Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Фенотипические свойства и эпизоотологическая значимость E.coli O157:H7

На правах рукописи

ОНИЩЕИКО ИРИНА СЕРГЕЕВНА

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Е. СОЫ 0157:Н7

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микоюксикологисй и иммунология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Новосибирск - 2008

ооз

003168347

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнею Востока Сибирскою отделения Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель доктор ветеринарных наук, профессор

Шкпль Николаи Алексеевич

Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор

Ковальчук Наталья Михайловна,

кандидат ветеринарных наук Вольф Виктор Теодоровпч

Ведущая организация Институт ветеринарной медицины

Омского государственного аграрного университета

Защита состоится « 29 » мая 2008 г в у/ ч на заседании диссертационного совета Д 006 045 01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу 630501, Новосибирская область, Новосибирский р-н, п Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии

Автореферат разослан «•//» ОпргЛ<Я 2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета (_ У ^т» "" Стеблева Г М

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Болезни желудочно-кишечного тракта (гастроэнтериты, гастроэнтероколиты), вызываемые токсинами эшерихий, распространены повсеместно и поражают сельскохозяйственных животных различных видов, поэтому представляет одну из сложных проблем для современной ветеринарии В последние годы во многих развитых странах колибактериоз находится под пристальным вниманием ветеринарных и медицинских специалистов, а также Всемирной организации здравоохранения, так как важную роль в инфекционной патологии человека и животных стали играть эше-рихии, вырабатывающие Шига-подобные токсины (веротоксины), в том числе и Е coli 0157 Н7 (А В Куликовский, А Н Панин, 1997) Данный серотип кишечной палочки приводит к возникновению у людей геморрагического колита, который может осложниться гемолитико-уремическим синдромом (ГУС) и тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП), а у молодняка крупного рогатого скота - диареи с признаками геморрагического гастроэнтерита и отечной болезни у свиней (Ю Г Степашин, Э А Светоч и др , 2005) Несмотря на достаточно широкое изучение Е coli 0157 Н7 в медицине, в ветеринарии проведены отдельные исследования по выявлению частоты выделения и бактерионосительства данного микроорганизма среди различных видов животных, птицы и человека При этом пока нет достаточных данных о патогенных свойствах Е coli 0157 Н7 и резистентности к антибактериальным препаратам В России отсутствуют данные о носительстве Е coli 0157 Н7 среди мелких домашних животных

Также в ветеринарии не совершенна бактериологическая методика выделения и идентификации Е coli 0157 Н7 из биологического материала

В связи с этим возникает необходимость изыскания новых подходов к профилактике инфекций, вызванных Е coli 0157 Н7, и борьбе с ней Для этого требуется комплексный подход к изучению широкого спектра биологических свойств возбудителя и совершенствование бактериологического метода выделения и идентификации Е coli 0157 Н7

Цель работы - изучить фенотипические свойства и эпизоотологиче-скую значимость Е coli 0157 Н7

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи

1 Определить частоту выделения Е coli 0157 Н7 из различных экологических ниш

2 Изучить биологические свойства изолятов Е coli 0157 Н7

3 Изучить биохимические свойства и их вариабельность

4 В экспериментальных условиях изучить эпизоотическую значимость носительства Е coli 0157 Н7 у мелких домашних животных

Научная новизна.

Получены данные о частоте выделения Е coli 0157 Н7 из различных экологических ниш

Впервые на территории России установлена эпизоотологическая значимость бактерионосительства у собак и кошек

Получены данные о восприимчивости мелких домашних животных к Е coli 0157 Н7 "

W '

Установлена вариабельность биохимических свойств выделенных изо-лятов, свидетельствующая о генетической разнородности популяции Е coli 0157 Н7.

Практическая ценность работы.

Усовершенствована методика выделения и идентификации энтероге-моррагической кишечной палочки серотипа 0157 Н7 из биологического материала от животных

Оформлена заявка на патент «Способ выделения и идентификации энте-рогеморрагической кишечной палочки Е coli 0157 Н7 в биологическом материале от животных», № 2006141983 от 27 11 2006

Получено свидетельство в ФГУ ФИПС об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007613064 от 18 июля 2007 г. Экспертная система «Биохимия микроорганизмов 2 0»

Подготовлены методические рекомендации по выделению и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е coli 0157 Н7 из биологического материала животных и птицы, утвержденные ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 3 от 30 октября 2007 г) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №3 от 30 октября 2007 г) Апробация работы. Материалы исследований доложены на заседаниях ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ (2004-2007 гг), на Сибирском международном ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2005 г)', на международной научно-практической конференции (Барнаул, 2005 г), на VI Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2006 г), на второй Международной научно-практической конференции молодых ученых (Новосибирск, 2006 г), на международной научно-практической конференции (Москва, 2006 г), на международной конференции (Ульяновск, 2006 г), на третьей Российской научно-практической конференции с международным участием (Новосибирск, 2006 г), на международной научно-практической конференции (Новосибирск, 2006 г), на VIII Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2008)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 работы в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ ("Сибирский вестник сельскохозяйственной науки" и "Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук")

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 123 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы и приложения Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками Список литературы включает 201 источник, в т ч 140 - зарубежных авторов Основные положения, выносимые на защиту:

- усовершенствование методики выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки 0157 Н7 из биологического материала,

- результаты исследований по частоте выделения Е coli 0157 Н7 из различных экологических ниш,

- биологическая характеристика изолятов Е coli 0157 Н7, выделенных от различных видов животных и человека,

- эпизоотическая значимость носительства Е coli 0157 Н7 у мелких домашних животных

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований. Диссертационная работа выполнена в 2004-2008 гг в лаборатории болезней молодняка сельскохозяйственных животных Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, в хозяйствах Новосибирской области и Алтайского края, в ветеринарных клиниках г Новосибирска, а также в детской инфекционной больнице Новосибирской области

Выделение чистой культуры Е coli 0157 Н7 из биологического материала (кал, молоко) проводилось в соответствии с "Методами выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е coli 0157 Н7" (методические указания МУК 4,2,992-00) Однако в процессе выполнения данной работы методика выделения Е coli 0157 Н7 была модифицирована для идентификации данных микроорганизмов из биологического материала от сельскохозяйственных и мелких домашних животных

Для выделения чистой культуры Е coli 0157Н7 использовалась селективная среда Эндо, элективная среда - сорбитол-агар и SDS-бульон

Изучение морфологических и ферментативных свойств, чувствительности к антибактериальным препаратам, а также определение патогенности выделенных культур Е coli 0157 Н7 проводилось согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденных Департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации от 27 07 2000 года

В целях изучения частоты выделения Е coli 0157 Н7 от сельскохозяйственных, мелких домашних животных, пушных зверей и птиц было отобрано 1246 проб биологического материала и 359 проб кала от людей, в том числе 306 проб кала от детей с клиническими признаками энтерита, гастроэнтерита и острой кишечной инфекции и 53 пробы от клинически здоровых взрослых людей

