Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение биологических свойств Е. сoli и совершенствование технологии изготовления вакцины против эшерихиоза телят

НОВОСИБИРСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи УДК 619:615.371:579.842.11 С636.2.082.35

ВОЛЬФ Виктор Теодорович

Изучение биологических свойств E.coli и совершенствование технологии изготовления вакцины против эшерихиоза.телят

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Новосибирск - 1994

Работа выполнена в Новосибирском Государственном Аграрном университете, кафедра эпизоотологии и микробиологии.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

-доктор ветеринарных наук, профессор Новак Д.Д.

-доктор ветеринарных наук, профессор Чекшпев В.М. -кандидат ветеринарных наук Овсяное Н.И.

-Омский Государственный ветеринарный институт

Запета состоится "_"_1994 года в _часов на

заседании специализированного совета Д 020.23.01 при Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии (633128, Новосибирская обл., р.п. Красно-обск, ИЭБС и ДВ, тел. 48-44-62).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЗВС и ДВ.

Автореферат разослан "_"_1994 г.

Ученый секретарь 'специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

А.А.Самоловов

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы. Несмотря на применение специфических средств профилактики и лечения, эшерихиоз телят продолжает наносить большой ущерб от падежа и снижения продуктивности животных, о чем свидетельствуют статистические данные и сообщения исследователей [Блинов И.К., Сидоров М.А., 1977; Ку-рашвили Т.К., 1979 и др.]. Возникновение и распространение эшерихиоза обусловлено высокой концентрацией поголовья, имму-нодефицитным состоянием новорожденных телят при скармливании неполноценного молозива, не соблюдением принципа "пусто-занято" и в е т еринарнс-оанкгарног о режима при их выращивании [Чекишев В.М., 1976; Фельдман K.Ii., 198Q; Дж/гжка С.И,, 1990.].

В зависимости от ряда условий колибактериоа может проявляться в септической, кишечной и энтеротоксемической формах [Антонов Б.И.,1986; Зароаа В.Г.,1991; Биргер М.0.,1982 и др.].

Исследования последних лет показали, что основное специфическое значение в патогенезе кслибактериоза имеют эшерихии^ патогенность которых связана с адгезивными антигенами (К88, К99, F41, 987Р и АТТ25) и энтерогоксинами [Бондаренко В.М., Петровская В.М. ,1990; Knutton S., Zloyd D.,1987;Evans D.,1973; Акатов A.K.,1991; Ушкалов В.А.,1992 и др.].

Было доказано, что эти субстанции эшерихий одновременно обладают иммуногенными свойствами, что явилось предпосылкой для расширения исследований и разработки нового поколения вакцин и других специфических биопрепаратов. В борьбе с колибак-териозом в нашей стране (страны СНГ), наряду с ветеринарно-санитарными, организационно-хозяйственны«'. и технологическими мероприятиями важное место принадлежит специфической профилактике.

Применяемая в практике формол-тиомерсаловая вакцина и гипериммунная сыворотка малоэффективны, так как, не создают достаточно напряженного антитоксического и антимикробного иммунитета в связи с технологией их изготовления. На основе новых научных данных о выделении экзотоксинов и протективных антигенов E.coli [Гнатенко Г.В., Сухарев Ю.С.,1992; Шапиро Н.И., Дудкина М.И.,1976.3 появились возможности получения более эффективной вакцины против эшерихиоза телят.

1.2. Цель работы - провести исследования в направлении совершенствования вакцинного препарата против эшерихиоза телят.

1.3. Были поставлены следующие задачи:

- выделить и изучить биологические особенности энтеропа-тогенных штаммов E.coli, циркулирующих в некоторых хозяйствах Новосибирской области;

- изыскать доступный способ выделения токсинов и протек-тивнога антигена с целью получения вакцинного препарата против эшерихиоаа геляг;

- испытать эффективность вакцинного препарата и гиперим-муной сыворотки на лабораторных животных;

- изучить профилактическую эффективность вакцинного препарата против эшерихиоза телят в опытах иммунизации . стельных коров;

- получить гипериммунную сыворотку и изучить ее профилактическую и лечебную эффективность;

1.4. Научная новизна. Изучены биологические свойства (патогенные, тоюзигенные, адгезивные, серологические, гемолитические и др.) штаммов E.coli выделенных в хозяйствах Новосибирской области от Сольных и павших от эшерихиоза телят. Получена новым способом вакцина (заявка на способ получения вакцины против эшерихиоза телят зарегистрирована Государственным патентным ведомством Российской Федерации под номером 93020246 от 26 мая 1993 года) посредством выделения токсинов E.coli и последующего перевода их в анатоксины, а также получение про-тектквного антигена щадящим способом.

