Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Индукция эндогенного интерферона и протективные свойства Bac. subtilis

На правах рукописи

ОСМАЕВ Ислам Аутаевич

ИНДУКЦИЯ ЭНДОГЕННОГО ИНТЕРФЕРОНА И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ВАС. вЦВТШЮ

16.00 03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

003070697

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики респираторных вирусных болезней лошадей и крупного рогатого скота отдела вирусологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (ВИЭВ) Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН)

Научный руководитель - заведующий отделом вирусологии ВИ ЭВ, доктор ветеринарных наук, Заслуженный деятель науки РФ, Лауреат премии Совета Министров СССР, Лауреат Государственной премии Республики Саха (Якутия) в области науки, профессор Константин Павлович Юров

Официальные опгоненты

1 Караваев Юрий Дмитриевич - доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, Лауреат премии Совета Министров СССР, Лауреат Государственной премии Республики Саха (Якутия) в области науки, заведующий лабораторией болезни овец ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им ЯР Коваленко» (ВИЭВ),

2 Валихов Алексей Федорович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биологии, вирусологии и генной инженерии ОГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Ведущее учреждение - ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП)

Защита состоится « 30 » мая 2007 г в 15— часов на заседании диссертационного совета Д 00Е5 033 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (ВИЭВ) Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу 109428, Москва, Рязанский проспект, д 24, корп 1, ВИЭВ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (ВИЭВ)

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совста,

профессор C^VjL^-' н-п Овдиенко

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы

Успешная реализация программы развития животноводства страны требует ветеринарного обеспечения в плане защиты животных от массовых инфекционных болезней Наибольший удельный вес в инфекционной патологии молодняка сельскохозяйственных животных приходится на болезнй органов дыхания и пищеварения вирусной этиологииг •инфекционйый ринотрахеит, парагрипп-3, вирусная диарея - болезни^ слизистых и др Часто эти заболевания протекают как вирусно-бактериаггьные смешанные инфекции с участием пастерелл, миколлазм, диплококков и других микроорганизмов

Эффективная борьба с названными болезнями возможна при условии сочетания мер, обеспёчивайщих выращивание здорового потомства с достаточно высокой резистентностью организма и напряженной иммунной защитой против осйовных возбудителей массовых заболеваний

Многочисленные неблагоприятные факторы внешней среды, включающие загазованность животноводческих помещений, высокое содержание условно-патогенной микрофлоры, нарушение температурного режима и др снижают резистентность организма в первую очередь молодых животных и затрудняют применение средств специфической профилактики В этом случае необходимо изыскивать альтернативные методы повышения устойчивости животных к инфекции, коррекции иммунной системы путем включения в арсенал защитных средств иммуномодуляторов и пробиотиков

Одним из значимых событий XX века является открытие интерферона (Isaacs А , Lindeman J , 1957) В настоящее время установлен широкий спектр биологической активности интерфероновых белков, которые наряду с другими цитокинами обладают многочисленными свойствами, включая антивирусное действие, регулирование взаимодействия главных интегративных систем организма -нервной, иммунной, эндокринной

Система интерферона не имеет специализированных клеток или органов, она существует в каждой клетке Каждая клетка в случае вирусной инфекции должна быть защищена от заражения вирусом (Ершов Ф И , 1982, Gale М , Jr, Tan S -L , Wambach M , Katze М G , 1996, Kotenko SV, Saccani S, Izotova LS, Mirochnitchenko Ol, Pestka S , 2000)

Различают три основных типа интерферонов альфа - а, бета -ß и гамма - у, которые в свою очередь разделяют на интерфероны 1 и 2 типов

Создание технологии получения генно-инженерных интерферонов позволило, в частности, выяснить ответственность каждого белка за тот или другой защитный эффект Так, у-интерферон является активатором макрофагов и усиливает их противоопухолевую активность, подавляет репликацию вирусов При вирусной инфекции у-интерферон (ИФН-у) вызывает изменения поверхности клеточной мембраны, при этом защищает клетки от проникновения вируса, нарушает внутриклеточный синтез вирусов (Рафальский В В , 1997)

Благодаря рекомбинантной технологии в медицинскую практику вошли чистые препараты интерферонов, обладающие широким спектром действия у человека Не меньшее значение феномен интерференции имеет и для ветеринарии Однако вследствие ряда объективных причин, во многих случаях использование препаратов чистых интерферонов в ветеринарии экономически мало оправдано или неэффективно несмотря на все их положительные свойства в отношении антивирусного, антибактериального, противоопухолевого действия или гармонизации гомеостаза в т ч иммуногенеза Перспективным направлением в ветеринарии, по нашему мнению, является изыскание активных индукторов эндогенного интерферона В первую очередь активных природных индукторов - защитных белков клетки Суммарный эффект защитного действия а-, р- или у-интерферонов в организме, как результат применения удачно подобранного индуктора, может быть использован в комплексе профилактических и лечебных мероприятий при вирусных инфекциях сельскохозяйственных животных Результативность этого метода во многом зависит от биологических характеристик индуктора эндогенного интерферона (Ершов Ф И , Киселев О И , 2005)

Следовательно, разработка новых индукторов интерферона является актуальной задачей

Весьма перспективным направлением, по нашему мнению, в плане изыскания возможных естественных индукторов интерферона и иммуномодуляторов является большая группа хорошо изученных микроорганизмов с весьма полезными свойствами пробиотиков (Грязнева Т Н , 2005)