Из выделенных культур Е coli 0157 Н7 готовились мазки и окрашивались по Граму Подвижность данных культур исследовалась в препарате «раздавленная капля»

Серологическая идентификация энтеропатогенных изолятов Е coli определялась при помощи реакции агглютинации (РА) на стекле с агглютинирующей сывороткой к адгезивным антигенам эшерихий 0157

Для определения патогенных свойств изолятов Е coli 0157 Н7 использовались 264 беспородные белые мыши весом 10-15 грамм Для этого культуры выращивали на МПА при температуре 37 °С в течение 18-20 часов, смывали стерильным физиологическим раствором и доводили до концентрации 1 млрд КОЕ/мл по стандарту мутности Белых мышей заражали внутри-брюшинно, вводя каждой по 0,5 мл (500 млн КОЕ) взвеси бактерий Учет результатов проводили в течение семи дней

Для изучения эпизоотической значимости носительства Е coli 0157 Н7 у мелких домашних животных использовали 18 щенков и 18 котят в возрасте

двух месяцев, из которых по признаку аналогов сформировали 12 групп по 3 головы в каждой

Каждой опытной группе животных в различных дозах однократно орально вводились патогенные культуры Е coli 0157 Н7, изолированные от крупного рогатого скота и собак Через 21 день у всех животных брали кал для исследования на наличие Е coli 0157.Н7 Клинический осмотр опытных животных проводили по общепринятой схеме Учитывали частоту, консистенцию и объем испражнений

Определение чувствительности 12 изолятов Е coli 0157 Н7 к антибактериальным препаратам проводилось методом диффузии в агаре при помощи стандартных бумажных дисков в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных»

Чувствительность к антибактериальным препаратам 31 изолята Е coli 0157 Н7, определялась методом серийных разведений на микропланшетах с внесенными в лунки антибактериальными препаратами В дальнейшем в лунки вносилось по 0,2 мл мясопептонного бульона со взвесью изолятов Через 24 часа инкубации при температуре 37°С сравнивалась оптическая плотность среды в лунках с антибактериальными препаратами с контрольной лункой без них

В опыте были использованы следующие антимикробные препараты амикацин, амоксициллин, ампициллин, апрамицин, бензилпенициллин, ген-тамицин, дитрим, доксициклин, зинаприм, канамицин, квинабик, клиндами-цин, коливет, левомицетин, левофлоксацин, леномак, неомицин, нифулин, нетилмицин, норфлоксацин, оксациллин, офлоксацин, пенбекс, полимиксин, рифан, родотиум, стрептомицин, тилозин, тетрациклин, ципрофлоксацин, цефазолин, цефотаксим, фуразолидон, фурадонин, энроколи, энрофлоксацин, эритромицин

Для биохимического типирования кишечной палочки серотипа 0157 Н7 использовали пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии (ПБДЭ) производства ООО «Диагностические системы» (Нижний Новгород) Дополнительно изучались протеолитические свойства на мясопептонном желатине (МПЖ) Изучение способности изолятов к образованию ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) проводилось на среде Кларка

Для идентификации микроорганизмов по биохимическим признакам совместно с СибФТИ была разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2 0» Полученные данные кодировались, и коды имеющихся изолятов после проверки соответствия кодов виду Е coli использовались для кластерного анализа

Расчеты производились с помощью программы «Microsoft Excel», входящей в пакет программ «Microsoft Office 7 О» В качестве ПЭВМ использовался компьютер Pentium-4 / 48 mb/ 1 1 Gb/ 256 mb video/ Windows-XP

Выражаем благодарность за оказание помощи в проведении исследований M H Шадриной, В H Афонюшкину и В Ю Коптеву

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Усовершенствование методики выделения и идентификации эн-терогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 из биологического материала от сельскохозяйственных и мелких домашних животных

Для выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е coli 0157 Н7 применялся метод, утвержденный Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (2001)

Сущность метода заключается в использовании особенностей биохимических свойств Е coli серотипа 0157 Н7 ферментировать сорбитол, при этом первоначальный посев производится на дифференциальную среду сорбитол-агар

Основным недостатком данного метода, затрудняющим его применение в ветеринарии, является различие микробного состава кишечника животных и человека, что не позволяет в качестве первичной среды использовать сорбитол агар

По результатам проведенных нами исследований, кал людей в 27,7 раза меньше контаминирован микроорганизмами рода Proteus, чем кал животных Входящие в состав нормофлоры кишечника животных микроорганизмы рода Proteus подавляют рост Е coli 0157 Н7, что препятствует ее выделению из биологического материала и снижает информативность методики, утвержденной Федеральным центром Госсанэпиднадзора Поэтому, для исключения контаминации среды роящимися формами микроорганизмов рода Proteus, биологический материал предварительно вносили в чашку Петри со средой Эндо

Для выделения Е coli 0157 Н7 в лабораторию доставляли фекалии от здоровых и больных желудочно-кишечными болезнями животных и птиц, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами Последовательность исследования материала

Выделение и идентификацию энтерогеморрагической кишечной палочки Е coli 0157 Н7 проводили в соответствии с прилагаемой ниже схемой (рис 1)

Первый день - каждую пробу фекалий (не более 0,5 г), взятую дротом, помещали в отдельную пробирку, содержащую 3-5 мл стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия, тщательно размешивали стеклянной палочкой и выдерживали 10-15 минут при комнатной температуре для осаждения крупных частиц Надосадачную жидкость в количестве 1-2 капли равномерно распределяли стерильным шпателем по поверхности среды Эндо в чашке Петри и инкубировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 18-24 часов Данная среда обеспечивала рост только Грам (-) микрофлоры

Второй день - чашки с культурами на агаре Эндо просматривали и отбирали 10 типичных для эшерихий колоний круглые с гладкой, выпуклой поверхностью, ровными краями, диаметром 2-4 мм, красно-малинового цвета, с металлическим блеском или без него

Отобранные колонии Е coli (10 штук) пересевали на дифференциальную среду - сорбитол - агар ("Питательная среда для выделения и дифференциации Е coli 0157 Н7 сухая") и инкубировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 18-24 часов Питательная среда обеспечивает рост тест-

штаммов Eschenchia coli 0157 H7, Shigella flexneri la 8516 При просмотре, Е coli 0157 Н7 росли в виде круглых прозрачных бесцветных или слаборозовых колоний диаметром 1,5-2,5 мм, S flexneri la 8516 в виде круглых прозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний диаметром 1,0-1,5 мм

