Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота

Казанский ордена Ленина ветеринарный институт имени Н.Э.Баумана

На правах рукописи

ЯКУПОВ ТАЛГЛТ РАБИНОВИЧ

ИИ'.'.УНМ'Е НДЕНТШЙ АНАЛИЗ В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата зетврииаршх наук

Казань 1991

Работа выполнена в Казанском ордена Ленина ветеринарном институте имени Н.Э.Баумана.

Научный руководитель - лауреат Государственной премии СССР,

заслуженнчй деятель науки ТССР, доктор ветершаршх наук, профессор

ХЛЗИПОВ II

Официальные оппонента - доктор ветеринарных ндук, профессор

ГОСМЛНОВ Р.Г.

кандидат биологических наук АЛИМОВ АЛЛ.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (г.Олек)

Затата состоится " 4 " НОэНрГл 1991 г. в ¿0 часов на заседании специализированного совета JI-I20.22.0I при Казанском ордена Ленина ветеринарном институте имени Н.Э.Баумана (420(374, Иаэаль-74, ветеринарный институт).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского ордена Ленина ьетеринарного института имени Н.Э.Баумана.

Автореферат разослан " Л 2 " ее/м/МО 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доцена

В.И.Угркг.юв

МШИ!

. лкЕ! ■ТДСЛ

ертаций —¿за

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

дальность тега. Основные задачи агропромышленного комп-

лекса - ато дальнейшее развитие сельского хозяйства, выполнение мероприятии, связанных со всесторонней интенсификацией производства в целях обеспечения населения высококачественными проектами питания и промышленность сырьем.

В успешном режении этих зг дач- большое значение имеет обеспечение благополучия хозяйств по инфекционным болезням »шотннх, среди которых, серьезною озабоченность высевает туберкулез крупного рогатого скота, наносящий огромный. экономический ускрб хи-вотповодстзу и представляющий значительную опасность длл г.г;оровьй людей.

Несмотря на очевидные успехи в борьбе с этой инфекцией, перед ветеринарной наукой проблема ликвидация туберкулеза стоит на первом месте.

Прозодишми в нагей стране противотуберкулезными мероприятиями, совершенствованием структуры профиляктическх.. и оздоровительных мероприятий достигнуто благополучие ряда крупных регионов зтриш, bJ.ii оте с тем, в отдельных районах эпизоотическая ситуация требует более энергичных усилий, направленных па достижение оздоровления неблагополучных хозяйств от туберкулеза крупного гюгатого скота.

Существующие ныне многочисленные мзрн борьбы с этим заболеванием в некоторых случаях не эффективны к : ; всегда позволяют з предельно короткий срок установить точный диагноз или ис!ш>-шть заболевание, что обусловлено несовершенством используемых итодов диагностики. Значительные затруднения впивают и неспе-Ш<$ические реакции на туберкулин, дифференциация которых являет-:я вшкнейпей проблемой, имеющей исклк'штель-.о большое практичес-сое значение, так как ложные реакции на туберкулин могу повлечь >а собой необоснованное проведение аротапстуйеркулезних керо-¡риягий и неоправданный убой высокопродуктивных здоровых яивот-!ух. Поото.'.г/, важное место в комплексе мероприятий занимает со-юршенствование методов диагностики, профилактики и ликвидации •уберкулеза, которые остаются в центре внимания научного поиска.

В этой связи, весьма перспективной является разработка и педрение в ветеринарную практику современных методов лаОогатс:>-¡ого исследования таких как кж.уно^грментлк^ паяли;.-, которые в

мировой практике иошли широкое применение для ракнзй диагностики вирусних и микробных инфекций, проведения массовых противо-эпизоотическах мероприятий, наблюдений за окружающей средой (Боре зли И.В., 1985; ОеИгХсК ц., Ю84 и др.).

