Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунологическая и морфологическая характеристика поствакцинального иммуногенеза при инфекционном эпидидимите баранов

На правах рукописи

7

НЕСТРЕЛЯЕВ Степан Сергеевич

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНОГЕНЕЗА ПРИ ИНФЕКЦИОННОМ ЭПИДИДИМИТЕ БАРАНОВ

Специальность - 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Специальность - 16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

- 1 ОКТ 2009

Москва-2009

003478442

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р.Коваленко» (ГНУ «ВИЭВ») (г. Москва)

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук АЛЬБЕРТЯН Мкртич Погосович (ВИЭВ)

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор ШУМИЛОВ Константин Васильевич (ФГУВГНКИ)

доктор ветеринарных наук, профессор БРАТИН Геннадий Иванович (МГУПБ)

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская Государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина (ФГОУ ВПО МГАВМиБ).

Защита состоится _2009 г. в ^ часов на заседании

диссертационного совета Д 212.149.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (МГУПБ) по адресу 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Автореферат разослан « » ^¿^У2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук, профессор

И Г. Серегин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуальность темы. В настоящее время немаловажной проблемой инфекционной патологии овец являются заболевания, вызываемые бруцеллами - инфекционный эпидидимит баранов (ИЭБ) и бруцеллез мелкого рогатого скота.

Многолетняя борьба с ИЭБ путем проведения только лишь общих организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий оказалась недостаточно эффективной. Внедрение средств специфической профилактики в комплекс противоэпизоотических мероприятий, позволило значительно повысить их эффективность (В И. Ким, 1978; Б H Афанасьев, 1980, АН Касьянов, В А. Ромахов, 1980, В Аманжолов, 1981; M Afsal, C.V. Kiniberlmg, 1986; А.Ф. Руденко, 1987, ГШ Абулхаиров, В А Ромахов, 1991) Поэтому многие исследователи за рубежом и в нашей стране занимаются изысканием более эффективных противобруцеллезных вакцин.

В ВИЭВ в лабораторных условиях в 80-х годах была разработана инактивированная адъювант-вакцина против инфекционного эпидидимита баранов из штамма 64/2 В ovis В дальнейшем, в результате многократных пересевов на питательные среды в культуре штамма В ovis стало наблюдаться явление реверсии бруцелл, из-за чего вакцина приобрела новые, нехарактерные для нее свойства и перестала отвечать первоначальным требованиям. В связи с этим было решено заменить штамм 64/2 В ovis более стабильным. Для этих целей было предложено использовать полевой штамм 10/2 В ovis.

Соответственно стала актуальной задача изучения основных биологических свойств экспериментальной инактивированной адъювант-вакцины из штамма 10/2 В ovis в сравнительном аспекте с инактивированной адъювант-вакциной из штамма 64/2 В ovis и живой вакциной из штамма Rev-1 В melitensis.

Не менее важной является задача изучения патологии мочевыделительной системы, развивающейся при хроническом течении инфекционного эпидидимита баранов.

1.2.Цепь и задачи исследования.

Цель работы - иммунологическая и морфологическая характеристика поствакцинального иммуногенеза при инфекционном эпидидимите баранов

В число поставленных задач входили.

- изучение основных биологических свойств штамма 10/2 В ovis;

- сравнительное изучение антигенных, вирулентных, иммуногенных и

других свойств экспериментальной вакцины из штамма 10/2 Bovis, вакцины из штамма 64/2 В ovis и вакцины из штамма Rev-1 B.mehtensis;

- сравнительное изучение патоморфологических изменений в органах и

тканях животных при иммунизации вакцинами из штаммов 10/2 B.ovis, 64/2 В ovis и Rev-1 В melitensis;

- изучение патоморфологических изменений в органах и тканях у баранов

при естественном течении ИЭ,

- анализ особенностей проявления эпизоотического процесса при инфекционном эпидидимите баранов в разных регионах Российской Федерации в течение 1976-2008 гг

1.3.Научная новизна исследований. Сконструирована адъювант-вакцина из штамма 10/2 В ovis против инфекционного эпидидимита баранов. Показана безвредность, умеренная реактогенность, антигенность и высокая иммуногенность экспериментальной серии препарата на белых мышах, морских свинках, кроликах и баранах.

Дана сравнительная оценка поствакцинального иммуногенеза у морских свинок и баранов, после однократной иммунизации экспериментальной вакциной из штамма 10/2 B.ovis, вакциной из штамма 64/2 Bovis и живой вакциной из штамма Rev-1 В melitensis

Показан полиморфизм патологических изменений у баранов при естественном течении инфекционного эпидидимита

По данным за 1976-2008 гг. впервые охарактеризованы динамика, закономерности и региональные особенности проявления эпизоотического процесса инфекционного эпидидимита баранов в Российской Федерации.

1.4.Пюактическая значимость исследований. Предложена новая адъювант-вакцина из штамма 10/2 B.ovis против инфекционного эпидидимита баранов.

Проведен анализ эпизоотических данных по инфекционному эпидидимшу баранов в целом по России за 1976-2008 гг. и создана соответствующая электронная база данных. Результаты эпизоотического анализа могут быть использованы для совершенствования противоэпизоотических мероприятий при ИЭБ.

Изучены патоморфологические изменения в мочеполовой системе при хроническом течении инфекционного эпидидимита баранов.

1.5Личный вклад соискателя заключается в проведении серологических, бактериологических, иммунологических и

патоморфологических исследований на белых мышах, морских свинках, кроликах и баранах, а также в создании электронной базы данных по эпизоотическому состоянию и анализе эпизоотических данных по инфекционному эпидидимшу баранов в Российской Федерации. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к в н О.В.Якушевой, членом-корреспондентом РАСХН, д.б.н., проф. Ю Н.Федоровым, к в н. М И.Искандаровым, за что автор выражает им сердечную благодарность

1.6.Апробаиия работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межлабораторных совещаниях сотрудников ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко в 2008 и 2009 гг. и на Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел» (Москва, 2009)

1.7.Публикаиия научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 в журналах,

рекомендованных ВАК Минобразования РФ («ВЕТКОРМ», «Ветеринарная патология»)

1.8.0счовные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения основных биологических свойств штамма 10/2

В омэ,

- результаты сравнительного изучения основных антигенных,

вирулентных, реактогенных, иммуногенных и других свойств экспериментальной вакцины из штамма 10/2 В 0У1Э, вакцины из штамма 64/2 В оу1б и вакцины из штамма Яеу-1 В теМегшБ,

- результаты сравнительного изучения патоморфологических изменений в

органах и тканях животных при иммунизации вакцинами из штаммов 10/2 В ОУ13, 64/2 В ОУ1Б И 11еу-1 В теШепэ^;

- патоморфологические изменения в органах и тканях у баранов при

естественном течении ИЭ,

- результаты анализа особенностей проявления эпизоотического процесса

при инфекционном эпидидимите баранов в различных зонах Российской Федерации в течение 1976-2008 гт

1.9.Стууктуоа и объем диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 290 источников, в том числе 110 источников иностранных авторов Работа иллюстрирована 62 фотографиями, 8 таблицами и 23 рисунками 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в секторе хронических инфекций и секторе патоморфологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского инсппуга экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ на острове «Лисий» Тверской области в соответствии с утвержденными планами научно-исследовательских работ по заданию 02.01.01 Российской научно-технической программы фундаментальных и прикладных исследований

2.1. Материалы и методы

Для анализа эпизоотической ситуации по инфекционному эпидидимиту баранов в Российской Федерации были собраны отчетные данные архива ФГУ «Центр ветеринарии» за 1976-2008 гт В качестве источников информации использовали:

- материалы ветеринарной отчетности Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ - «Отчет о заразных болезнях животных» (форма 1-вет),

- материалы ветеринарной отчетности Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ - «Отчет о противоэпизоотических мероприятиях» (форма 1-вет-А);

- материалы ветеринарной отчетности Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории РФ - «Отчет о работе ветеринарных лабораторий» (форма 4-вет)

Сравнительное изучение антигенных, вирулентных, иммуногенных, реактогенных и других свойств экспериментальной вакцины из штамма 10/2 В.о^б, вакцины из штамма 64/2 В.оухз и Яеу-1 В теШегшз проводили на морских свинках (весом 300-350 г) и баранах, в возрасте 18 мес, из хозяйства, благополучного по бруцеллезу и инфекционному эпидидимиту баранов

Безвредность и антигенную активность экспериментальной вакцины из штамма 10/2 В.омз проверяли на морских свинках (весом 300-350 г), белых мышах (весом 18-20 г) и кроликах (весом 2-2,5 кг). Всего было использовано 47 белых мышей, 127 морских свинок, 14 кроликов и 76 баранов.

