Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Морфофункциональная характеристика действия на организм животных экстракта предстательной железы быков

На правах рукописи

СМАГИНА ГАЛИНА ИВАНОВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ ЖИВОТНЫХ ЭКСТРАКТА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ БЫКОВ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2005

Работа выполнена в филиале ФГУП «НПО» Микроген» «Иммунопрепарат» (г. Уфа)

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

Бобкова Евгения Владимировна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Мыписин Владимир Александрович

кандидат биологических наук Мусина Ляля Ахияровна

Ведущая организация - Башкирский государственный

медицинский университет

Защита состоится 26 декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.02 при ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» 450001, г. Уфа, ул. 50 лет Октября, 34).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан "^^ноября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Д.В.Н.

Каримов Ф.А.

г&оН 22.6 Э2А~? 22Ш

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Предстательная железа (ПЖ, простата) у животных, также как и у человека, является основной вспомогательной половой железой у животных, также как и у человека, и влияние её на жизнедеятельность мужского организма многогранно (вгаИаск 1.Т, Кх^омгеИ 1.М., 1991).

Экстракт простаты половозрелых бычков в течение последних 20 лет успешно используется в качестве сырья для производства медицинских препаратов (Хавинсон В.Х. с соавт., 1997). Однако известно, что экстракты органов и тканей представляют собой сложные комплексы биологически активных молекул, которым свойственны различная функциональная направленность и сложный до конца неизученный механизм действия (Хавинсон В.Х. с соавт., 1997).

Можно предположить, что далеко не все функциональные особенности экстракта простаты на организм изучены и применение в исследованиях новых функциональных тестов (влияние на гормонообразование, рост шерсти, клеточный рост, оплодотворение и т.д.) сможет выявить возможности его использования в новых перспективных направлениях, в частности в животноводстве.

Цель исследования. Оценка морфофункциональных изменений во внутренних органах и периферической крови экспериментальных животных после введения им очищенного экстракта из предстательной железы быков.

Задачи исследования. Для достижения цели исследования необходимо решить следующие задачи:

1. С помощью клинических, патологоморфологических и лабораторных методов исследования провести анализ морфологических и функциональных изменений во внутренних органах и периферической крови экспериментальных животных после 20-ти дневного внутрижелудочного введения им жидкого очищенного экстракта из ткани простаты быков.

2. С помощью биохимических методов исследования провести количественное определение общих пептидов и фрагментированных нуклеиновых кислот в составе экстракта из ткани простаты быков и установить влияние криопротектора глицина на снижение их концентрации в экстракте после лиофильного высушивания.

3. Изучить с помощью жидкостной гель-хроматографии фракционный состав экстракта из ткани простаты быков и, используя набор стандартных весовых маркеров, определить относительную молекулярную массу компонентов этих фракций.

4. С помощью реакции восстановления активности щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином, изучить влияние криопротектора глицина на биологическую активность экстракта простаты и его отдельных пулов компонентов.

5. Провести изучение влияния экстракта простаты быков и его отдельных пулов компонентов:

- на содержание тестостерона в периферической крови половозрелых мышей-самцов при внутрибрюшинном способе введения с помощью иммунофермент-ного анализа;

- на рост шерсти у кроликов и морских свинок при введении исследуемых образцов способами: аппликация, per os и внутримышечная инъекция;

- на сократительную активность гладкой мускулатуры подвздошной кишки морской свинки в тестах «прямого» влияния и отмены торможения глад-комышечных сокращений, вызванной хлористым лантаном;

- на артериальное давление у петухов породы «Белый Леггорн» биологическим методом, основанном на способности окситоцина снижать кровяное давление у птиц.

Научная новизна настоящей работы заключается в том, что впервые, с помощью комплекса клинических, патологоанатомических, морфометрических, гистологических, биохимических, биологических и хроматографических методов дана характеристика полифункционального действия экстракта простаты быков на организм экспериментальных животных, обусловленного многокомпонентностью его состава.

Впервые в экспериментах на белых мышах показано, что однократное парентеральное введение экстракта из ткани простаты быков приводит к волновому повышению содержания тестостерона в периферической крови: через 1, 3,6 и 72 часа. Ответственными за этот эффект являются нуклеиновопептидные компоненты с относительной молекулярной массой (о.м.м.): от 0,075 до 17 кДа. Установлено, что они регулируют уровень эндогенного тестостерона в крови в различные промежутки времени с различной интенсивностью, что может свидетельствовать о различных механизмах, лежащих в основе наблюдаемого эффекта.

Впервые разработан и предложен метод контроля этой активности в экстрактах из ткани простаты (патент РФ № 2000113922 «Способ определения биологической активности препаратов из ткани предстательной железы», 2002 г).

Впервые выделены методом жидкостной гель-хроматографии и охарактеризованы по относительной молекулярной массе компоненты, стимулирующие рост шерсти у животных и не содержащие в своем составе свободный тестостерон. Экспериментальным путем определены эффективные дозы этих компонентов при. различных способах их введения.

