Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.08) на тему:Идентификация жиров животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

На правах рукописи

ГЛЕБОВ РОМАН ИГОРЕВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЖИРОВ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

16.00.08 - гигиена животных, продуктов животноводства и ветеринарно-санитарная экспертиза

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научные руководители: /

- доктор ветеринарных наук, профессор В.И. Родин

- кандидат химических наук К.И. Элл€

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гигиеническая характеристика жиров............................................................10

1.2. Ветеринарно-санитарная экспертиза пищевых животных

жиров..................................................................................................................................................................21

Определение триацилглицеринового состава животных жиров

1.3 Методы анализа триацилглицеринов

1.3.1 Методы выделения и очистки фракции ТАГ.............................................22

1.3.2 Капиллярная газожидкостная хроматография.......................................2 6

1.3.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография.................................35

1.3.4 Методы получения "узких" фракций ТАГ из природных жиров..................................................................................................................................................................41

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований........................................................................4 9

2.1.1 Материалы для изучения.............................................................................................4 9

2.1.2 Изучение эффективности растворителей и их смесей

для экстракции ТАГ...........................................................................................................................50

2.1.3 Определение общей суммы липидов..................................................................51

2.1.4 Выделение фракции триацилглицеринов из общих липидов...51

2.1.5 Определение жирно-кислотного состава фракций ТАГ...............52

2.1.6 Определение молекулярных видов ТАГ методом ВЭЖХ..................54

2.1.7 Идентификация молекулярных видов ТАГ...................................................56

2.1.8 Дополнительные расчеты для программы идентификации

ТАГ и оценки хроматографических параметров системы........................58

2.1.9 .Графические методы сравнения молекулярного

спектра ТАГ животных жиров...................................................................................................59

2.1.10 Определение суммарного пула ТАГ и

степени его очистки........................................................................................................................59

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Эффективность растворителей и их смесей для экстракции ТАГ.....................................................................................................................................................................61

3.2 Общее содержание липидов в исследованных образцах...............64

3.3 Определение молекулярных видов ТАГ методом ВЭЖХ.....................64

3.4 Молекулярный спектр триацилглицеринов животных жиров......69

3.5 Анализ триацилглицеринового спектра

животных жиров графическим способом.....................................................................72

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................................................8 4

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.............................................................................................8 7

6. ВЫВОДЫ...................................................................................................................................................88

7 . СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................90

8. ПРИЛОЖЕНИЯ....................................................................................................................................106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

ТАГ - триацилглицерины

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГЖХ - газожидкостная хроматография ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты ПСК - показатели состава и качества

ТН ВЭД СНГ - товарная номенклатура внешнеэкономической деятельности Содружества независимых государств ЖК - жирная кислота

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

ВВЕДЕНИЕ

Качество и ветеринарное, состояние продуктов животноводства при их производстве в хозяйствах, на предприятиях по переработке, в местах хранения и реализации контролируют ветеринарные специалисты. Правильная организация и обязательный ветеринарно-санитарный контроль обеспечивают выпуск экологически чистых продуктов высокого санитарно-гигиенического качества.

Статистическая информация об объемах мировой торговли жирами и маслами животного и растительного происхождения наглядно показывает, что данный сектор мировой экономики проявляет стабильную тенденцию к росту продажи. По данным бюллетеня "Таможенная статистика внешней торговли Российской Федерации" за 1997г., экспорт в Россию масел и жиров в этот период составил 1.140.200 т на общую сумму 652.033,3 тыс. долл. США, из них на долю животных жиров пришлось 11.27 6 т на общую сумму 6.144,2 тыс. долл. США.

Значительный и постоянно увеличивающийся объем потребления масел, жиров и родственных им продуктов и, как следствие, большие возможности для получения стабильной и долговременной прибыли, агрессивная конкурентная борьба - косвенные причины, приведшие к появлению на рынке фальсифицированных жировых продуктов.

Действующие в настоящее время в России нормативные документы и применяемые аналитические методы идентификации, основанные на определении физико-химических характеристик исследуемых объектов, не позволяют достаточно точно классифицировать жировые продукты, оценить их пищевую ценность и выявить случаи фальсификации. Поэтому возникла необходимость

разработать методы достоверной идентификации природы и характеристического компонентного состава жировых продуктов, основанные на результатах определения состава жирных кислот и анализа молекулярных форм триацилглицеринов.