Накопленный большой объем научной информации свидетельствует, что пробиотики относятся к числу высокоэффективных лечебно-профилактических средств (Антипов В А, 1991, Бабин ВН, 1994, Бондаренко В М , 1997, Малик Н И , 2001, Панин А С , 1993, тендеров Б А , 1997, Goldiri В R , 1992, Gordon J 1, 1997)

Эффективность этих препаратов оказалась во многих случаях настолько высокой, что ряд исследователей пришли к заключению о наступлении «эры пробиотиков»

Весьма важным обстоятельством является наличие у бактерий, .обладающих пробиотическими свойствами, не только антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, но и ряда других полезных свойств, таких как иммуномодулирующих, антиаллергических и др (Будагов Р С , 1996, Войчишина Л Г , 1991, Воробьев А А , 1997; Павлюк Т Д , 1995, Позняк А Л , 1997, Никитенко В И , 1990, Петров А Н , '2001)

Новым направлением в конструировании и совершёнствовании пробиотиков является включение в число основных претендентов бактерий рода Bacillus (Смирнов ВВ, 2002, Смирнов ВВ, 1993, Сорокулова И Б , 1996, Сорокулова И Б , 1997, Мс Ti'gue М А , 1995, Mendonca A L , 1996, Muscettola М , 1991, Muscettola М , 1992)

Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте животных (Никитенко В И , 2000, Резник С Р , 1981, Резник CP, 1985, Резник С Р 1991, Pennington JE, 1976, Tanaka R, 1983)

Указанное определило цель нашего исследования изыскать доступный,природный индуктор интерферона и Изучить его влияние на формирование защитных реакций организма при некоторых вирусных инфекциях животных

1.2. Задачи исследования

1 Определить возможность использования В subtilis в качестве индуктора интерферона и отработать методику определения интерферона, используя в качестве тест-системы культуру клеток и чувствительный к интерферону вирус ВС

2 Провести экспериментальные исследования по определению образования интерферона 1 типа и гуморальных антител у телят после прививки им вируса диареи - болезни слизистых

3 Определить образование гуморального иммунитета и a/fä-интерферона в результате прививки им вирусов ПГ-3 и ИРТ

4 Изучить на лабораторной модели - мышах линии Balb/c - возможность индуцирования устойчивости к ВГЛ-1, синтез интерферона 1 типа и некоторых интерлейкинов вследствие инокуляции культуры В subtilis

1.3. Научная новизна исследований

Выяснены особенности секреции интерферонов 1 типа у телят после введения им культуры Вас subtilis и вакцинных штаммов вирусов ИРТ-ИПВ, ПГ-3 и ВД-БС крупного рогатого скота Установлено, что индукция интерферона зависит от очередности и времени прививки вакцин и введения индуктора интерферона Показано, что

иммунный фон и присутствие спонтанного интерферона у телят существенно влияют на секрецию цитокинов В опытах на лабораторной модели - мышах линии ВАШ/с - впервые установлена возможность защиты от экспериментальной'летальной инфекции вирусом герпеса лошадей - 1, путем индукции у них эндогенного интерферона Впервые получены данные, характеризующие секрецию интерлейкинов 6 и 10 в ответ на введение Вас виЫ^э и ВГЛ-1 1.4. Практическая значимость работы -Проведенными исследованиями показана перспективность применения культуры Вас виЬЫ^ - препарата «Сахабактисубтил» в системе лечебных и профилактических мероприятий против респираторных инфекций телят Применение этого препарата позволяет повысить иммунный статус животных и обеспечить защиту от инфекции вследствие образования эндогенного интерферона, который является важным фактором защиты молодого организма с недостаточно сформированной иммунной системой от вирусной ин фекции

Полученные результаты использованы при разработке «Системы ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации», утвержденной 17 мая 2006 г заместителем директора Департамента отраслевого развития МСХ В А Апалькиным

1 5. Личный вклад соискателя заключается в проведении экспериментальных исследований по теме диссертации, включающих культивирование вирусов, титрование интерферона и антител, проведение опытов на телятах и лабораторных животных, анализ и обобщение полученных результатов, подготовку материала для публикаций, написание и оформление диссертации

1.6. Основные положения, выносимые на защиту: - результаты экспериментальных исследований, полученных при изучении иммунного ответа и секреции интерферона у естественно-восприимчивых и лабораторных животных (телят и белых мышей), на вакцинные вирусы ВД-БС, ИРТ-ИПВ, ПГ-3 крупного рогатого скота, ВГЛ-1 при использовании Вас эиЬЫ^' в качестве индуктора интерферона (ИИ),

-данные, характеризующие особенности формирования протек-тивного эффекта, секреции цитокинов и реакции иммунитета в зависимости от времени и порядка введения ИИ и вакцин,

результаты разработки лабораторной модели (белые мыши линии ВА(-В/с) для оценки эффективности ИИ

1 7. Апробация работы

Материалы работы были представлены на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы \мнфекци* онной патологии и иммунологии животных» посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля наук РСФСР,.доктбрё'вете^ ринарных наук, профессора, академика ВАСХНИГК Якова/Ромаяо-г вича Коваленко (Москва, 2006 г) Основные' положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно-производственном совещании научных сотрудников ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (Москва, 2007 г)

1.8 Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 2 научные работы

1.9 Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 117 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение выводы, практические предложения, список литературы и приложения Список литературы содержит 197 источников Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 17 рисунками