Хроматографически выделены и охарактеризованы по о.м.м. компоненты экстракта простаты быков, оказывающие влияние на сократительную способность гладкой мускулатуры и артериальное давление. Биологическим методом оказано, что одним из них, является окситоциноподобный пептид.

Впервые предложен стабилизатор, обеспечивающий сохранение изученных морфофункциональных характеристик экстракта при хранении

(Уведомление о положительном результате формальной экспертизы № 2004112873/15(013845)). Раствор для инъекций «Простакор», восстанавливающий функцию предстательной железы, 2004).

Практическая значимость и реализация результатов исследования

Дано научно-методическое обоснование возможности применения жидкого очищенного экстракта простаты или его отдельных компонентов в некоторых областях животноводства (повышение потенции и оплодотворяющей функции у самцов-производителей, улучшения качества шерсти у пушных зверей).

С помощью разработанного метода контроля можно количественно охарактеризовать эффективность препаратов, содержащих в своем составе экстракт простаты быков в тесте повышение уровня тестостерона в крови самцов -производителей.

Разработанный стабилизатор обеспечивает сохранение изученных свойств жидкого экстракта при хранении в течение 3-х лет.

Разработаны три новых лечебных препарата для нужд здравоохранения, содержащих жидкий экстракт из ткани простаты КРС, позволяющие максимально сохранить исходную биологическую активность.

Результаты проведенных исследований оформлены в виде научно-технической документации на субстанцию «Экстракт из ткани простаты крупного рогатого скота очищенный концентрированный жидкий» и «Простакор раствор для внутримышечного введения».

Образцы новых препаратов переданы: в осеменительную станцию для изучения возможности его применения с целью улучшения качества спермы (объем, количество, жизнеспособность, отсутствие патологических форм сперматозоидов) у быков-производителей для искусственного осеменения; - в Улу-Телякское звероводческое хозяйство для изучения возможности улучшения качества меха (качество подшерстка, густота и т.д.) черно-бурых лисиц.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции, посвященной- 95-летию НИИВС им И.И. Мечникова (Уфа, 2000 г.) и Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной: 100-летию со дня основания филиала «Имму но препарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ (Уфа, 2005 г.).

Диссертация апробирована на заседании ученого совета Башкирского государственного аграрного университета (протокол № от 13.05.05 г.).

Публикации. Основные положения диссертационной работы изложены в 5 научных статьях, опубликованных в материалах научно-практических конференций, тематических сборниках вузов. По материалам диссертации получено 3 патента РФ и одна приоритетная справка на патентование.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах

компьютерного текста, состоит из разделов «Обшая характеристика работы», «Обзор литературы», «Собственные исследования», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Практические предложения», «Библиографический список», «Приложения» Библиографический список включает 400 источников, в том числе 160 иностранных Диссертация содержи: 26 таблиц, 35 рисунков, в том числе _ _фотографий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Экстракт простаты быков не вызывает патологических морфологических изменений во пнутренних органах и периферической крови экспериментальных животных в условиях острого и хронического опыта даже при введении высоких доз (10-кратно превышающие предполагаемую однократную).

2. Очищенный экстракт из ткани предстательной железы быков многокомпонентен и содержит в своем составе пептидно-нуклеиновые комплексы с о.м.м. от 0,075 до 17,0 кДа, неравнозначные по своей функциональной активности.

3 Физическое состояние экстракта существенно влияет на качественный и количественный состав входящих в него компонентов. Процесс лиофильного высушивания в присутствии глицина ведет к потере ряда его активностей.

4. Экстракт из ткани предстательной железы быков (или его отдельные компоненты с о.м.м 0,075 и до 17 кДа) вызывает волнообразное повышение содержания свободного тестостерона в периферической крови. Эта специфическая биологическая активность может быть количественно охарактеризована разработанным методом с использованием набора для ИФА.

5. Жидкий очищенный экстракт из ткани предстательной железы быков (или его отдельные компоненты с о.м.м. 0,075-4,2 кДа) вызывает усиление роста шерсти у подопытных животных при различных способах его введения.

6. Жидкий очищенный экстракт из ткани предстательной железы быков (или его отдельные компоненты) вызывает сокращение гладкой мускулатуры и изменяет артериальное давление.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследования

Работа выполнена в НИИВС им. И.И. Мечникова филиала ФГУП «НПО» Микроген» «Иммунопрепарат» (г. Уфа) в лаборатории препаратов крови и на кафедре фармакологии «Башкирский государственный медицинский университет». Эксперименты на животных проводили в специализированном виварии филиала ФГУП «НПО» Микроген» «Иммунопрепарат» (г. Уфа). В работе использовали беспородных белых половозрелых мышей (10280 голов), белых крыс породы «Вистар» (60 голов), петухов породы «Белый Леггорн» (5 голов), беспородных морских свинок черно-белого окраса (275 голов); кроликов породы «Шиншилла» (35 голов).