Вопреки традиционному мнению, роль жиров в питании не ограничивается их энергетической ценностью. Животные жиры содержат биологически активные вещества: витамины А и Е, антиоксиданты, незаменимые жирные кислоты, стерины,

углеводороды. Химический состав многих компонентов важнейших пищевых жиров до настоящего времени изучен недостаточно полно. Это в первую очередь касается триацилглицеринов, что связано с несовершенством существующих методов их разделения и идентификации. Имеющиеся многочисленные данные о жирно-кислотном составе жиров (известны видовые особенности состава жирных кислот большинства пищевых жиров) не могут отражать структуры индивидуальных ТАГ, так как сочетание жирных кислот в них весьма разнообразно. Основные и минорные виды ТАГ в животных жирах определяют ряд физиолого-биохимических характеристик, связанных с утилизацией жиров в организме: скоростью всасывания, формирование определенных эндогенно-образованных видов ТАГ, их метаболизм и др. С биологической и медицинской точек зрения небезразлично, в какие молекулярные виды ТАГ потребляемых жиров входят, например, коротко- и среднецепочечные жирные кислоты, являющиеся энергетически важными, особенно для детей раннего возраста, для больных, страдающих тучностью, и спортсменов; жирные кислоты, являющиеся предшественниками простагландинов (20:4ю6, 20:5соЗ и др.); миристиновая, обладающая наибольшей способностью индуцировать гиперхолестеринемию, что является

фактором риска для лиц, предрасположенных к атеросклерозу; докозагексаеновая (22:бсоЗ), являющаяся эссенциальной для детей раннего возраста и входящая в липидные структуры мозга. Понимание биохимических основ метаболизма индивидуальных ТАГ необходимо для разработки научно обоснованной диетотерапии болезней, при которых нарушается обмен липидов. В промышленных жирах (маргарины, саломасы, кулинарные жиры и др.)г для изготовления которых используют гидрирование или

переэтерификацию определенных исходных продуктов, изучение ТАГ состава также является необходимым для сравнения образующихся ТАГ с индивидуальными ТАГ в нативных "традиционных" маслах и жирах.

Для анализа индивидуальных ТАГ в жирах разработаны физико-химические и биохимические методы. Все они включают этап хроматографического разделения [58, 67, 69, 70, 82, 83, 96, 97, 104, 118] с последующей идентификацией. Рассматривая современное состояние проблемы анализа индивидуальных ТАГ, представлялось целесообразным модифицировать и усовершенствовать, главным образом, процесс их идентификации [8, 14-28]. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования являлась разработка метода идентификации (определения видовой принадлежности) жиров животного происхождения, основанного на применении

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для достижения поставленной цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Дать оценку точности методов определения видовой принадлежности жира путем изучения физико-химических свойств и состава жирных кислот триацилглицеринов.

2. Изучить эффективность и экстрагирующую способность растворителей и их смесей для экстракции фракции триацилглицеринов.

3. Разработать программу идентификации индивидуальных ТАГ с помощью ЭВМ.

4. Изучить триацилглицериновый состав гусиного, куриного, утиного, свиного, говяжьего, бараньего жиров и жира кролика методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с многоканальным УФ-детектированием.

5. Разработать основные критерии, позволяющие проводить идентификацию и ветеринарно-санитарную оценку качества жиров, импортируемых на таможенную территорию России.

6. Разработать методические рекомендации по анализу мультикомпонентного состава жиров, включающего в себя определение видовой принадлежности, определение наличия гидроперекисей и сопряженных двойных связей, определение содержания витаминов и стеролов.

7. Внедрить в Центральной таможенной лаборатории ГТК России, и региональных таможенных лабораториях ГТК России разработанные методические рекомендации.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Условия подготовки жиров, масел и родственных им продуктов для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

2. Идентификация и определение показателей пищевой и биологической ценности жиров животного происхождения;

3. Создание коллекции хроматограмм жиров различных животных и птицы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гигиеническая характеристика жиров

Общие свойства жиров

Жиры растительного и животного происхождения не являются однородными и химически чистыми веществами, а представляют собой смесь сложного состава, в которой наряду с основным компонентом-сложными эфирами жирных кислот и глицерина (собственно жирами) присутствуют различные минорные компоненты, рассматриваемые как примеси к жиру. К числу примесей относятся воски, стеролы (стерины) и их эфиры, фосфолипиды, свободные жирные кислоты, пигменты, жирорастворимые витамины, смолы, слизистые и белковые вещества и пр. Восками называют соединения типа сложных эфиров, образуемых жирными кислотами и одноатомными высокомолекулярными спиртами. К воскоподобным веществам относят также и высшие алифатические углеводороды (парафины). Стеролы (стерины) являются алициклическими спиртами, относящимся к замещенным циклопентанопергидрофенантрена. Фосфолипиды (фосфатиды)

представляют собой сложные эфиры глицеридов и фосфорной кислоты (свободной или этерифицированной азотистым основанием). В числе пигментов встречаются хлорофилл, каротин, ксантофилл и госсипол. Все жиры обладают рядом общих свойств, а именно: они легче воды, имеют удельный вес в пределах от 0,9 до 0,98 (за исключением жира, именуемого японским воском, удельный вес которого при температуре 15 °С составляет 0,963—1,006); на бумаге оставляют жирное пятно, не исчезающее при нагревании, обладают значительной вязкостью, вызывающей ощущение жирности на ощупь. В

воде жиры не растворимы, в присутствии же белковых, слизистых веществ или щелочей образуют с водой эмульсию. Жиры легко растворимы в органических растворителях, например в этиловом эфире, сероуглероде, бензине, хлороформе, четыреххлористом углероде, трихлорэтилене, дихлорэтане и пр. Жиры имеют низкую летучесть и при повышенной температуре разлагаются.