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 2004 - 2007 гг по плану научно-исследовательских работ в лаборатории диагностики и профилактики респираторных болезней лошадей и крупного рогатого скота отдела вирусологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (ВИЭВ) в соответствии с утвержденными планами научно-исследовательских работ в период 2004-2007 гг (исследования по заданию РНТП 02 02 04, 08 02 02 02 )

2 1. Материалы и методы

Вирусы

В работе использовали вакцинные штаммы вирусов ИРТ-ИПВ, ПГ-3, ВД-БС, применяемые в производстве коммерческих вакцин, разработанных в ВИЭВ (Н Н Крюков с соавт), лабораторный штамм вируса везикулярного стоматита; вируЬ ринопневмонии лошадей (ВГЛ1)- штамм ПП/1, адаптированный к белым мышам (С В Алексеенкова с соавт, 2005, 2006) Вакцины использовали в дозах по 2,0*5,0 logTCD50/ml внутримышечно

Клеточные культуры , Для культивирования вирусов использовали перевиваемые клеточные культуры почки кролика (RK-13), почки теленка (MDBK) и .семенники теленка (CT) Культуры клеток выращивали на среде Игла MEM (производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова РАМН») с добавлением 2мМ глутамина( 5%-ной сыворотки крови КРС для культур клеток (производства ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ), пенициллина по 100 ЕД/мл и стрептомицина по 100 мкг/мл

Наборы для определения интерлейкинов в ИФА фирмы «Bender MedSystem» (Австрия)

Набор иммуноферментного анализа для определения мышиного ИЛ-6 (Innovation On The Move mouse IL-6 ELISA BMS 603) и мышиного ИЛ-10 (Innovation On The Move mouse IL-10 ELISA BMS 614) Культуры бактерий

Культура В subtilis с концентрацией 5 млрд м к /мл - препарат «Сахабактисубтил» на основе штаммов «ТНП-3» и «ТНП-5», выращенных на твердой питательной среде и суспензированных в физиологическом растворе хлорида натрия, с концентрацией 5 млрд живых м к /мл Препарат применяли подкожно по 2,0 мл или внутрь по 10 мл телятам, и по 10-20 мкл белым мышам Животные

Телята в возрасте 4-6 мес -14 голов, мыши линии BALB/c -176 шт Культивирование вируса в культуре клеток ^ Вирусы культивировали в перевиваемых клеточных культурах RK-13tíMDBK и CT Для 'пассирования отбирали матрасы со сформировавшимся клеточным монослоем, ростовую питательную среду сливали, клетки 1-2 раза промывали раствором Хенкса Затем вно-" сили вируссодержащую культуральную жидкость и равномерно распределяли ее по слою клеток Адсорбция вируса проходила в течение "1-1,5 часа при температуре 37°С После этого вируссодержащую жидкость удаляли и добавляли поддерживающую питательную среду Инкубировали матрасы в термостате при 37°С до наступления цитопатического действия не менее чем в 75 - 80% монослоя Титр вируса "оценивали в 1дТЦД5о/1мл по Риду и Менчу 1 Титрование вирусов • '

,,, В ¡лунках 96-луночных планшетов для клеточных культур (фирмы л «CORNING Costar», США) готовили четыре ряда последовательных 10-кратных разведении полученного вируссодержащего материала на среде Игла MEM с 10"1 до '10'3 Затем в каждую лунку вносили равный объем суспензии культуры клёток (5 * 10 клеток/мл) Инку-

бировали при 37°С в атмосфере С02 Учет результатов производили через 3-е суток по наличию ЦПД Титр вируса оценивали в 1дТЦД50/1 мл по Риду и Менчу Определение интерферона

Для количественного определения интерферона в биологических жидкостях применяли вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана Титрование проводили двумя методами в пробирках с монослоем культуры клеток против 100ТЦД50/мл вируса ВВС и в 50 мл флаконах с культурой под агаровым покрытием (1%-ный агар Дифко, 1%-ная фетальная сыворотка крупного рогатого скота, краситель нейтральрот и стандартный раствор Эрла) За титр интерферона принимали минимальное разведение, при котором на 50% подавляется цитопатическое действие вируса ВС в пробирках или образование негативных колоний под агаровым покрытием Экспериментальная инфекция мышей ВГЛ 1 Экспериментальную инфекцию воспроизводили по методу, описанному С В Алексеенковой (2005)

Для воспроизведения экспериментальной инфекции мышам опытных групп вводили интрацеребрально по 20 мкл соответствующего штамма вируса в титре 5 0-5 5 1д ТЦД50/мл Для этого кожу головы мышей оттягивали к затылку, иглой шприца прокалывали кожу и череп (на глубину скоса иглы) в точке, лежащей на пересечение средней сагиттальной линии и перпендикуляра к ней, проходящего по наружному краю глазниц Животным контрольной группы вводили интрацеребрально по 20 мкл культуральной жидкости не-инфицированной культуры

Зараженных животных ежедневно подвергали клиническому осмотру В течение первых 10 дней после заражения фиксировали изменение массы тела путем взвешивания на весах модели ЕК-205-А (с!=0,1мг) производства ООО «ПетВес» Санкт-Петербург Юзе рассчитывали по Риду и Менчу

2 2 Результаты исследований

Изучение образования интерферона и динамики гуморальных антител у телят после введения культуры Вас. виМИ/в и вирус-вакцины против ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота.