Объектом изучения являлись парные образцы (п=14) сухих и жидких

экстрактов с содержанием от 4 до 6 мг/мл общих пептидов и жидкие экстракты (п=5) из ткани простаты быков с содержанием от 7 до 15 мг/мл общих пептидов, полученные в цехе цитомединов филиала «Иммунопрепараг» ФГУП «НПО» Микроген»

Исследование влияния жидкого экс факта простаты быков на морфологию внутренних органов, массу тела, кровь и поведенческие реакции проводили на белых крысах породы «Вистар» и белых беспородных мышах с массой тела (0,200-0,250) и (0,016-0,019) кг соответственно. Животные ежедневно в течение 20 дней внутрижелудочно получали экстракт простаты в дозах 6 и 60 мкг общих пептидов на 1 кг тела, контрольные животные получали питьевую воду. Наблюдение за общим состоянием, массой тела, двигательной активностью животных проводили в течение всего периода введения экстракта и в течение 7 дней после окончания опыта («Методические рекомендации», 1980). Клиническое состояние животных определяли по общепринятым в ветеринарной медицине методам, а также выборочного биохимического исследования крови на содержание билирубина, глюкозы, белка (Кост Е.А.. 1975).

Исследование наличия патоморфологических изменений в сердце, легких, печени, почках, селезенке, тимусе, пилорической части желудка, тонком кишечнике в области пейеровмх бляшек и лимфатических узлах проводили гистологическим методом 50 % животных убивали через 24 часа и 50 % -на 7 сутки после курса введения тсст-доз экстракта. Извлекали органы, взвешивали и определяли их весовые коэффициенты (ВКО). Кусочки органов фиксировали в 10 % растворе формалина. После гистологической проводки и заливки парафином из них с помощью микротома санного фирмы «Reinchert» (Австрия) изготавливали срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином (Меркулов Г. А., 1969).

Биохимическая характеристика состава экстракта, наличие в нем глицина проведена с использованием методов спектрофотометрии, потенциометрии и хроматографии на бумаге согласно ВФС 42-2077-91.

Исследования фракционного состава экстракта проводили на хромато-графической установке («LKB», Швеция) с использованием колонки с ультрагелем «АсА-202» и детекцией оптической плотности при длине волны X 280 нм. Селективность ультрагеля изучена с помощью набора стандартных весовых маркеров с молекулярной массой (м.м.) от 0,075 до 1000 кДа.

Изучение влияния экстракта простаты на содержание тестостерона в исследуемых образцах экстракта и в сыворотке крови мышей-самцов проводили иммуноферментным методом с использованием стандартного набора («BIO RAD», США; «Биолот», Россия) для количественного определения тестостерона в биологических жидкостях.

Исследование способности экстракта из ткани ПЖ быков влиять на рост шерсти проведено на кроликах породы «Шиншилла» и беспородных морских свинках черно-белого окраса. Животным в течение 16 дней вводили жидкий экстракт простаты способами: аппликация, per os и внутримышечная инъекция измеряли в мм длину шерсти.

Исследование способности исследуемых образцов экстрактов влиять на гладкомышечные сокращения проведено на изолированном отрезке подвздошной кишки морской свинки. Предварительно морских свинок убивали ударом по затылку, открывали брюшную полость и выделяли подвздошную кишку. Самый ближайший проксимальный срез около 20 см длиной освобождали от лишней брыжейки, разрезали на фрагменты около 2 см каждый и промывали в физиологическом растворе. Фрагменты кишки помещали в ванночку и присоединяли ее к кимографу для графической регистрации. Опыт проводили по методике (Досье на Раверон, 1989), снимали показания кимографа и определяли активность исследуемых образцов экстракта простаты.

Исследование способности экстракта из ткани ПЖ быков вызывать снижение кровяного давления у птиц проводили в сравнении со стандартным государственным образцом окситоцина синтетического согласно ФСП 42-0061-0587-00. Зафиксированному петушку под фенобарбиталовым наркозом обнажали бедренную артерию и вводили в нее канюлю, заполненную раствором натрия цитрата 8 % и присоединяли ее через ртутный манометр к кимографу для графической регистрации кровяного давления (АД). В отпрепарованную бедренную вену вводили попеременно и в случайном порядке 2 дозы исследуемых образцов и две дозы стандарта окситоцина, замеряли АД и вычисляли относительную и абсолютную активности.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом оценки достоверности разницы между парными данными и путем определения среднего арифметического и среднеквадратичного отклонения с использованием t-критерия Стьюдента (Беленький M.JL, 1963, Ракицкий).

Достоверным считали разницу между сравниваемыми величинами при значении Р<0,05.