Третий день — светлые колонии с сорбитол - агара вносили в пробирку с 5 мл среды SDS-бульона и инкубировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 6-12 часов Е coli 0157 Н7 изменяет цвет SDS-бульона с зеленого на желтый Это позволяет дифференцировать сорбитол - положительные колонии Е coli 0157 Н7 от сорбитол - положительных микроорганизмов рода Shigella

Е coli 0157 Н7

Рисунок 1 - Схема выделения и идентификации Е coli 0157 Н7 из биологического материала от животных и птицы

Оценка результатов

Выделенные из биологического материала изоляты Е coli считались принадлежащими к серовариантам 0157 Н7 если

- на сорбитол-агаре росли прозрачные бесцветные или бледно-розовые колонии,

- сорбитол-положительные изоляты изменяли цвет SDS-бульона с зеленого на желтый

Данная схема выделения и идентификация Е coli 0157 Н7 из биологического материала позволяет в течение 56 часов исследовать биологический и патологический материал на Е coli 0157 Н7

Для идентификации выделенных изолятов проводили серологическую типизацию Серогруппу считали установленной, если в течение 5 минут наступало полное просветление жидкости с образованием хлопьев на стекле Все выделенные изоляты относились к серогруппе 0157

3.2. Частота выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш Для изучения частоты выделения Е coli 0157 Н7 среди животных и птицы исследовано 1246 проб биологического материала

Частота выделения Е coli 0157 Н7 из биологического материала от сельскохозяйственных животных

Для изучения частоты выделения Е coli 0157 Н7 среди сельскохозяйственных животных исследовали 406 проб кала от телят, 250 проб кала и 149 проб молока от коров, 77 проб от поросят, 34 пробы от лошадей

Исследования показали, что в среднем процент выделения энтерогемор-рагической кишечной палочки серотипа 0157 Н7 от телят различных возрастов в Алтайском крае составил - 10,61%, в Новосибирской области - 6,14%

Максимальное выделение Е coli 0157 Н7 (13,33%) наблюдалось из биологического материала от телят 1-10 дневного возраста из Алтайского края, от здоровых телят - 11,67%, от больных гастроэнтеритом - 18,18% В Новосибирской области частота выделения Е coli 0157 Н7 от телят 1-10 дневного возраста отмечалась значительно ниже - 3,57%, от здоровых -2,38%, от больных - 7,14% (табл 1)

Таблица 1 - Частота выделения Е coli 0157 Н7 от крупного рогатого скота

Вид животного Исследовано проб % выделения

Новосибирская область

Телята 1-10 дней 56 3,57

- здоровые 42 2,38

- больные 14 7,14

Телята 10-30 дней 187 4,81

- здоровые 155 5,16

- больные 32 3,13

Телята 45-180 дней 50 20,59

- здоровые 44 11,36

- больные 6 33,33

Всего 293 6,14

Коровы - кал 230 2,17

- молоко 149 0

Алтайский край

Телята 1-10 дней 45 13,33

- здоровые 34 11,67

- больные И 18,18

Телята 10-30 дней (больные) 13 7,69

Телята 45-180 дней 55 9,09

Всего 113 10,61

Коровы (кал) 20 25

От телят 10-30 дневного возраста с признаками гастроэнтерита в Алтайском крае Е coli 0157Н7 выделили в 7,69% случаев, в Новосибирской области - в 4,81%, от больных телят в 3,13%, от здоровых в 5,16% случаев Среди телят 45-180 дневного возраста максимальное выделение наблюдалось в Новосибирской области (20,59%) Частота выделения Е coli 0157 Н7 отмечалась больше от больных (33,33%), чем от здоровых (11,36%) животных. В

Алтайском крае выделение данного микроорганизма среди здоровых телят составило 9,09% Из кала клинически здоровых коров данный серотип выделяли в Алтайском крае в 25% случаев, в Новосибирской области - 2,17%

В среднем процент выделения энтерогеморрагической кишечной палочки из кала исследованных поросят составил 15,58%

При исследовании 34 проб биологического материала от клинически здоровых лошадей энтерогеморрагическую кишечную палочку серотипа 0157 Н7 выделяли в 20,59% случаев

Частота выделения Е coli 0157 Н7 из биологического материала от мелких домашних животных и пушных зверей

Для выделения Е coli 0157 Н7 из биологического материала от мелких домашних животных и пушных зверей исследовали 90 проб кала от собак, 84 пробы от кошек, 70 проб кала от пушных зверей, из них 50 проб от лис и 20 от норок

В среднем процент выделения энтерогеморрагической кишечной палочки из кала мелких домашних животных составил 5,17, от пушных зверей -4,29% От собак Е coli 0157 Н7 была выделена в 7,78%, от кошек - в 2,38% случаях (табл 2)

Таблица 2 - Частота выделения Е coli 0157 Н7 от мелких домашних животных и

пушных зверей

Вид животного Исследовано проб % выделения

Собаки 90 7,78

Кошки 84 2,38

Всего мелких домашних жнвотных 174 5,17

Лисы 50 2

Норки 20 10

Всего пушных зверей 70 4,29

При исследовании кала от пушных зверей процент выделения Е coli 0157 Н7 составил 4,29%, в том числе от лисиц - 2%, от норок - 10%

Таким образом, исследования показали, что Е coli 0157 Н7 выделяется от клинически здоровых мелких домашних животных в 5,17% случаев, что при не соблюдении санитарно-гигиенических норм общения с животными может представлять потенциальную опасность для людей

Частота выделения Е coli Ol57 Н7 из биологического материала от птииы

Для изучения частоты выделения Е coli 0157Н7 от птицы проведено исследование 86 проб помета птицы, в том числе 76 проб от кур и 10 проб от индеек

В среднем процент выделения изолятов Е coli 0157 Н7 из помета птицы составил 9,30% Максимальное количество изолятов (20,59%) Е coli 0157 Н7 отмечалось у взрослых кур, от цыплят 10-20-дневного возраста процент выделения составил 3,70 У однодневных цыплят и взрослых индеек данный серотип не обнаружен (табл 3)

Таблица 3 - Частота выделения Е coli 0157 Н7 ог птицы

Вид животного Исследовано проб % выделения

Цыплята 1 день 15 0

Цыплята 10-20днеп 27 3,70

Взрослые куры 34 20,59

Индейки 10 0

Всего 86 9,30

По результатам исследования можно сделать вывод о том, что взрослые куры являются бактерионосителями энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа 0157 Н7 Данный микроорганизм, выделенный от кур, является потенциально опасным для обслуживающего персонала Также опасность могут представлять яйца, загрязненные пометом

Частота выделения Е coli 0157 Н7 из биологического материала от чюдей При изучении частоты выделения Е coli 0157 Н7 от людей было исследовано 359 проб кала, в том числе 306 проб от детей с клиническими признаками энтерита, гастроэнтерита и острой кишечной инфекции и 53 пробы от клинически здоровых взрослых людей