Схема опыта 6 телят разделили на три равные группы Телятам 1 группы подкожно вводили по 3 мл культуры В виЬМв, а через 3 дня этим же телятам прививали ассоциированную вакцину против инфекционного ринотрахеита (штамм «ТК-А») и ПГ-3 Телятам второй группы культуру В эиЬМэ (индуктор интерферона) вводили одновременно с вакцинным вирусом Телятам 3-й группы (положительный контроль) прививали только вакцину

До вакцинации и введения культуры В. эиЬМз у телят определяли к вирусу ИРТ и ПГ-3 иммунный ответ (в РН и РТГА) и интерфе-роновый статус.

Первые 6 дней опыта от телят ежедневно получали пробы крови, в последующем отбор крови проводили на 30 и 75 сут№.

Для определения общего (суммарного) интерферона сыворотку крови прогревали при 60° С в течение 2 часов.

Наличие интерферона оценивали по ингибированию репродукции вируса везикулярного стоматита (ВВС) в культуре клеток МОВК, взятого в титре 190 ТСД60/мл.

1. Иммунный статус телят, использованных в опыте

Вирус № телят

1 2 3 4 5 6

ИРТ КРС 0 16 16 4 0 4

ПГ-3 КРС 256 64 256 256 32 32

ВС 0 0 0 0 0 о I

В таблице показаны результаты РН с вирусами ИРТ и ВС, РТГА с вирусом ПГ-3 крупного рогатого скота (титры антител в показателях, обратных разведению сыворотки).

Из табл. 1 следует, что использованные в опыте телята имели антитела в довольно высоком титре к вирусам ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота. Кроме того, как видно на рис. 2, у телят выявляли спон танный интерферон. Наличие этих ранее приобретенных антител, поводимому, существенно повлияло на конечные результаты опыта, одновременно приблизив их к естественным полевым условиям

Ш|р

П2гр □ 3|р

Рис. 1 . Динамика нейтрализующих антител к вирусу ИРТ в РН

10

s

н

Q1 ф

02 rp

03 rp

сутки

Рис. 2 . Уровень ИФН » крови телят (в среднем по группе)

В предварительном опыте на 2-х телятах было показано, что подкожное введение культуры В. subtilis вызывает образование у телят эндогенного интерферона, в течение последующих 3-х суток срок наблюдения) титр интерферона в крови телят составил 1:16 против 100 ТСО50/мл вируса ВС и снизился на вторые сутт до 1:8.

Известно, что вирусы ИРТ и ПГ-3 являются достаточно активными индукторами интерферона. В нашем опыте прививка телятам 3-й группы ассоциированной вакцины стимулировала у них продукцию этого цитокина на 4-е сутки до титра 3 ¡од2 с последующим снижением к 30 дню. В двух других подопытных группах телят (1 и 2) введение вакцины и культуры В. subtilis приводило к существенному снижению титра интерферона (1,5-2,5 log2) в те же сроки исследования, с последующим повышением его уровня на 3 и 4-е сутки.

Использованные в данном опыте телята имели гуморальные" антитела к вирусам ИРТ и ПГ-3, что было установлено исследованием их сывороток крови в РН и РТГА.

Вакцинация этих телят ассоциированной вакциной привела к снижению через 48 часов титра антител к обоим вирусам. При этом наибольшее снижение уроеня антител отмечали у телят 3 группы. У животных других групп, которым вводили В. subtilis, снижение количества антител было менее выражено, особенно при одновременном введении вакцины и индуктора интерферона. В последующие сроки наблюдения уровень антител к вирусам ИРТ и ПГ-3 восстанавливался и на 3-4 сутки превышал исходные показатели в 4-8 раз.

В настоящее время известно, что интерферониндуцирующая активность свойственна весьма пестрой группе высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений.

11

В ветеринарной практике преимущества индукторов интерферона (ИИ) перед экзогенными интерферонами определяется несколькими факторами При использовании ИИ образуется собственный интерферон (ИФН), который в отличии от рекомбинантных не обладает антигенностью, при однократном введении индуктор обеспечивает длительную продукцию ИФН, тогда как. для достижения подобных концентраций экзогенного ИФН необходимы многократные инъекции, что в большинстве случаев невозможно в условиях животноводческих хозяйств

Использование ИИ снижает риск развития аутоиммунных реакций и оказывает иммуномоделирующее влияние

В наших опытах показано, что В виЫШз (ИИ) как в виде монопрепарата, так и при совместном парентеральном введении с двухвалентной (ассоциированной) вакциной ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота, индуцирует образование ИФН При одновременном введении отмечается выраженный иммуностимулирующий эффект в отношении обоих вирусов, что регистрируется по увеличению в 4-8 раз титра вирусспецифических сывороточных антител

Таким образом, установлено, что эндогенный интерферон, образующийся у телят в ответ на парентеральное введение культуры В эиЬМв влияет на динамику иммунного ответа к вирусам ИРТ и ПГ-3 Более выраженное повышение иммунной реакции отмечено при одновременном введении вакцины ИРТ и ПГ*3 и индуктора интерферона

Циркуляция возбудителей ВД-БС и ИРТ-ИПВ в животноводческих хозяйствах

Массовые заболевания новорожденных телят с симптомами конъюнктивита, поражения верхних и нижних дыхательных путей, гастроэнтеритов представляют наиболее серьезную проблему для животноводческих хозяйств во многих регионах Несмотря на то, что в инфекционном процессе может принимать участие большое число микроорганизмов различной природы, как правило, главная роль принадлежит только нескольким возбудителям Так, в 60-70 годы в период создания крупных откормочных хозяйств массовые вспышки респираторной инфекции телят вызывали вирусы вирусной диареи, парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (Н Н Крюков с соавторами)