Возможность выявления Еммуноформегашм методом малых количеств антигена в исследуемом материале, п также специфических антител в сыворотке крови представляет большой интерес при разработка метода ИФА для диагностики туберкулеза,

В постановлении Государственного комитета г;о науке и технике (06.01.83г.) и приказа МСХ СССР (G5.03.84r.) также указывается на 1.^обходимость расширения научно-исследовательских работ в области создания диагностических препаратов дая шыуноферментного анализа и внедрения их ь ьетеринарную практику.

Цель у яагачи ^сслетованнй. Работа проводилась в соответст-Еи;; с пл/шовыы зедаичеы ГУБ Госагропрсма СССР 02.02.Д.26 по разделу "Разработка метода иммуноферментного анализа для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота". Иоходя из этой целя для выполнения ставились задачи:

1. Разработать &кспресс-метод диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом кмэдноферглентного анализа.

2. Определить место данного метода з комплексе диагностических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота,

3. Получить високоспецкфичные иммунные сыворотки против ми-кобакте р:;ад ъшх антигенов, позволяющих использовать их при дифференциальной диагностике туберкуле за кивогных методом И$А.

4. Изучить возможности метода ИСА при выявлении и типизации мнкобактерлй из патологического материала крупного рогатого скота.

[{пучнвд. нов-»1;рнп. Усовершенствован метод повышения специфичности иммунннх сывороток против микобактериальшх антигенов различиях видев, которий позволяет использоват. их для типизации кикобактерий в патологическом мк.ариале с визуальной оценкой результатов "эдлуноферментн 'о анализа. Показана высокая информативность '/¡ФА си-ороток крови крупного рогатого скота при выяснении ?-и£оотической ситуации хозяйств по туберкулезу. Создан "Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА". Отмечена высокая чувствительности и специфичность твердофазного им^ноферментного анализа при выявлении и типизации микобактерий возбудителя тубер-

кулеза крупного рогатого енота.

Практическое значение■ Создание экспресс котода прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА открывает широкую перспективу его применения для выяснения эпизоотической ситуации в хозяйствах но туберкулезу.

Получение внсокоспецифичных иммунных сывороток против мико-Сактериалышх антигенов вносит вклад з разработку метода ди<4фэ-решиалъноИ диагностик:! туберкулеза крупного рогатого скота.

Аппобятн работ». Основше положения работа доложены и об-сужде.чи на Республиканских даучн*.-производственных конференциях Кгзанского ветеринарного института им.Н.Э.Баумана (I988-I99I), Всесоюзной научно-технической кон! ренции "Современные иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной коднщша" (г.Нижний Новгород, 1990), НежвузсвскоЛ на» учно-практической конференции колодцх ученых И специалистов, посвященной 60-летаю Ставропольского сельскохозяйственного института "Вклад колодах ученых и специалистов в науно-техгическнЯ прогресс с/х производства" (г.Ставрополь, 1991).

Публикация результатов доследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

¿ilfgjEXilíiРезультат работа нсполт.зуытся в практике лабораторных исследований Казанского ветеринарного института им.Н.Э. Баумана; включены в учебный процесс по специальностям эпизоотология, микробиология, биохимия.

Казанским ветеринарным институтом оформлено рационализаторское предложение .4 314-91 от 23 мая 1991г. ¡ja загат' выиоегто.^ г

Результаты лаборатордах юследоьиний по создании ускоренного метода диагностики туберкулеза крупного рс атого скота на основании данных ИОЛ сывороток крови, получении г:терц-.:.\гун"<М! сывс-роткк на ЖСО-антиген и использованию их в нммунофермектном анализе при выявлении и типизации возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота.

(?трукгуг>м и объру писсеРТДПИЛ. Работа наложена на 127 страницах (машинописного текста и состоит из введения, oóno¡.. литературы, собственных исследований, заключения, выводов и пряят*. / ких рекомендаций, иллюстрирована 15 таблицах! . 10 рисунка:«!. Список использованной литорату-и содержит 129 цазве-ли:! работ отечественных и 112 - пнс~траншх язтороэ.