От детей в возрасте до месяца Е coli 0157 Н7 выделялась в 4,17%, от детей до 1 года в - 5,56% случаев От детей от 1 года до 6 лет Е coli 0157 Н7 изолировалась в 1,87% случаев, а от детей 7-18 лет - в 3,13% От взрослых людей Е coli 0157 Н7 выделялась в 1,89% случаях (табл 4)

Таблица 4 - Частота выделения Е coli 0157 Н7 от люде»

Возрастные группы Исследовано проб % выделения

Взрослые 53 1,89

Дети 306 2,61

до 1 месяца 24 4,17

до 1 года 36 5,56

от 1 до 3 лет 165 1,21

от 4 до 6 лет 49 4,08

от 7 до 10 16 0

от 11 до 18 16 6,25

Всего 359 2,5

Таким образом, наибольшее выделение энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа 0157 Н7 наблюдалось у детей до шестилетнего возраста с клиническими признаками энтерита, гастроэнтерита и острой кишечной инфекции Клинически здоровые взрослые люди являлись бактерионосителями

По результатам исследования частоты выделения Е coli 0157 Н7 среди различных видов животных и человека видно, что наибольшее число выделений Е coli 0157 Н7 наблюдается от птицы (9,3%) и от сельскохозяйственных животных (7,69%) Среди мелких домашних животных процент выделения составил 4,92%, среди людей - 2,5%

3.3. Сезонность выделения Е. coli 0157:Н7

Для изучения сезонного выделения Е. coli 0157:Н7 из кала крупного рогатого скота в течение 2005-2007 гг. каждый месяц брали пробы от телят в возрасте 1-100 дней.

Максимальное выделение Е. coli 0157:Н7 наблюдалось в сентябре (20%), в феврале (12,5%) и в июне (11,1%). В апреле, июле, августе и октябре процент выделения Е. coli 0157:Н7 составил 6,25; 8,69; 3,7; 5% соответственно. В декабре, январе, марте, мае, ноябре выделение энтерогеморрагической кишечной палочки не наблюдалось.

Наибольший процент выделения Е. coli 0157:Н7 от телят зарегистрирован в летний и осенний периоды (6,78 и 7,25% соответственно). Зимой количество выделения изолятов Е. coli 0157:Н7 снизилось до 5%, весной наблюдалось снижение выделения данного микроорганизма до 2,04% (рис. 2).

лето; 6,78 осень; 7725

зима; 5

■ ''

весна; 2,04

сезоны года

Рисунок 2 - Динамика выделения Е. coli 0157:Н7 по сезонам года

Таким образом, частота выделения Е. coli 0157:Н7 из биологического материала от телят оказалась более высокой в летний период, чем во время зимнего содержания.

3.4. Изучение биологических свойств

Изучение морфологических свойств выделенных изолятов.

Все изоляты Е. coli 0157:Н7 представляли собой короткие, грамотрица-тельные палочки с закругленными краями. В мазках они располагались одиночно, реже - попарно, и обладали подвижностью.

Изучение биохимических свойств Е. coli Q157:H7.

Изучение биологических свойств проводилось при помощи диагностической системы ПБДЭ Для идентификации микроорганизмов по биохимическим признакам была разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2.0».

Выделенные изоляты Е. coli 0157:Н7 ферментировали с кислотообразо-ванием углеводы - глюкозу, мальтозу, лактозу (92,2%), маннит (90,2%), ара-бинозу (82,4%); не ферментировали инозит; не утилизировали цитрат натрия,

малонат натрия, не имели фенилаланиндезаминазы, уреазы (94,12%) Они давали отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра и положительную с метил-ротом - 76,5%, сбраживали вариабельно сахарозу (60,8%)

Большинство изолятов Е coli 0157 Н7 расщепляли аминокислоты лизин (74,5%) и орнитин (66,7%), не расщепляли аргинин (96,1%), продуцировали индол (66,7%), не образовывали сероводород, давали положительную реакцию со средой Кода, а также не разжижали желатин Сорбит ферментировали 70,6% изолятов Все выделенные изоляты не ферментировали сорбитол, что является характерной особенностью Е coli Ol57 Н7

Исследования ферментативных свойств показали, что все изученные изоляты являются типичными представителями вида Escherichia coli, хотя среди них наблюдались культуры с измененными биохимическими свойствами

Изучение биохимической вариабельности Е cok внутри серотипа 0157 При проведении кластерного анализа использовались данные о биохимических свойствах выделенных изолятов Е coli 0157 Н7 Первоначально были выявлены наиболее и наименее вариабельные биохимические критерии Наибольшей вариабельностью обладает часть кода, зависящая от активности декарбоксилаз орнитина и лизина, а также гидролазы аргинина По этому критерию выделенные изоляты были сгруппированы в 5 кластеров К наиболее консервативным биохимическим свойствам отнесли ферментацию глюкозы, арабинозы и мальтозы, цитрата и малоната натрия, а также глюкозы в присутствии цитрата Сочетание этих критериев обеспечивает группировку изолятов в два кластера, не совпадающих по биохимическим свойствам

В виду того, что максимальный уровень кластеризации выделенного пула изолятов достигается при использовании в кластерном анализе всех биохимических свойств, в исследованиях использовали 7 кодов, отражающих 21 биохимический признак Е coli Так как величина каждой составной части кода варьировала во взаимосвязи с качественными биохимическими свойствами, то кластеризацию, преимущественно, проводили по не взвешенным величинам

Попытка сравнить различные изоляты Е coli серотипа 0157, помимо значительных биохимических различий внутри этого серотипа, в подавляющем большинстве случаев показала отсутствие идентичности между этими изолятами

В то же время кластеризация всего пула изолятов показывает их группировку по биохимическим признакам вне взаимосвязи от источника выделения Данный феномен отражает два факта во-первых, в однородных популяциях макроорганизмов-хозяев существует широкий спектр разных биотипов Е coli, различающихся по биохимическим свойствам даже внутри серотипа, во-вторых, встречающиеся совпадения биохимических характеристик изолятов, выделенных из различных объектов, например, два изолята из первой и второй группы (телята и коровы) и два изолята из первой и четвертой группы (телята и люди), по нашему мнению, свидетельствуют о циркуляции Е coli серотипа 0157 между крупным рогатым скотом и людьми и о достаточно хорошей персистенции у телят и коров

Результаты кластерного анализа показывают формирование минимум семи кластеризованных по биохимическим свойствам групп Е coli внутри серотипа 0157 и трех изолятов, которые не входили ни в один кластер Данный факт свидетельствует о высокой биологической и экологической пластичности кишечной палочки Кластерный анализ изолятов Е coli внутри серотипа 0157 Н7 по биохимическим критериям показывает принципиальную возможность адаптации к различным экологическим нишам Е coli 0157 Н7

Изучение патогенных свойств культур Е coli 0157 Н7, выделенных от животных и человека

