил лабораторный штамм микобактерий туберку-ia Bov-8.

Заражали по 3—5 животных (морских свинок — подкожно в об ласти паха, кроликов — внутривенно).

Л-формы и культуры-ревертанты М. bovis в организме лабор; торных животных вызывают множественные туберкулезоподобны образования в печени и в легких. Однако патологоанатомически изменения у животных опытной группы были менее выраженным в сравнении с животными контрольной группы, зараженных культу рой референтного штамма ВOV — 8.

Бактериологическим исследованием материала от животны зараженных Л-формами М. avium, возбудитель туберкулеза выд( лен- в бактериальной форме и в Л-форме.

При исследовании материала от экспериментальных животны зараженных культурами-ревертантами, возбудитель выделен н только в бактериальной форме, но и в Л-форме.

При исследовании материалов от животных, зараженных атипи' ными микобактериями (М. scrofulaceum,' М. terrae), возбудитель вь делен в измененной Л-форме. Патологоанатомических изменени характерных для туберкулеза, не обнаружено. Из 3-х кроликов, з. раженных М. scrofulaceum, у одного была выделена бактериальнг культура.

Л-формы и культуры-ревертанты М. avium в организме вызыва; увеличение региональных - лимфатических узлов и катаральну бронхопневмонию. Бактериологическим исследованием Morepnaj от животных возбудитель выделен в бактериальной и Л-форм

Сенсибилизирующие свойства Л-форм микобактерий изучили t тех же морских свинках и кроликах, на которых изучалась патоге ность.

Аллергическое исследование животных проводили ППД-тубе кулином для млекопитающих через 30, 60 и 90 дней после их зар жения. Сенсибилизация организма животных при введении Л-фор и культур-ревертантов М. bovis появлялась к 30 дню и сохранялась течение срока исследования. Характер реакций был различным, незначительного (следы реакции) до характерно выраженного ра литого воспалительного отека размерами от 2—3 до 6—8 м

Реверсированные культуры обладали более выраженными сенс билизирующими свойствами. На введение в организм Л-форм культур-ревертантов М. avium аллергическая реакция появляла! к-30 дню и сохранялась в течение 60 и 90 дней. Однако реакщ была менее выраженной и характеризовалась от проявления незн чительного воспалительного отека до величины 3—6 мм.

У животных, зараженных Л-формами и культурами-ревертант ми (М. scrofi^ageum i М. terrae), реакция отмечена к 60 дню размер ми от 9,3 до 4"—4 мм.

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что Л-формы и культуры-ревертанты обладают сенсибилизирующими свойствами к ППД-туберкулину для млекопитающих.

Более выраженными сенсибилизирующими свойствами обладали

Л-формы и культуры-ревертанты возбудителя туберкулеза бычьего------

вида.

3.5 Адаптация Л-форм микобактерий в организме морских свинок

В задачу наших исследований входило изучение приживаемости Л-форм микобактерий в организме морских свинок. В этих целях мы искусственно вводили им культуры Л-форм следующих видов микобактерий: М. bovis, М. avium, М. scrofulaceum, М. terrae.

Опыт проводили на 12 морских свинках, культуру Л-форм вводили в дозе 1 мг подкожно, в область паха.

Убой лабораторных животных проводйли в разные сроки через 1—10—20—30 дней с последующим осмотром внутренних органов и бактериологическим исследованием патологического материала на выделение бактериальных и Л-форм микобактерий.

Л-формы М. bovis обнаруживали в организме морских свинок в первые сутки. Йа 10 день опыта возбудитель туберкулеза выделен в Л-форме и бактериальном состоянии, в последующие сроки исследования (20, 30 дней) — бактериальные культуры.

При введении Л-форм и М. avium лабораторным животным в первые сутки и на 1 0, 20 и 30 день выделены Л-формы в неизмененном виде, и патологических изменений во внутренних органах и лимфоузлах не обнаружено.

При изучении адаптации Л-форм атипичных микобактерий (М. scrofulaceum, М. terrae) через 1, 10 и 30 дней исследований бактериологическими методами мы наблюдали рост названных культур также в измененном состоянии, патологических изменений во внутренних органах и лимфоузлах не обнаружено.

Таким образом, Л-формы М. bovis и атипичных микобактерий приживаются в организме в первые сутки после заражения. Л-фор-мы микобактерий туберкулеза в_ организме лабораторных животных реверсируют в исходное бактериальное состояние, что может быть использовано с диагностической целью.