2. СОБСТВЕННЫЕ ШЖДОВЛНШ 2.1. Материалы и метода исследований

Работа выполнена в I988-I99I гг на кафедре органической и биологической химии Казанского ветеринарного института им. Н.Э. Баумана.

Использовали пробы сывороток крови крупного рогатого скота (реагирующего и нереагирующего на туберкулин), из благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств ТССР в количестве 3723

Иссле.пуекый патологический материал (заглоточные, брихеечпие сре хтенные лимфоузлы) получали от коров, поступивших в Казанский мясокомбинат, а также проб, поступивших для анализа в Республиканскую ветеринарную лабораторию - 69 гол. В огштах били использована также кролики живой массой 3-3,5 кг (80 голов).

Испольэовапныо культуры микобактериальных клеток, убитые ав-токлавкрованием a.bovis-e, t:. a vi un, М. scotochromoíjeaae, ы.попсп-roaogenoo получены каКу рекой ордена Трудового Красного Знамени биофабрике; w.phlei получен из ВИИВИ.

Антиген из микобактериальных клеток готовили путем обработки их органическими растворителями (ДОСО-антиген). Метод раэработш] на кафедре в 1989 году.

Микобактеркальше клетки из тканей патматериала крупного рогатого скота выделяли методом флотации углеводородами после мягкого разрушения эукариотних клеток с помощью гипотонического раствора, содержащего 0,09? Nací ,0,05$ МвС1г'бН20

В качестве продуцентов гипериммунных сывороток использовали кролико_. Иммунизацию поводили по методу, описанному Harfcoe и., lügHd а. (1977), На 50-й день отирала кровь из ушной вены. Через каздце шесть недель брали очередную порцию крови, причем животному вводили стандартную смось антигена за 8-10 дней до от> бора крови.

Специфичность получению: ан юывороток изучали d динамике в РСК и »'ФА с гоыологичиш-"* антигенами различных микобактериалыш: культур.

О целью .овиаения специфичности, иммунные сыворотки обраба-т^ис—л белково-глутаральдегидшш икыуносорбентом, приготовлении на основе методов Avraraaas S., Ternyack Т. (1969), Frlmal G. (IS84).

Pec-am? свярыванля комплемента проводили согласно наставления по постановке и учету РСК при диагностике туберкулеза жшзот

ных от 15.СВ.78 г.

Постановку реакции нэпряг.юго твердо^язного 1;ммуно$ерментнэ~-го анализа проводили _1о методу о л пеон пому Voller (1078).

Учет результаюв реакции ИЗА проводили визуально и инструментально на вертикальном сканирующем спектрофотометре Titortek Kuitiscan (Швейцария) при длине ваий 402 нм, Sa титр сыворот-ни принимали то ее наивысшее разведение, при котором отнокепио показателя оптической плотности лунок с испытуемой сывороткой к таковым лунок с контрольной сывороткой тото те разведения ровно или более 2,0. Исследуемая сыворотка считалась положятельяо роп~ гирукпеЯ в ИФА если титр специфических противотуберкулезных антител бил мке 1:100.

Постановку КФА проводили в мгосротнтрацконных планшетах дал иммунологических решгций, пеготоалеииых £11?"! и J5T (Г.Москва). В качестве контроля использовали коммерческие позтапздае и Keva-тивгае сыворотки кропи крупного рогатого скота для диагностик;; туберкулеза в ГСК, изготовлзюше на Курской бис'чбрнке*

Конъюгатом слулили яитлтэла диагностические проачг» п-.-муно-глобу.г-'ног кролика и крупного рогатого скота, меченное горокси-двьой, изготевлошюе "ТО "КНЯЩТйВЛ" прзккпдчоР йкохгигоскоИ лаборатория и г, Щелково.

I) качестве суистрг.та '¡и гсг.пяьгззач реегг.ор р~£«и<,.'".;,гдк''':г-т в цитратио-фос^атае».'« бу^зро.