Изучение основных биологических свойств вакцин из штаммов штамма 10/2,64/2 В.ога и И.еу-1 В.те^егшз проводилось общепринятыми методами: по потребности культур в СОг, выделение НгЗ, бактериостатическое действие красок (тионин, основной фуксин), а также степень диссоциации культур в реакции термоагглютинации, реакции с трипафлавином 1 500 и методом окраски колоний бруцелл кристаллвиолетом 1:2000 по Уайт-Вильсону. В качестве контроля использовался стабильный штамм 16 М В те^егшз

С целью серологической идентификации штаммов (проверка на наличие агглютинирующих антител) использовали двухсуточные агаровые культуры исследуемых штаммов и диагностические агглютинирующие Б- и Я-сыворотки.

Для изучения иммуногенных свойств экспериментальной микросерии вакцины из штамма 10/2 В.оухб в сравнении с аналогичными свойствами вакцин из штаммов 64/2 В.оте и 11еу-1 В теШешйз привитых данными препаратами животных заразили вирулентным штаммом бруцелл и через 45 дней провели убой, патологоанатомическое вскрытие и бактериологическое исследование биоматериала от них. Сыворотку крови животных исследовали в динамике в РБП с цветным бруцеллезным антигеном, в РА и РСК с единым бруцеллезным антигеном, в РДСК с антигеном из В. о^э, а также в РИД. Постановку и учет серологических реакций проводили в соответствии с требованиями «Наставления по диагностике бруцеллеза животных», утвержденного Департаментом ветеринарии МСХ РФ от 29.09 2003 г., «Наставления по диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой Бруцелла овис (инфекционный эпидидимит баранов)» ГУВсГВИ МСХ и П СССР от 13.11.1991 г., а также «Методов лабораторных исследований по бруцеллезу» ФАО и ВОЗ 1968 г. Количественное определение содержания 1§М, и 1£А в испытуемых сыворотках крови баранов проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.

Бактериологическое исследование биоматериала от морских свинок и баранов проводили путем высева материала из паренхиматозных органов, лимфатических узлов и семенников с придатками на МППГТБ и МППГТА с добавлением 10% сыворотки крови. Окончательный учет бактериологического исследования проводили на 30-й день

Для изучения поствакцинальных морфологических изменений, а так же динамики плазмоцитарной реакции в тканях и органах у баранов в отдаленные сроки после иммунизации и при естественном течении ИЭБ, проводили отбор проб лимфатических узлов (подчелюстные, предлопаточные, парааортальные,

средостенные, печеночные, брыжеечные, поверхностные паховые, медиальные подвздошные), паренхиматозных органов (легкие, сердце, печень, почки, селезенка) и семенников с придатками Биоматериал для гистологического исследования фиксировали нейтральным 10%-ным раствором формалина и в жидкости Карнуа. Парафиновые и целлоидиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, по Маллори в модификации Слинченко, по Тенцеру, по Браше и исследовали в световом микроскопе.

Для изучения патоморфологических изменений, наблюдаемых у баранов при естественном течении ИЭ, и сопоставления их с поствакцинальными изменениями, в хозяйствах Астраханской области, в результате осмотра 1231 барана, было отобрано 7 баранов с клиническими признаками эпидидимита Диагноз подтверждали исследованием сыворотки крови от данных баранов в РДСК с антигеном из B.ovis.

Для обработки полученных цифровых данных и создания электронной базы данных по эпизоотическим показателям инфекционного эпидидимита баранов использовалась программа Microsoft Office Excel 2007 Для улучшения визуализации и проверки достоверности динамики показателей, на графики была добавлена полиномиальная линия тренда со степенью б, а также величина достоверности аппроксимации (R2)

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Анализ эпизоотической ситуации по Инфекционному эпидидимиту баранов в Российской Федерации за 1976-2008 гг. Графический и статистико-математический анализ динамики таких показателей как количество имеющихся на начало года неблагополучных пунктов; количество выявленных за год неблагополучных пунктов, количество оставшихся неблагополучных пунктов на конец года, количество оздоровленных за год неблагополучных пунктов; общее поголовье мелкого рогатого скота на территории РФ; численность выявленных за год больных животных (таб.1); численность животных, первично исследованных на ИЭБ, численность животных, повторно исследованных на ИЭБ, численность животных, положительно реагирующих при первичном исследовании; показатель заболеваемости на 100000 гол., коэффициент очаговости, как в целом по России, так и по отдельным ее субъектам, а также исследование корреляционной зависимости между ними позволили нам выявить следующие закономерности.

В период с 1976 г. по 2008 г. инфекционный эпидидимит отмечался в 50 субъектах Российской Федерации

В 1976 году инфекционный эпидидимит баранов был зарегистрирован в 30 субъектах РСФСР, формируя 2 неблагополучные зоны, 1-я, включающая Центрально-Европейскую и всю южную территорию РСФСР, и 2-я, включающая южную часть Сибири ИЭБ отмечался в зоне протяженностью от 27° до 122° восточной долготы и южнее 60° северной широты. В 2008 году инфекционный эпидидимит баранов был зарегистрирован в 10 субъектах РФ, формируя 4 неблагополучные зоны - Забайкальскую, Алтайскую, Европейскую и Прикавказскую.

Талица 1. - Основные показатели эпизоотического процесса при ИЭБ

Годы Заболело, гол Неблагополучные пункты Поголовье, млн гол

Наличие на 1 января Выявлено за год Оздоровлено за год Наличие на конец года

1976 7970 201 160 182 179 66,109

1977 5359 179 76 98 157 65,361

1978 6135 157 83 87 153 66,701

1979 6939 153 46 64 135 67,461

1980 3621 135 52 69 118 66,869

1981 4610 118 33 40 111 64,973

1982 4220 111 35 48 98 64,534

1983 4192 98 49 51 96 64,883

1984 5613 96 67 65 98 66,263

1985 3883 98 65 72 91 64,5

1986 4785 91 53 47 97 63,4

1987 4207 97 52 62 87 64,1

1988 3845 87 49 49 87 62,9

1989 3204 87 45 63 69 62,7

1990 2971 69 36 53 52 61,3

1991 1733 52 22 20 54 58,2

1992 1539 54 31 20 65 55,3

1993 1657 65 37 37 65 51,4

1994 1203 65 14 23 56 43,7

1995 1319 56 30 42 44 34,5

1996 901 44 10 17 37 28

1997 707 37 15 23 29 23,8

1998 1071 29 16 23 22 18,8

1999 867 22 28 33 17 16

2000 668 17 12 13 16 14,7

2001 502 16 31 32 15 14,8

2002 766 15 35 26 24 15,3

2003 782 24 32 42 14 16

2004 445 14 42 47 9 16,9

2005 403 9 28 29 8 17

2006 365 8 25 25 8 17,3

2007 558 8 41 35 14 18,97

2008 240 14 23 16 21 20,249

Первое место по количеству заболевших животных в настоящее время занимает Европейская зона (42,1%), а по количеству выявляемых неблагополучных пунктов - Забайкальская зона (56,5%).