1.5. Практическая ценность. Вакцина против эшерихиоза телят испытана в двух хозяйствах (1992-1994) в контролируемых эпизоотологических опытах в сравнении с контрольными, непривитыми животными и с животными привитыми гидроокись-алюминиевой формол-тиомерсаловой вакциной. При этом падеж телят от коров привитых опытной вакциной сократился в два раза (по сравнению с контролем). Клиническое проявление эшерихиоза телят получениих от вакцинированных коров опытной вакциной протекало в легкой форме. Полученная от быков продуцентов гипериммунная сыворотка в комплексе с другими антибактериальными препаратами и симптоматическими средствами обладает лечебной эффективностью в среднем на 87%.

1.6. Апробация работы. Результаты проделанной работы об-сувдадись на расширенных заседаниях совета факультета ветеринарной медицины НГАУ; научные данные использовались при проведении открытой лекции по теме: " Возбудитель колибактериоза".

Материалы исследований докладывались . на научно-практической конференции посвященной проблемам науки и производства в условиях аграрной реформы в 1993 году.

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликована одна статья, другая в печати, подана заявка на выдачу патента.

1.8. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 2 графика, 3 диаграммы, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы, список литературы и приложение.

2. СОБСТВЕННЫЕ ЮСЛЕДОВЛННЯ

2.1.Материалы и методы исследования

Исследования проводили е лаборатории микробиологии Новосибирского Аграрного университета и в 7 хозяйствах Новосибирской области: Коченевский район - совхоз "Чикский", совхоз "Шагаловский"; Новосибирский район - учебное хозяйство "Тулинское", совхоз "Пригородный", совхоз "Толмачевский"; Мош-ковский район - совхоз Еарлакский"; Маслянинский район - совхоз "Сибирский долгунец".

Порядок исследования патологического материала, выделение чистой культуры, изучение ее'морфологических, культуральных, ферментативных и гемолитических свойств, а также определение патогенностн выделенных культур эшерихий проводили согласно "Методическим указаниям по бактериологической диагностике коли-бактериоза (эшерихиоза) животных"(1981).

Для определения патогенности. выделенных 292 культур E.coli, использовали 876 беспородных белых мышей весом 15-20 г.

Серологическую типизацию 120, выделенных культур эшери-хий, проводили согласно "Наставления по применении агглютинирующих 0-коли-сывороток(1980).

Адгезивные свойства изучали у 12 энтеропатогенных штаммов к эпителиальным клеткам кишечника крыс гнотобиотов в соответствии с методическими рекомендациями разработанными В.М.Бонда-ренко, В.Г.Петровской, Е.М.Горской (1989), и у 72 штаммах энтеропатогенных E.coli при помощи агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эшерихий К88, К99, 987Р, F41, A2Q .

Биологическую активность тершстаОшшного энтеротоксина изучали у 10 птаьшов зшерихий с помощью тестов анальной пробы на 38 мышах-сосунках по методу Н.И.Романенковой и др. (1980).

Идентификации 15 штаммов E.coli по термолабидьному (ТЛ-) и термостабильному (ТС-) зктеротоксинам проводили на 45 мышах весом 15-18 г. с помощью теста на отек мышиной лапы - Ю.П.Вар-танян и др. (1978).

Определение чувствительности IZO штаммов E.coli к антибиотикам проводили методом диффузии в агар (среда АГВ) при помощи стандартных дисков с антибиотиками.

Общи белок в сыворотке крови определяли у 180 животных рефрактометрическим способом.

Белковые фракции (альбумины, альфа-, бэтта-, гамма-глобулины) в сыворотке крови определяли при помощи нефелометри-ческого (турбодиметрического) метода. При.этом пересчитывали процент соотношения фракций в абсолютные величины, исходя из количества"" общего белка в сыворотке крови определенного рефрактометрическим способом.

Количество общих иммуноглобулинов в сыворотке молозива определяли у 80 коров по методике предложенной М.А.Костшюй (1983).

Определение титров антител в сыворотке крови и сыворотке молозива изучали на 260 животных при помощи РА на планшетах, пользуясь методом двукратных серийных разведении, используя при этом антиген содержащийся в опытной вакцине.

Для приготовления О-антигена использовали смывы двухсуточных культур зшерихий (7 энтеропатогенных штаммов, используемых в производстве опытной вакцины) густотой около 5-8 млрд микр.тел в 1 мл. Смесь культур прогревали при 100°С на водяной бане в течение 1 часа. Затем приготовленный антиген консервировали 52 фенолом до общего его содержания 0.25-0.5% и расфасовывали в стерильные флаконы по 10 мл и обжимали пробки алюминиевыми колпачками. Антиген хранили в холодильнике при температуре 4°С в течение 6 мес.

Изготовление анатоксин-антимикробной вакцины проводили по нашей методике. Для осаждения экзотоксинов E.coli из 6-7 маточных культур выращенных на среде Хоттингера использовали адюмо-калиевые квасцы, а при выделении протективных антигенов -

субметальные концентрации формалина и перекиси водорода.

Временное наставление по применению вакцины и гипериммунной сыворотки рассмотрено и одобрено ученым Советом ветеринарного факультета НГАУ ( решение от 21.01.92г.).

Эпизоотические опыты •в хозяйствах по изучению эффективности иммунизации стельных коров проводили в совхозе "Чикский" на 50 коровах, в учхозе "Тулинское" - на 45. Гипериммунную сыворотку получили при иммунизации 6 быков в совхозе "Чикский" и 10 в учхозе "Тулинское". Опыты в хозяйствах проводились комиссионно по разрешению ветеринарного отдела Новосибирской области о участием государственных инспекторов районов и специалистов хозяйств.

Биометрическая обработка производилась на персональных профессиональных 2Ш IBM/PC XI с использованием программы (системы управления багами данных) PGN1, разработанной И.В. Наумкиным и В.В. Гартом (1992,1993) на языках программирования "TURBO BASIC" и "TURBO PASCAL" длиной 500 килобайт.

Связь между признаками определяли вычислением тетрахори-ческого, бисериального и межгруппового коэффициентов корреляции. Вычисление степени влияния различных факторов на исследуемые признаки осуществляли при помощи однофакторного дисперсионного анализа по методу Шюхинского. Достоверность вычисленных биометрических показателей определяли по критерию Стьвдента.

2.2. Результаты наследований

В семи хозяйствах Новосибирской области проведены бактериологические исследования на эшерихиоз фекалий от 170 больных телят и патологического материала от 130 павших телят с симптомами диареи.

В таблице 1 указано количество культур эшерихий выделенных из органов павших телят в результате исследований.

Таблица 1

Количество культур E.coli выделенных от павших телят

Коли- Всего Бр.лимфо- Печень Селе- Почки Костный Легкие

чество выделено узлы зенка мозг

павших культур

телят E.coli

130 292 130 125 110 23 45 30

2.2.1. Изучение патогенности выделенных культур E.ooll

Для изучения патогенности 292 выделенных культур E.coli использовали 876 беспородных белых мышей, массой 15-20г. 120 штаммов эшерихий оказались патогенными для белых мышей. Эти культуры в дальнейшей использовали для изучения, а 162 не патогенных уничтожили с целью экономии питательных сред, посуды и времени на исследования.

2.2.2. Изучение серотипов у изолятов E.coli

Для изучения серотипов, использовали набор агглютинирующих О-коли-сывороток, состоящий из 4 поливалентных и 30 моно-ваденгных сывороток. Сыворотки изготовлены Армавирской биофабрикой в 1991 году, срок годности до апреля 1993г.

Серогрупповую принадлежность определяли только у культур, отнесенных по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам к роду Escherichiae.

Из 120 культур (исследуемых РА на стекле при помощи агглютинирующих О-коли-сывороток) - 3 (2,5%) были 078; 2 (1,7%) - 08; 1 (0,8%)- - 09; 2 (1,7%) 0149; 3 (2,5%) - подверглись диссоциации; 38 (31,7Z) - не титровались, а остальные 71 (59,2%) имели от 2 до 8 положительных, перекрестных реакций с различными сыворотками (04; 08;- 09; 078; 026; 0101; 0117; 0149).

2.2.3. Изучение лекарственной чувствительности изодятов E.coli к антибиотикам

Для изучения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам пользовались методом диффузии в агар с использованием стандартных бумажных дисков. У нас в наличие имелись диски, изготовленные заводским путем, к 17 антибиотикам.

Мы изучили чувствительность 120 штаммов E.coli к антибактериальным препаратам. Результаты сведены в таблицу 2.

Из данных таблицу видно, что из имеющихся антимикробных средств in vitro, бактерицидным действием обладали гентамицин и полимиксин, остальные же в большинстве случаев проявляли слабовыраженньй бактерицидный аффект, или полное его отсутствие.

Таблица 2

Чувствительность изолятов E.coli к антибиотикам

Антибиотик устойчивые умерено-устойч. чувствительные

культуры %. культуры Z культуры %

Бензилпеницшшин 112 93.3 5 4.2 3 2.5

Стрептомицин 110 91.7 8 6.7 2 1.7

Неомицин 55 46.7 44 36.7 20 16.7

Канамицин 80 66.7 36 30 4 3.3

Мономицин 112 93.3 8 6.7 0 0

Тетрациклин 116 96.7 4 3.3 0 0

Эритромицин 120 100 0 0 0 0

Полимиксин 58 48.3 17 14.2 45 37.5

Ампициллин 60 50 20 15.7 40 33.3

Карбенициллин 65 54.2 55 45.8 0 0

Окоацидлин 120 100 0 0 0 0

Гентамицин 36 30 12 10 72 60

Доксициклин 112 33.3 8 6.7 0 0

Олеандомицин 103 90 12 10 0 0

Линкомицин 110 91.7 7 5.8 3 2.5

Фузидин 100 83.3 9 7.5 11 9.2

Левомицетин 88 73.3 12 10 20 16.7

2.2.4. Изучение адгезивных и токсигенных свойств изодятов E.coli

У двенадцати штаммов энгеролатогенных эшерихий изучили способность адгезии к поверхности эпителиальных клеток килечного происхождения крыс гнотобиотов. В результате исследований оказалось, что изучаемые аташы энтеропатогенных E.coli обладали низкой и средней степенью адгезии к энтероцитам (М±ш от 3.27¿Q.14 до 5.8±0.35) и средней и высокой адгезией к колоно-¡51Гам (M+ir. от 5.4+0.31 ДО 12.7+0.35).

Адгезивные антигены эшерихий изучали при помощи анткадге-зивных коли-сывороток KS9, N38, 987Р, F41 и А20 в реакции агглютинации на стекле.

Антиадгезивные коли-сыворотки изготовлены ВНШПМ-ВГНКИВП 27.06.90г., серия N 1, срок годности до июня 1995 года.

Для бактериологического исследования от телят, павших с клиникой колибактериоза (диареи), кроме паренхиматозных органов, дополнительно брали, для обнаружения эшерихий с адгезивными антигенами, отрезок тонкого отдела кишечника с содержимым, брыжеечные лимфатические узлы, фекалии.

Для изучения адгезивных свойств было взято 72 культуры энтеропатогеннсй E.coli. Из них 4 штамма (5.6Х) дали положительный результат с антиадгезкзкой сывороткой К99, 5 штаммов (6.9Х) растирались в капле сыворотки в виде комочков, 17 штаммов (23,БХ) при смачивании культуры, находящейся на бактериологической петле, г капле сыворотки сразу склеивались в виде казеинового сгустка и не растирались в капле сыворотки, хотя в контроле с физиологическим раствором и кроличьей сывороткой они хорошо растирались з однородную взвесь. Остальные 46 штаммов (63,9%) с сыворотками не агглютинировали.

Культуры изучали ка способность вырабатывать ТС-энтеро-тсксины на мышах-сосунках. Штаммы E.coli выращивали на бульоне Хоттингера (pH 7,5-7,4) в течение 48 часов при 37°С. Для опыта использовали надосадочную жидкость, которую вводили 2-4 дневным мышам-сссункам (белым, беспородным). Задень до опыта их отделяли от маток и 18-20 часов при температуре 25°С выдерживали в течение суток на голодной диете в стеклянных банках ем-

костью 0,2 л, на дно которой положена фильтровальная бумага.

Для опыта были отобраны 10 знтерапатагенных штаммов E.coli. Эксперимент проводился на 50 шшзх-сосунках. Результаты представлены в таблице 3.

Из таблицы видно, что рекомендуемый коэффициент расширения более 0.09 не был достигнут. Следовательно,' испытуемые штаммы в малом количестве вырабатывали гермостабяльные энтеро-токсины, как и положительный контроль(штамм К12К99), который частично потерял свою способность вырабатывать термостабильные знтеротоксины в связи с частыми пересевами и длительным хранением на питательных средах.

Таблица 3

Проверка штаммов E.coli на способность вырабатывать ТС-знтеротоксины

Наименование штамма Средний вес мышей- сосунков, м ¡Средний вес кип-|ки, мг Коэффициент j расширения J

Стерильный

МПБ 1782 92 0.052

К12К99 1878 129 0.069

П1 1610 122 0.076

П19 1790 123 0.069

П26 1688 115 0.068

П28 1290 92 0.071

П32 1819 130 0.071

П35 1682 106 0.063

П37 1620 99 0.061

П39 1843 114 0.062

П42 1735 105 0.061

П115 1759 110 0.063

Для теста на отек мьппиной лапы использовали белых беспородных мышей живой массой 12-14 г. В подушечку правой лапы вводили разрушенный ультразвуком лизат бульонной культуры E.coli в объеме 0,05 мл, левая лапа служила контролем (в нее вводится стерильный бульон в том же количестве, что к в опыт-

нуп). Бактериальный лизат шел исходную концентрацию около 100 млрд. клеток в 1 мл. На каждое исследование в оште использовали по 3 мышки. Отек лап учитывали через 48 часов. Для этого задние конечности ампутировали по голеностопному суставу и взвешивали на аналитических весах.

Величину отека определяли по разнице веса правой и левой лапы каждой мыши (в миллиграммах), затем расщитывали среднюю арифметическую величину отека. За положительный результат принимали показатель отека равный 65 мг и более.

Для опыта было отобрано 14 штаммов знтеропатогенкых E.coli и один штамм К12К99 в качестве положительного контроля. Микроорганизмы разрушались при помощи ультразвукового диспер-гатора УЭДН-2Г на частоте 22кГц при 4 минутной экспозиции. Контрольный штамм дал недостоверный отек лапы - всего 20 мг, остальные штаммы имели различный отек лап от 25 до 80 мг. Достоверный отек по первому уровню значимости наблюдали только у 2 штаммов который составил 75 и 80 мг - 13.ЗХ.

2.2.5. Получение анатоксин-антимикробной вакцины из местных штаммов E.coli. Проверка ее на стерильность, . безвредность и активность

Для приготовления вакцины отобрали 7 штаммов E.coli выделенных от новорожденных телят в хозяйствах Новосибирской области, которые обладали вирулентными, токсигенными, иымуноген-ными и адгезивными свойствами.

Отобранные штаммы E.coli засевали в колбочки на 100 мл со средой Хоттингера и после получения матровых культур каждый штамм засевали в двухлитровые колбы с бульоном Хоттингера (рН-7,8) и выращивали 7 дней в термостате при 37°С. Затем культуры каждого штамма фильтровали через фильтр Сальникова (пластины ФС) в общую бутыль. После этого к фильтрату добавляли формалин до 0,3-0,4% и выдерживали з термостате при 37 °С 10-12 дней (для перевода токсина в анатоксин). Полученный анатоксин осаждали 10Т. стерильным раствором алвмокалиевых квасцов из расчета до 1% на весь объем. После отстаивания анатоксина в течение 2-3 дней надосадочную жидкость отсасывали сифоном.

К- и 0-антигены получали путем посева суточных бульонных

культур отобранных штаммов E.coli на №А в колбы Тартаковского и выращивания в термостате при 37°С в течение двух суток, после чего бактериальные клетки смывали физраствором содержащим 0,35% формалина в стерильную колбу. Концентрацию микробов доводили по стандарту мутности до 50-60 млрд. микробных клеток в 1 мл. К смыву культур добавляли перекись водорода до концентрации 0,15-0,25%. Через несколько часов после окончания реакции выделения кислорода из смыва делали посев на стерильность. Через сутки, а случае отсутствия бактериального роста на питательных средах полученные, анатоксин и антиген смешивали в равных объемах и смесь разбавляли стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд. микробных тел.

Остаточное количество форыашна в смеси не должно превышать 0.07Х.

Вакцину расфасовывали при соблюдении стерильности во флаконы емкостью 100 и 200 мл, анкетировали с указанием даты изготовления, срока годности, вводимых доз, реквизиты изготовителя.

Было получено две серии вакцины. Первая серия выпущена в количестве 10 литров и вторая - 20.

Каждую серию вакцины перед выпуском контролировали на стерильность - при высеве на ЫП4, МШЗ, МППБ под вазелиновым маслом и 10 дневной инкубации в термостате при 37°С, при атом роста микрофлоры не отмечали.

Безвредность проверяли при внутрибршинном введении 4-6 белым мышам массой 14-18г вакцины а дозе 0,3-0,5 мл. Вакцинированные мыши, в течение 10 дневного срока наблюдения, оставались живыми и не проявляли клинических признаков болезни.

Активность (иммуногенность) проверялась на 10 белых мышах привитых подкожно вакциной в доге 0,1 мл (500 млн.микробных тел) и через 14 дней зараженных смесью гомологичных штаммов E.coli в дозе ЗДЛ50. При проверке первой серии вакцины из 10 пата две мыши, а при проверке второй серии вакцины из 10 пало три белых мыши.

Из выше изложенного следует, что вакцина стерильна, безвредна и активна. В дальнейшем вакцина использовалась для гипе-ришмунизации быков и иммунизации стельных коров.

2.2.6. Получение гипериммунной сыворотки против зшери-хиоза телят при гипериммунизации быков

Учхоз "Тулинское" - хозяйство благополучное по заразным. болезням. Для опыта отобрали клинически здоровых быков»обработанных против накожных паразитов, выше-средней упитанности, полуторалетнего возраста, массой около 300 кг. Десяти отобранным быкам одели ошейники и поставили их в отдельный ряд базы для взрослых животных. В это же время провели исследование внутрикожной туберкулиновой пробой, взяли сыворотку крови для диагностических исследований в Областной бактериологической лаборатории на бруцеллез (экспертиза N 48088 от 8.12.92), леп-тоспироэ (экспертиза N 19835 от 8.12.92), лейкоз (экспертизы Ш 12693-12702 or 8.12.92) и по результатам исследований реагирующих животных на эти инфекции не выявлено.

За время диагностических исследований и выдачи экспертиз, животные были витаминизированы тетравитом в дозе по 10 мл внутримышечно и обработаны против эктопаразитов 1Z раствором хлорофоса по 500-700 мл на каждое животное при помощи опрыскивателя.

Для гипериммунизации использовалась опытная вакцина. Вакцина вводилась с интервалом в 3-5 дней, подкожно в область шеи и спины в догах - 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 60 мл. Затем периодически брали кровь для получения гипериммунной сыворотки, контролируя при атом титр антител.

2.2.7. Контроль содержания иммуноглобулинов и титры антител к иэодятам E.coli в процессе гипериммунизации быков

При гипериымунизации быков изучались титры антител к культурам эшерихий содержащихся в вакцине, а гак же контролировалось изменение белкового состава сыворотки крови.

На графике 1 изображена динамика изменения белкового

состава крови в процессе иммунизации животных. Из графика видно, что альбумины и альфа-глобулины на протяжении всего курса гипериммунизации являются наиболее стабильными, как и количество общего белка. Количество бэтта-глобулинов достоверно уменьшилось по 3 уровни значимости, а количество гамма-глобулинов достоверно увеличилось по первому уровню значимости.

График 1

ъъ

50

4В

а1

I

ч X а

аз о а

зв

20

10

Динамика изменения бе/жо&ого состаВа| кроВи у быкоВ при гипериммунизации |

---Ц ч 43 г= -4

' -— таг

г: В 23 32 23 Й 91 ?

____ „од. 17

___% |в---

—г Г 1 5——^

10

Общий белок В-Глобулины

15

Л^нь опыта

— Альбумины

— Г-Г лобулины

20

Я-Глобулины

25

2.2.8. Получение сыворотки от быков продуцентов и ее контроль на стерильность, безвредность и активность

Первое взятие крови от гипериммунных животных производили при достижении титра антител по 0-антигену 1:1280.

После этого продолжали гипериммунизацгао и по достижении нужных титров антител в сыворотке крови производили опять двукратное кровевзягие с интервалом в сутки. Первый раз 1фовь

брали до 1% от массы тела, а через сутки в половину меньше.

Гипериммунную сыворотку проверяли на стерильность путем посева на питательные среды: МПА, МПБ, ШГШ под вазелиновым маслом, а один иг флаконов с сывороткой помещали в термостат при температуре 37°С на 10 дней. По всем этим показателям сыворотка была стерильна.

Безвреднось сыворотки проверяли на белых мышах путем подкожного введения по 0.5 мл сыворотки 6 белым мышам массой 1Б-18 г. Опытные мыши оставались живыми, без признаков заболевания в течение 10 дневного срока наблюдения.

Активность сыворотки проверяли на 20 белых мышах разделенных на две группы по 10 мышей в каждой, которым сыворотка вводилась в дозах 0.25 и О.Б мл. Через 24 часа мышей заражали смесью гомологичных штаммов E.coli в дозе ЗДЦ50. В качестве контроля использовали 4 мышей, которым сыворотка не вводилась. В результате проведенных опытов в группе мышей, которым вводили 0.5 мл сыворотки - пало 2 мышки; в другой группе, которой вводили 0.25 мл сыворотки - пало 3 мышки и 3 были сильно угнетены, шерсть была взъерошена, наблюдался озноб. Через два дня эти признаки заболевания полностью прошли. В группе контрольных мышей все четыре пали через 8-15 часов.

Из проведенных опытов следует, что сыворотка стерильна, безвредна и активна и может быть использована в эпизоотических опытах на новорожденных телятах.

2.2.9. Схема иммунизации стельных коров и контроль за качеством иммуноглобулинов и титром антител в сыворотке крови и молозиве

В учхозе "Тулинское" в опыте использовались стельные коровы и телки. В опыте использовали 3 группы животных: - коровы привитые поливалентной Г0А формолвакциной, изготовленной в апреле 1992 г., Омским биокомбинатом, госконтроль N 12, серия N 12 - 104 коровы (опытная группа Ml); - коровы привитые опытной анатоксин-антимикробной вакциной - 45 голое (опытная группа N 2) и 271 непривитая корова (контрольная группа). Стельным

»

коровам опытная и биофабричная вакцины вводились подкожно, двукратно, с интервалом в 10 дней в дозах: 1-й раз - 10 мл, 2-й раз - 20 мл. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Для изучения тигров антител, количества иммуноглобулинов в сыворотке крови и молозиве из каждой группы животных отбирали по 5 коров.

Таблица 4

Среднее количество иммуноглобулинов и титры антител у коров учхоза "Тулинское"

Показатели Контроль Опыт 1 Опыт 2

Общий белок мг/мл Альбумины мг/мл Альфа-глобулины мг/мл Бета-глобулины мг/мл Гамма-глобулины мг/мл Белковый коэффициент Общие иммуноглобулины молозива мг/мл антител , крови антител молозива

56.98+2.84 20.00+1.20 7.70+0.73 9.96+0.97 19.26+2.09 0.550+0.05

59.02+3.90 23.44+2.19 8.78+1.74 8.32+1.10 18.52±3.54 0.691+0.10

53.98±2.48 25.74±1.81* 6.28+0.83 6.0+0.47** 15.98±1.39 0.93+0.09**

7.660+1.206 14.19+2.838 16.87+4.76** 1.927+0.074 2.367+0.068 2.587±0.14** 1.746+0.06 2.11+0.095* 2.187±0.165*

Примечание: здесь и далее * - соответствует Р<0.05; ** -соответствует Р<0.01; *** - соответствует Р<0.001.

2.2.10. Наличие иммуноглобулинов и титры антител в крови новорожденных телят

У новорожденных телят кровь для исследований брали на 2-3 сутки после рождения. Результаты представлены в таблице 5.

Опытная вакцина повышает у коров и телят рожденных от них, титры специфических антител в сыворотке крови и сыворотке молозива (у коров), количество же бегта-глобулинов при этом понимается.

Таблица 5

Изучение количества иммуноглобулинов и титра антител в сыворотке крови новорожденных телят учхоза"Тулинское"

Показатели Контроль Опыт 1 Опыт г

Общий белок мг/мд 43.1213.25 41.32±2.10 42.44±2.02

Альбумины мг/мл 18.58+2.56 17.78±1.47 20.18±1.52

Альфа-глобулины иг/мл 5.38±0.64 5.14±1.05 6.12±0.91

Бета-глобулины мг/мд 10.60±0.93 5.88±0.42** 6.8±1.275*

Гамма-глобулины иг/мл 8.54±1.56 12.54±1.12 9.32±1.48

Белковый коэффициент 0.785±0.12 0.782±0.10 0.912±0.09

Ье антител крови 1.505±0.095 1.927+0.15* 2.06540.15***

2.2.11. Заболеваемость и летальность телят полученных от вакцинированных коров

Дая изучения динамики заболеваемости телят колибактерио-зом в учхозе "Тулинское" отбирали 3 группы новорожденных телят рожденных от коров вакцинированных поливалентной ГОД формол-вакциной - опытная группа N 1; телят рожденные от коров привитых опытной вакциной - опытная группа N 2; телята рожденные от не вакцинированных коров - контрольная группа. В каждой группе отобранной по типу аналогов, наблюдали по 10 новорожденных телят в течение 10 дней их содержания в индивидуальных клетках до перевода в общие.

Телят ежедневно клинически осматривали, измеряли температуру тела. При клинических признаках заболевания лечили антибактериальными препаратами и симптоматическими средствами, традиционно применяемыми в хозяйстве в общепринятых дозах.

Основным признаком заболевания считали жидкий стул бело-желтого цвета с пенистым содержимым или без него,' а также профузный понос.

Температура тела у заболевших и, клинически здоровых телят фактически находилась в пределах нормы. Так, у здоровых телят

она в среднем составляла 39.04°С, а у заболевших - 39.3°С.

Динамика заболеваемости новорожденных телят представлена на диаграмме 1.

Из диаграммы видно, что телята контрольной группы на 2 день заболевают на 90% колибактериозом, а к 4 дню не остается ни одного здорового теленка. Телята контрольной группы тяжелее переносили заболевание. Несмотря на оказанное лечение болевнь для телят контрольной группы имела два пика на 4 и на 8 сутки. В опытных группах пик заболевания приходился на 4 сутки, после чего происходил постепенных спад заболеваемости.

Диаграмма 1

Динамика заболеваемости телят ('О

А 8

Лень жизни

Ейг^З контроль

опыт 1 ВЗЗЗЗ опыт 2

За период опыта в совхозе "Тулинское" (с января по июнь 1993 г.) родилось 420 телят. Из них в первый месяц жизни пало 14 телят (З.ЗХ). В контрольной группе из 271 новорожденного теленка пало 10 (3.7%), а в опытной группе N 1 из 104 новорожденных телят - 3 теленка (2.ЭХ), в опытной группе N 2 из 45 новорожденных телят - 1 теленок (2,2%).

2.2.11. Лечебная и профилактическая эффективность подива-денгной сыворотки против эшерихиоза тедят в комплексе с антибактериальными препаратами и симптоматическими средствами

В совхозе "Чиксюга" гипериммунная сыворотка применялась внутримышечно в дозе - 40 мл с лечебной целью вместе с антибиотиками. Всего обработано сывороткой 150 телят, из них пало 20. Лечебная эффективность гипериммунной сыворотки составила 85.7%.