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Патоморфологическое исследование влияния жидкого очищенного экстракта из ткани предстательной железы быков на организм экспериментальных животных

Для анализа возможных морфологических изменений в организме исследованы внутренние органы и кровь крыс и мышей обоего пола после 20-ти дневного внутрижелудочного введения им жидкого очищенного экстракта из ткани простаты быков.

Предварительное исследование показало, что весовые коэффициенты сердца, легких, печени, селезенки и почек крыс оставались в течение всего периода наблюдения в пределах колебания контрольных величин

Таблица 1

Влияние экстракта из ткани предстательной железы на весовые коэффициенты внутренних органов крыс (п=10; Х±Ах)

Группы животных Сроки исследования Весовые коэффициенты, %

сердце легкие печень селезенка почки

Контроль 24 часа 0,36±0,02 0,59±0,02 3,36±0,09 0,46±0,03 0,6±0,02

7 суток 0,36±0,02 0,58±0,05 3,16±0,19 0,38±0,03 0,60±0,04

Расч. доза (РЭД) 24 часа 0,34±0,01 0,55±0,01 3,26±0,10 0,40±0,05 0,63±0,02

7 суток 0,35±0,02 0,50±0,02 3,22±0,10 0,42±0,02 0,63±0,02

ЮхРЭД 24 часа 0,35±0,01 0,57±0,04 3,13±0,10 0,39±0,04 0,65±0,02

7 суток 0,36±0,02 0,59±0,03 2,90±0,10 0,45±0,03 0,67±0,03

Через 24 часа после окончания введения экстракта у крыс, получавших расчетную эффективную дозу (6 мкг на кг массы тела животного) экстракта микроскопические изменения обнаружены в тимусе, лимфоузлах почках, легких. Микроскопически определяемых изменений в серозных оболочках не обнаружено. В тимусе крыс отмечено расширение и полнокровие сосудов, в почках -полнокровие сосудов коркового вещества и капилляров клубочков, в легких отмечены утолщение и отечность межальвеолярных перегородок.

У животных, получавших в 10-ти кратную эффективную дозу (10хРЭД) экстракта, микроскопические изменения обнаружены в легких, тимусе, селезенке и лимфоузлах. В тимусе крыс сосуды расширены, полнокровны. В брыжеечных лимфоузлах отмечена умеренная гиперплазия, увеличение размеров самих лимфоузлов и увеличенное количество лимфатических фолликулов в них. В легких у крыс обнаружены реактивность стромы, полнокровие крупных сосудов, лейкоцитарная инфильтрация межальвеолярных перегородок, реактивность стромы. В почках сосуды коркового слоя расширены, полнокровны, встречаются участки отечности канальцевого эпителия и лейкоцитарная инфильтрация стромы. В селезенке крыс наблюдалось увеличение количества и размеров фолликулов белой пульпы (гиперплазия), а также расширение их реактивных центров.

Обнаружены некоторые изменения в тимусе опытных крыс: отмечены не резко выраженная отечность перегородок, полнокровие сосудов.

Таким образом, микроскопические изменения во внутренних органах крыс в условиях длительного внутрижелудочного введения экстракта из ткани простаты быков свидетельствуют о том, что его введение, особенно в 10-кратнопревы-шающей дозе, ведет к возникновению застойных явлений в легких. Отмеченные изменения со стороны лимфоидных органов у животных этой группы можно связать со стимуляцией иммунного ответа, вызванного высокой дозой препарата.

На 7 сутки после прекращения инъекций препарата видимых изменений внутренних органов и серозных оболочек не обнаружено Микроскопические изменения в тимусе и почках обнаружены у крыс 3 группы: в тимусе отмечены расширение сосудов и отечность перегородок, а в почках - полнокровие и спазм отдельных сосудов коркового вещества.

Нами установлено, что многократное введение очищенного жидкого экстракта в исследуемых дозах не оказывает существенного влияния на массу тела экспериментальных животных.

Таблица 2

Влияние жидкого очищенного концентрированного экстракта из ткани простаты быков на массу тела животных (п-20; Х±Ах)

Группы животных Масса тела, г

до эксперимента после 10 введений после 20 введений в конце опыта

КРЫСЫ

1 (Контроль) 226,3±6,0 229,8±7,4 247,0*5,3 248,6±8,6

2 (РД) 228,1±5,4 231,7±6,1 246,7±3,5 248,1±7,0

3 (ЮхРД) 225,2±4,0 214,4±4,1 222,8±8,8 234,8±3,2

МЫШИ

1 21,0±0,5 21,8±0,6 22,4±0,6 22,4± 1,1

2 2 1,0+0,6 21,9±0,6 21,8±0,7 22,9±1,1

3 21,4±0,4 . 21,8±0,6 21,9±0.6 22,5±1,3

* - Даны усредненные величины массы тела животных (и самцов и самок).