"Коццентрацта б-злкл « про-*"-: уалл с 'ектрс^отс'гтрпчс:)''.-1 метолом тт СС-4Л при дг.аиз полги 230 i:iu

2.2. Получгн. е т-лмушых сывороток нрсиэ мзхс-бгктерпрльнчх антигенов и изуч,',з;::е кич с.-з

Существ} .jt рпашчше схем; глдунизатя! чрол5ткси. Метод, от:-сагашЗ Herboe ц., 1:1.7.111 л, (1977), на наш взгляд, является белее- доступным и простым пр:; получении кроличьих сизопотск и успешно был нами примочен. 3 процессе етстоя!:;к исследоз:?нп.'! полечены иг.:мунше сыворотки против Д'СО-ентнгенов ч. bovis., avicm, ;,'.. phlei, acotochro^.ogonas, и, noncliroiso^eaan.

Титры антисысорстск определялись в ГСК и непрямом в'риантз ИФА, которые составили от 1:140 до 1:180 и от Г:S.CCG0 до х:С '."ГС. соответственно. Нанвисшю титры хчгперпммучп.ых чворотск получены при иммунизации кроликов антигенами к. to vi. о и u.phlei . Несколько ниже титры были при r.v /низгщии их штигеном Li. avion.

Все виды полученных антисывороток проверялись ка ertoци-;.:!ч- .

кость в ИФА против нескольких видов гомологичных шкобактери-ашшх антигенов. Использовались также группы атипичных микобак-терий, такие как окстохромогенные и иефотохромогешшо, типичными представителями которых являются соответственно u.ßordanae,

М. sorofulaceura u Ц.intracellulars, U.'.ettey.

В результате проаедешшч исследований показано, что пшер-иммунныо сыворотки, полученные против соответствующих антигенов кккобактерий, хотя и обладают специфичностью и могут быть использованы при дифференциации этих штампов, межяу некоторыми вида-ми микобактериЯ наблюдаются значителыше перекрестные реакции. Вероятно, это объясняется слояшо!! антигенной структурой микобак-терий и кедостаготао!) чистотой антигена.

Иммунная сыворотка против ДМСО-антигена u.bovis давала наибольшие перекресты на антиген K.nonchroaogonos (к - 1,7)

IS K.yhlei - «.bovis (К-1,6), Ы.nonchrom (K-1,6) IS Ы.sootoohroiü - M.phlei (K-I,'+), U.avium (K-I,7) IS tl.avium - K.bovis (K-I,5), U.phlei lK-I,4-,

U.nocchronogenes (K-I,7).

Из всех полученных антисьшороток наиболее неспецифичной оказалась кииуиная сыворотка против птичьего вида микобактсрии, которая позволяет дифференцировать с коэффициентом специфичности (К) 2 только мккобактьрнй сиотохромогенной группы.

Большое влияние оказывает на специфичность иммунных сывороток и сроки иммунизации животных. Наиболее специфичные антитела образуются в белее поздних сроках иммунизации. Все выше указан-1Ы антчсыворотки были получены ¡¡а 170-й день с начала иммунизация, В начальных этапах коз;|фкцизп'гы специфичности иммунных сывороток намного mixte.

Особенно большие титры специфических на n.aviаа антител наблюдается в начальных етапах при м/луниоации со всеми видами мп?сбаь:терий, которые сохраняются на доволь-.о высоком уровне и в коте иммунизации.

Облад тай значител. .ой простотой, высокой производительностью и чувег дельность», метод ИФА с использованием высоко-спеп 'ическет аитиемворотох перспективен для выявления и типизации глжобактер/апьных антигенов в патологическом материале исследуемых на туберкулез животных. Однако,-низкая специфичность ]'"которнх иммунных сыьороток могут вызвать затруднения при диМ<гренцкш»ин микобактериалышх антигенов по визуальной

оценке результатов кммунофврментного анализа.