Патогенные свойства Е coli 0157 Н7 изучались путем постановки биологической пробы на белых мышах

В опыте по изучению патогенных свойств выделенных Е coli 0157 Н7 было выявлено, что 55,69% изолятов были патогенными для белых мышей

Патогенными свойствами обладали изоляты Е coli 0157 Н7, выделенные из кала крупного рогатого скота (43,48 - 58,82%), из кала телят-55,56 -66,67% (табл 5)

Таблица 5 - Патогенные свойства изолятов Е coli 0157 Н7, выделенных из капа крупного _рогатого скота_

Вид животного Выделено изолятов

Всего Патогенных %

Новосибирская область

Телята 1-10 дней 2 0 0

Телята 10-30 дней 9 7 77,78

- здоровые 8 7 87,5

- больные 1 0 0

Телята 45-180 дней 7 2 28,57

- здоровые 5 0 0

- больные 2 2 28,57

Всего 18 10 55,56

Коровы (кал) 5 2 40

Алтайский край

Телята 1-10 дней 6 4 66,67

- здоровые 4 3 75

- больные 2 1 50

Телята 10-30 дней (больные) 1 I 100

Телята 45-180 дней 5 3 60

Всего 12 8 66,67

Коровы (кал) 5 2 40

От новорожденных телят (1-10 дней) патогенность выделенных изолятов составила 66,67%, от телят профилакторного возраста (10-30 дней) - 77,78100% Патогенность выделенных изолятов из кала коров дойного стада составила 40%, от поросят - 58,33%, от лошадей - 71,43%

От собак и кошек патогенными свойствами обладали 71,43%, и 50% изолятов Е coli 0157 Н7 соответственно Выделенные культуры Е coli 0157 Н7 от пушных зверей не обладали патогенными свойствами

Патогенность изолятов Е coli 0157 Н7, выделенных из помета птицы, составила 50% Максимальное выделение патогенных изолятов Е coli 0157 Н7 (100%) отмечалось от цыплят 10-20-ти дневного возраста, в то время как изоляты, выделенные от взрослых кур, обладали патогенными свойствами в 42,86% случаев (табл 6)

Таблица б - Патогенные свойства изолятов Е coli 0157 Н7, выделенных из помета птицы

Вид животного Выделено изолятов

Всего Патогенных %

Цыплята 10-20 дней 1 1 100

Взрослые куры 7 3 42,86

Всего 8 4 50

Изоляты Е coli 0157 Н7, выделенные из кала людей в 55,5% случаев обладали патогенными свойствами Все изоляты энтерогеморрагической кишечной палочки из кала детей до месяца и от 11 до 18 летнего возраста были патогенные для белых мышей Изоляты от детей до года и от 1 до 3-х летнего возраста только в 50% случаев обладали патогенными свойствами

От взрослых клинически здоровых людей 100% изолятов Е coli 0157 Н7 обладали патогенными свойствами Данный факт указывает на то, что они являются бактерионосителями патогенной кишечной палочки серо-типа 0157 Н7 без проявления симптомов заболевания

По результатам исследования патогенных свойств Е coli 0157 Н7 среди различных видов животных и человека видно, что патогенные изоляты выделялись от сельскохозяйственных животных в 57,63%, от людей - в 55,5% случаев Изоляты Е coli 0157 Н7, выделенные от мелких домашних животных и птицы, обладали патогенными свойствами в 50% случаев

Изучение антибиотикорезистентности изолятов Е coli 0157 Н7, выделенных от животных и птицы

Для определения чувствительности 31 изолята Е coli 0157 Н7 к антибактериальным веществам использовались микропланшеты с внесенными в лунки антибактериальными препаратами

Изоляты Е coli 0157 Н7, выделенные из кала крупного рогатого скота, мелких домашних животных и птицы обладали высокой чувствительностью к энроколи (73,49%), коливету (72,27%) и к леномаку (71,24%) К таким антибактериальным препаратам как энрофлоксацин, родотиум, ампициллин, стрептомицин, ципрофлоксацин чувствительность была на уровне 60-70% К апромицину, амоксициллину, рифану, эритромицину и квинабику изоляты Е coli 0157 Н7 обладали резистентностью

Для определения чувствительности 12 изолятов Е coli 0157 Н7 к антибактериальным веществам использовали стандартные бумажные диски с различными антибиотиками

Выделенные из кала лошадей и поросят изоляты Е coli 0157 Н7 обладали высокой чувствительностью к оксациллину, гентамицину (25 мм), офлоксацину (23 мм), норфлоксацину (24 мм), нетилмицину (22 мм),

левофлоксацину (21 мм) и фурадонину (21 мм) К амоксициллину, полимексину, клиндамицину, доксициллину и тилозину выделенные изоляты были резистентны

Установлено, что изоляты Е coli 0157 Н7 выделенные от различных видов животных были резистентны к антибактериальным препаратам из групп макролиды (тилозин, эритромицин), линкозамиды (клиндамицину), полусинтетические пенициллины (амоксициллину, бензилпенициллину) и цефалос-порины (цефазолину)

Высокая чувствительность выделенных изолятов регистрировалась к таким антибактериальным группам, как фторхинолоны (левофлоксацин, оф-локсацин, норфлоксацин), фторхинолы (энрофлоксацин), аминогликозиды (амикацин, гентамицин, нетилмицин), полипептидной группе антибиотиков (коливет, энроколи) и комплексным антибиотикам (зинаприм, дитрим, лено-мак, родотиум)

3.5. Изучение эпизоотической значимости носительства Е. coli 0157:Н7 у мелких домашних животных

Для выяснения вопроса о том, являются ли мелкие домашние животные носителями, могут ли они заболевать геморрагическим колитом, был проведен опыт по заражению щенков и котят патогенными для белых мышей изо-лятами Е coli 0157 Н7, выделенными от собак Для этого по признаку аналогов были сформированы три группы из щенков и три - из котят До начала опыта животные прошли процесс адаптации в виварии института На 8-ой день щенки были размещены в вольерах, а котята в клетках по 3 головы в каждой Первоначально у всех опытных животных были взяты пробы кала на наличие Е coli 0157 Н7 и общее клиническое обследование определяли габитус, исследовали видимые слизистые оболочки, волосяной покров, кожу, лимфоузлы Животные были клинически здоровыми

Щенкам однократно, орально задавали взвесь культур Е coli 0157 Н7 в дозах 1-опытной группе - 2 млрд КОЕ, 2-й - 4 млрд КОЕ, 3-й - 6 млрд КОЕ