3.6. Иммунологические показатели сыворотки

крови лабораторных животных, ЪС^Ш^ебсгг^е

- fj-c.fu.ucui.и* ь г-¿Л

Целью наших исследований было изучить значение ППН (показателя повреждения нейтрофилов) и нейраминовой кислоты как дополнительных тестов в диагностике туберкулеза. Исследование проводили методом заражения животных (кроликов и морских сви-чок) культурами Л-форм микобактерий и их ревертантами, кроли-

15

ков — внутривенно, морских евин ок — подкожн о в дозе 1 мл. Кров для исследования у зараженных животных брали до постановки опь та и через 1,10, 20, 30, 60 и 90 дней.

В опыте использованы Л-формы и их ревертанты следующих в^ дов микобактерий: М. bovis, М. avium, М. scrofulaceum, М. terra«

В качестве контроля — бактериальные культуры эталонной штамма BOV — 8.

Показатели повреждения нейтрофилов (ППН) определяли п методу Фрадкина.

Результаты исследований показывают, что у лабораторных жь вотных, зараженных Л-формами М. bovis, показатель повреждени нейтрофилов в первый день опыта составлял от 0,047 до 0,052 eд^ ниц инстин., к 10 дню отмечен о незначительное увеличение (0,0570,066), в последующие сроки исследования — резкое увеличени (0,216—0,236).

Аналогичные результаты получены при заражении животнь М. avium (0,105—%, 172) и атипичными ми'кобактериями (0,1050,123).

В сравнении с Л-формами культуры-ревертанты вызывали наибе лее характерные изменения нейтрофилов в крови. При заражени М. bovis равнялся 0,268 ед. инст., М. avium — 0, 190, М. scrofulaceu — 0,123 и М. terrae — 0,115.

Идентично предыдущим получены результаты при исследовани нейраминовой кислоты в сыворотке крови. Так, в первый день опыт у лабораторных животных, зараженных М. bovis, нейраминова кислота находилась в пределах 0,032— 0,057 единиц инстинкци ФЭК, с 10 дня отмечено увеличение, которое к 90 дню достигло М. bovis — 0,330 единиц, М. avium — 0,186, М. scrofulaceum — 0,14 и М. terrae — 0,144.

Наиболее сильное увеличение нейраминовой кислоты в сыворотк крови лабораторных животных вызывали культуры-ревертант Л-форм. Так, M.'bovis составил 0,335, М. avium — 0,227, М. scrofulac« um — 0,146 и М. terrae — 0,142.

Высокие показатели повреждения нейтрофилов и концентраци нейраминовой кислоты получены у лабораторных животных кон рольной группы и к 90 дню соответственно составили 0,293 и 0,40

Таким образом, Л-формы М. bovis и культуры-ревертанты их лабораторных животных вызывают увеличение концентрации нейр. миновой кислоты и показателя повреждения нейтрофилов.

Наиболее характерные изменения данных показателей наблк дали при заражении лабораторных животных культурами-реверта! тами.

вывода

1. В неблагополучных хозяйствах возбудитель ту^беркулеза атипичные микобайтерии способны персистировать в организм крупного рогатого скота в Л-форме. Из патологического материал

: бактериальной форме микобактерии выделены в 124 (33,8%), 1-форме — 208 (56,7%), случаях соответственно из молока микобак-ерии в бактериальной форме выделены в 33 (54,0%), Л-форме — 8 (46,0%) случаях. • . ------ ---------------- --------'

2. Бактериальные культуры и культуры-ревертанты, изолирован-ые из молока коров неблагополучных хозяйств, идентифицирова-ы: М. bovis — 1, М. avium — intracelluiare — 7, М. smegmatis — 8, Л. forluitum — 6; в благополучных хозяйствах: М. scrofulaceum —4, Л. terrae — 6, М. fortuitum — 6, М. 'smegmatis —5. q « 3. Частота выделений микобактерий в Л-форме из молка коров аходилась в прямой зависимости от сроков отела. В первые 10 дней осле отела в неблагополучных хозяйствах Л-варианты выделены 36 (72,0%) случаях, через 45-,54 дней — 21 (52,5%), через 91—-100 ней в'17 (56,0%) случаях; соответственно в благополучных хозяйст-ах: через 1—10 дней в 28(56,0%), 45—54 дней — в 20(40,0%), 91 — 00 дней — в 16 дней (40,0%) случаях. ,