Учитывая это, дальнейшая нала работа была направлена на повышение специфичности долученных иммунных сывороток лабораторными методами. В этих целях использовали метод иммунссорбентной очистки антисывороток. В качестве кммуносорбента использовали целые микробные клетки, Кдаунные сыворотки-пятикратно обрабатывали свежими порциями тарное рбента при 37°С в течение 2-х часов при постоянном перемешивании.

В результате проделанной работы нам удалось в несколько раз повысить специфичность антисывороуок.

Перекрестные реакции между различными видами сывороток и ми-кобактериальныма антигенами из различных видов, наблюдала только в разведениях 1:100 - 1:150, в то время как специфические сыео-ротки против соответствующих антигенов работали в разведениях свыше 1:30000.

Таблица I

Сравнительна* характеристика иммунной сыворо: и протиз tjj. '¿£$¡4 до и после обработки иммуносорбентом

До обработки юлуносорбентом I После обработки иммуносорбентом

Показатели!Коэффици- Í Антигены i Показатели!Коэффгаи-1Антигены is M.bovi.ienT спеть!микобакте-!15 H.boviaieHT спе- ¡мияобакте-ü ИФА в 1фичности !ряй !в 1№А в !цкфичпос-!рий

разведении! (к) ! ¡разведении!ти !

1:256 ! ! ! 1:253 ' (к) !.

1,26 U.bovle 0,695 М.bovii

0,45 2,8 M.phlei 0,173 4,1 M.phlel

0,58 2,1 M.scotochr. 0.T9I 3, ó M. eootochr.

0,74 K.nonchrora. 0,134 3,7 K.nonchron.

0,45 2,8 Ы. avlura 0,181 3,8 M. svium

Из данных представленных з таблице видно, что обработка та-глуносорбентом значительно повышает специфичность иммугих сывороток против и.ЬоуАз . Так, если до обработки коэффициент с.пе-шф!чносги (К) антисыворотки против антигена м.попсЬгоп. всего лишь 1,7, то после очищения этот показатель составляет 3,7. Увеличилось специфичность данной сыворотки и прот!"* остальных в:;лсе шкобактерий.

Применение в ИФА гипеу иммунных сывороток против ДКО-анткге-

нов микобактерий, истоидашшх кшуносорбентом, позволяет ди$фе-рещировать микобактериальиые антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5, что является достаточно высокими показателями специфичности полученных антисывороток,

Исходч их этих результатов можно аключить, что антисыворотки полученные против соответствующих ДМСО-алтигеиов ыикобак-териалышх культур и обработанные кшуносорбонтом обладают достаточно высокой специфичностью и успешно могут быть использованы при типизации этих ишшоа, что является ватам шагом в создании ькспресс катода для выявления и дифференциации возбудителя »./беркулеза в патологическом материале.

2,3. Исследования прсб сывороток крови и патологического материала крупного рогатого скота методом IBA

Исходя из имеющихся данных, указывающих на то, что адсорбция на полистирол определяется количеством и строением молекулы используемого антигена, а также из исследовании, указывавших на необходимость тщательного определения оптимальной концентрации антигена для наекцоиия поверхности твердой фазы, так как это позволяет устранить многие артефакты ИФА, нами проведено исследование по определению оптимально!! концентрации ДМСО-ьнти-гена при адсорбции в лунки полистирольного планшета для иммунологических рзаип:!;.

С этой целью адсорбцию ДУ.СО-актигена ы.bovis в лунки микропланзет проводили и диапазоне концентрации 32-0,25 ыхг/мл. Максимальная величина коэффициента специфичности отмечается при адсчрбт.-i антигена в концентрации 2 мкг/мл, Дальнейшее увеличение или уменьшение концентрации приводит к снижению как специфичности, так и чувствительности анализа и появлению ложнополо-кительккх результатов. Эта концентрация антигена и была использована нами в дальнейшие опытах.

При шдуноферментном анализ« онвороток крови, большое значение имеет определение ср^ов годности тчунологических планшет с адсорбированным антигеном ы.bovis. .