Так, наблюдающаяся у крыс (п=10), получавших 10-кратную дозу экстракта (2 группа), незначительная потеря в весе составила (222,8±8,8) г против (225,2±4,0) г в начале опыта. К концу опыта (на 7 сутки после последнего введения экстракта) она исчезла. У мышей (п=10) потери в массе тела не отмечено. Прирост массы тела у мышей 2 и 3 опытных групп составил 9,0 и 3,7 % соответственно, контрольной - 7 %.

Исследование периферической крови не показано отклонений по количественному содержанию лейкоцитов, эритроцитов от контрольной группы.

Таблица 3

Влияние экстракта из ткани предстательной железы на морфологические показатели крови животных (п=10; Х±Ах))

Группы животных Сроки исследования Морфологические показатели

гемоглобин, г % эритроциты, млн/мкл лейкоциты, тыс/мкл

КРЫСЫ

1 24 часа 13,6±0,2 5,7±0,4 7,2±0,3

7 суток 13,7±0,2 5,0±0,2 7,8±0,7

2 24 часа 13,7±0,2 5,4±0,4 8,4А1,0

7 суток 13,4±0,2 4Д±0,1*»р< 0,001 6,6±0,8

3 24 часа 13,8±0,2 5,7±0,3 9,8±1,0 **Р<0,02

7 суток 13,7±0,2 4,4±0,4 5,4±0,6 **Р<0,02

МЫШИ

1 24 часа 13,9±0,35 7.4±0.4 5,6±0,4

7 суток 13,7±0,2 6,0±0,5 4,3±0,5

2 24 часа 13,7±0,5 7,3±0,6 5,5±0,5

7 суток 13,8±0,2 6,5±0,2 5,3±0,6

3 24 часа 13,5±0,2 7,3±0,3 5,5±0,6

7 суток 13,3±0,2 6,3±0,2 5.5±0,5

** Р - здесь и далее достоверно по сравнению с контролем.

Содержание билирубина, глюкозы и белка в крови опытных животных не отличалось от контроля и находилось в пределах физиологической нормы.

Таблица 4

Влияние экстракта из ткани предстательной железы на биохимические показатели крови крыс (п=10;Х±Лх)

Группы животных Сроки наблюдения Содержание

билирубина, мкмоль/л глюкозы, мкмоль/л белка, г/л

1 7 суток 10,0 ±0,4 5,6 ± 0,3 68,0 ±2,3

2 7 суток 9,9 ±0,3 5,7 ±0,2 67,5 ± 1,6

3 7 суток 10,4 ±0,4 5,4 ±0,3 68,6 ± 1,6

Таким образом, клиническое и патоморфологическое изучение крови и внутренних органов (тимус, селезенка, почки, печень, легкие, сердце) после введения очищенного жидкого экстракта простаты быков в условиях длительного введения не выявило значительных отклонений по сравнению с контрольной группой.

2.2.2 Биохимическая характеристика экстракта из ткани простаты быков и входящих в его состав отдельных фракций

2.2.2.1 Биохимическая характеристика жидких и сухих экстрактов из ткани простаты быков

Предварительное исследование содержания основных биологически активных молекул цитомединовых препаратов нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и пептидов в составе жидкого очищенного экстракта из ткани простаты быков показало наличие в нем как пептидов (8,4±6,7) мг/мл (Р<0,05), так и нуклеиновых кислот (679,0±639,8) мг/мл (Р<0,05). Причем содержание нуклеиновых кислот в 80,8 раза превосходило содержание общих пептидов.

Поскольку лиофилизированная форма лекарственных препаратов является более удобной нами изучено влияния лиофилизации на основные нормативные характеристики (содержание общих пептидов, способность восстанавливать активность щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином и рН) лиофилизи-рованной формы экстракта простаты - коммерческого препарата Простатилен.

Биохимические исследования показали, что в сухих препаратах отмечено снижение (Р>0,01) концентрации общих пептидов на 6,5-10,5 %, способности восстанавливать активность щелочной фосфатазы на 8,3-12,8 %, при сдвиге рН на 3,7-4,4 % в щелочную сторону (Р>0,01). Изменение этих характеристик экстракта простаты мы связали с наличием в нем криопротектора глицина Исследование содержания его в парных образцах показало снижение концентрации глицина на 40,83-53,39 %(Р=0,01).

2.2.2.2 Фракционный состав жидких и сухих экстрактов из ткани простаты быков

Исследование хроматографического профиля очищенного экстракта из ткани простаты быков с использованием ультрагеля АсА-202 показало, что в его составе присутствуют 14 фракций нуклеиново-пептидных компонентов, разнящихся по м.м.

Рис.1. Хроматографический профиль жидких очищенных экстрактов из ткани простаты быков.

Использование набора стандартных весовых маркеров с известной м.м. (от 0,075 до 1000 кДа), позволило определить их относительную молекулярную массу (0,001 </э<0,01).

Таким образом, установлено, что экстракт простаты многокомпонентен, м.м. его составляющих компонент колеблется от 16 кДа до 0,075 кДа, что позволяет предположить и его многофункциональность.

Сравнительное изучение хроматографических профилей жидкого и лио-фильно высушенного экстракта показало, что часть компонентов с о.м.м. более 11,8850 и менее 1,7783 кДа, присутствующая в жидком экстракте, в сухой форме не определяется. Остальные компоненты сохраняются и полностью повторяют профиль жидкого экстракта, отличаясь меньшей высотой регистрируемых нуклеиново-пептидных пиков.

Зная, что природные гетерополимеры имеют сложную аминокислотную последовательность, самое незначительное изменение которой может привести к нарушению или даже полному исчезновению биологической активности (Терней А., 1981, Ткачева Г.А. с соавт., 1983), можно предположить существенное изменение возможных биологических активностей экстракта после сушки.

2.2.3 Влияние отдельных фракций компонентов в составе экстракта из ткани простаты быков на содержание эндогенного тестостерона

*>

Применение ряда новых тестов при изучении биологических свойств экстракта простаты быков позволило выявить ряд его функций, не описанных в литературе ранее.

Известно, что простата в своем развитии и функционировании тесно связана с состоянием гормонообразования в системе гипофиз - половые железы и обладает широким спектром воздействия на клетки Лейдинга и кору надпочечников, продуцирующих тестостерон (Егоров A.M. с соавт., 1991; Nicholson H.D. and Hardy М.Р. 1992). Исходя из этого на следующем этапе исследования нами изучено влияние отдельных фракций компонентов экстракта, введенных внутри-брюшинно половозрелым мышам-самцам, на уровень эндогенного тестостерона в сыворотке крови.

Исследование содержания тестостерона в периферической крови здоровых половозрелых белых беспородных мышей (самцов), которым однократно внутрибрюшинно вводили жидкий очищенный экстракт простаты в установленной экспериментальным путем тест - дозе 1,4 мкг/мышь, показало, что на протяжении 168 часов наблюдения идет четырехразовый подъем уровня тестостерона в периодической крови мышей через 1, 3, 6, 72 часа при максимальном повышении у сухого экстракта через 72 часа после инъекции.

Кратность повышения уровня тестостерона

*жид Исух

15 1050

1 пик (Зч.)

2 пик (6 ч.) 3 пик (72ч.)

i и™ (О Ч.|

V - V Г- J* SW

{ —■ t .......,_

сух

жид

0,301 0,477 0,6 0,69 0,78 0,845 1,851 1,857 1,863,

logT

Рис. 2. Периодичность выброса тестостерона в кровь после однократной инъекции тест - доз жидкого и сухого экстрактов в течение 7 суток наблюдения.

По оси ординат - кратность повышения контрольного уровня тестостерона. Но оси абсцисс - Т-период наблюдения, в часах (масштаб логарифмический).

При введении мышам сухого экстракта тест - доза для достижения обнаруженного эффекта была увеличена в 15,6 раз (с 1,4 до 11,2 мкг/мышь), при этом максимального значения концентрация тестостерона в крови достигала только к 72 часам.

На основе полученных данных проведено сравнительное исследование 14 производственных серий жидкого экстракта и полученных из них сухих препаратов в тесте стимуляции повышения уровня эндогенного тестостерона в сыворотке крови мышей через трое суток после инъекции тест - доз препаратов: 1,4 и 11,2 мкг/на мышь общих пептидов соответственно. Через 72 ч методом ИФА определяли содержание тестостерона в исследуемых образцах сыворотки с использованием набора для ИФА фирмы «BIO RAD» (США).

Концентрация тестостерона, нг/мл

2 3

6 7 8 9 10 11 12 13 14

Номер фракции

Рис. 3. Содержание тестостерона в сыворотке крови мышей-самцов через трое суток после инъекции тест-доз жидкого (п=14) и сухого экстрактов из ткани простаты быков (п=14).

Достоверно показано (Р<0,01), что экстракты простаты быков в установленных тест-дозах (1,4 и 11,2 мкг) через 3 суток после инъекции вызывали повышение уровня сывороточного тестостерона не менее, чем в 4 раза превышающий контроль.

Поскольку, специфическая биологическая активность выпускаемых в нашей стране препаратов из экстракта простаты не контролируется. Нами, на основе полученных фактов, предложен новый метод контроля биологической активности препаратов экстракта простаты в тесте усиления выброса тестостерона после однократного внутрибрюшинного введения тест-дозы. Предложенный метод контроля защищен патентом РФ (№ 2186387 от 27 июля 2002 г).

Таким образом, обнаруженное нами снижение количественных характеристик компонентов жидкого экстракта и изменение его хроматографического профиля при лиофилизации было подтверждено и изменением его биологической активности в тесте влияния на уровень тестостерона в крови мышей-самцов. Преимущество использования жидкого экстракта простаты быков при разработке лекарственных препаратов отражено в 2 патентах РФ (№ 2152204, 2000 г; №2186387,2002 г).

Важная роль тестостерона в регуляции сексуальной активности и его опосредованное влияние на выработку спермы и жизнеспособность сперматозоидов у животных и человека (Молочков В.Ф., Ильин Л.И., 1998) позволяет предположить возможное использование экстракта простаты быков в животноводстве (повышение объема и улучшения качества спермы при хранении для искусственного осеменения).

2.2.3 Влияние отдельных фракций компонентов в составе экстракта из ткани простаты быков на рост шерсти подопытных животных

Литературные данные о содержании тестостерона в луковицах волос (Д. Менцлер, 1980) и его влиянии на морфологию волосяных фолликул, дали нам основание провести изучение влияния жидкого экстракта на рост волос у половозрелых животных (кролики и морские свинки).

20

Длина шерсти, мм

«—Аппликация 0 «—Питье

--Юм инъекции

-— Контроль

Рис. 4. Динамика роста шерсти у морских свинок при различном способе введения экстракта.

На рисунке показано, что при всех способах введения экстракт стимулировал рост шерсти в используемых концентрациях, которые составляли: 0,405, 0,810, 0,040 мг/на свинку - при аппликации, per os и внутримышечном введении соответственно. Длина шерсти, в среднем, составляла, 15,0, 10,7 и 13,2 мм соответственно при 7,0 мм в контроле. Достоверно показано (Р<0,05) возрастание не только длины, но и скорости роста шерсти (в 2 раза) у подопытных свинок по сравнению с контролем).

Для выявления компонентов, ответственных за этот эффект, опыт повторен на морских свинках с введением отдельных компонентов, объединенных по близкой о.м.м. (рис. 8)

15

Длина шерсти (X), мм

Рис. 5. Динамика роста шерсти у морских свинок после аппликации содержимым пулов 1-4 экстракта из ткани простаты быков в V концентрации 12,1 мкг/мл о.п.

Показано, что компоненты, входящие в пулы 1 и 3 в концентрации достоверно (0,05<р<0,02) стимулируют рост шерсти у морских свинок в 4-5 раз соответственно по сравнению с контролем.

Обнаруженный впервые факт стимуляции роста волос у животных после введения экстракта простаты, позволяет рекомендовать его возможное применение в звероводстве для улучшения качества шерсти у пушных зверей.

2.2. 4 Влияние отдельных фракций компонентов в составе экстракта из ткани простаты быков на сократительную активность

Простата является железисто-мышечным органом, и сокращение ее гладких мышц способствует выбросу секрета и семяизвержению. Для оценки этих функции экстракта нами применен известный тест изучения тонуса гладкой мускулатуры подвздошной кишки морской свинки под воздействием раздражителей в двух вариантах: прямого влияния и отмены торможения сокращений гладкой мускулатуры, вызванного хлористым лантаном.

Показано, что введение в реакционную смесь экстракта вызвало резкое сокращение кишки по сравнению со стандартом, в качестве которого мы использовали раствор хлористого калия.

Рис. 6. Способность экстракта-полуфабриката из ткани простаты быков серии 247 стимулировать сокращения гладкой мускулатуры подвздошной кишки морской свинки по методу прямого введения.

При постановке 2 варианта опыта получен аналогичный результат.

Рис. 7. Способность экстракта из ткани простаты быков серии 2 стимулировать сокращения гладкой мускулатуры подвздошной кишки морской свинки по методу отмены торможения сокращений, вызванного хлористым лантаном.

Установлено, что одна из фракций, влияющих на сокращение гладкой мускулатуры (фракция 4*) с о.м.м. менее 1,47 кДа и более 754 Да, близка к м.м. окситоцина (1003,0 Да) и, возможно, содержит окситоцин.

Известна способность окситоцина вызывать снижение у птиц кровяного давления. С использованием этого метода нами изучено влияние экстракта простаты на артериальное давление у петухов.

На рисунке 8 показано, что экстракт (8 мг/мл) обладает окситоцино-подобным эффектом и достоверно (Р<0,05) снижает у петухов кровяное давление, по сравнению со стандартом окситоцином синтетическим.

Рис. 8. Способность экстракта из ткани простаты КРС серии 2 снижать кровяное давление у петуха породы «Белый Леггорн».

S], S2 - средние величины изменения артериального давления при введении

меньшей и большей дозы S стандартного образца окситоцина (мм); Т], Т2 - средние величины изменения артериального давления (АД) при вве-введении меньшей и большей дозы Т исследуемых образцов (мм).

Таким образом, можно предположить наличие в составе жидкого экстракта простаты КРС окситоциноподобных пептидов, учавствующих в сокращении .гладкой мускулатуры

Полученные результаты заставили нас провести поиск стабилизатора, обуславливающего стабильность свойств и состава жидкого экстракта при .длительном хранении. Таким стабилизатором оказалась мальтоза. Внесение ее в жидкий экстракт сохраняло активность жидкого экстракта в течение 3 лет хранения (Р=0,01).