Котятам однократно, орально задавали взвесь культур Е coli 0157Н7 в дозах 1-опытной группе-1 млрд КОЕ, 2-й-2 млрд КОЕ, 3-й-3 млрд КОЕ Ежедневно, в течение 21 дня, проводилось клиническое исследование опытных животных При этом учитывалось клиническое состояние животного, подвижность, поедаемость корма, наличие или отсутствие жажды, диареи За время проведения опыта клиническое состояние подопытных животных не изменилось, ни одно животное не пало и у них не наблюдалось признаков геморрагического колита У всех подопытных животных во время эксперимента сохранялся хороший аппетит, жажда отсутствовала, температура, пульс, дыхание находились в физиологической норме, диарея отсутствовала

При бактериологическом исследовании кала на 21 день опыта у всех животных была выделена патогенная для белых мышей Е coli 0157 Н7 При вскрытии животных патологических изменений внутренних органов не обнаружено

В течение двух лет велось наблюдение за двумя собаками из первой и третьей опытных групп Каждые три месяца у них брались пробы кала, кото-

рые исследовались на наличие Е coli 0157 Н7 За время наблюдения у опытных животных выделялась патогенная для белых мышей энтерогемор-рагическая кишечная палочка серотипа 0157 Н7

Таким образом, мелкие домашние животные продолжительное время являются бактерионосителями Е coli 0157 Н7, выделяющие ее во внешнюю среду, что при несоблюдении санитарно-гигиенических норм общения людей с животными-бактерионосителями повышается риск заражения Е coli 0157 Н7 и заболевания людей геморрагическим колитом и гемолитико-уремическим синдромом

3 6. Изучение патогенности изолятов Е. coli 0157:Н7, выделенных от крупного рогатого скота, для мелких домашних животных

Для изучения патогенности изолятов Е coli 0157 Н7, выделенных от крупного рогатого скота, для мелких домашних животных был проведен опыт по заражению щенков и котят патогенными для белых мышей изолята-ми, для чего были использованы 9 щенков и 9 котят аналогов в возрасте 2 месяца, которые после прохождения адаптации были размещены в клетках и вольерах по 3 головы в каждой

Щенкам однократно, орально задавали взвесь культур Е coli 0157 Н7 в дозах 4-опытной группе-2 млрд КОЕ, 5-й-З млрд КОЕ, 6-й-4 млрд КОЕ Котятам однократно, орально задавали взвесь культур Е coli 0157 Н7 в дозах 4-опытной группе -1 млрд КОЕ, 5-Й-2 млрд КОЕ, 6-й-3 млрд КОЕ За время проведения опыта клиническое состояние подопытных животных не изменилось, ни одно животное не пало и у них не наблюдалось признаков геморрагического колита Также у всех опытных животных во время эксперимента сохранялся хороший аппетит, жажда отсутствовала, температура, пульс, дыхание находились в пределах физиологической нормы, диарея отсутствовала, что указывает на то, что Е coli 0157 Н7 не обладает патогенными свойствами для мелких домашних животных Но при бактериологическом исследовании кала на 21 день опыта у всех опытных животных была выделена патогенная для белых мышей Е coli 0157 Н7

В течение двух лет, каждые три месяца, у двух опытных животных (собаки) брались пробы кала и исследовались на наличие Е coli 0157 Н7 В течение этого времени у опытных животных выделялась патогенная для белых мышей Е coli Ol 57 Н7

Таким образом, экспериментальное инфицирование патогенными изоля-тами Е coli 0157 Н7 не привело к клиническому проявлению болезни у опытных животных, при этом последующее выделение данного микроорганизма из кала животных на 21 день доказывает, что мелкие домашние животные становятся бактерионосителями патогенной для белых мышей Е coli 0157 Н7 Вероятно для проявления патогенности Е coli 0157 Н7 необходимы условия, снижающие резистентность организма животных

ВЫВОДЫ

1 Кал животных в 27,7 раз больше контаминирован микроорганизмами рода Proteus, чем фекалии людей Входящие в состав нормофлоры кишечника животных микроорганизмы рода Proteus подавляют рост Е coli 0157 Н7, что препятствует ее выделению из биологического материала и снижает информативность методики, утвержденной Федеральным центром Госсанэпиднадзора

2 Е coli 0157 Н7 выделяется от крупного рогатого скота, мелких домашних животных, пушных зверей, птиц и людей Наибольшее выделение Е coli 0157 Н7 регистрируется от мелких домашних (9,3%), сельскохозяйственных животных (7,69%) и птицы (4,92%) Выделение кишечной палочки серотипа 0157 Н7 среди людей достигает - 2,5%

3 Наибольший процент выделения Е coli 0157 Н7 от телят отмечается в летний и осенний период года (6,78 и 7,25% соответственно) Минимальное выделение данного микроорганизма (до 2,04 %) наблюдается в весенний период года

4 Выделенные культуры по морфологическим и ферментативным свойствам являются типичными представителями вида Escherichia coli серотипа 0157 Н7 Стабильность биохимических признаков отмечалась в отношении цитрата и малоната натрия, аргинина, финилаланина, уреазы, глюкозы, лактозы, инозита, мальтозы, желатина, среды Кода и в реакции Фогеса-Проскауэра В отношении лизина (74,5%), орнитина (66,7), индола (66,7), ацетилметилкарбинола (72,5), сахарозы (60,8), сорбита (70,6%) наблюдалась вариабельность биохимических признаков Все выделенные изоляты не ферментировали сорбитол, что является характерной особенностью Е coli 0157 Н7 Компьютерная экспертная система «Биохимия микроорганизмов 2 0» позволяет по биохимическим свойствам быстро идентифицировать выделенные энтеробактерии

5 Установлена биохимическая разнородность изолятов Е coli внутри серотипа 0157 Результаты кластерного анализа показывают формирование минимум семи кластеризованных по биохимическим свойствам групп Е coli внутри серотипа Ol57 и трех изолятов, не входящих ни в один кластер Данный факт показывает высокую биологическую и экологическую пластичность кишечной палочки, выделенную как от различных видов животных и человека, так и от одного вида животных

6 Установлено, что 55,68% выделенных изолятов Е coli 0157 Н7 были патогенными для белых мышей Большее количество патогенных изолятов выделялось от сельскохозяйственных животных (57,63%) и людей (55,5%) Изоляты выделенные от мелких домашних животных, пушных зверей и птицы обладали патогенными свойствами в 50% случаев

7 Выделенные изоляты резистентны к антибактериальным препаратам из следующих групп макролиды, линкозамиды, полусинтетические пени-циллины и цефалоспорины Чувствительность выделенных изолятов наблюдалась к антибактериальным препаратам из групп фторхинолоны, фторхи-нолы, аминогликозиды, полипептидной группе антибиотиков и комплексным антибиотикам

8 Мелкие домашние животные продолжительное время до двух лет (срок наблюдения) являются бактерионосителями Е coli 0157 Н7, что подтверждает их эпизоотологическую значимость и при не соблюдении санитарно-гигиенических норм общения людей с животными-бактерионосителями повышает риск заражения Е coli 0157 Н7 и заболевание людей геморрагическим колитом и гемолитико-уремическим синдромом