По данным Катра и др (2005), при исследовании сборных проб молока в ИФА в поголовье коров 220 стад установлена инфициро-ванность на ИРТ и вирусную диарею 73 и 67 % соответственно Авторы считают, что оздоровление неблагополучных стад от ИРТ и ВД достигается заменой скомпрометированных животных здоровыми Использование ИФА для исследования сборных проб молока, позво-

12

ляет существенно снизить затраты на проведение оздоровительных мероприятий В Нижней Саксонии для выявления животных, инфицированных вирусом диареи, применяли ПЦР в режиме реального времени и ИФА В Великобритании, как считает Ра1е1 (2005), наиболее эффективным методом борьбы с ИРТ является интраназальная и/или парентеральная иммунизация вирус-вакцинами

Нами проведены клинические и лабораторные исследования материала от больных и переболевших животных в хозяйстве, неблагополучном по массовым респираторным болезням телят

Специфические антитела к вирусам ИРТ и ВД-БС выявляли в ИФА и реакции нейтрализации в культурах клеток МЭВК и СТ Ви-русовыделение проводили в культурах клеток 1\/ЮВК и СТ

Установлено, что во многих случаях характер течения и симптоматика массовых болезней новорожденных телят не позволяют достоверно дифференцировать этиологическую принадлежность При этом исходили из того, что на клиническое проявление инфекции влияют такие факторы, как длительная персистенция возбудителей в организме инфицированных животных, выраженная имму-носупрессия вирусов Последняя особенно присуща вирусу ВД-БС, который передается во время беременности от матери плоду, инфицирует эмбрион и провоцирует формирование иммунотолерант-ности у новорожденного теленка, на фоне которой течение и симптоматика болезни могут существенно меняться

В этом случае вполне оправдано использование в комплексе лечебных и профилактических мероприятий индукторов интерферона В связи с указанным нами был поставлен 2 опыт на телятах

В табл 2 приведен протокол исследования проб сыворотки крови от 2-3-месячных телят методом ИФА

2 Выявление антител к вирусам ИРТ и ВД у телят в хозяйстве неблагополучном по респираторным болезням

№ животного Результат ИФА

Титр антител к вирусу ИРТ Титр антител к вирусу вд

1 2 3

1 3200-6400 1600-3200

2 3200-6400 1600-3200

3 12800-25600 6400

4 6400 1600-3200

5 3200-6400 1600

6 6400 3200

7 6400-12800 3200

8 12800 3200

9 3200 1600

10 12800 6400-12800

1 2 3

11 . 12300 6400-12800

12 12600 6400-12800

13 12800 6400-12800

14 12800-25600 12800

15 >25600 6400-12800

16 12800 6400-12800

17 12800 12800

18 12800 12800-25600

19 12800 12800

20 >25600 25600

21 >25600 25600

, ■ , 22 >25600 25600

23 >25600 >25600

24 >25600 >25600

25 >25600 >25600

26 25600 >25600

27 >25600 25600

28 >25600 >25600

29 >25600 >25600

30 >25600 >25600

Из представленных данных следует, что вирусы диареи и ИРТ имеют широкое распространение в неблагополучном по респираторным болезням тепят хозяйстве

35 30 25 20 15 10

-Л

_ I

V ■

3

сутки

14

-г И;

\

30

□ 1 гр

□ 2 гр 03 гр

Рис, 3 . Изучение образования интерферона и динамики гуморальных антител у телят при введении культуры В. зиЫШэ и вирус-вакцины против ВД-ВС крупного рогатого скота (в РН)

сутки

Рис. 4 Титр интерферона в крови телят при введении культуры В. subtilis и вирус-вакцины против ВД-БС (в БОЕ)

1 группа - 2 телятам - 1 мл вакц. в/м;

2 группа - 3 телятам - 1 мл вакц в/м и per os Вас. subtilis 10 мл (5 млрд м.к./мл);

3 группа - 3 телятам - 1 мл вакц. в/м и п/к Вас. subtilis 3 мл.

Из представленных данных следует, что совместное введение культуры Вас. subtilis и вакцины против ВД-БС существенно повышает индукцию интерферона и образование специфических антител. Этот эффект более выражен при внутримышечном введении Вас. subtilis.

Как указывалось выше, использованные в наших опытах телята, как правило, имели вирусспецифические антитела. В связи с этим были проведены опыты на линейных серонегативных мышах. В качестве модельного вируса был взят герпес-вирус лошадей 1 (адаптированный штамм «ПП 1/1», вирулентный для мышей, полученный C.B. Апексеенковой).

дни наблюдения

Рис. 5 . Изменение массы тела у мышей, после и/ц заражения вирусом РГТЛ в группе, обработанной В.зиЬгШз, и в контроле (п=27>

1 группе - 13 мышам ввел п/к среду Игла Мем 0,2 мл и через сутки и/ц вирус РПЛ по 0,02 мл,

2 группе - 14 мышам ввел п/к Вас виЬМэ 0,2 мл и через сутки и/ц вирус РПЛ по 0,02 мл (после и/ц заражения выжили 7 мышей из 14 обработанных Вас БиЬйЬэ)

дни наблюдения

Рис 6 Заболеваемость мышей (снижение массы тела) после и/ц заражения вирусом РЛЛ (по 0,002 х 5,0 log TCDso/mi) в зависимости от времени введения В subtilis (п=25)

Контрольное заражение и/ц вирусом РПЛ в дозе 0,025 мл

1 группа - 6 мышей, через 24 часа после заражения ввели Вас subtilis в дозе 0,2 мл,