Выполняя .ту задачу, партию планшет с адсорбированными антигенов хранили в течение года в разных условиях периодически определяя активность адсорбированного антигена методом ПОА.

üp;i sтс:.; антиген ы.bovis вносили в лунки планшетов в концентрат;« с (.жг/гл. и инкубировали их в термостате при 37°С в

течение трех часов. После промывки планиетов оставшиеся свободные места блокировали 2% раствором яичного альбумина в твин-фос-фатно-солевом буфере.

Одна партия планшетов, обработанная таким образом, хранилась в полиэтиленовых мешочках при комнатной температуре, другая ~ при +4°С.

В течение года, каждый месяц, определяли активность иммуно-логиче ;k:ix планшет с адсорбированным антигеном в серологической роi-jai.iiи с помоцьг метода КФА.

При хранении в условиях комнатной температуры активность иммунологических плансет с 7-го месяца хранения начинает закономерно снижаться и у:ге к 10-t.fy месяцу эта активность фактически равна нулю.

При хранении хе их iir i +4°С иммунологическая активность адсорбированного антигена, с истечением 12 месяцев снизилась незначительно и продолжала оставаться на высоком уровне, позволяющем использовать тпк'ие планшеты для постановки реакции ПСА при определении специфических противотуберкулезных антител в сыворотке крепи крупного рогатого скота.

Одной из задач пппей работы было создание ускоренного метода диагностики туберкулеза крупного рогатого скота путем исследования сывороток крови методом IMA и определение его места в комплексе диагностических мероприятий против туберкулеза.

Выполняя эту гапачу, и с целью выявления специфичности Д'СО-пнтигенл ¡л.bovis по отношению к другим видам кикобактерий, исследовали пробы сывороток крови крупного рогатого ско^а из различных по эпизоотической ситуации на туберкулез хозяйств ТССР,

Всего исследовано 3723 проб сыворотки крови положительно л отрицательно реагирующего на тубэркулш поголовья .-азотных. Параллельно результатом исследований методом ИФА, учитывались данные аллергических проб геивотшх в тз^ я? хозяйствах за последние 3 года.

Из благополучных по туберкулезу хозяйств исследовано 1053 проб сыворотки крови. В 23 хозяйствах, где за последа 3 года по выявлено ни одного животного, положительно реагирующего на туберкулин, результаты иммунофер.'зптного анализа были отрицательными. Однако в 48 про ix из 4-х хозяйств обнаружены специфические противотуберкулезные антитела. .

Из неблагополучных ,цо туберкулезу хозяйств било исследовано 2670 проб сыворотки. 426 из них при иммуноферментном анализе дали положительную, реакцию.

2445 проб сыворотки крови из неблагополучных по туберкулезу хозяйств были исследованы иыыун офе рме н т ны м методом в сравнении с результатами аллергической п обы у тех же животных, в том числе 663 проб от реагирующих и 1782 - от не реагирующих на ту-бер!^'лин животных»

При исследовании сывороток от 663-х реагирующих на ГЩ животных в 330 пробах обнаружены противотуберкулезные антитела в титрах, позволяющих отнести их к положительно реагирующим, а в 333 пробах сывороток получены отрицательные результаты. В процентном отношении соответственно 49,8$ и 50,2°',

При анализе методом ИФА проб сыворотки крови животных, не-реагирующих на туберкулин (1782 головы) были получены следующие результата*

158 проб (8,91$) - с положительной реакцией 1624 проб (91,1$) - с отрицательной реакцией Для определения степени достоверности наших данных производился контрольный убой этих животных и натолого-анатомический анализ тканей. Полученный патматериал подвергался параллельно исследованиям методом.иммуноферментного анализа на выявление микобактериальнкх антигенов.

Нами произведено исследование патологического матери.ша от 69 голов крупного рогатого скота, убитых на Казанском мясокомбинате , в том числе.от 33 головы реагирующих и от 36 голов не-реагирующих на 1Щ, но имеющие высокие титры специфических антител против bovis при ИФА сывороток крови.