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложена усовершенствованная схема выделения и индикации Е coli 0157 Н7 из биологического материала от животных и птицы,

Разработаны методические рекомендации по выделению и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е coli 0157 Н7 из биологического материала животных и птицы, утвержденные ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 3 от 30 октября 2007 г) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30 октября 2007 г)

Результаты исследований используются в учебном процессе при подготовке студентов по специальности «Ветеринария»

По материалам исследований подана заявка на патент РФ «Способ выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е coli 0157 Н7 в биологическом материале от животных», № 2006141983 от 27 11 2006

Разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2 О», получено свидетельство в ФГУ ФИПС об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007613064 от 18 июля 2007 г

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Нестерова И С Распространение Е coli 0157 Н7 среди сельскохозяйственных животных, птицы и продуктов животного происхождения / Соавт В Ю Коптев, Н А Шкиль, Е А Орлова // Актуальные вопросы ветеринарной медицины матер Сибирского Междунар ветеринарного конгресса - Новосибирск, 2005 -С 138-139

2 Нестерова И С Бактерионосительство Е coli Ol57 Н7 среди животных и птицы / Соавт В Ю Коптев, Н А Шкиль // Аграрная наука сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Кыргызстана труды Междунар науч -практ конф - Новосибирск, 2005 - Т 2 - С 262-265

3 Нестерова И С Распространение Е coli 0157 Н7 среди мелких домашних животных / Соавт В Ю Коптев, Н А Шкиль // Российский ветеринарный журнал Мелкие домашние животные -2005 -№3 - С 33-34

4 Нестерова И С Распространение Е coli 0157 Н7 среди животных и птицы/Соавт ВЮ Коптев, НА Шкиль//Практик -2005 -№11-12 -С 49-51

5 Нестерова И С Патогенность Е coli 0157 Н7 для мелких домашних животных/ Соавт Н А Шкиль, В Ю Коптев // Матер VI Сибирской ветеринарной конф - Новосибирск, 2006 - С 33-35

6 Нестерова И С Изучение патогенности Е coli 0157 Н7 для мелких домашних животных / Соавт В Ю Коптев, Е А Петрова // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых труды II Междунар науч -практ конф молодых ученых - Новосибирск, 2006 - С 422-427

7 Нестерова И С Распространение и биологические свойства Е coli 0157 Н7, выделенной от домашних животных и птицы / Соавт H А Шкиль, В Ю Коптев // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных матер Междунар науч -практ конф - M , 2006 - С 403-406

8 Нестерова И С Особенности распространения, патогенность и чувствительность к антибиотикам Е coli 0157 Н7/ Соавт НА Шкиль, В Ю Коптев // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных матер Междунар конф - Ульяновск, 2006 - С 185-188

9 Нестерова И С Распространение Е coli 0157 Н7 среди мелких домашних животных и людей / Соавт H А Шкиль, В Ю Коптев // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера 3-я Российская науч -практ конф с международным участием - Новосибирск, 2006 -С 129-130

10 Нестерова И С Дискриминация штаммов некоторых таксономических единиц семейства энтеробактерий по биохимическим характеристикам с использованием кластерного анализа и базы данных / Соавт В H Афонюшкин, В Ю Коптев, Е К Табатчикова // Информационные технологии, системы и приборы в АПК «Агроинфо - 2006» матер междунар науч-практ конф - Новосибирск, 2006 - С 91-93

11 Нестерова И С Биологические свойства и распространение Е coli 0157 Н7 среди мелких домашних животных и птицы / Соавт • H А Шкиль, В Ю Коптев, Е H Петрова // Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири Сб науч тр СО РАСХН ИЭВСиДВ - Новосибирск, 2006 -С 302-307

12 Нестерова И С Биохимическая вариабельность изолятов Е coli 0157 Н7/Соавт В H Афонюшкин, НА Шкиль, В Ю Коптев//Сибирский вестник сельскохозяйственной науки - 2007 - Na 1 - С 83-85

13 Нестерова И С Биохимический полиморфизм Е coli серотипа 0157 Н7 / Соавт В H Афонюшкин, H А Шкиль, В Ю Коптев//Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук -2007 -№4 -С 75-77

14 Онищенко И С Моделирование колибактериоза мелких домашних животных, вызванного Е coli 0157 Н7 // Актуальные вопросы ветеринарной медицины матер VIII Сиб вет конф / Новосиб гос аграр ун-т - Новосибирск, 2008 - С 244-247

Подписано в печать 03 04 2008 г Формат 60x84 1/16 Печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ №90

ИПФ «Агрос» 630501, Новосибирская область, пос Краснообск

Болезни желудочно-кишечного тракта (гастроэнтериты, гастроэнтеро-колиты), вызываемые токсинами эшерихий, распространены повсеместно и поражают сельскохозяйственных животных различных видов, поэтому представляет одну из сложных проблем для современной ветеринарии. В последние годы во многих развитых странах колибактериоз находится под пристальным вниманием ветеринарных и медицинских специалистов, а также Всемирной организации здравоохранения, так как важную роль в инфекционной патологии человека и животных стали играть эшерихии, вырабатывающие Шига-подобные токсины (веротоксины), в том числе и Е. coli 0157:Н7 (A.B. Куликовский, А.Н. Панин, 1997). Данный серотип кишечной палочки приводит к возникновению у людей геморрагического колита, который может осложниться гемолитико-уремическим синдромом (ГУС) и тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТЛ), а у молодняка крупного рогатого скота - диареи с признаками геморрагического гастроэнтерита и отечной болезни у свиней (Ю.Г. Степашин, Э.А. Светоч и др., 2005).

Современная проблема пищевых зоонозов связана с продукцией, полученной главным образом от внешне здоровых животных, прошедшей в полном объеме ветеринарно-санитарную экспертизу и вторично контами-нированной в процессе получения, транспортировки, переработки, хранения, реализации и потребления (A.B. Куликовский, 2007).

Несмотря на достаточно широкое изучение Е. coli 0157:Н7 в медицине, в ветеринарии проведены отдельные исследования по выявлению частоты выделения и бактерионосительства данного микроорганизма среди различных видов животных, птицы и человека. При этом пока нет достаточных данных о патогенных свойствах Е. coli 0157:Н7 и резистентности к антибактериальным препаратам. В России отсутствуют данные о носи-тельстве Е. coli 0157:Н7 среди мелких домашних животных.

Также в ветеринарии не совершенна бактериологическая методика выделения и идентификации Е. coli 0157:Н7 из биологического материала.

В связи с этим возникает необходимость изыскания новых подходов к профилактике инфекций, вызванных Е. coli 0157:Н7, и борьбе с ней. Для этого требуется комплексный подход к изучению широкого спектра биологических свойств возбудителя и совершенствование бактериологического метода выделения и идентификации Е. coli 0157:Н7.