4. Ускоренный метод реверсии на куриных эмбрионах позволил ократить сроки исследований до 30 дней. Реверсия Л-форм мико-актерий на куриных эмбрионах получена из молока коров неблаго-олучных хозяйств в первые дни после отела в 16,0% случаев, через 5—54 дней — в 14,0%, 91—100 дней — в 7,0% случаев, в благопо-учных: через 10 дней — в 25,0% случаев, через 45—54 дней —

10,0%, через 91—100 дней — в 7,0% случаев.

5. Л-формы М. bovis и атипичных микобактерий способны при ждаться в организме морских свинок и вызывать сенсибилизацию т;<а-эй кожи к ППД-туберкулину для млекопитающих.

6. В сыворотке крови лабораторных животных Л-форллы и кул фы-ревертанты микобактерий индуцируют увеличение концентр ни нейраминовой кислоты и показателя повреждения нейтрофиг.с

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для правильной-оценки эпизоотическогосостояния хозяйств по беркулезу крупн ого рогатого скота бактериологическое исследо-ние молока коров после отел£ необходимо проводить однозре-гнно на выделение бактериальных культур и Л-форм микобакте-|й с последующей идентификацией культур-ревертантов.

2. В качестве дополнительных тестов при постановке диагноза на беркулез необходимо использовать иммунобиологические реак-и (показатель повреждения нейтрофилов и нейрамимозую кис-<ту).

3. Полученные данное о длительном персистировании Л-формы (кобактерий в организме крупного рогатого скота, а также выделе-и их с молоком коров примен яются в учебн ом процессе на кафед-х эпизоотологии и микробиологии в Троицком ветеринарном ин-итуте и рекомендуются для использования в^других вузах.

Практические предложения включены в «Рекомендации по выде-нию Л-форм микобактерий из патологического материала и моло-

коров», рассмотренные; и утвержденные методической комисси-

Троицкого ветеринарного института (протокол №5 от 16.04.93г.).

17

Список опубликованных работ

1. Петров А. А., Гертман М. И., Галатова Л. В., Хабибуллина С. X.

Значение своевременной диагностики туберкулеза в оздоровлении неблагополучных хозяйств. // Рукопись депонирована во ВНИИТ ЭИ № 584/16. ВС-88, ДСП. 1988. л. 6,5.

3. Галатова Л. В. Использование биохимических тестов для идентификации микобактерий. //Ветеринария. -1989. -№ 5. -с. 37-38.

3. Галатова Л. В., Гертман М. И., Петров А. А. Свойства Л-форм микобактерий. // Ветеринария,- 1990.N9 № 2. -с. 32-33.

4. Галатова Л. В., Гертман М. И., Петров А. А., Симбирцев В. Е. Атипичные микобактерии и их эпизоотологическое значение при туберкулезе крупного рогатого скота. // Актуальные проблемы интенсификации животноводства и подготовки специалистов. -Троицк,- 1990. -с. 44-45. ,

5. Галатова Л. В., Гертман М. И., Петров А'. А., Симбирцев В. Ё. Л-формы микобактерий и их роль в эпизоотологии туберкулеза.// Тезисы докладов 33 научной конференции Свердловского СХИ,— 1990. -с. 77-78.

. 6. Гертман М. И., Галатова Л. В., Петров А. А. Выделение Л-форм микобактерий из молока коров. // Ветеринария. -1990. -№ 6. -с. 3031. ,

7. Гертман М. И., Галатова Л. В., Петров А. А., Симбирцев В. Е.

Характеристика микобактерий, выделенных из объектов внешней среды неблагополучных по туберкулезу хозяйств. //Актуальные проблемы инсификации и животноводства. -Троицк, -1991. -с. 40-42.

8. Га лат сз а Л. В., Гертман М. И., Петров A.A., Федосеев В. С. Рекомендации по выделению Л-форм микобактерий из патологического материала и молока коров. -Челябинск. -1993. -6 с.

Подписано к печати 10.06.93. Формат 60x84 1/16 Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 5220

Увельская типография областного управления пЪчати и информации администрации Челябинской области 457000 п. Увельский Челябинской обл., ул. 30 лет ВЛКСМ, 3.