Сыворотка также применялась в учхозе "Тулинское" с профилактической и лечебной целью. После однократного применения в дозе 20 мл в первые часы после рождения профилактический эффект был в течение-5-6 дней, после чего телята переболевали колибактериогом в более легкой форме. Испытали на 123 телятах. При двукратном подкожном применении сыворотки в дозах 20-30 мл на первый и четвертый день жизни удавалось существенно снизить заболеваемость. Так в опытах на 12 телятах заболело 3 теленка на 4-5 день жизни.

Лечебную эффективность сыворотки наблюдали в комплексе о антибактериальными препаратами и симптоматическими средствами. Было подвергнуто лечении 58 телят. Сыворотку вводили подкожно, внутрубрюшинно и внутримышечно в дозе 40 мл о интервалом 1 день до выздоровления. При атом пало 7 телят. Лечебная эффективность составила 88%.

ВЫВОДЫ

1. В 7 хозяйствах Новосибирской области выделено 583 штамма E.coli от новорожденных телят. Из них 120 сказались эн-теропатогенными. Наиболее часто встречались следующие серова-ры: 078; 08; 09; 0149.

2. Ив 120 энтеропатогенных птаммов, выделенных.от новорожденных телят, лекарственной устойчивостью обладали к эритромицину и оксациллину 100% птаммов эшерихий, к тетрациклину -97%, к бензилпенициллину, мономкцйну, доксициклину - 93%, к

стрептомицину и линкомицину - S2X, к сшеандомицину - 90S, к фузидину - 83%, к левомицетину - 73%, к канамицину - 67%, к карбенициллину - 5471, к ампициллину - 50%, к полимиксину -48%, к неомицину 47%, к гентамицину 30%.

3. Для получения анатоксина Е.coll культивирование целе-собразно производить на среде Хогтингера в течение 7 дней с последующей инактивацией формалином до обшей концентрации 0.35-0.40%, выдерживая в термостате при 37°С в течение 7-10 дней и осаждением его 10% алшо-калиевыми квасцами до 1% к общей концентрации.

4. Для получения протективкого антигена E.coll можно использовать субълетадьные концентрации перекиси водорода (0.15-0.25%) и формалина (0.1%).

5. Изготовление анатоксин-антимикробной вакцины производится при смешивании осажденного анатоксина с 5 млрд взвесью протективного антигена в соотношении 1:15.

6. В опытах на белых мышах массой 15-18г, привитых вакциной в дозе 0.1 мл (500 млн) микробной взвеси и при их внутриб-ршпинном заражении смесью вирулентных штаммов через 14 суток дозой ЗЛД50, выжило 8 мышей из 10 при 100% гибели в контроле.

7. У коров иммунизированных опытной вакциной в день отела Lff антител по "О" антигену E.coli в сыворотке крови составил Mim 2.5868±0.143, в молозиве 2.1868±1.17; у вакцинированных биофабричной вакциной соответственно 2.3674±0.07 и 2.1072±0.1; у контрольных, непривитых коров титры антител в сыворотке крови были Lff М±ш 1.9266±0.07 и в сыворотке молозива 1.745+0.06.

8. В опытах на белых мышах массой 15-18 г., обработанных подкожно опытной гипериммукной сывороткой в дозах 0.25 и 0.5 мл и зараженных E.coli в дозе ЗДЦ50 предохранено 80 и 70% мышей, в то время как среди группы белых мышей обработанных гипериммунной биофабричной сывороткой в дозе 0.25 мл предохранено только 30% мышей.

9. Лечебная эффективность опытной гипериммунной сыворотки при лечении телят с клиническими признаками колибактериоза в комплексе с антибактериальными препаратами и симптоматическими средствами составили в совхозе "Чикский" - 86.7%, а в учхозе "Тулинское" - 88%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДГОШШ

1. Предложен способ изготовления вакцины против эшерихио-за телят (подана заявка N 93-020245/13(020291) и установлен приоритет от 10 апреля 1993г).

2. Разработана наставление по применению вакцины против зшерихиоза телят.

3. Согласно решения Департамента ветеринарии от 09.11.93г N 19-4/634 за подписью зам.начальника Ю.Е.Шатохина намечены комиссионные производственные испытания опытной партии вакцины и сыворотки против зшерихиоза телят в двух хозяйствах Новосибирской области.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Вольф В.Т. 0 биологических особенностях к лекарственной устойчивости E.coli, выделяемых при диареях новорожденных телят в некоторых хозяйствах Новосибирской области // Проблемы науки и производства в условиях аграрной реформы: Тез. докл. науч.-практич. конф. НГАУ. Новосибирск. -1993. N 4.-1С.225-227.

Подписано к печати 05 0 а. 34г. Формат 60*84/16 Объем 1 п.л. Заказ N74S. Тираж 100 экз. Редакционно-полиграфическое объединение СО РАСХН, ротапринт 633128, Новосибирская область,п. Красносбск