Цель работы - изучить фенотипические свойства и эпизоотологиче-скую значимость Е. coli 0157:Н7.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Определить частоту выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш.

2. Изучить биологические свойства изолятов Е. coli 0157:Н7.

3. Изучить биохимические свойства и их вариабельность.

4. В экспериментальных условиях изучить эпизоотическую значимость носительства Е. coli 0157:Н7 у мелких домашних животных.,

Научная новизна.

Получены данные о частоте выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш.

Впервые на территории России установлена эпизоотологическая значимость бактерионосительства у собак и кошек.

Получены данные о восприимчивости мелких домашних животных к Е. coli 0157:Н7.

Установлена вариабельность биохимических свойств выделенных изолятов, свидетельствующая о генетической разнородности популяции Е. coli 0157:Н7.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Усовершенствована методика выделения и идентификации энтероге-моррагической кишечной палочки серотипа 0157:Н7 из биологического материала от животных.

Оформлена заявка на патент «Способ выделения и идентификации эн-терогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 в биологическом материале от животных», № 2006141983 от 27.11.2006.

Получено свидетельство в ФГУ ФИПС об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007613064 от 18 июля 2007 г. Экспертная система «Биохимия микроорганизмов 2.0».

Подготовлены методические рекомендации по выделению и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 из биологического материала животных и птицы, утвержденные Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол №3 от 30 октября 2007 г.

Апробация работы.

Материалы исследований доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ (2004-2007 гг.), на Сибирском международном ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2005 г.), на международной научно-практической конференции (Барнаул, 2005 г.), на VI Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2006 г.), на второй Международной научно-практической конференции молодых ученых (Новосибирск, 2006 г.), на международной научно-практической конференции (Москва, 2006 г.), на международной конференции (Ульяновск, 2006 г.), на третьей Российской научно-практической конференции с международным участием (Новосибирск, 2006 г.), на международной научно-практической конференции (Новосибирск, 2006 г.), на VIII Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 работы в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ ("Сибирский вестник сельскохозяйственной науки" и "Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук").

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 123 страницах и включает введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 201 источник, в т.ч. 140 - зарубежных авторов.

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс в Новосибирском государственном аграрном университете, Иркутском государственном аграрном институте при подготовке ветеринарных специалистов.

Основные положения, выносимые на защиту. усовершенствование методики выделения и идентификации энтеро-геморрагической кишечной палочки 0157:Н7 из биологического материала; результаты исследований по частоте выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш;

- биологическая характеристика изолятов Е. coli 0157:Н7, выделенных от различных видов животных и человека;

- эпизоотическая значимость носительства Е. coli 0157:Н7 у мелких домашних животных.

ВЫВОДЫ

1. Кал животных в 27,7 раз больше контаминирован микроорганизмами рода Proteus, чем фекалии людей. Входящие в состав нормофлоры кишечника животных микроорганизмы рода Proteus подавляют рост Е. coli 0157:Н7, что препятствует ее выделению из биологического материала и снижает информативность методики, утвержденной Федеральным центром Госсанэпиднадзора.

2. Е. coli 0157:Н7 выделяется от крупного рогатого скота, мелких домашних животных, пушных зверей, птиц и людей. Наибольшее выделение Е. coli 0157:Н7 регистрируется от мелких домашних (9,3%), сельскохозяйственных животных (7,69%) и птицы (4,92%). Выделение кишечной палочки серотипа 0157:Н7 среди людей достигает - 2,5%.

3. Наибольший процент выделения Е. coli 0157:Н7 от телят отмечается в летний и осенний период года (6,78 и 7,25% соответственно). Минимальное выделение данного микроорганизма (до 2,04 %) наблюдается в весенний период года.

4. Выделенные культуры по морфологическим и ферментативным свойствам являются типичными представителями вида Escherichia coli серотипа 0157:Н7. Стабильность биохимических признаков отмечалась в отношении: цитрата и малоната натрия, аргинина, финилаланина, уреазы, глюкозы, лактозы, инозита, мальтозы, желатина, среды Кода и в реакции Фогеса-Проскауэра. В отношении лизина (74,5%), орнитина (66,7), индола (66,7), ацетилметилкарбинола (72,5), сахарозы (60,8), сорбита (70,6%) наблюдалась вариабельность биохимических признаков. Все выделенные изоляты не ферментировали сорбитол, что является характерной особенностью Е. coli 0157:Н7. Компьютерная экспертная система «Биохимия микроорганизмов 2.0» позволяет по биохимическим свойствам быстро идентифицировать выделенные энтеробактерии.

5. Установлена биохимическая разнородность изолятов E.coli внутри серотипа Ol57. Результаты кластерного анализа показывают формирование минимум семи кластеризованных по биохимическим свойствам групп E.coli внутри серотипа Ol57 и трех изолятов, не входящих ни в один кластер. Данный факт показывает высокую биологическую и экологическую пластичность кишечной палочки, выделенную как от различных видов животных и человека, так и от одного вида животных.

6. Установлено, что 55,68% выделенных изолятов Е. coli 0157:Н7 были патогенными для белых мышей. Большее количество патогенных изолятов выделялось от сельскохозяйственных животных (57,63%) и людей (55,5%). Изоляты выделенные от мелких домашних животных, пушных зверей и птицы обладали патогенными свойствами в 50% случаев.

7. Выделенные изоляты резистентны к антибактериальным препаратам из следующих групп: макролиды, линкозамиды, полу синтетические пенициллины и цефалоспорины. Чувствительность выделенных изолятов наблюдалась к антибактериальным препаратам из групп: фторхинолоны, фторхинолы, аминогликозиды, полипептидной группе антибиотиков и комплексным антибиотикам.

8. Мелкие домашние животные продолжительное время до двух лет (срок наблюдения) являются бактерионосителями Е. coli 0157:Н7, что подтверждает их эпизоотологическую значимость и при не соблюдении санитарно-гигиенических норм общения людей с животными-бактерионосителями повышает риск заражения Е. coli 0157:Н7 и заболевание людей геморрагическим колитом и гемолитико-уремическим синдромом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложена усовершенствованная схема выделения и индикации Е. coli 0157:Н7 из биологического материала от животных и птицы;

Разработаны методические рекомендации по выделению и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 из биологического материала животных и птицы, утвержденные ученым советом ГНУ ИЭВС и ДВ (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.).

Результаты исследований используются в учебном процессе при подготовке студентов по специальности «Ветеринария».

По материалам исследований подана заявка на патент РФ «Способ выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 в биологическом материале от животных», № 2006141983 от 27.11.2006.

Разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2.0», получено свидетельство в ФГУ ФИПС об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007613064 от 18 июля 2007 г.