Температура, при которой начинается разложение, для разных жиров неодинакова и находится в пределах 250—300°С. Жиры загораются с трудом, но с фитилем горят легко, образуя светящееся пламя. Температура воспламенения для большинства жиров выше 300 °С [15] .

Значение жиров для животных организмов

Жир животных отлагается в жировой ткани, стенки клеток которой образованы коллагеном. Жиросодержащие ткани в животном организме располагаются в самых разнообразных местах: в подкожной клетчатке, между мышцами, вокруг некоторых внутренних органов. Жир входит в состав костного мозга и участвует в образовании нервной ткани. Обладая высокой энергетической ценностью, жир имеет большое значение для животного организма. Жир, расположенный в подкожной клетчатке и покрывающий достаточно толстым слоем все тело хорошо упитанных животных, в особенности полярных, имеющих постоянную температуру крови (тюлень, морж, белый медведь, китообразные), является хорошим изолятором, предохраняющим организм от потери тепла. Этим объясняется способность упомянутых животных сохранять высокую температуру тела (+38, +40°С) при низкой температуре

окружающего воздуха (-40, -50°С). Кроме того, жир, находящийся

в соединительной ткани, заполняющей в брюшной полости

пространства между отдельными органами (около почек и др.), благодаря своей упругости и эластичности механически защищает (амортизирует) их от сотрясений и смещений. Как подкожный, так и внутренний жир являются основными резервами энергии, используемыми в момент наибольшего расхода ее организмом, поэтому они называются "жир-депо" [15] . Жир, входящий в состав костного мозга и нервной ткани, обычно не является запасом энергии, а непосредственно участвует в построении этих тканей. Этот вид жира по своему физиологическому назначению отличается от "жира-депо" и может быть назван "конституционным жиром". Конституционный жир расходуется только в исключительных случаях — в период усиленного голодания организма. Жиры разных видов животных организмов отличаются друг от друга по своему качественному составу. Например, жиры человека, кролика и зайца отличаются температурами плавления, которые обусловливаются свойствами входящих в них жирных кислот. Температура плавления жира взрослого человека 21°С, кролика 40°С, зайца 42°С. Жиры одного вида животных по своим физико-химическим свойствам более или менее постоянны. Однако свойства эти варьируют в зависимости от места отложения жира в организме животного, его возраста, а также условий питания. Многочисленные наблюдения показали, что жиры, отложенные в разных тканях животного или участвующие в строении их клеток, различны «по своему химическому составу, который зависит от физиологических функций органов и тканей, а также от температурных условий той области, где они отложены.

Классификация жиров

Все жироподобные вещества (липиды) подразделяются на следующие три группы: собственно жиры, являющиеся сложными эфирами жирных кислот и глицерина; воски — тоже сложные эфиры, но образуемые жирными кислотами с одноатомными и двухатомными высокомолекулярными спиртами, и липоиды — также сложные эфиры. Группу липоидов составляют фосфатиды и стерины. Каждая из указанных групп, в свою очередь, делится на подгруппы в зависимости от природы их происхождения. Установившиеся наименования некоторых жироподобных веществ иногда не соответствуют их химической природе. Это порождает неясность в определении их принадлежности к тому или иному классу. Например, японский воск представляет собой сложный эфир жирных кислот и глицерина, т.е. настоящий жир, а именуется воском. Шерстяной жир и спермацетовое масло по химической природе являются восками. Наряду с принятыми для этой группы органических соединений наименованиями некоторые из них, в частности жиры растительного происхождения и молочный жир, имеют и другое название — масла. В основу классификации жиров положен признак их происхождения; каждую группу подразделяют на подгруппы в зависимости от консистенции жиров; и, наконец, каждая из этих подгрупп в зависимости от физико-химических особенностей ее представителей распадается на ряд более мелких. По происхождению жиры разделяют на две основные группы: растительные и животные. И в тех и в других в качестве примеси находятся незначительные количества высокомолекулярных спиртов, именуемых стеролами (стеринами), причем в жирах растительного происхождения

присутствует от 0,1 до 0,3% фитостеролов (бета-ситостерины, стигмастерины и др.), имеющих определенную кристаллическую структуру и плавящихся при температуре 135—14 0°С. В животных жирах стерины представлены в основном холестерином в количествах, не превышающих долей процента, с температурой плавления 14 7,5°С. Поэтому примесь животного жира в растительном, а также растительного в живот