2 группа - 6 мышей, через 48 часов после заражения ввели Вас subtilis в дозе 0,2 мл,

3 группа - 6 мышей, через 72 часа после заражения ввели Вас subtilis в дозе 0,2 мл,

4 группа - 7 мышей - контроль вируса

(после и/ц заражения из 6 мышей 1-й группы, обработанных Вас subtilis через 24 часа после заражения, выжили 4, остальные мыши пали)

На рисунках № 7, 8, 9, 10 представлены результаты экспериментов проведенных по схеме

1 группа - 13 мышам п/к ввели Вас subtilis по 0,2 мл, через 72 часа вакцинный штамм ВГЛ-1 <<СВ/69» по 0,2 мл, через 48 часов и 72 часа отбирали селезенку и легкие,

2 группа - 13 мышам п/к ввели Вас виЬШэ по 0,2 мл и одновременно п/к вакцинный штамм ВГЛ-1 «СВ/69» по 0,2 мл; через 48 часов и 72 часа отбирали селезенку и легкие;

3 группа - 12 мышам п/к ввели вакцинный штамм ВГГМ «СВ/69» по 0,2 мл, через 72 часа п/к Вас. ёиЫШэ по 0,2 мл; через 48 часов и 72 часа отбирали селезенку и легкие;

4 группа - 12 ¡мышам ввели вакцинный штамм ВГЛ-1 -«СВ/69» п/к по 0,2 мл (контроль); через 48 часов и 72 часа отбирали селезенку и легкие

Рис. 7 . Определение ИЛ-6 в селезенке мышей после введения им Вас. виЬННв и вакцинного штамма ВГЛ-1 «СВ/69» (разведение 1;400)

группы

Рис, 8 . Определение ИЛ-6 в легких мышей после введения им Вас. йиМШэ и вакцинного штамма ВГЛ-1 «СВ /69» {разведение 1:200)

12 3 4

группы

Рис. 9. Определение ИЯ-10 в селезенке мышей после введения им Ззс. эиЫШэ и вакцинного штамма ВГЛ-1 «СВ/69» (разведение 1:800}

12 3 4

группы

Рис. 10. Определение ИЛ-10 в легких мышей после введения им Бас. и вакцинного штамма ВГЛ-1 «СВ/69» (разведение 1:100)

Таким образом, установлено существенное увеличение количества ИЛ-б в селезенке мышей. В легких секреция ИЛ-б, который является важным фактором трансформации В-лимфоцитов в антите-лообразующие клетки, выражено в меньшей степени.

3. ВЫВОДЫ

1, Культура Вас.зиЬШй (препарат « С ахабактису бтил») при парентеральном, а также пероральном применении, индуцирует у телят- секреции сывороточного а/р-интерферона и повышает иммун-

ный гуморальный ответ на прививку вакцинных штаммов вирусов ИРТ, ВД - БС, ПГ-3 крупного рогатого скота

2 В результате введения мышам линии Balb/c культуры Вас subtilis (ИИ) у них создается невосприимчивость к контрольному интрацеребральному заражению вирусом ВГЛ-1 Максимальный протективный эффект достигается при одновременном или с интервалом 24 часа введении вируса и индуктора интерферона

3 В органах мышей после инъекции Вас subtilis обнаруживаются интерлейкины 6 и 10, играющие существенную роль в патогенезе герпесвирусной инфекции Интерлейкин-6 в наибольшем количестве обнаруживается в селезенке мышей через 48 часов (срок наблюдения) и существенно снижается через 72 часа

4 Динамика и уровень секреции интерферона зависят от очередности введения индуктора интерферона (Вас subtilis) и вакцинного вируса, а также остаточного уровня гуморальных антител и спонтанного интерферона Оптимальным является одновременное или с интервалом в 24 часа введение вакцины и культуры Вас sub-tilis, последовательная прививка вакцины и Вас subtilis с интервалом более 24 часов приводит к существенному снижению секреции интерферона и специфических антител

5 Лабораторная модель (мыши линии Balb/c), разработанная для оценки поствакцинального иммунитета к вирусу ринопневмонии лошадей, может быть использована также в качестве тест-системы для оценки активности индуктора интерферона

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны (в соавторстве) «Системы ветеринарно-санитар-ных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации», утвержденные 17 мая 2006 г заместителем директора Департамента отраслевого развития МСХ В А Апалькиным

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Осмаев И А Этиология, диагностика и профилактика массовых респираторных болезней телят / Юров К П , Шуляк А Ф , Алексеенкова С В , Юров Г К , Ткачев И Ю , Осмаев И А // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» - М , 2006 - С 128,

2 Осмаев И А Иммуномоделирующие свойства эндогенного интерферона у телят / Осмаев И А , Юров К П , Неустроев МП// Ветеринария 2007 - № 1 -С 11-12