2.2.2. Изучение основных биологических свойств штамма 10/2 В-отоя Изучение основных биологических свойств штамма 10/2 В оую проводили в сравнении со штаммами 64/2 В оуиз и 11еу-1 В.те1ие1Ш5

В результате видовой идентификации используемых штаммов было выявлено, что все они находятся в различной степени диссоциации (таб. 2)

Таблица 2 - Характеристика основных биологических свойств штаммов 10/2 и _64/2 В 0У1$ и вакцинного штамма 11еу-1 В теШегшз_

Показатели 10/2 В ovis 64/2 В ovis Rev-1 В mehtensis

Потребность в СОг + + -

Образование H2S - - +

Рост на среде с тионином + + -

с основным фуксином - - +

Термоагглютанация + + -

Реакция с трипафлавином + ± -

Окраска кристаллвиолетом по Уайт-Вильсону колонии R-формы 97% 48% 2%

колонии S-формы - 6% 95%

колонии RS-SR-формы 3% 46% 3%

РА с S-сывороткой - + +

с R-сывороткой + + -

Штамм 10/2 B.ovis по основным биологическим свойствам является типичным для бруцелл вида Ovis, и отличается от штамма 64/2 B.ovis (48% Ii-форм бруцелл) более стабильным состоянием в отношении реверсии бруцелл (97% R-форм бруцелл)

2.23. Сравнительное изучение антигенных, реактогенных, иммуногенных и вирулентных свойств экспериментальной микросерии вакцины из штамма 10/2 B.ovis на морских свинках

Изучение иммуногенных свойств вакцины проводили на морских свинках весом 300-350 г, предварительно исследованных на бруцеллез в РБП с цветным бруцеллезным антигеном, в РА и РСК с единым бруцеллезным антигеном, и на инфекционный эпидидимит - в РДСК с антигеном из B.ovis. Все животные показали отрицательные результаты.

Для определения безвредности смесь опытной серии вакцины в равных количествах из 5 флаконов ввели 47 самцам белых мышей по 0,4 мл (8 млрд м.к.) подкожно в область спины, и 14 кроликам, массой 2-2,5 кг, по 0,5 мл (10 млрд м.к.) подкожно в области грудной клетки слева и справа (всего 1 мл -20 млрд м.к). После 10 дневного наблюдения провели убой и патологоанатомическое вскрытие.

В период наблюдения за иммунизированными белыми мышами и кроликами каких-либо отклонений в общем состоянии и поведении не наблюдали. При патологоанатомическом вскрытии видимых изменений в лимфатических узлах, паренхиматозных органах, а также на месте введения препарат не обнаружено.

С целью определения антигенной активности экспериментальную вакцину ввели подопытным 19 морским свинкам однократно подкожно в области паха в дозе 0,25 мл (5 млрд м к ) Затем в течение 15 дней за свинками вели клиническое наблюдение, которое не выявило изменений в общем состоянии животных. Падежа в группе также не отмечали.

С целью исследования поствакцинального антителогенеза были сформированы 4 группы по 15 морских свинок в каждой Для сравнения напряженности создаваемого иммунитета взяли также инактивированную адъювант-вакцину из штамма 64/2 В оу18 и живую вакцину из штамма Яеу-1 В теЫепз^ Все препараты вводили подкожно в области паха в объеме 0,25 мл В качестве адьюванта в экспериментальной микросерии вакцины из штамма 10/2 В оу15 и вакцине из штамма 64/2 В оу1Б использовали гель гидроокиси алюминия.

Сыворотки крови от морских свинок всех групп исследовали в динамике на 15-й, 30-й, 60-й и 90-й дни после иммунизации в РБП, РА, РСК с бруцеллезными антигенами и в РДСК с антигеном из В оу1б. РА ставили в разведении 1 10,1 20,1 40, 1 80, 1 160, 1 320 и 1 640, а РДСК и РСК - 1 5,110,1:20,1. 40

В результате исследований выявили, что различная степень диссоциации испытуемых штаммов оказывала значительное влияние на качественный и количественный состав агглютинирующих и комплементсязывающих антител в сыворотке крови морских свинок

Вакцина из штамма 10/2 В 0У15 не вызывала синтеза антител, связывающих бруцеллезные антигены в РБП, РА и РСК (рис 1 а, б), но, в то же время, стимулировала образование антител, связывающихся в РДСК с антигеном из В 0У1Ч (рис 1 в)

При иммунизации вакциной из штамма 11еу-1 В тс1Цсгшз у морских свинок наблюдали активный синтез противобруцеллезных антител (рис 1 а, б) и отсутствие антител, выявляемых в РДСК с антигеном из В ОУ18 (рис 1 в)

Вакцина из штамма 64/2 В оу1б обладает свойством образовывать как антитела, связывающиеся бруцеллезными антигенами в РБП, РА и РСК (рис 1 а, б), так и связывающиеся антигеном из В 0У1в в РДСК (рис 1 в)

В РДСК с антигеном из В оу1б у морских свинок, иммунизированных вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2 В оун, наблюдали схожие тенденции изменения титров антител Пик образования антител приходился на первый месяц после иммунизации При этом у морских свинок, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В 0У18, наблюдали более высокие титры антител, выявляемых в РДСК, чем в группе морских свинок, привитых вакциной из штамма 64/2 В оу1я (рис 1 а) На 30-й день в группе свинок, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В оув, 33,3% животных реагировало в титре 1 5, 46,7% - в тире 1 10 и 20% - в титре 1 20 В группе свинок, иммунизированных вакциной из штамма В оую 64/2, 53,3% животных реагировало в титре 1 5 и 40% - в титре 1 10

Титры комплементсвязывающих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ОУ1в, при исследовании на 30-й и 90-й дни после вакцинации были выше аналогичных показателей у животных, привитых вакциной из штамма 64/2 В оув, соответственно на 35,5 и 11,3%

В то же время вакцина из штамма 64/2 В 0У1Я уступала живой вакцине из штамма Ясу-1 В те1Це1ш$ в выраженности антителогенеза, проявляющейся в

10

более низких титрах РА и РСК с единым бруцеллезным антигеном на протяжении всего опыта В группе свинок, иммунизированных вакциной из штамма Яеу-1 В те^егшя, на 15-й день после иммунизации титр антител в РА был выше в 2,5 раза, на 30-й день - на 32%, а на 90-й день эта разница составляла 59% В РСК наблюдали аналогичную тенденцию - 26%, 20% и 22% соответственно.

и ю ьо 90

С |м»к нее КДОВЛШЯ, дни

(В)

Рис. 1 (а) - Динамика агглютинирующих антител в РА с единым бруцеллезным антигеном, (б) - динамика комплементсвязывающих антител в РСК с единым бруцеллезным антигеном; (в) - динамика комплементсвязывающих антител в РДСК с антигеном из В оу1Я

Для проверки напряженности иммунитета, создаваемого испытуемыми вакцинами, использовали вирулентный штамм 8406 В оУ1я Предварительно штамм титровали на морских свинках для определения минимальной заражающей дозы (ИДмо)

Данный опыт провели на 6 аналогичных группах морских свинок, предварительно проверенных в РБП, РА, РСК с бруцеллезными антигенами на бруцеллез и в РДСК с антигеном из В 0У1$ на инфекционный эпидидимит Каждую группу составляли 8 животных весом 300-350 г.

Полученные нами результаты показали, что 1 млн м к штамма 8406 В ОУ15 является минимальной заражающей дозой для морских свинок (ИДюо) Проверку напряженности иммунитета, сформированного у морских свинок через 90 дней поле иммунизации вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2

В ovis и Rev-1 В mehtensis, провели путем подкожного заражения вирулентным штаммом 8406 В ovis в дозе 5 ИДюо (5 млн м к)

Через 45 дней после заражения провели убой, патологоанатомическое вскрытие и бактериологическое исследование биоматериала от каждой морской свинки

При патологоанатомическом вскрытии изменения были обнаружены только у заразившихся морских свинок У двух из пяти свинок из группы, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis, обнаружены изменения, характерные для генерализованной формы ИЭ

Среди морских свинок, привитых вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2 В ovis, иммунных животных было 80% и 66,7% соответственно Индекс ин-фицированности морских свинок, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ovis, составил 3,3%, против 8,7% у аналогичной группы свинок, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis.

Наиболее иммуногенной для морских свинок, при испытании иммунитета через 90 дней, оказалась вакцина из штамма Rev-1 В mehtensis - иммунных 93,3%

2.2.4. Сравнительное изучение антигенных, реактогенных, иммуноген-ных и вирулентных свойств экспериментальной микросерии вакцины из штамма 10/2 B.ovis на баранах

Для изучения основных свойств экспериментальной инактивированной адъювант-вакцины из штамма 10/2 В ovis на баранах в сравнении с вакцинами из штаммов 64/2 В ovis и Rev-1 В mehtensis сформировали 4 группы (3 опытные и 1 контрольную) полуторагодовалых баранов по 14 голов в каждой Предварительно всех животных исследовали на бруцеллез в РБП, РА и РСК с бруцеллезными антигенами, на ИЭБ в РДСК с антигеном из В ovis с отрицательным результатом Вакцины в дозе 1 мл вводили подкожно в области правого локтевого сустава с медиальной стороны

Сыворотку крови баранов, исследовали в РБП, РА, РСК с цветным и единым бруцеллезным антигенами, в РДСК с антигеном В ovis, а также в РИД на 7-й, 15-й, 24-й, 31-й, 46-й, 61-й, 90-й и 127-й дни после иммунизации РА ставили в разведениях 1 25, 1:50, 1 100, 1.200, 1 400, 1 800, 1 1600 и 1 3200, РСК и РДСК - в разведениях 1 5, 1 10, 1 20 и 1 40

В РБП положительные реакции получили уже на 7-й день после вакцинации у 100% баранов, иммунизированных вакцинами из штаммов Rev-1 В mehtensis и 64/2 В ovis Некоторое ослабление реакции отметили с 61-го дня в обеих группах, причем более выражено в группе баранов, привитых вакциной из штамма 64/2 В ovis Тем не менее, положительные реакции отмечали в обеих группах и на 127-й день после иммунизации

При исследовании в РБП сыворотки крови баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ovis, получали отрицательные результаты на протяжении всего опыта, также как и при исследовании в РА и РСК.

Специфические агглютинины у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 В mehtensis, выявлялись в РА на 7-й день после иммунизации в

титрах от 100 МЕ до 1600 МЕ (в среднем 589 МЕ), и достигли своего максимального значения на 24-й день (623 МЕ) (рис 2) В дальнейшем наблюдали постепенное снижение титра антител На 61-й день после вакцинации он составлял в среднем 44 МЕ На 90-й день антитела в РА не обнаруживали

Аналогичные результаты получили при исследовании сыворотки крови баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В (рис 2) Агглютинины, появившиеся в крови на 7-й день после иммунизации, в титрах от 50 МЕ до 200 МЕ (в среднем 117 МЕ), достигли максимального значения также на 24-й день после иммунизации (в среднем 233 МЕ) Однако в отличие от предыдущей группы, в этой, агглютинирующие антитела хотя и в низких титрах, но все-таки выявляли до окончания опыта На 127-й день их уровень составлял в среднем 32 МЕ Таким образом, уровень образуемых агглютининов в ответ на иммунизацию баранов вакциной из штамма 64/2 В оу13 примерно в 3 раза ниже, чем у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Яеу-1 В теЫегшя

Рис 2 - Динамика агглютинирую- Рис 3. - Динамика комплементсвя-

Рис 4 - Динамика комплементсвязывающих антител в сыворотке крови баранов в РДСК с антигеном из В оув

щих антител в сыворотке крови баранов в РА с единым бруцеллезным антигеном

зывающих антител в сыворотке крови баранов в РСК с единым бруцеллезным антигеном

Определение наличия комплементсвязывающих антител, проводимое с помощью РСК с единым бруцеллезным антигеном, уже на 7-й день после вакцинации показало их наличие в разведении 1.10 в сыворотке крови 44% баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 В melitensis, и 11% баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis (рис 3).

Максимальное количество комплементсвязывающих антител отмечено на 31-й день после иммунизации В это время они были зарегистрированы в разведении 1.10 у 56% баранов, иммунизированных вакциной из штамма В melitensis Rev-1, и 78% баранов, иммунизированных вакциной из штамма В ovis 64/2

Отмеченное в последующие сроки исследования снижение титра комплементсвязывающих антител привело к тому, что на 127-й день их обнаруживали лишь в разведении 1 5 у 33% исследованных баранов в группах, иммунизированных вакцинами из штаммов Rev-1 В melitensis и 64/2 В ovis

В группе баранов, привитых вакциной из штамма 10/2 В ovis, синтеза комплементсвязывающих антител, выявляемых в РСК с единым бруцеллезным антигеном, в течение всего периода исследования не наблюдали (рис 3)

Комплементсвязывающие антитела выявили в РДСК с антигеном из B.ovis через 14 дней после вакцинации в разведении 1.5 в сыворотке крови 44% баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis, и 56% баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 B.ovis (рис 4)

Максимальной концентрации комплементсвязывающие антитела достигли на 61-й день после иммунизации- 78% баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ovis, и 44% баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis, реагировали в РДСК в разведении 1 10

В последующие сроки отметили уменьшение титра комплементсвязывающих антител При этом в группе баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis, наблюдали более резкое снижение антитела на 90-й и 127-й дни определяли только в разведении 1-5 В то же время в группе баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ovis, комплементсвязывающие антитела определяли в разведении 1 10 у 56% животных на 90-й, а на 127-й после вакцинации только в разведении 1.5.

Рост титра иммуноглобулинов М-класса, отмеченный на 7-й день после иммунизации, составил 37,5% у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 В melitensis, 30,1% - у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ovis и 13,4% - у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis (рис 5)

Максимального уровня титры IgM достигли у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 В melitensis, на 24-й день после вакцинации (4,19 мг/мл), а у баранов иммунизированных вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2 В ovis, на 31-й день после иммунизации и составили 3,97 и 3,55 мг/мл соответственно

Наблюдавшееся в последующие сроки исследования снижение титров IgM привело к тому, что на 127-й день после иммунизации уровень данных антител оказался ниже первоначального

У вакцинированных баранов, не зависимо от иммунизирующего штамма наблюдали одинаковую тенденцию роста и снижения уровня антител Однако при этом количественные показатели IgM у животных, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1, были выше на протяжении всего опыта, чем у животных, иммунизированных вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2 В ovis

На 7-й день после иммунизации также отмечено некоторое повышение уровня IgG на 3,8% у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 В mehtensis, на 5,3% у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ovis и на 1,2% у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В о vis (рис 6)

Максимальных значений уровень IgG достиг у баранов всех групп на 31 день после вакцинации и составил 22,2 мг/мл у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 В mehtensis, 21,89 мг/мл у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В ovis и 21,33 мг/мл у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В ovis (рис 6), что в свою очередь выше первоначального уровня IgG в этих группах на 8,3%, 14,7% и 5,8% соответственно

Рис 5 - Динамика IgM в сыворотке крови баранов

Рис 6 - Динамика IgG в сыворотке крови баранов

Рис 7 - Динамика IgA в сыворотке крови баранов

В последующие сроки исследования отметили снижение титров IgM. В группах, иммунизированных вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2 B.ovis, на 127-й день после иммунизации уровень антител оказался ниже первоначального. Однако в группе баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 B.melitensis, в отличие от двух других групп, после периода снижения концентрации IgM со второго месяца после иммунизации отмечали второй подъем титров IgM, связанный с особенностями расселения вакцинного штамма в организме подопытных баранов.

На протяжении первого месяца после иммунизации уровень IgA у баранов всех групп колебался в небольшом диапазоне значений. Однако на 46-й день наблюдали резкое увеличение концентрации IgA в группах, иммунизированных вакцинами из штаммов Rev-1 B.melitensis и 10/2 B.ovis, на 31% и 56,4% соответственно (рис.7). Причем в группе баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 B.melitensis, на 60-й день уровень IgA вырос еще на 16,4%, а к концу исследования составлял 79,4 % от первоначального, в то время как в группе баранов, иммунизированных вакциной го штамма 10/2 B.ovis, он оставался без значительных изменений до окончания исследования и на 127-й день составлял 87,5% от первоначального. Таким образом, пик синтеза IgA приходился на более ранний период и носил более выраженный характер у баранов при иммунизации вакциной из штамма 10/2 B.ovis.

Динамика уровня IgA в сыворотке крови баранов, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 B.ovis, носила линейный характер Рост уровня IgA в этой группе отмечали на протяжении всего периода исследования и на 127-й день после иммунизации составлял 0,43 мг/мл, что на 34,4% выше первоначального. Таким образом, у баранов данной группы наблюдали слабовыраженное усиление синтеза IgA, связанное с иммунизацией.

В результате исследований установили, что динамика количественных изменений уровня IgG и IgM была практически одинакова у всех иммунизированных баранов, значительные отличия наблюдали лишь в динамике IgA.

Динамика количественных показателей М-, G- и А-классов иммуноглобулинов коррелирует с титром агглютинирующих антител, выявляемых в РА с единым бруцеллезным антигеном (г = 0,91, Р < 0,05).

Проверку напряженности иммунитета у баранов провели через 180 дней поле иммунизации путем подкожного введения в области левого локтевого сустава с медиальной стороны вирулентного штамма 8406 B.ovis, в общепринятой дозе 10 ИДюо Предварительно культуру 8406 B.ovis титровали на баранах для определения минимальной заражающей дозы (ИДюо). С этой целью, сформировали 4 группы, по 5 полуторагодовалых баранов в каждой Предварительно всех опытных баранов исследовали на бруцеллез (РБП, РА, РСК) и инфекционный эпидидимит (РДСК) Все животные показали отрицательные результаты.

В результате титрации заражающей дозы штамма 8406 В 0У13 установили, что минимальная инфицирующая доза (ИДюо) для баранов составляет 500 млн м к Серологическое исследование баранов на бруцеллез (РБП, РА, РСК) и инфекционный эпидидимит (РДСК) провели через 15, 30 и 45 дней после заражения в том же разведении

Убой баранов (по 5 голов из каждой группы), патологоанатомическое вскрытие и отбор биоматериала для бактериологического и гистологического исследования провели через 45 дней после заражения.

Бактериологическое исследование биоматериала от каждого барана провели путем высева из подчелюстных, заглоточных, предлопаточных, портального, гипогастральных, парааортальных, средостенного, глубоких паховых и надколенных лимфатических узлов, селезенки, печени, почек, сердца, семенников и их придатков на мясо-пептонно-печеночно-глюкозо-глицериновый бульон (МППГГБ) и мясо-пептонно-печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГТА) с добавлением 10% нормальной сыворотки крови. Окончательный учет роста микробной массы провели через 30 дней инкубации в термостате при температуре 38°С.

По результатам серологического, патологоанатомического и бактериологического исследования баранов установлено, что в контрольной группе заразились все 5 баранов, причем 4 из них в генерализованной форме, что дало право судить о высокой вирулентности заражающего штамма 8406 В.оу1З.

При серологическом исследовании сывороток крови опытных баранов, после заражения вирулентным штаммом 8406 В оу1э в дозе 5 млрд м к, на 30-й день у 1 барана из группы животных, иммунизированных вакциной из штамма 64/2 В оу!з, наблюдали прорыв иммунитета и появление в сыворотке крови комплементсвязывающих антител в титре 1:200 в РДСК с антигеном из В.оу1з

Бараны, иммунизированные вакциной из штамма Яеу-1 В.те1Иепз13, даже через 205 дней после вакцинации продолжали реагировать в РБП РА и РСК с бруцеллезными антигенами Антитела в РДСК с антигеном из В ото определялись в данной группе лишь на 15 день после заражения в титре 1 5, а в последующие сроки исследования были получены отрицательные результаты

У баранов, иммунизированных вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2 В 0У18, на всех этапах исследования сыворотки крови после заражения, не обнаружено бруцеллезных антител, выявляемых в РБП РА и РСК с бруцеллезными антигенами. В РДСК с антигеном из В олав комплементсвязывающие антитела в титрах 1:5 и 1:10 выявлялись на 15-й и на 30-й дни после заражения. На 45-й день после заражения в сыворотке 1-го барана, иммунизированного вакциной из штамма 64/2 В олаэ, обнаружили комплементсвязывающие антитела в РДСК с антигеном из В оте в титрах 1 40 С сывороткой других баранов данной группы, а также других опытных групп РДСК с антигеном из В 0У1в была отрицательной.

При проведении патологоанатомического вскрытия у заразившихся баранов контрольной группы и барана из группы, иммунизированных вакциной

из штамма 64/2 В ОУгё, обнаружили увеличение большинства лимфатических узлов.

Вакцины из штаммов Б1еу-1 В.те^егшБ и 10/2 В ОУ1Э, обеспечили 100% иммунитет у баранов, зараженных через 6 месяцев после однократной иммунизации. Вакцина из штамма 64/2 В 0У1Б показала 80% эффективность с индексом инфицированности 2,2 %

2.2.5. Сравнительное изучение иммуногенеза на баранах при использовании вакцин из штаммов 10/2 и 64/2 В.оую, Леу-1 В.теШе1Ш8

С целью изучения поствакцинального иммуногенеза в тканях и органах баранов при использовании вакцин из штаммов 10/2 и 64/2 В.оухэ и штамма Яеу-1 В теШепя^ проведен убой баранов, патологоанатомическое вскрытие и отбор биоматериала для гистологического исследования на 61-й, 90-й и 127-й дни после иммунизации. Для этого произвольно выбирали по 3 барана из каждой группы.

Макроскопически видимой патологии в органах и тканях брюшной, тазовой и грудной полостей, а также в половых органах при вскрытии не обнаружили.

Заметные изменения, заключающиеся лишь в небольшом увеличении предлопаточных лимфатических узлов, регионарных месту введения вакцинных препаратов, обнаружили у всех баранов на второй месяц после иммунизации (61 день) Причем оно было более выражено у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Яеу-1 В теШег^Б

При гистологическом исследовании отмечали гиперпластические процессы в паракортикальной зоне предлопаточных лимфоузлов и, в меньшей степени, в других лимфатических узлах. В то же время, в герминативных центрах и субкапсулярных зонах вторичных фолликулов имела место В-клеточная лимфоцитарная пролиферация в виде утолщения зоны мантии Эти изменения характерны для всех иммунизированных баранов, но более интенсивно выражены они были у баранов, привитых вакциной из штамма Ясу-1 В теШепэ^

В селезенке на второй месяц после иммунизации отмечали плазмоцитарную реакцию в красной пульпе и лимфоцитарную пролиферацию лимфофолликулов белой пульпы, одинаково выраженную у животных всех групп

Явления лимфоидно-клеточной пролиферации различной степени интенсивности отмечали и в других органах - печени, почках, сердце

У животных, убитых через 90 дней после иммунизации, гиперпластические процессы были выражены значительно слабее и регистрировались только в правом предлопаточном лимфатическом узле, регионарном месту введения вакцины Причем более выраженные изменения отмечались у баранов, иммунизированных вакциной из штамма Яеу-1 В те1Цеш13. В других лимфоузлах структура органа не отличалась от таковой у контрольных не вакцинированных животных.

На 127-й день после иммунизации видимых морфологических изменений со стороны исследованных органов не обнаружено.

На 61 и 90-й дни после иммунизации в лимфатических узлах и селезенке отмечали выраженную в различной степени плазмоцитарную реакцию. У баранов, иммунизированных вакциной из штамма Rev-1 В melitensis, она была более выражена, чем у баранов, иммунизированных вакцинами из штаммов 10/2 и 64/2 Bovis, у которых она была практически одинакова В лимфатических узлах отмечали более быстрое угасание плазмоцитарной реакции, чем в селезенке, где она отмечалась и на 127-й день после иммунизации.

Интенсивность иммуноморфологических реакций была несколько выше и отмечалась более длительное время при использовании вакцины из штамма 10/2 B.ovis, чем при использовании вакцины из штамма 64/2 B.ovis.

При сопоставлении данных гистологического и серологического исследований выявилась положительная корреляция динамики наблюдаемых явлений лимфоидно-клеточной и плазмоцитарной пролиферации в лимфатических узлах, селезенке и других паренхиматозных органах с динамикой антител и количеством иммуноглобулинов в сыворотке крови.

2.2.6. Изучение патоморфологических изменений у баранов при естественном течении ИЭ.

Ввиду тропизма возбудителя и тесной морфофункциональной взаимосвязи органов половой и мочевыделительной систем им при осмотре уделяли особое внимание.

При осмотре наружных половых органов баранов наблюдали поражение семенников и их придатков в виде деструктивно-пролиферативных процессов в соединительнотканных структурах с образованием асептических абсцессоподобных образований в области головки и тела придатков семенника

При микроскопическом исследовании в зоне некротического распада в придатках семенников отмечали выраженную макрофагальную реакцию с образованием большого количества гигантских клеток типа Лангганса.

В стенках кровеносных сосудов придатков семенников наблюдали деструктивные изменения мышечного слоя в виде фибриноидного пропитывания и коллагенизации.

Изменения различной степени тяжести обнаружили в почках Макроскопически они проявлялись в виде отека околопочечной клетчатки, увеличения почек с отеком капсулы и паренхимы, сращений наружного соединительнотканного и внутреннего мышечного слоев фиброзной капсулы с образованием значительных по площади спаек, выраженного полнокровия сосудов, диапедезных кровоизлияний в корковом и мозговом слоях органа. Отмечали стертость рисунка и истончение коркового и мозгового слоев, утолщение слизистой оболочки почечной лоханки, а также значительное расширение полости больших и малых почечных чашечек и самой почечной лоханки

После отделения жировой капсулы отмечали утолщение мочеточника, в его адвентиции наблюдали разрастание соединительной ткани и фибриноидное пропитывание стенок сосудов.

В корковом слое вокруг извитых канальцев и клубочков часто обнаруживали множественные обширные очаговые лимфоидно-моноцитарные пролифераты в виде муфтообразных утолщений Большинство проксимальных канальцев мозгового вещества расширены, наблюдается нарушение базальной исчерченности В просветах канальцев содержались гиалиновые цилиндры. Интерстициальная ткань отчетливо выявлялась вокруг клубочков и по ходу канальцев, где отмечалась ее инфильтрация лимфоидными клетками.

Обнаруживали большое количество гипертрофированных клубочков, имевших интенсивно окрашенные ядра подоцитов, полностью заполнявшие боуменово пространство, в котором обнаруживали скопление гомогенной эозинофильной пенистой белковой массы и эритроцитов Сосудистый клубочек почечного тельца уменьшен в размерах и имеет лопастной вид, подоциты едва просматривались Часть почечных канальцев заполнена аналогичной белковой массой

Отмечались огрубение остова и гиперплазия мезангиальных клеток сосудистого клубочка Имелись клубочки, потерявшие клеточную структуру и заполненные фибриноидными бесклеточными структурами. Капсула подобных клубочков утолщена Лежащие вблизи кровеносные сосуды имели утолщенную и разволокненную стенку.

В эпителии почечных лоханок наблюдали клеточную инфильтрацию, местами с формированием крупных лимфофолликулярных гранулем и обширных пролифератов

При исследовании лимфатической системы часто изменения обнаруживали в поверхностных и глубоких паховых, тазовых, почечных и поясничных лимфатических узлах в виде их увеличения, гиперемии, отека и кровоизлияний на поверхности и на разрезе При гистологическом исследовании отмечали гиперпластические процессы в лимфоидной ткани в мозговом и корковом слоях. Наблюдалось изменение соотношения корковой, медуллярной и паракортикальной зон в пользу увеличения последней, за счет уменьшения объема фолликулов Часто паракортикальный слой расширен вплоть до капсулы лимфоузла, причем фолликулы сильно раздвинуты широкими тяжами клеток

Макроскопических изменений в селезенке при вскрытии не обнаружили. При гистологическом исследовании часто наблюдали клеточно-пролиферативные реакции ретикулоэндотелия в синусах и мякотных шнурах, гиперплазию фолликулов и эозинофильную инфильтрацию красной пульпы

При визуальном осмотре изменений в печени не обнаружили Гистологически часто отмечали дистрофию печеночной ткани, очаговую лимфоидную пролиферацию триад Глиссона, а также диффузную гиперплазию и гипертрофию клеток Купфера

При гистологическом исследовании в интерстициальной ткани миокарда выявляли небольшие пролифераты лимфоидных клеток вокруг сосудов, а также пролиферацию эндотелия сосудов

При гистологическом исследовании в легких обнаружили истончение альвеолярных перегородок в связи с дистрофическими изменениями.

Таким образом, при гистологическом исследовании биоматериала обнаруживали полиморфизм дистрофических и пролиферативных процессов в различных органах

3. ВЫВОДЫ

1. Экспериментальная инактивированная адъювант-вакцина из штамма 10/2 В оу!з, предохраняла от заражения вирулентным штаммом 8406 В.оу1б 80% морских свинок через 3 месяца, и 100% баранов - через 6 месяцев после иммунизации. По количественным показателям поствакцинального иммуногенеза экспериментальная инактивированная адъювант-вакцина из штамма 10/2 В 0У1Б превосходит вакцину из штамма 64/2 В.оу1з и незначительно уступает вакцине из штамма Яеу-1 В.те1кегшз.

2 При сопоставлении данных гистологического, серологического и иммунологического исследований баранов, привитых экспериментальной вакциной из штамма 10/2 В оу15, выявлена положительная корреляция динамики наблюдаемых явлений лимфоидно-клеточной и плазмоцитарной пролиферации в лимфатических узлах, селезенке и других паренхиматозных органах с динамикой уровня антител и количеством иммуноглобулинов в сыворотке крови

3 Изменения, обнаруживаемые при гистологическом исследовании биоматериала от привитых баранов, сводятся к пролиферации антиген-специфических лимфоидных клеток в лимфатических узлах, селезенке, печени и почках. Плазмоцитарная реакция в лимфоидных органах у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 В 0У1Э, более выражена, чем у баранов, привитых вакциной из штамма 64/2 В омэ, что свидетельствует о высокой иммуногенности вакцины из штамма 10/2 В оу1б Глубоких структурных изменений, наблюдаемых в тканях и органах при естественном течении инфекционного эпидидимита, у вакцинированных баранов не обнаружено, что свидетельствует о доброкачественно протекающем поствакцинальном иммуногенезе при применении данного препарата

4. При ретроспективном анализе эпизоотической ситуации по инфекционному эпидидимиту баранов в России за 1976-2008 гг. отмечено сокращение числа неблагополучных пунктов и уровня заболеваемости в 10 раз, установлена закономерность географического распространения и приуроченность инфекционного эпидидимита баранов к определенной местности, территориально выделено 4 стационарно-неблагополучные зоны с разной степенью неблагополучия - Алтайская, Европейская, Забайкальская и Прикавказская

5. В патоморфологической картине ИЭБ преобладают некробиотические изменения в придатках семенников В остальных органах мочеполовой системы и лимфатических узлах наблюдаются менее выраженные патоморфологические изменения, вызванные реакциями гиперчувствительности III и IV типов В почках отмечаются очаговые и диффузные изменения, характеризующиеся полиморфизмом.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Новая адъювант-вакцина из штамма 10/2 B.ovis против инфекционного эпидидимита баранов.

Проект лабораторного регламента по производству контролю и применению адъювант-вакцины из штамма 10/2 Brucella ovis против инфекционного эпидидимита баранов утвержденный директором ВНИИЭВ им Я Р.Коваленко.

Полученные результаты исследований могут быть использованы при разработке нового наставления по диагностике инфекционного эпидидимита баранов и новой инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного эпидидимита баранов.

Рекомендуется использовать данные, полученные при анализе эпизоотологических сведений, для корректировки проведения противоэпизоотических мероприятий в регионах Российской Федерации, неблагополучных по инфекционному эпидидимшу баранов

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Нестреляев, С С. Значение гуморального и клеточного иммунитета при бруцеллезе / Федоров А И, Искандаров М И, Игнатов П Е., Альбертян М П., Нестреляев С.С, Некрасов А В , Хаитов Р М., Петров Р В // Физиология и патология иммунной системы —2006 -Т10 — №8 -С 3-7.

2. Нестреляев, С С Сравнительная оценка антигенной активности вакцин против инфекционного эпидидимита баранов / Нестреляев С С. // ВЕТКОРМ. -2008 -№3.-С23.

3 Нестреляев, С С. Количественная характеристика иммуноглобулинов и динамика титра антител в сыворотке крови баранов, вакцинированных против инфекционного эпидидимита / Федоров Ю Н, Альбертян М П, Нестреляев С С. // Ветеринарная патология. - 2008. - №3(26) - С. 77-81.

4 Нестреляев, С С Патоморфологические изменения у баранов, клинически больных инфекционным эпидидимитом / Альбертян М П, Нестреляев С.С // Ветеринарная патология. - 2008. -№4(27) - С.8-11.

5. Нестреляев, С.С Эпизоотологическая и эпидемиологическая роль бруцеллеза мелкого рогатого скота и других видов животных в РФ / Искандаров М И., Федоров А И, Нестреляев С С., Альбертян М П. // Труды ВИЭВ. - Москва, 2009. - Т. 75. - С. 312-317

6. Нестреляев, С С. Протективный антиген бруцелл как фактор патогенности / Федоров А.И, Искандаров М И, Альбертян М П, Нестреляев С С //ТрудыВИЭВ -Москва, 2009 -Т 75 - С. 644-647.

7 Нестреляев, С С. Анализ Эпизоотической ситуации по инфекционному эпидидимиту баранов в Российской Федерации за 1976-2007 гг / Нестреляев С.С, Искандаров МИ., Альбертян М.П, Федоров А.И. // Труды ВИЭВ. -Москва, 2009. - Т. 75. - С. 490-494.

8. Нестреляев, С С. Изучение иммунобиологических свойств культуры штамма В оу!з 10/2 / Нестреляев С С., Искандаров М И, Альбертян МП// Труды ВИЭВ.-Москва, 2009 -Т 75.-С 483-489.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" ОГР № 1067746281514 от 15 02 200бг Москва, Талалихина, 33

Подписано к печати 07 09 2009г Формат 60x84/16 Бумага "Офсетная №1" 80г/м2 Печать трафаретная Услпечл 1,50 Тираж 100 Заказ 288

WWW.FRANTERA.RU

1.1. Актуальность темы:

В настоящее время немаловажной проблемой инфекционной патологии овец являются заболевания, вызываемые Brucella ovis, (инфекционный эпидидимит баранов, ИЭБ) и Brucella melitensis (бруцеллез). Растущее внимание к проблеме инфекционного эпидидимита баранов обусловлено экологическими и экономическими факторами. По данным D.L. Hoover A.M. Freidlander, D.R. Franz, P.B. Jahrling, D.J. McClain, W.R. Bryne, J:A. Pavlin, G.W. Christopher, E.M. Eitzen, в период с 1940 по I960 гг., в США успешно испытывали B.suis как возможный биологический агент для создания биологического оружия.

Рост уровня урбанизации, распространение животноводства на новые территории, недостаточная степень развития санитарно-гигиенических мер в животноводстве и в пищевой промышленности также способствует распространению возбудителей инфекций, в том числе бруцеллеза и ИЭБ.

Значительный экономический ущерб, причиняемый ИЭБ, складывается из: преждевременной выбраковки баранов-производителей в результате, значительного снижения или полной утраты воспроизводительной функции; выбраковки маточного поголовья по причине рождения ослабленных или нежизнеспособных ягнят, абортов и развивающегося бесплодия; недополучения приплода; уничтожения всего запаса спермы от больного производителя; экономических потерь в результате проведения оздоровительных и профилактических мероприятий.

Одним из возможных факторов, объясняющих недостаточное внимание к проблеме ИЭБ, является устоявшееся мнение о том, что при этом заболевании поражается преимущественно половая система, в частности придатки семенников. Однако, как при любом хронически протекающем заболевании, при ИЭ в той или иной степени поражаются и другие системы организма.

Имеющиеся литературные данные по анализу эпизоотического состояния при ИЭБ характеризуют лишь отдельные территории, тогда как аналогичные данные по стране в целом отсутствуют, что в свою очередь не позволяет провести достоверную оценку качества проводимых мероприятий по борьбе и профилактике с ИЭБ в нашей стране.

Многолетняя борьба с ИЭБ путем проведения только лишь общих организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий оказалась недостаточно эффективной. Внедрение средств специфической профилактики в комплекс противоэпизоотических мероприятий, позволило значительно повысить их эффективность (В.И. Ким, 1978; Б.Н. Афанасьев, 1980; А.Н. Касьянов, В.А. Ромахов, 1980; В. Аманжолов, 1981; М. Afsal, C.V. Kiniberling, 1986; А.Ф. Руденко, 1987; Г.Ш. Абулхаиров, В.А. Ромахов, 1991).

С учетом возможности перекрестной иммунизации животных бруцеллами разных видов для специфической иммунопрофилактики ИЭ используют те же вакцины, что и для профилактики бруцеллеза у овец (А.Н. Касьянов, В.А.Ромахов, 1980).

Вместе с тем установлено, что при бруцеллезе иммунитет непродолжительный и может быть преодолен массивной дозой возбудителя, даже после естественного переболевания, однако применение вакцин при одновременном выполнении ветеринарно-санитарных и организационно-хозяйственных мер дает положительный результат. Поэтому многие исследователи за рубежом и в нашей стране занимаются изысканием более эффективных противобруцеллезных вакцин (Е.С. Орлов, П.С. Уласевич , 1976).

Для специфической иммунопрофилактики бруцеллеза овец и инфекционного эпидидимита баранов предлагаются различные вакцинные препараты. При практическом применении их в производственных условиях обнаруживается, что часть из них не соответствует требованиям, предъявляемым к препаратам подобного рода по показателям безвредности — вакцины 45/20, 53Н38 (Т.К. Касымов, 1985), другие - по резко выраженным агглютиногенным свойствам: штаммы 19, 104-М (Е. Biderstein, Me. Cowan, R. Harzold, 1962; L. Kater, V. Hartley, 1963; Т.К. Касымов, 1988).

В лаборатории по изучению бруцеллеза ВИЭВ совместно с лабораторией биохимии в 80-х годах была разработана инактивированная адъювант-вакцина против инфекционного эпидидимита баранов из штамма 64/2 В.ovis. В дальнейшем в связи с повышенной реактогенностью вакцины масляно-ланолиновый адъювант (84% минерального масла ПЭС-3 и 16% безводного ланолина) заменили гидроксидом алюминия. Также проводилась работа по подбору оптимальной концентрации микробных клеток антигена. В результате многократных пересевов на питательные среды в культуре штамма В.ovis стало наблюдаться явление реверсии бруцелл, из-за чего вакцина приобрела новые, нехарактерные для нее свойства и перестала отвечать первоначальным требованиям. В связи с этим фактом было решено заменить штамм 64/2 В.ovis более стабильным. Для этих целей было предложено использовать полевой штамм 10/2 B.ovis из музея сектора хронических инфекций ВИЭВ.

Соответственно стала актуальной задача изучения основных биологических свойств экспериментальной инактивированной адъювант-вакцины из штамма 10/2 B.ovis в сравнительном аспекте с инактивированной адъювант-вакциной из штамма 64/2 B.ovis и живой вакциной из штамма Rev-1 B.melitensis. Кроме этого, изучение вопроса иммуногенеза при инфекционном эпидидимите баранов имеет большое теоретическое значение.

Не менее важной является задача изучения патологии мочевыделительной системы, развивающейся при хроническом течении инфекционного эпидидимита баранов.

В связи с отсутствием обобщения данных о распространенности этой болезни, необходимо провести анализ статистических данных о проявлении эпизоотического процесса инфекционного эпидидимита баранов на территории Российской Федерации.

1.2. Цели и задачи исследования:

Цель работы иммунологическая и морфологическая характеристика поствакцинального иммуногенеза при инфекционном эпидидимите баранов.

В число поставленных задач входили:

- изучение основных биологических свойств штамма 10/2 B.ovis;

- сравнительное изучение антигенных, вирулентных, иммуногенных и других свойств экспериментальной вакцины из штамма 10/2 B.ovis, вакцины из штамма 64/2 B.ovis и вакцины из штамма Rev-1 B.melitensis;

- сравнительное изучение патоморфологических изменений в органах и тканях животных при иммунизации вакцинами из штаммов 10/2 B.ovis, 64/2 B.ovis и Rev-1 B.melitensis;

- изучение патоморфологических изменений в органах и тканях у баранов при естественном течении ИЭ;

- анализ особенностей проявления эпизоотического процесса при инфекционном эпидидимите баранов в разных регионах Российской Федерации в течение 1976-2008 гг.

1.3. Научная новизна:

Сконструирована адъювант-вакцина из штамма 10/2 B.ovis против инфекционного эпидидимита баранов. Показана безвредность, умеренная реактогенность, антигенность и высокая иммуногенность экспериментальной микросерии препарата на белых мышах, морских свинках, кроликах и баранах.

Дана сравнительная оценка поствакцинального иммуногенеза, происходящего в организме морских свинок и баранов, после однократной иммунизации экспериментальной вакциной из штамма 10/2 B.ovis, вакциной из штамма 64/2 B.ovis и живой вакциной из штамма Rev-1 B.melitensis.

Показан полиморфизм патологических изменений у баранов при естественном течении инфекционного эпидидимита.

По данным за 1976-2008 гг. впервые охарактеризованы динамика, закономерности и региональные особенности проявления эпизоотического процесса инфекционного эпидидимита баранов в Российской Федерации. Создана компьютерная база данных, позволившая выявить современные особенности эпизоотической ситуации инфекционного эпидидимита баранов в Российской Федерации.

1.4. Практическая значимость:

Предложена новая адъювант-вакцина из штамма 10/2 B.ovis против инфекционного эпидидимита баранов.

Проведен анализ эпизоотологических данных по инфекционному эпидидимиту баранов в целом по России за 1976-2008 гг. и создана соответствующая электронная база данных. Результаты эпизоотологического анализа могут быть использованы для совершенствования противоэпизоотических мероприятий при ИЭБ.

Изучены патоморфологические изменения в мочеполовой системе при хроническом течении инфекционного эпидидимита баранов.

1.5. Личный вклад соискателя заключается в проведении серологических, бактериологических, иммунологических и патоморфологических исследований на 47 белых мышах, 127 морских свинках, 14 кроликах и 76 баранах, а также в создании электронной базы данных по эпизоотологическому состоянию и анализе эпизоотологических данных по инфекционному эпидидимиту баранов в Российской Федерации. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.вет.н. О.В.Якушевой, членом-корреспондентом РАСХН, д.б.н., проф. Ю.Н.Федоровым, к.вет.н. М.И.Искандаровым, за что автор выражает им сердечную благодарность.

1.6. Апробация работы:

Основные положения диссертационной работы доложены на межлабораторных совещаниях сотрудников ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко в 2008 и 2009 гг. и на Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел» в Москве в 2009 г.

1.7. Публикации:

По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («ВЕТКОРМ», «Ветеринарная патология»).

1.8. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- результаты изучения основных биологических свойств штамма 10/2

B.ovis;

- результаты сравнительного изучения антигенных, вирулентных, реактогенных, иммуногенных и других свойств экспериментальной вакцины из штамма 10/2 B.ovis, вакцины из штамма 64/2 B.ovis и вакцины из штамма Rev-1 B.melitensis;

- результаты сравнительного изучения патоморфологических изменений в органах и тканях животных при иммунизации вакцинами из штаммов 10/2 B.ovis, 64/2 B.ovis и Rev-1 B.melitensis;

- патоморфологические изменения в органах и тканях у баранов при естественном течении ИЭ;

- результаты анализа особенностей проявления эпизоотического процесса при инфекционном эпидидимите баранов в различных зонах Российской Федерации в течение 1976-2008 гг.

1.9. Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 205 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 290 источников, в том числе 110 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 62 фотографиями, 8 таблицами и 23 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальная инактивированная адъювант-вакцина из штамма; 10/2 B.ovis, предохраняла от заражения вирулентным штаммом 8406 B.ovis 80% морских свинок через 3 месяца, и 100% баранов — через 6 месяцев после иммунизации. По количественным показателям поствакцинального иммуногенеза экспериментальная инактивированная адъювант-вакцина из штамма 10/2 B.ovis превосходит вакцину из штамма 64/2 B.ovis и незначительно уступает вакцине из штамма Rev-1 B.melitensis.

2. При сопоставлении данных гистологического, серологического и иммунологического исследований баранов, привитых экспериментальной вакциной из штамма 10/2 B.ovis, выявлена положительная корреляция динамики наблюдаемых явлений лимфоидно-клеточной и плазмоцитарной пролиферации в лимфатических узлах, селезенке и других паренхиматозных органах с динамикой уровня антител и количеством иммуноглобулинов в сыворотке крови.

3. Изменения, обнаруживаемые при гистологическом исследовании биоматериала от привитых баранов, сводятся к пролиферации антиген-специфических лимфоидных клеток в лимфатических узлах, селезенке, печени^ и почках. Плазмоцитарная реакция в лимфоидных органах у баранов, иммунизированных вакциной из штамма 10/2 B.ovis, более выражена, чем у баранов, привитых вакциной из штамма 64/2 B.ovis, что свидетельствует о высокой иммуногенности вакцины из штамма 10/2 B.ovis. Глубоких структурных изменений, наблюдаемых в тканях и органах при естественном течении инфекционного эпидидимита, у вакцинированных баранов не обнаружено, что свидетельствует о доброкачественно протекающем поствакцинальном иммуногенезе при применении данного препарата.

4. При ретроспективном анализе эпизоотической ситуации по инфекционному эпидидимиту баранов в России за 1976-2008 гг. отмечено сокращение числа неблагополучных пунктов и уровня заболеваемости в 10 раз, установлена закономерность географического распространения и приуроченность инфекционного эпидидимита баранов к определенной местности, территориально выделено 4 стационарно-неблагополучные зоны с разной степенью неблагополучия — Алтайская, Европейская, Забайкальская и Прикавказская.

5. В патоморфологической картине ИЭБ преобладают некробиотические изменения в придатках семенников. В остальных органах мочеполовой системы и лимфатических узлах наблюдаются менее выраженные патоморфологические изменения, вызванные реакциями гиперчувствительности III и IV типов. В почках отмечаются очаговые и диффузные изменения, характеризующиеся полиморфизмом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Проект лабораторного регламента по производству контролю и применению адъювант-вакцины из штамма 10/2 Brucella ovis против инфекционного эпидидимита баранов утвержденный директором ВНИИЭВ им Я.Р.Коваленко.

Полученные результаты исследований могут быть использованы при разработке нового наставления по диагностике инфекционного эпидидимита баранов и новой инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного эпидидимита баранов.

Рекомендуется использовать данные, полученные при анализе эпизоотологических сведений, для корректировки проведения противоэпизоотических мероприятий в регионах Российской Федерации, неблагополучных по инфекционному эпидидимиту баранов.

Полученные данные могут быть использованы при составлении соответствующих разделов учебников и учебных пособий по специальности «Ветеринария».