ВЫВОДЫ

1. Жидкий очищенный экстракт простаты не вызывает патологических морфологических изменений во внутренних органах и периферической крови подопытных животных при длительном введении (20 дней).

2. Очищенный экстракт из предстательной железы быков многокомпонентен. В его состав входят нуклеиново-пептидные компоненты с широким диапазоном о.м.м. от 17 до 0,075 кДа, различающиеся по функциональной активности.

3. Процесс лиофильного высушивания с принятым в качестве стабилизатора глицином ведет к снижению его биологической активности. Добавление в экстракт 4 % мальтозы сохраняет активность жидкого очищенного экстракта в течение 3 лет хранения.

4 Введение экстракта простаты быков приводит к подъему уровня эндогенного тестостерона в периферической крови экспериментальных животных. Ответственным за этот эффект являются нуклеиново-пептидные комплексы с о.м.м. от 0,075 до 17 кДа.

5 Введение экстракта простаты быков дозозависимо ускоряет (в 2,5 раза) рост шерсти у экспериментальных животных при' любом способе введения (аппликация, per os, внутримышечно). Ответственными за этот- эффект являются нуклеиново-пептидные комплексы с о.м.м. 14,8-17 и 6-4 кДа.

6 Жидкий очищенный экстракт простаты статистически значимо увеличивает амплитуду сокращения гладкой мускулатуры. Ответственными за этот эффект являются нуклеиново-пептидные комплексы с о.м.м.12,0-14,8 и 4-6 кДа, один из которых обладает окситоциноподобным действием.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Пат. 2152204 CI RU, 7 А 61 К 9/02, 35/48, А 61 Р 13/08, 1/14. Ректальное средство / Е.В. Бобкова, Г.И. Смагина, М.Х. Козырева, Ф.Х. Галиахметов. - Заявл. 19.02.1999; Опубл. 10.07.2000//Бюл. -2000. -№ 19.

2 Пат. 2160114 CI RU, 7 А 61 К 35/48, 38/00, 38/21, 9/02. Ректальное средство для лечения хронических простатитов / Е.В. Бобкова, Г.И. Смагина, М.Х. Козырева. - Заявл. 06.10.1999; Опубл. 10.12.2000//Бюл. -2000. -№ 34.

3 Пат. 2186387 С2 RU, 7 G 01 N 33/48, А 61 К 35/48. Способ определения биологической активности препаратов из ткани предстательной железы/ Е.В. Бобкова, Г.И. Смагина.- Заявл. 31.05.2000; Опубл. 27.07.2002 //Бюл. - 2002. - № 21.

4 Уведомление о положительном результате формальной экспертизы. Заявка № 2004112873/15(013845). Раствор для инъекций «Простакор», восстанавливающий функцию предстательной железы/Е.В. Бобкова, Г.И. Смагина, М.Х. Козырева, Ибрагимов В.Г., - Заявл. 27.04.2004.

5 Фархутдинов М.Р. Изучение антиоксидантной активности препарата простатилен /Фархутдинов М.Р., Смагина Г.И., Мельников Н.В., Бобкова Е.В // БГМУ.-СПб, 1999.-С. 81.

6 Смагина Г.И. Изучение фракционного состава препаратов простатилена/ Смагина Г.И, Бобкова Е.В., Мельников Н.В // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Материалы Всероссийской конференции. - Уфа, 2000. Ч. 2. - С.99-102.

7 Смагина Г.И. Биологическая активность простатилена /Смагина Г.И., Бобкова Е.В. // Там же. - С. 102-104.

8 Галиахметов Ф.Х. Эффективность препаратов простатилена при лечении сексуальных дисфункций, обусловленных хроническим простатитом хламидийной этиологии /Галиахметов Ф.Х., Смагина Г.И., Бобкова Е.В. // Там же. - С. 107-109.

9 Аминева Г.З. Нуклеиновые кислоты в составе простакора /Аминева Г.З., Смагина Г.И., Бобкова Е.В., Аминев Р А. // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: Разработка, производство и применение- Материалы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня основания филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ 7-9 июня 2005 года. - Уфа, 2005. Ч. 2. - С. 301-304.

СМАГИНА ГАЛИНА ИВАНОВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ ЖИВОТНЫХ ЭКСТРАКТА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ БЫКОВ

16 00.02 - патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ответственный за выпуск Р.К Каримова

Подписано в печать 25 И 05 г Бум офсетная Формат 60x84 1/16 Гарнитура «Times New Roman» От на ризографе Уел печ л 1,4 Уч-изд л 1,2 Тираж 100 экз. Заказ Л» 1861

РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ 450014, г Уфа,ул Новороссийская, д 105, тел (3472)21-32-14

\

1

<7

»25577

РНБ Русский фонд

2006-4 29793