Сдано в производство 28 04 2007 г Ризограф Тираж 100 Заказ 148

Издательско-полиграфический отдел ФГОУ ВПО МГАВМиБ им К И Скрябина

109472, Москва, ул Академика Скрябина, 23

Успешная реализация программы развития животноводствастраны требует ветеринарного обеспечения в плане защитыживотных от массовых инфекционных болезней. Наибольшийудельный вес в инфекционной патологии молоднякасельскохозяйственных животных приходится на болезни органовдыхания и пищеварения вирусной этиологии: инфекционныйринотрахеит, парагрипп-3, вирусная диарея - болезнь слизистых идр. Часто эти заболевания протекают как вирусно-бактериальныесмешанные инфекции с участием пастерелл, микоплазм,диплококков и других микроорганизмов.Эффективная борьба с названными болезнями возможна приусловии сочетания мер, обеспечивающих выращивание здоровогопотомства с достаточно высокой резистентностью организма инапряженной иммунной защитой против основных возбудителеймассовых заболеваний.Многочисленные неблагоприятные факторы внешней среды,включающие загазованность животноводческих помещений,высокое содержание условно-патогенной микрофлоры, нарушениетемнературного режима и др. снижают резистентность организма внервую очередь молодых животных и затрудняют применениесредств специфической нрофилактики. В этом случае необходимоизыскивать альтернативные методы повышения устойчивостиживотных к инфекции, коррекции иммунной системы путемвключения в арсенал защитных средств иммуномодуляторов ипробиотиков.Актуальность темы.Одним из значимых событий 20 века является открытиеинтерферона Isaacs А,, Lindeman J., 1957. В настоящее времяустановлен широкий спектр биологической активностиинтерфероновых белков, которые наряду с другими цитокинамиобладают многочисленными свойствами, включая антивирусноедействие, регулирование взаимодействия главных интегративныхсистем организма - нервной, иммунной, эндокринной.Система интерферона не имеет специализированных клетокили органов, она существует в каждой клетке. Каждая клетка вслучае вирусной инфекции должна быть защищена от заражениявирусом (Ф.И.Ершов, 1982; М. Gale et al., 1996; S.V.Kotenko et al.,2000).Различают три основных типа интерферонов: альфа - а, бета- Р и гамма - у, которые в свою очередь разделяют наинтерфероны 1 и 2 типов.Создание генно - инженерных интерферонов позволило, вчастности, выяснить ответственность каждого белка за тот илидругой защитный эффект. Так, у - интерферон являетсяактиватором макрофагов и усиливает их противоопухолевуюактивность, подавляет репликацию вирусов. При вируснойинфекции у - интерферон (ИФН-у) вызывает измененияповерхности клеточной мембраны, при этом защищает клетки отпроникновения вируса, нарушает внутриклеточный синтез вирусоввследствие усиления образования ферментаолигоаденилатсинтетазы и т.д. (В.В. Рафальский, 1997).Благодаря рекомбинантной технологии в медицинскуюнрактику вошли чистые препараты интерферонов, обладающиешироким спектром действия у человека. Не меньшее значениефеномен интерференции имеет и в ветеринарии. Однако,вследствие ряда объективных нричин, во многих случаяхиспользование нренаратов чистых интерферонов для животныхэкономически мало онравдано или неэффективно, несмотря на всеих положительные свойства в отношении антивирусного,антибактериального, противоопухолевого действия илигармонизации гомеостаза, в том числе иммуногенеза.Перспективным направлением в ветеринарии, по нашему мнению,является изыскание активных индукторов эндогенногоинтерферона. В первую очередь активных природных индукторов защитных белков клетки. Суммарный эффект защитного действияа - Р или Y - интерферонов в организме, как результат примененияудачно подобранного индуктора, может быть использован вкомплексе профилактических и лечебных мероприятий привирусных инфекциях сельскохозяйственных животных.Результативность этого метода во многом зависит отбиологических характеристик индуктора эндогенного интерферона(Ф.И. Ершов, О.И. Киселев, 2005).Следовательно, разработка новых индукторов интерферонаявляется актуальной задачей.Весьма перспективным направлением, по нашему мнению, вплане изыскания возможных естественных индукторовинтерферона и иммуномодуляторов является большая группахорошо изученных микроорганизмов с весьма полезнымисвойствами- пробиотиков (Т.И. Грязнева, 2005).Накопленный большой объем научной информациисвидетельствует, что пробиотики относятся к числувысокоэффективных лечебно-профилактических средств (В.А. Аптипов, 1991; В.Н. Бабин, 1994; В.М. Бондаренко, 1997; Н.И. Малик, 2001; А.С. Панин, 1993; Б.А. Шендеров, 1997; B.R. Goldin,1992; J.I. Gordon, 1997;)Эффективность этих ирепаратов оказалась во многих случаяхнастолько высокой, что ряд исследователей пришли к заключениюо наступлении «эры пробиотиков».Весьма важным обстоятельством является наличие убактерий, обладающих пробиотическими свойствами, не толькоантагонистической активности по отношению к патогенным иусловно-патогенным микроорганизмам, но и ряда других полезныхсвойств таких как, иммуномодулирующих, антиаллергических идр. (Р.С. Будагов, 1996; Л.Г. Войчишина, 1991; А.А. Воробьев,1997; Т.Д. Павлюк, 1995; А.Л. Позняк, 1997; В.И. Никитенко,1990; А.Н. Петров, 2001).Новым направлением в конструировании исовершенствовании пробиотиков является включение в числоосновных претендентов бактерий рода Bacillus (В.В. Смирнов,2002; В.В. Смирнов, 1993; И.Б. Сорокулова, 1996; И.Б. Сорокулова, 1997; М.А. McTigue, 1995; A.L. Mendonca, 1996; М.Muscettola, 1991; М. Muscettola, 1992).Эти микроорганизмы широко распространены в природе,являются устойчивыми к литическим и пищеварительнымферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочнокишечном тракте животных (В.И. Никитенко, 2000; С Р . Резник,1981; С Р . Резник, 1985; С Р . Резник, 1991; J.E. Pennington, 1976;R. Тапака, 1983).Цель и задачи исследования.Указанное определило цель нашего исследования: изыскатьдоступный природный индуктор интерферона и изучить еговлияние на формирование защитных реакций организма принекоторых вирусных инфекциях животных.Задачи исследования.1. Определить возможность использования Вас. subtilis вкачестве индуктора интерферона и отработать методикуопределения интерферона, используя в качестве тест системы культуру клеток и чувствительный к интерферонувирус ВС.