При убое 33 животных из группы реагируюдах на туберкулин У 18 голов обнаружены характерные для туберкулеза патолого-анато-мические изменения. А при анализе методом КОЛ паткатериала были выявлены еще 5 голов крупного рогатого скота больных туберкулезом. (Результата подтверждены данными Республиканской нетлчборатории) .

Таким образом, в дан:-ом случае можно слазать, что степень достоверности-выявления болышх туберкулезом животных аллергической пробой, составило 69,1%.

В 5 случаях из тканей органов, с выраженным туберкулезным процессом в средостенных лимфоузлах не удалось выделить микобак-

териальныЯ антиген.

12 проб сывороток этих ко 33-х животных показали отрицательные результаты при ммуноферментнем анализе. Результаты патолого-анатомического исследования доноров атих сывороток и исследования патмате риала с помоцью ИФА показали отсутствие возбудителя туберкулеза в 10 из них. И только в 2-х случаях были обнаружены характерные для туберкулеза патолого-анатомические изменения в сремогтошдах лимфоузлах. Следовательно, если наряду с ачлс.ги-ческш методом диагностики туберкулеза применять иммунофермент-ний квтод анализа сывороток крови, то степень достоверно вняв-ленных больных туберкулезом животных составит уже не 69,7'/?, а 92,4;?.

При рассмотрении данных иммуноферментного анализа сывороток крови животных, нереагирусщих на туберкулин видно, что 158 исследованных проб имеют положительные результаты, 36 голов из этого числа дивотшх были забиты и патматериал бил подвергнут патолого-анатомическилу исследованию и иммуноферментиому анализу,

В результате у 18 голов обнаружены характерные для туберкулеза патолого-анатомические изменения и еда в II случаях без видимых патологс-анятомических иаченений реакция в ИФА была положительной.

Таким образом, нмшши исследованиями установлено, что пмму-HOffept.wHTHiiil анализ сывороток крови животных из неблагополучных по туберкулезу хозяйств дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям, повышая таким образом эффективность диагностики туберкулеза.

Использование метода ИФА позволяет установить наличие возбудителя туберкулеза и тканях убитых животных путем исследования специфических ¡млушгдх сывороток в течение суток, в то время как сук;зстяу;а>{кэ методы отнимаю» для этих иелей до двух месяцев времени. Чувствительность метода И-5А при этом составляет 10 м.кл./г ткани ми 100 микробных клеток на /л1 тксли.

Для определения чувствительности мзтедз ИФА ткани здоровых ■'наотных искусственно заражали бактериями к.bovis (EIS) дозами от 10 4 до 10 микробных клеток на грамм ткани. Выдерживали 30 минут при комнатной температура и после соответствующей обработки патматераала выделяли мякобактериалышй антиген и ставили реакцию нммуноферментного анализа. Результаты приведет; в таблице 2.

Таблица 2

! Дозы микобактерий м.кл./г

! тп7 í Kf ! г. __1С1 . !

13 0,83 0,63 0,72 0,48

NS 0,38 Dt 32 0,34 0,35

К 0,18 1,96 2,04 1,37

is - сыворотка позитивная для диагностики туберкулеза в ГС К NS - сыворотка негативная для диагностики туберкулеза в РСК К - коэффициент специфичности

Результаты работ по определению специфичности полученных гп-перилмунных противотуберкулезных сывороток, а такке rio определению чувствительности метода ¡¡ФА при выявлении микобгжтернй ".bovis в патологическом материале с использованием этих сывороток подтверждены меквузовским комиссионным испытанием.

Использовав в исследованиях по выявлении туберкулезных антигенов методом ИФА, в качестве патологического материала заглоточные, средостенгше, брыгсеечные лимфоузлы убитых на мясокомбинате животных попытались показать некоторую .-.заиыосвязь кежду титрами сывороточных противотуберкулезных антител и шрадвншпга туберкулезными изменениями в лимфоузлах.