2. Провести экспериментальные исследования поопределению образования интерферона 1 типа игуморальных антител у телят после прививки им вирусадиареи - болезни слизистых.3. Определить образование гуморального иммунитета и а/ринтерферона в результате прививки им вирусов ПГ-3 иИРТ.

4. Изучить на лабораторной модели - мышах линии BALB/cвозможность индуцирования устойчивости к ВГЛ-1;синтез интерферона 1 типа и некоторых интерлейкиноввследствие инокуляции культуры Вас, subtilis.Научная ноеизиа исследоеаиий.Выяснены особенности секреции интерферонов 1 типа у телятпосле введения им культуры Вас. subtilis и вакцинных штаммоввирусов: ИРТ-ИПВ, ПГ-3 и ВД-БС крупного рогатого скота.Установлено, что индукция интерферона зависит от очередности ивремени введения вакцин и индуктора интерферона. Показано, чтоиммунный фон и присутствие спонтанного интерферона у телятсущественно влияют на секрецию цитокинов, В опытах налабораторной модели - мышах линии BALB/c впервые установленавозможность защиты от экспериментальной летальной инфекциивирусом герпеса лошадей — 1, путем индукции у них эндогенногоинтерферона. Впервые получены данные, характеризующиесекрецию интерлейкинов 6 и 10 в ответ на введение Вас. subtilis иВГЛ-1.Практическая значимость работы.Проведенными исследованиями показана перспективностьприменения культуры Вас. subtilis - препарата «Сахабактисубтил»в системе лечебных и профилактических мероприятий противреспираторных инфекций телят. Применение этого препаратапозволяет повысить иммунный статус животных и обеспечитьзащиту от инфекции вследствие образования эндогенногоинтерферона, который является важным фактором защитымолодого организма с недостаточно сформированной иммуннойсистемой от вирусной инфекции.Полученные результаты использованы при разработке«Системы ветеринарно - санитарных, профилактических илечебных мероприятий против инфекционных болезней крупногорогатого скота в хозяйствах Российской Федерации»,утвержденной 17 мая 2006 года заместителем директораДепартамента отраслевого развития МСХ В.А. Апалькиным.Апробация работы.Материалы работы были представлены на международнойнаучно - практической конференции «Актуальные проблемыинфекционной патологии и иммунологии животных» посвященной100 - летию со дня рождения Заслуженного деятеля наук РСФСР,доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХПИЛ10Якова Романовича Коваленко (Москва, 2006 г.). Основныеположения, выводы и практические предложения, изложенные вдиссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научнопроизводственном совещании научных сотрудников ГНУ«Всероссийского научно - исследовательского институтаэкспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (Москва,2007 г.).Публикации.По материалам диссертационной работы опубликовано 2научные работы.Объем и структура диссертаиии.Материалы диссертации изложены на 117 страницахмашинописного текста и состоят из следующих разделов:введение, обзор литературы, собственные исследования,обсуждение, выводы, практические предложения, списоклитературы и приложения. Список литературы содержит 197источников, из них 62 - зарубежных авторов. Диссертацияиллюстрирована 10 таблицами, 17 рисунками.

1. Культура Вас. subtilis (препарат «Сахабактисубтил») при

парентеральпом, а также пероральном применении индуцирует у

телят секрецию сывороточного а/р интерферона и повышает

иммунный гуморальный ответ на прививку вакцинных штаммов

вирусов ИРТ, ВД - БС, ПГ - 3 крупного рогатого скота. 2. В результате введения мышам линии BALB/c культуры Вас. subtilis (ИИ) у них создается невосприимчивость к контрольному

интрацеребральному заражению вирусом ВГЛ-1, Максимальный

протективный эффект достигается при одновременном или с

интервалом 24 часа введении вируса и индуктора интерферона. 3. В органах мышей после инъекции Вас. subtilis

обнаруживаются интерлейкины 6 и 10, играющие существенную

роль в патогенезе герпесвирусной инфекции. Интерлейкин - 6 в

наибольшем количестве обнаруживается в селезенке мышей через

48 часов (срок наблюдения) и существенно снижается через 72

4. Динамика и уровень секреции интерферона зависят от

очередности введения индуктора интерферона (Вас. subtilis) и

вакцинного вируса, а также остаточного уровня гуморальных

антител и спонтанного интерферона. Оптимальным является

одновременная или с интервалом в 24 часа введение вакцины и

культуры Вас. subtilis, последовательная прививка вакцины и Вас. subtilis с интервалом более 24 часов приводит к существенному

снижению секреции интерферона и специфических антител. 5. Лабораторная модель, мыши линии Balb/c, разработанная для

оценки поствакцинального иммунитета к вирусу ринопневмонии

лошадей, может быть использована также в качестве тест-системы

для оценки активности индуктора интерферона.VI. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕИИЯ

Разработаны (в соавторстве) «Системы ветеринарно - санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против

инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах

Российской Федерации», утвержденные 17 мая 2006 года

заместителем директора Департамента отраслевого развития МСХ

В.А. Апалькиным.