Оказалось, что наибольшее количество патологических изменений, характерных туберкулеза, обнаруживается в средостонннх лимфоузлах. Caí,тал низкая поражаемость - у брихесшых лш$оуа'к>в. Однако при осмотре пораженности лимфоузлов в зависимости от титров сывороточных противотуберкулезных антител, ииявляег.ость больного туберкулезом крупного рогатого скота методом i НА сывороток крови выше у животных с поражениями брыжеечных и заглоточных лимфоузлов. Средний титр антител в №&Л в откх случаях соответственно составляет 1:5800 и 1:2£С0. У янвотгшх с поражениями средостенных лимфоузлов этот показатель намного ниже и составляет 1:1600 и есть случаи необнаружения в сыворотках крови антител против ы.bovis методом ИФЛ,

2.4. Приготовление "Набора препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА"

На основании полученных результатов исследований по диагностике туберкулеза крупного рогатого сгота методом иммунофермент-ного анализа ними приготовлен "Набор препаратов для выявления антител к возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота методом ЮЛ".

Техническое задание на разработку нибора утверздено 1УВ 1'ЗХ СССР в адию реалио'лиш задания, утвержденного постановлением ПК КПС : л СМ СССР от CG.0I.P3 г. га !* 0.CX.6I.

Данный набор предназначен для исследования сывороток крови крупного рогатого скота с целью впявлення эпизоотической ситуации по туберкулезу в хозяйствах.

Одним набором мохно исследовать ТОО проб сыворотки крови. В набор входят 5 планшетов с адсорбировандам на них антигеном !л,boviз и гее компонента, необходимые для постановки реакции игмуноферме нтного анали за.

К набору препаратов прилагается упаковочный лист и наставление по применению. Биопрепараты, входяэде в набор, расфасованы в ампулы с указанием на этикетке наименования. препарата, количества его в ампуле, номера серии, рабочего разведения, даты изготовления. Набор хранят в сухом темном месте при температуре t-4°C. Срок годности набора - 12 месяцев со дня изготовления.

ЖА проводят в непрямом варианте с использованием компенен-тов, входящих в набор.

Пригодность "Набора препаратов для выявления антител к возбудителю туберкуле па крупного рогатого скота методой И5Л" проверялась межвузовским комиссионным пепытттем. На основании анализа получе"ных результатов ко'лисс1!Я заключила, что предлагаемый нвмп набор пригоден по своему целевому назначению и метод KÎA может слу.тать для получения дополнительной информации к аллергической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

Комиссия рекомендовала представить в Главное упрг лепио ветеринарии МСХ СССР 1ВД я опытную партию набора.

выводы

1. Путем иммунизации кроликов ДМСО-антигеном и последующей иммуносорбентной очисткой получены, высокоспецийичные иммунные сыворотки против соответствующих видов микобактерий, пригодные для типизации возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе.

2. Отработан режим твердофазного иммуноферментного анализа для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

3. Определена чувствительность метода ПСА при выявлении микобактерий и.ЪоуХв в патологическом материале, что составляет 100 микробных клеток на мг ткани.

4. Исследованием проб сывороток крови из различных по эпизоотической ситуации хозяйств ТССР, положительно и отрицательно реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, установлено, что если наряду с аллергическим методом диагностики туберкулеза применять иммуноформентны¡1 метод анализа сывороток крови, то степень достоверно выявленных больных туберкулезом животных составит 92,4$.

5. На основании проведенных исследований создан "Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИСА". Научно-техническая документация и опытная партия набора представлены в Г/В ЫСХ СССР.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПИ2ДЛ(КЕНИЯ

1. Усовершенствованный метод повышения специфичности иммунных сывороток против микобактериалышх антигенов может быть использован при создании набора препаратов для выявления и типизации возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота в патологическом материале.

2. "Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИСА" реко.ме;иуетсл для использования при выяснении в хозяйствах эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота.