Изучение генетической вариабельности возбудителя сибирской язвы

Колбасов, Денис Владимирович

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение генетической вариабельности возбудителя сибирской язвы

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Колбасов, Денис Владимирович Покров 2000 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Изучение генетической вариабельности возбудителя сибирской язвы

На правах рукописи

УДК 577.21: 619:616.98:579.852.11

РГ6 од

2 5 ЛЕН ?т

КОЛБАСОВ ДЕНИС ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров-2000 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, прифессор С.Ж. Цыбанов

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор, академик

И.А. Бакулов (ВНИИВВиМ)

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

B.C. Русалеев (ВНИИЗЖ)

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии, г. Москва.

Защита диссертации состоится 27 декабря 2000 г. в 1130 часов на заседании диссертационного совета Д-120.61.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан 27 ноября 2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук ВЛ. Савукова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Сибирская язва является широко распространенным особо опасным зооантропонозом, который наносит серьезный ущерб животноводству и представляет угрозу здоровью людей. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, природной очаговостью, наличием широкого круга хозяев, недостаточной изученностью генома и антигенной структуры микробных клеток. Широкий спектр восприимчивых животных и людей, способность длительное время сохраняться во внешней среде определяют необходимость дальнейшего изучения природы возбудителя сибирской язвы с целью разработки новых, более чувствительных и специфичных средств и методов идентификации патогенных бацилл.

В последние годы большое внимание уделяется исследованиям молекулярной структуры генома возбудителей особо опасных болезней животных, изучению взаимосвязи структуры и функции генома с целью создания чувствительных, специфичных диагностических тест-систем и эффективных средств специфической профилактики нового поколения. Для идентификации возбудителей бактериальных болезней животных широко применяют высокочувствительные методы анализа генома, такие как рестрикционный анализ, методы молекулярной гибридизации, геномной "дактилоскопии", полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования и риботипирования.

нетического разнообразия микроорганизмов, паспортизации и дифференциации близкородственных микроорганизмов, картирования и определения структуры генов и эпизоотологического мониторинга (БсЬетег! Р., КгаиББе Я., 1996).

Поскольку частоты различных классов коротких тандемных повторов значительно различаются у микроорганизмов, принадлежащих к разным таксономическим группам, для каждой группы' необходимо подбирать свои наборы праймеров. Наиболее привлекательным свойством коротких тандемных повторов является то, что они распределены по всему геному (что облегчает использование этих маркеров для молекулярного картирования генома). Простота манипуляций в сравнении с ЯРЬР-анализом и значительная вариабельность, порой в 10 раз превышающая вариабельность Ш-ЪР-фрагментов, что обеспечивает высокую информативность этих маркеров.

Сравнительная эффективность методов анализа генотипов бацилл с использованием четырех видов ДНК-маркеров (Ш-ЪР-, ЯАРВ-, АБЬР- и ББК-методы) показало, что ББИ-маркеры (короткие тандемные повторы) обеспечивают наибольшую информацию, а использование АРЬР-зондов — наибольшее число локусов, выявляемых в одном и том же опыте (Мь гаш К., ко N.. 1997).

Указанные методы позволяют, прежде всего, выявлять не фенотипи-ческое проявление, а непосредственно исследовать молекулярную структуру генома, выявлять генетическую вариабельность, устанавливать генетическую взаимосвязь штаммов и изолятов возбудителей, выделенных в разных регионах.

1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось изучение вариабельности генома различных штаммов Bacillus anthracis, выявление их различий и идентификация возбудителя сибирской язвы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• рассчитать и синтезировать универсальные и специфические праймеры для избирательной амплификации различных генов возбудителя сибирской язвы;

• охарактеризовать геномы различных штаммов возбудителя сибирской язвы и спорообразующих сапрофитов методами рестрикционно-го анализа, молекулярной гибридизации и риботипирования;

• оптимизировать условия постановки ПЦР для дифференциации изолятов В. anthracis;

• клонировать фрагменты генов протективного антигена и капсуло-образования в плазмидном векторе pUC19.

1.3. Научная новизна :

1. Экспериментально доказана возможность использования методов RAPD-fingerprint и риботипирования для изучения геномного полиморфизма вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы и спорообразующих сапрофитов.

2. Установлено наличие в хромосомной ДНК гипервариабельных последовательностей, детектируемых универсальными праймерами, а также праймерами, комплементарными вариабельной последовательности рРНК и инсерционного элемента, расположение которых имеет родовую, видовую и штаммовую специфичность.

3. Определены оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции для дифференциации капсулообразующих штаммов сибирской язвы от непатогенных с использованием универсальных прайме-ров, комплементарных гену СарВ.

1. 4. Практическая значимость.

Полученные результаты и разработанные методы используются:

• для идентификации и дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы;

• дифференциации и паспортизации производственных вакцинных штаммов;

• полученные рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты ДНК сибиреязвенных плазмид рХ01, рХ02, кодирующих гены протектив-ного антигена и капсулообразования, могут в дальнейшем использоваться для проведения различных генно-инженерных манипуляций.

По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ВНИИВВиМ методические указания, которые подтверждены актами комиссионных испытаний.

1.5. Положения, выносимые на защиту.

1. Изучение геномного полиморфизма хромосомной ДНК различных штаммов возбудителя сибирской язвы методами КАРО-{]п£егрпги и риботипирования.

2. Оптимизация полимеразной цепной реакции для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы с использованием праймеров, комплементарных генам плазмид вирулентности рХ01 и рХ02 возбудителя сибирской язвы.

3. Клонирование фрагментов ДНК сибиреязвенных плазмид рХ01 и рХ02, кодирующих гены протективного антигена и капсулообразования, в составе плазмидного вектора р11С19.

1.6. Апробация результатов исследований.

Результаты исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ в 1999-2000 г., опубликованы в сборниках материалов научно-практических конференций Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (Покров 1998, 1999,2000).

1.7. Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

1.8. Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 37 отечественных и 94 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 16 рисунками и 1 приложением.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2000 г.г. в лабораториях "Биофизики" и "Экспериментальной микробиологии» ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Российской академии сельскохозяйственных наук по теме 01.06. "Разработать генно-инженерные и иммунохимические методы идентификации и дифференциации возбудителей оспы овец и коз, чумы мелких жвачных, инфекционной бурсальной болезни, синдрома снижения яйценоскости, африканской чумы свиней, классической чумы свиней, сибирской язвы и листериоза".

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы.

Штаммы, в работе были использованы вакцинные штаммы B.anthracis: СТИ-1, М-71; М 71/12; 34/F2; 55 - ВНИИВВиМ и спорообра-зующие сапрофиты рода BACILLUS: В. anthracoides 1312, B.cereus 96, B.subtilis США, B.mesenthericus 1228, В.megatherium 2250. Все перечисленные штаммы получены из музея бактериальных культур ВНИИВВиМ.

Ферменты, рестриктазы EcoRI, ДНК-полимераза I, Taq-полимераза, Т4 ДНК-лигаза ("Ферментос", Вильнюс); протеиназа К ("Boehringer-Manheim", ФРГ), РНК-аза А, ДНК-аза 1, лизоцим ("Serva"), Альфа Р-32 dNTP ("Изотоп", Обнинск). А также реактивы отечественного и импортного производства ("Serva", ФРГ; "Pharmacia", Швеция; "Promega", США).

2.1.1. Культивирование вакцинных штаммов. Культивирование вакцинных штаммов сибирской язвы проводили в пробирках с жидкими питательными средами (МПБ, бульон Хоттингера) в течение 18 часов при температуре 37°С. Полученную бульонную культуру засевали сплошным газоном на поверхность питательных агаров.

2.1.2. Выделение хромосомной ДНК бацилл. Полученную бактериальную массу смывали с поверхности питательного агара буферным раствором (0,05 М трис-HCL, рН 8,0) и дважды отмывали от остатков питательной среды центрифугированием при 6000 об./мин в течение 10 минут. Осадок, полученный после центрифугирования, суспендировали в этом же буферном растворе, содержащем 20% сахарозы, добавляли лизоцим до конечной концентрации 15 мг/мл и инкубировали 1,5-2 часа при 37°С. Затем добавляли растворы ЭДТА-Ыаг и SDS до конечной концентрации 50 мМ и 1%, соответственно.

К лизату добавляли равный объем свежеперегнанного фенола, осторожно перемешивали в течение 30 минут на шуттеле и центрифугировали 20 минут при 6000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фазу и повторно экстрагировали смесью равных объемов фенола и хлороформа (1:1), перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин. После переосаждения спиртом, хромосомную ДНК обрабатывали РНК-азой и протеиназой К в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 30 мин при

37°С. Очищенные препараты хромосомных ДНК переосаждали этиловым спиртом и хранили в 70%-ном этиловом спирте при минус 20°С.

Чистоту препаратов оценивали по величине отношения оптической плотности растворов ДНК при 230, 260, 280 нм.

2.1.3. Рестрикция ДНК. Разделение продуктов гидролиза осуществляли электрофорезом в геле агарозы. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили, применяя 10-кратный рестрикционный буфер согласно паспорту, прилагаемому изготовителем для каждой рестриктазы.

2.1.4. Введение радиоактивной метки в ДНК. Введение радиоактивной метки в ДНК с помощью ДНК-полимеразы I и полинуклеотидкиназы проводили согласно инструкции к наборам фирм- изготовителей.

2.1.5. Риботипирование. Препараты хромосомной ДНК гидролизо-вали рестриктазой EcoRl. Продукты рестрикции разделяли в 0,8 % агароз-ном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр по методу Саузерна и гибридизовали с ПЦР-продуктом, комплементарным рРНК бацилл.

2.1.6. Амплификация фрагментов ДНК. Амплификацию фрагментов ДНК проводили в 20-50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl (рН 8,9), 3 мМ MgCl, 40 мМ КС1, 0,1 мг/мл БСА, 0,2 мМ смеси dNTP, 1 мкМ каждого праймера, 1-10 нг тотальной ДНК, 1-2 ед. акт. Taq-полимеразы. Амплификацию осуществляли 30-кратным повторением последовательности следующих стадий: денатурации (94° С, 1-3 мин), отжига (37- 65 0 С, 1-3 мин) и полимеризации (70-72° С, 1-5 мин) на термо-циклере «Touch Down» Hybaid (Англия) с использованием Taq-полимеразы и dNTP фирм Pharmacia (Швеция) и Promega (США).

2.1.7. Компьютерный анализ. Компьютерный анализ и сравнение первичных последовательностей нуклеиновых кислот, расчет олигонукле-отидов проводили с использованием пакетов прикладных программ DNASIS/PROSIS версия 3.00 и PC Gene, версия 5.15 1988 (Intelligenetics, Швейцария). Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с использованием соответствующих энергетических правил по программе "OLIGO". Синтез олигонуклеотидов проведен к.х.н. А.И. Ломакиным (ВНИИЗЖ, Владимир).

1.2. Результаты собственных исследований.

При идентификации вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы основное внимание было уделено поиску генетических маркеров, локализованных на внехромосомных генетических элементах.

Маркерами для выявления внутриштаммовых различий возбудителя сибирской язвы служили гипервариабельные последовательности хромосомной ДНК, которые были обнаружены у близкородственных бацилл.

. 2.2.1. Клонирование фрагментов ДНК сибиреязвенных плазмид.

Для клонирования фрагментов плазмидной ДНК (pXOl, рХ02) использовали вектор pUC 19. При анализе клонов методом дот-гибридизации были отобраны рекомбинанты, дающие положительный сигнал с меченными Р32 олигонуклеотидами, комплементарными гену протективного антигена (клоны рПА 8, 9, 10) и гену cap В (клоны рСАР 5, 6,7).

Рестрикционный анализ рекомбинантных клонов эндонуклеазами BamHI, EcoRI, Hindlll показал, что полученные клоны имели размеры вставок от 1,0 до 4,0 т.п.о.

Результаты исследований различных проб ДНК, выделенных из раз, личных бацилл, методом дот-гибридизации свидетельствуют о том, что рекомбинантные плазмиды, меченые радиоактивным фосфором, при 68°С не гибридизуются с контрольными препаратами ДНК, выделенными из спорообразующих сапрофитов, и дают четкий положительный сигнал с препаратами ДНК шт. 55-ВНИИВВиМ и М-71.

2.2.2. Выявление ДНК возбудителя сибирской язвы с помощью ПЦР

Для выявления возбудителя сибирской язвы были использованы специфические праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям генов протективного антигена и капсулообразования.

Для обнаружения ДНК капсулообразующих вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы были синтезированы 2 пары праймеров, комплементарные последовательностям гена капсулы (СарВ, плазмида рХ02), фланкирующие последовательности размерами 620 п.о. (наружная пара

праймеров) и 340 п.о. (внутренняя пара праймеров).

При отработке оптимальных режимов амплификации с использованием ДНК-матриц выделенных из штаммов М-71 и 71/12, было установлено, что размеры полученных ПЦР-продуктов соответствовали ожидаемым (622 и 340 п.о.).

При использовании препаратов ДНК, выделенных из бескапсульных штаммов 55-ВНИИВВиМ, СТИ-1, 34/Т2, спорообразующих сапрофитов и органов здоровых морских свинок (сердце, лимфатические узлы, селезенка), специфических ПЦР-продуктов не обнаружено.

Результаты исследований чувствительности показали, что метод ПЦР позволяет обнаружить в образцах бульонной культуры ДНК возбудителя сибирской язвы (капсулообразующие штаммы М-71, 71/12) в концентрации 10-100 КОЕ 50/мл или 1 фг ДНК.

С целью дифференциации возбудителя сибирской язвы от различных видов спорообразующих бацилл были использованы праймеры, комплементарные гену протективного антигена (плазмида рХ01), фланкирующие ПЦР-продукт размером 800 п.о.

Результаты исследования различных бацилл с помощью ПЦР показали, что данная пара праймеров специфически связывается только с ДНК бескапсульных штаммов и не связывается с ДНК спорообразующих сапрофитов и других бактерий (листерий, микоплазм, Е.соИ).

Таким образом, на основание проведенных исследований были разработаны «Методические указания для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы с помощью ПЦР», утвержденные директором ВНИИВВиМ.

2.2.3. Генотипирование хромосомной ДНК штаммов возбудителя сибирской язвы с помощью 11АРР-АпеегрпгП.

Для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы были использованы праймеры, комплементарные вариабельным последовательностям хромосомной ДНК и также спейсерным последовательностям рибосомальной РНК (методы риботипирования и КАРВ-:йп£егрпп1).

С этой целью были использованы в качестве затравки 12 олигонук-леотидных праймеров длиной 12-20 нуклеотидов.

Эксперименты показали, что из испытанных праймеров только отдельные праймеры позволяют амплифицировать участки генома различных штаммов возбудителя сибирской язвы и спорообразующих сапрофи-тов.

Так, два праймера (М> 5, № 6) длиной 20 нуклеотидов эффективно амплифицировали набор мажорных и минорных фрагментов из 1-5 полос размером от 800 до 2800 п.о. (Табл. 1 и 2).

Полученные профили фрагментов ДНК были, в основном, одинаковы для всех исследованных штаммов возбудителя сибирской язвы и составлял 1,0; 1,5; 1,9; 2,3; 2,8 т.п.о. Различия между тремя исследованными вакцинными штаммов возбудителя сибирской язвы не выявлены. Изменения температуры и времени отжига праймеров, а также концентрации "ионов не позволили дифференцировать вакцинные штаммы возбудителя сибирской язвы. В то же время, использование данных праймеров позволило отличить спорообразующих сапрофитов от сибиреязвенных вакцинных штаммов (В. сегеш - 0,8; 1,2; 1,4; 1,7 т.п.о.; В. зиЫШв - 0,8; 1,2; 1,5; 2,8 т.п.о.; В. ап^гао^ез - 1,2; 1,5; 1,7; 1,9 т.п.о.).

Таблица 1 п=3

Результаты ПЦР с универсальным праймером № 5 (размер продуктов в т.п.о.).

№ фрагм. 55-ВНИИВВиМ СТИ-1 М-71 В.сегеиэ В. БиЫШэ В. апЛгассис1ез

1 2,8 2,8 2,8 2,8

2 2,3 2,3 2,3

3 1,9 1,9 1,9 1,9

4 1,7 1,7

5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

6 1,4

7 1,2 1,2 1,2

8 1,0 1,0 1,0

9 0,8 0,8

Различия по фрагментам наблюдались также и у других видов са-профитов, не являющихся возбудителем сибирской язвы. Обнаружено, что шт. 55-ВНИИВВиМ отличается от шт. М-71 и СТИ-1 одним фрагментом размером 1,4 т.п.о. (Табл. 2).

Таблица 2 п=4

Результаты ПЦР с универсальным праймером № 6 (размер продуктов в т.п.о.).

№ фрагм. В. апЛгассмс1е5 В. виЫШэ В. сегеиз М-71 55-ВНИИВВиМ СТИ-1

1 1,9 1,9 1,9

2 1,7

3 1,5 1,5 1,5

4 1,4

5 1,3

6 1,0 1,0 1,0 1,0

При использовании праймера № 7, выявлены от 1 до 4 мажорных полос, специфичных для каждого штамма возбудителя сибирской язвы. Размеры фрагментов составляли от 560 до 2700 п.о. (Табл. 3).

Таблица 3 п=4

Результаты амплификации ДНК различных бацилл с помощью универсального праймером № 7 (размер продуктов в т.п.о.).

№ фрагм. СТИ-1 55-ВНИИВВиМ 34/F2 М-71 71/12 B.cereus B.subtilis

1 2,7 2,7

2 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3

3 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

4 1,7

5 1,6 1,6 1,6 1,6

6 1,2

7 1,0 1,0

8 0,8 0,56

Межштаммовые различия бацилл характеризовались наличием от 1 до 4 фрагментов, имеющих различные размеры (за исключением шт. М-71 и 71/12). У всех исследованных штаммов, за исключением шт. СТИ-1 и 34/F2, обнаружено два общих фрагмента размером 1,9 и 2,3 т.п.о. Шт. 55-ВНИИВВиМ отличался от шт. М-71 и 71/12 наличием дополнительного фрагмента размером 1,2 т.п.о.

Другой разброс величин фрагментов ДНК вакцинных штаммов 55-ВНИИВВиМ, СТИ-1, М-71, был получен при использовании праймера № 10, длиной 12 нуклеотидов. При помощи этого праймера была оценена

стабильность штаммов СТИ-1, 55-ВНИИВВиМ и М-71, прошедших 1 и10 пассажей. Результаты исследований показали, что набор фрагментов остается специфичным для каждого штамма, независимо от числа пассажей (Табл. 4).

Таблица 4 п=4 Результаты ПЦР с универсальным лраймером № 10 (размер продуктов в т.п.о.). ____ _

№ 1-й пассаж 10-й пассаж

фрагм. 55-ВНИИВВиМ СТИ-1 М-71 55-ВНИИВВиМ СТИ-1 М-71

1 2,3 2,3

2 2,0 2,0 2,0 2,0

3 1,7 1,7 1,7 1.7 1,7 1,7

4 1,6 1,6 1,6 1,6

5 1,3 1,3

6 1,2 1,2

7 1,0 1,0

8 0,6 0,6

При исследовании генома бацилл с использованием праймеров 1Б № 5, 1Б № 6, комплементарными последовательности инсерционного элемента, получен более широкий набор (от 2 до 11) фрагментов, имеющих размеры от 300 до 2500 п.о. Все исследованные вакцинные штаммы сибирской язвы и штаммы спорообразующих сапрофитов характеризовались наличием уникальных как мажорных, так и минорных полос (Табл. 5).

Таблица 5 п=4

Результаты ПЦР с универсальным праймером 1Б № 6 (размер продуктов в т.п.о.).

№ фрагм. ' СТИ-1 55-ВНИИВВиМ М-71 34/Р2 В.сегеив В. зиЫШэ

1 3,9

2 3,7

3 3,3 3,3 3,3 3,3

4 3,1 3,1 3,1 3,1

5 2,9 2,9 2,9 2,9

6 2,7 2,7 2,7

7 2,5 2,5 2,5

8 2,3 2,3

9 2,1 2,1

10 1,9 1,9

11 1,7

12 1,5

13 1,3

14 1,1 1,1

15 0,9 0,9

16 0,6

Таким образом, показана возможность использования ПЦР для анализа генома вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы. Универсальные праймеры позволяют осуществлять генотипирование штаммов возбудителя сибирской язвы и могут быть использованы для дифференциации и паспортизации производственных вакцинных штаммов.

2.2.5. Исследование геномного полиморфизма штаммов возбудителя сибирской язвы методом риботипирования.

Зондирование последовательностей хромосомной ДНК с помощью ДНК-зонда, комплементарного спейсерному участку 16Б рРНК, проводили для изучения возможности дифференциации штаммов, характеризующихся высокой степенью генотипического родства.

После расщепления хромосомной ДНК вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы (шт. 55-ВНИИВВиМ, М-71) эндонуклеазой ЕсоШ, фрагменты ДНК после переноса на мембранные фильтры, гибридизовали с ПЦР продуктом (размером 300 п.о.), комплементарным 16Б рРНК. ПЦР-продукт метили радиоактивным фосфором и гибридизацию проводили при температурах 50 и 65°С.

Анализ результатов молекулярного зондирования фрагментов ДНК, полученных с помощью рестрикгазы ЕсоШ, показал, что профили гибридизации с ДНК-зондом (размером 300 п.о.) различных штаммов возбудителя сибирской язвы (шт. 55-ВНИИВВиМ, М-71) имеют мажорные и минорные полосы, которые являются как общими, так и специфичными для штаммов (Табл. 6). Исследованные штаммы содержали от 4 до 12 фрагментов различной молекулярной массы.

Наряду с общими фрагментами, присутствующими в ДНК исследованных штаммов, выявляются уникальные фрагменты размерами 1,0; 1,6; 2,3; 2,5; 4,1; 4,4; 4,8; 6,0; 6,3; 6,9; 8,9 т.п.о. При этом, наряду со специфичными для каждого штамма возбудителя сибирской язвы фрагментами, различающимися по молекулярной массе, выявлены и общие, одинаковые для всех штаммов, фрагменты с одинаковой молекулярной массой, что свидетельствует о принадлежности штаммов к одному виду.

Таблица 6 п=3

Результаты блот-гибридизации при 50 и 65°С ПЦР продукта рРНК с хромосомной ДНК В. ашЬгаыБ, разрезанной ЕсоЫ.

Фрагменты 65°С 50°С

55-ВНИИВВиМ М-71 55-ВНИИВВиМ М-71

1. 8,9 16,0 24,0 24,0

2. 6,3 6,9 16,0 16,0

3. 2,5 3,5 8,9 6,9

4. 1,8 1,8 6,3 6,0

5. 1,0 4,8 4,4

6. 4,1 3,5

7. 3,5 2,8

8. 2,8 2,3

9. 2,5 2,0

10. 2,0 1,8

11. 1,8 1,6

12. 1,0

Таким образом, использованные методы риботипирования и ЯАРО-Яг^егрпШ позволяют исследовать полиморфизм ДНК возбудителя сибирской язвы имеет перспективы для дифференциации близкородственных штаммов бацилл.

3. выводы

1. Методы полимеразной цепной реакции, КАРО-Агшегрпги и ри-ботипирования, позволяют выявить генетическую вариабельность вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы (шт. 55-ВНИИВВиМ, СТИ-1, М-71) и спорообразующих сапрофитов.

2. Препараты ДНК вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы специфически амплифицируются с универсальными праймерами, комплементарными гипервариабельным последовательностям инсерцион-ного элемента хромосомной ДНК, расположение которых имеет родовую, видовую и штаммовую специфичность. Данный метод может быть использован для дифференциации вакцинных штаммов, а также для контроля за изменениями штаммов в процессе их культивирования.

3. Анализ ДНК различных штаммов возбудителя сибирской язвы методом риботипирования с помощью ДНК-зонда, комплементарного рРНК бацилл, позволяет выявить различия между геномами исследуемых штаммов (шт. 55-ВНИИВВиМ, М-71) и может быть использован для дифференциации вакцинных штаммов. Установлено, что при проведении гибридизации при температурах 50 и 65° С, исследованные штаммы характеризуются наличием как общих, так и индивидуальных, различающихся по молекулярной массе, фрагментов ДНК.

4. Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с праймерами, комплементарными последовательностям гена капсулообразования, позволяющие при температуре отжига 55° С выявлять ДНК капсулоообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы в патологическом материале и бульонных культурах в концентрации 10-100 КОЕ50/мл.

5. Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты генов протективного антигена и капсулообразования высокомолекулярной сибиреязвенной плазмиды (рХ01, рХ02), которые при температуре гибридизации 68°С не взаимодействует с ДНК близкородственных спорообразующих сапрофитов.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны "Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибирской язвы с помощью полимеразной цепной реакции", утвержденные директором ВНИИВВиМ 14.10.2000 г., которые могут быть использованы для выявления возбудителя сибирской язвы при проведении лабораторных исследований.

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О., Колбасов Д.В., Конвисарев А.П., Цыдыпов В.Ц. Дифференциация вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы с помощью ПЦР. // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, стр. 313.

2. Колбасов Д.В., Цыбанов С.Ж. Геномный полиморфизм возбудителя сибирской язвы. // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, стр. 316.

3. Колбасов Д.В., Цыбанов С.Ж. Современные подходы типирования патогенных микоплазм и возбудителя сибирской язвы. // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, стр. 321.

4. Цыбанова Л.Я., Колбасов Д.В., Котляров В.М., Цыбанов С.Ж. Исследование листерий с помощью праймеров, комплементарных Act А гену. // Листериоз на рубеже тысячелетий: Материалы международного симпозиума по листериозу. Покров 1999, стр .86.

5. Муруева Г.Б., Конвисарев А.П., Цыдыпов В.Ц., Колбасов Д.В., Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О. Характеристика сибиреязвенного микроба, выделенного из органов павших животных. // Сборник статей "Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных": Материалы международной научно-практической конференции ВНИИВВиМ, Покров, 2000, стр.246.

6. Муруева Г.Б., Конвисарев А.П., Цыдыпов В.Ц., Колбасов Д.В., Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О. Биологическая характеристика микробов, выделенных из проб почв. // Сборник статей "Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных": Материалы международной научно-практической конференции ВНИИВВиМ, Покров, 2000, стр.248.

ТИПОГРАФИЯ ОКДМИМ ВНИИВВИМ, Г. ПОКРОВ, 2000 Г., ТИРАЖ 65 ЭКЗ.

Оглавление диссертации Колбасов, Денис Владимирович :: 2000 :: Покров

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1.ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общая характеристика возбудителя сибирской язвы 11 2.1.1 .Диагностика сибирской язвы 12 2.1.2. Факторы патогенности возбудителя сибирской язвы

2.2. Классификация метод типирования бактерий

2.2.1. Фенотипические методы типирования микроорганизмов

2.2.2. Генотипические методы типирования микроорганизмов

2.2.3. Использование молекулярных маркеров для идентификации микроорганизмов

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЙ^

3.1. Материалы '

3.1.1. Штаммы

3.1.2. Ферменты и метки

3.1.3. Реактивы

3.1.3.1. Растворы

3.1.3.2. Среды

3.1.4. Лабораторное оборудование

3.2. Методы

3.2.1. Выделение ДНК из исследуемых бактерий

3.2.1.1. Выращивание бактерий

3.2.1.2. Выделение хромосомной ДНК

3.2.1.3. Выделение плазмидной ДНК

3.2.2. Электрофоретическое разделение хромосомной и плазмидной ДНК и фрагментов рестрикции ДНК

3.2.3. Рестрикционный анализ ДНК

3.2.3.1. Перенос рестрикционных фрагментов на нитроцел-люлозные фильтры

3.2.3.2. Радиоавтография

3.2.4. Клонирование плазмидной ДНК

3.2.5. Постановка ПЦР 48 3.3. Результаты исследований

3.3.1. Клонирование фрагментов плазмидной ДНК возбудителя сибирской язвы в составе вектора рис

3.3.2. Идентификация В. аг^ЫжпБ с помощью ДНК-зонда на основе рекомбинантной плазмиды (Чох)

3.3.3. Идентификация сибиреязвенных штаммов методом по-лимеразной цепной реакции.

3.3.3.1. Разработка ПЦР для индикации возбудителя сибирской язвы

3.3.3.2. Генотипирование хромосомной ДНК бацилл с помощью ПЦР

3.3.3.3. Анализ хромосомной ДНК бацилл с использованием праймеров, комплементарных инсерционному элементу

3.3.3.4. Анализ хромосомной ДНК бацилл с использованием праймеров, комплементарных рибосомальной ДНК

3.3.3.5. Исследование геномного полиморфизма штаммов возбудителя сибирской язвы методом риботипирования

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Колбасов, Денис Владимирович, автореферат

Сибирская язва является широко распространенным, особо опасным зооантропонозом, который наносит серьезный ущерб животноводству и представляет угрозу здоровью людей. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, природной очаговостью, наличием широкого круга хозяев, недостаточной изученностью генома и антигенной структуры микробных клеток. Широкий спектр восприимчивых животных, а также людей, способность длительное время сохраняться во внешней среде определяют необходимость дальнейшего изучения природы возбудителя сибирской язвы с целью разработки новых, более чувствительных, специфичных средств и методов идентификации патогенных бацилл.

В последние годы большое внимание уделяется исследованиям молекулярной структуры генома возбудителей особо опасных болезней животных, изучению взаимосвязи структуры и функции генома с целью создания чувствительных, специфичных диагностических тест-систем и эффективных средств специфической профилактики этой инфекции нового поколения. Для идентификации возбудителей бактериальных болезней животных широко применяют высокочувствительные методы анализа генома, такие, как ре-стрикционный анализ, методы молекулярной гибридизации, геномной "дактилоскопии", полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования и риботипирования.

Разработка методов молекулярной генетики в последнее десятилетие привело к появлению нового класса молекулярных маркеров — фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям, комплементарных генам или сцепленных с этим геном (125). Появление ДНК-маркеров радикально изменило методы оценки генетического разнообразия микроорганизмов, паспортизации и дифференциации близкородственных микроорганизмов, картирования и определения структуры генов и эпизоотологического мониторинга (112).

Поскольку частоты различных классов коротких тандемных повторов значительно различаются у микроорганизмов, принадлежащих к разным таксономическим группам, для каждой группы необходимо подбирать свои наборы праймеров. Наиболее привлекательным свойством коротких тандемных повторов является то, что, они распределены по всему геному (что облегчает использование этих маркеров для молекулярного картирования генома). Простота манипуляций в сравнении с КЕЪР-анализом и значительная вариабельность, порой в 10 раз превышающая вариабельность ЯРЬР-фрагментов, обеспечивает высокую информативность этих маркеров.

Сравнительная эффективность методов анализа генотипов бацилл с использованием четырех видов ДНК-маркеров (11ЕЬР-, ИАРО-, АРЬР- и 88Я-методы) показало, что 8ТК-маркеры (короткие тандемные повторы) обеспечивают наибольшую информацию, а использование АЕЬР-зондов — наибольшее число локусов, выявляемых в одном и том же опыте (52).

Указанные методы позволяют, прежде всего, выявлять не фенотипиче-ское проявление, а непосредственно исследовать молекулярную структуру генома, выявлять генетическую вариабельность, устанавливать генетическую взаимосвязь штаммов и изолятов возбудителей, выделенных в разных регионах.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось изучение вариабельности генома различных штаммов Bacillus anthracis, выявление их различий и возможность идентификации возбудителя сибирской язвы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

•рассчитать и синтезировать универсальные и специфические прай-меры для избирательной амплификации различных генов возбудителя сибирской язвы;

• охарактеризовать геномы различных штаммов возбудителя сибирской язвы и спорообразующих сапрофитов методами рестрикционного анализа, молекулярной гибридизации и риботипирования;

• оптимизировать условия постановки ПЦР для дифференциации изо-лятов В. anthracis;

• клонировать фрагменты генов протективного антигена и капсулооб-разования в плазмидном векторе pUC19.

Научная новизна:

3. Определены оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции для дифференциации капсулообразуюгцих штаммов бацилл сибирской язвы от непатогенных штаммов с использованием праймеров, комплементарных гену СарВ.

Практическая значимость:

Полученные результаты и разработанные методы используются:

• для идентификации и дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы;

• дифференциации и паспортизации производственных вакцинных штаммов;

• полученные рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты ДНК сибиреязвенных плазмид рХ01, рХ02, кодирующих гены протективного антигена и капсулообразования, могут в дальнейшем использоваться для проведения различных генно-инженерных манипуляций.

По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ВНИИВВиМ методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибирской язвы с помощью полимеразной цепной реакции.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изучение геномного полиморфизма хромосомной ДНК различных штаммов бацилл сибирской язвы методами КАРР-Аг^егрпЩ и риботипиро-вания.

Апробация результатов исследований. Результаты исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ в 1999-2000 г.г., опубликованы в сборниках материалов научно-практических конференций Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (Покров 1998, 1999, 2000).

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 37 отечественных и 94 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 16 рисунками и 1 приложением.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2000 г. г. в лабораториях "Биофизики" и "Экспериментальной микробиологии" ВНИ-ИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Российской академии сельскохозяйственных наук по теме 01.06. "Разработать генно-инженерные и иммунохимические методы идентификации и дифференциации возбудителей оспы овец и коз, чумы мелких жвачных, инфекционной бурсальной болезни, синдрома снижения яйценоскости, африканской чумы свиней, классической чумы свиней, сибирской язвы и листериоза".

В выполнении отдельных разделов работы принимали участие: заведующий лабораторией "Экспериментальной микробиологии" ВНИИВВиМ кандидат биологических наук Селянинов Ю.О., старший научный сотрудник лаборатории "Биофизики", кандидат биологических наук Цыбанова Л.Я., заведующий кафедрой микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова доктор ветеринарных наук, профессор Цыдыпов В,Ц., доцент кафедры микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова кандидат ветеринарных наук Муруева Г.Б., которым автор выражает искреннюю признательность.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение генетической вариабельности возбудителя сибирской язвы"

5. ВЫВОДЫ

1. Методы полимеразной цепной реакции, КАРВ-йп§егрпЩ и рибо-типирования, позволяют выявить генетическую вариабельность вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы (шт. 55-ВНИИВВиМ, СТИ-1, М-71) и спорообразующих сапрофитов.

2. Препараты ДНК вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы специфически амплифицируются с универсальными праймерами, комплементарными гипервариабельным последовательностям инсерционного элемента хромосомной ДНК, расположение которых имеет родовую, видовую и штаммовую специфичность. Данный метод может быть использован для дифференциации вакцинных штаммов, а также для контроля за изменениями штаммов в процессе их культивирования.

3. Анализ ДНК различных штаммов возбудителя сибирской язвы методом риботипирования с помощью ДНК-зонда, комплементарного рРНК бацилл, позволяет выявить различия между геномами исследуемых штаммов (шт. 55-ВНИИВВиМ, М-71) и может быть использован для дифференциации вакцинных штаммов. Установлено, что при проведении гибридизации при температурах 50 и 65°С, исследованные штаммы характеризуются наличием как общих, так и индивидуальных, различающихся по молекулярной массе, фрагментов ДНК.

4. Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с праймерами, комплементарными последовательностям гена кап-сулообразования, позволяющие при температуре отжига 55 ° С выявлять ДНК капсулоообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы в патологическом материале и бульонных культурах в концентрации 10-100 КОЕ50/мл.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны "Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибирской язвы с помощью поли-меразной цепной реакции", утвержденные директором ВНИИВВиМ 14.10.2000 г., которые могут быть использованы для выявления возбудителя сибирской язвы при проведении лабораторных исследований.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2000 года, Колбасов, Денис Владимирович

1. Абалакин В. Л., Сергеева Л. В. // Всесоюзная конф. "Бактериальные токсины", 2-я: Тезисы.— Юрмала, 1989.— С. 4.

2. Ахмедзянов Ю.А., Найманов П.И. Использование плазмидного скрининга для дифференциации штаммов Вас.апШга^э от близко родственных видов почвенных бацилл. // Журнал микроб, эпидем. и иммунологии.-1989,- 11.- с.26-28.- М,-" Медицина

3. Бадашкеева А.Г, Кнорре Д.Н. Олиго-и полинуклеотидные зонды. Метод молекулярной гибридизации. //Молекулярная биология 1991.Т.25.- 2.- с. 309-323.-М,-" Наука ".

4. Бакулов И.А, Бударков В.А, Чумак Р.М, Макаров В.В. Радионуклидные методы исследования в вирусологии и микробиологии. // 1990.- с.58,- М. " Энергоиздат".

5. Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Иммунопрофилактика сибирской язвы животных. //Вестник с-х науки.- 1991.- 8.- с.128-132.

6. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Косяченко Н.С. Современные воззрения на безопасность живых сибиреязвенных вакцин. // Ветеринария,- 1993.- 1.- с. 22-25.

7. Бектимиров Т.А. Гибридизация нуклеиновых кислот как средство быстрой вирусологической диагностики. // Вопросы вирусологии.- 1988.-М 1,-С. 110-117.-М,-"Медицина".

8. Брода П. Плазмиды. // 1982, СТО, М. " Мир".

9. Гаврилов В.А. Иммуногенетические аспекты разработки противосибире-язвенных вакцин. //Ветеринария.-1987.-10.- с.27-29.

10. Ю.Гинцбург А.Г., Шагинян И.А. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций. // Молек.ген.мик.вир., 1991, N 12, с. 3-9.

11. П.Гинцбург A.J1., Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной " дактилоскопии". //Генетика.-1989.-Т. 25, N 7.- С. 1320-1324,- М," Наука".

12. Дейвис К. // Анализ генома. Методы. М., Мир, 1990.

13. Езепчук Ю.В. // Патогенность как функция биомолекул.- М.,1985.- С. 6773.

14. Еремин С.А, Ежов И.Н., Костюкова Т.А. Определение плазмидного профиля у штаммов сибиреязвенного микроба методом электрофореза в ага-розном геле. // Микробиол. иммунология и биохимия особо опасных инфекций,- 1987.-С.91-95.-Саратов.

15. Еремин С.А., Ежов И.Н., Костюкова Т.А. Конструирование и изучение штаммов сибиреязвенного микроба, обладающих различным набором собственных плазмид.//Мол.ген.микр.вирус.-1989.- 10. с.35.

16. Золотарев Ф.Н, Голубев Д.Б., Петров H.A. Метод точечной гибридизации в вирусологии. // Успехи современной биологии.-1989,- том 108.- с. 375382.

17. Ипатенко Н.Г., Гущин В.Н., Маничев A.A. Профилактика сибирской язвы. // Ветеринария.- 1992.- 2.- с. 31-32.

18. Ипатенко Н.Г., Маничев A.A., Саленко A.C., Гаврилов В.А. Иммуноген-ные свойства вакцины против сибирской язвы из штамма 55. II Ветерина-рия.-1993.-3.-е. 17-19.

19. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. // 1990, с.116.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.//Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование,- 1984,- С. 102-103 М,- " Мир ".

21. Проскурина В.А. Скрининг плазмидной ДНК сибиреязвенного микроба // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиол. и профилактики особо опасных инф. болезней. // Тез. докл. науч. конф., Омск, окт. 1993 г. Ставрополь, 1993,- С.347-348.

22. Рысков А.П., Токарская О.Н., Вербовая J1.B. Геномная дактилоскопия микроорганизмов. Использование в качестве гибридизационного зонда ДНК фага М-13. // Генетика,- 1988.-N 7,- Т. 24,- с.1310-1313.

23. Рысков А.Р., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И. Геномная "дактилоскопия" организмов различных таксономических групп. Использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М-13. // Генетика, 1988, N 2,Т. 24, с. 227-238.

24. Степанов A.C. О молекулярной природе токсина Bac.anthracis. // Мол.ген.микроб.и вирус,- 1991.- 1,- с. 3-8,- М.- " Медицина ".

25. Степанов A.C., Пузанова О.Б., Гаврилов C.B. Глицинзависимая кри-отрансформация Вас. anthracis ДНК различных плазмид. // Мол. ген.микроб. и вирус. -1989.-N 12.-с.39-44."Медицина".

26. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Вас. anthracis в клетках E.coli, Вас. subtilis, Вас. anthracis. // Мол.ген.микроб.и вирус.- 1993.- N 2.- М.- с.3-8. " Медицина".

27. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Липницкий A.B. Видоспе-цифический ДНК-зонд для идентификации токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы //Молекулекулярная генетика, микробиология и иммунобиология 1994. - N1. - С. 30-33.

28. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Липницкий A.B. Видоспе-цифический ДНК-зонд для обнаружения токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы. // Молек. гинет.микроб.и вирусол.-1994,- 1,- с. 3032." Медицина".

29. Тимошин В.Б., Романова Л.В., Мишанкин Б.Н.,Сучков И.Ю. Полимераз-ная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Fran.tularensis с использованием неспецифических праймеров. //Биотехнология,- 1993.- N 6,- с. 8-9.

30. Уотсон Дж. // Рекомбинантные ДНК: Краткий курс. М., Мир, 1986, 288 с.

31. Шагинян И.А., Токарская О.Н., Грижебовский F.M. // Современные направления медицинских диагностикумов.-М.1990.с.80.

32. Altwegg М. General problems associated with diagnostic application of amplification methods. // J.Microbiol. Meth. 1995.- N 23. - P. 21-30.

33. Andersen G.L., Simchock J.M. and Wilson K.H. Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species. //Journal of Bacteriology. 1996. - 178, 377-384.

34. Bebear C.M., Bove J.M., Bebear C. and Renaudin J. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob.// Agents Chemother. 1997,- N 41,- P.269-279.

35. Belgrader P; Benett W; Hadley D; Long G; Mariella R Jr; Milanovich F; Na-sarabadi S; Nelson W; Richards J; Stratton P Rapid pathogen detection using a microchip PCR array instrument. // Clin Chem, 1998 Oct, 44:10, 2191-4

36. Beyer W; Gluckner P; Otto J; Behm R Title A nested PCR method for the detection of Bacillus anthracis in environmental samples collected from former tannery sites. //Microbiol Res, 1995 May, 150:2, 179-86

37. Bhatnagar R., Singh Y.,Leppla S.H.,Friedlander A.M. Calcium is Reguired for the Expression of Anthrax Lethal Toxin Activity in the Macrophagelike Cell Line J 774 A 1.// Infect.Immun.-1989.-Vol.57.-P.2107-2114.

38. Brightwell G, Pearce M, Leslie D Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. Mol Cell Probes 1998 Dec;12(6):367-77

39. Candrian U. Probes and PCR in Diagnosis of Mycoplasma Infections. // Journal of microbiolgy methods, 1995.

40. Cataldi A., Labruyere F. // International Workshop on Anthrax.-Winchester, 1989.-P.87.

41. Daffonchio, D., Borin, S., Frova, G. et al. (1999) A randomly amplified polymorphic DNA marker specific for the Bacillus cereus group is diagnostic for Bacillus anthracis. // Applied and Environmental Microbiology 65, 1298— 1303.

42. Debarbeurac B. Detection of Mycoplasma-pneumonia and Mycoplasma-genitalium in clinical samples by using PCR. // Clinical infectious diseases, 1993.

43. Dooley J. Detection of Mycoplasma infection by PCR. // Biotechnology advences, 1994.

44. Ericsson H. Relationships between members of the Mycoplasma mycoides cluster as shown by DNA probes and sequence analysis. // Applied and environmental microbiology, 1995.

45. Escuer V., Duflot E., Sezer O, Structural homology between virulence-associated bacterial adenylate cyclases. // Gene.-1988.-Vol.71.-P.293-298.

46. Fouet-A., Sirard-JC., Mock-M. Bacillus-Anthracis Pxol Virulence Plasmid Encodes a Type-1 DNA Topoisomerase. // Molecular Microbiology 1994, Vol 1 1, Iss 3, pp 471-479

47. Freer J.H. Virulence Mecchanism of Bacterial Pathogenecity. // International Workshop on Anthrax.-Winchester,1989.-P.43.

48. Friedlander A.M., Bhatnagar R., Leppla S., Singh Y. // International Workshop on Anthrax.-Winchester.-1989,- P.51.

49. Geary S.J. and Forsyth M.H. PCR: random amplified polymorphic DNA firngerprinting. // Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. -1996,- P. 81-85.

50. Green, B.D., Battisti, L., Koehler, T.M., Thorne, C.B. and Ivins, B.E. (1985) Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis. // Infection and Immunity 49, 291-297.

51. Harrell, LJ., Andersen, G.L. and Wilson, K.H. (1995) Genetic variability of Bacillus anthracis and related species. // Journal of Clinical Microbiology 33, 1847-1850.

52. Henderson I., Yu, D. and Turnbull, P.C. (1995) Differentiation of Bacillus anthracis and Bacillus cereus group bacteria using IS231-derived sequences. // FEMS Microbiology Letters 128, 113-118.

53. Henderson, I., Duggleby, C.J. and Turnbull, P.C. (1994) Differentiation of Bacillus anthracis from other Bacillus cereus group bacteria with the PCR. //1.ternational Journal of Systematic Bacteriology 44, 99-105.

54. Hiederwohrmeier B Bohm R // International Workshop on Anthrax — Winchester 1989 —P 36 37

55. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and Expression of the Bac.anthracis Protective Antigen Gene in Bac. subtilis. //Infect. Immun.-1986.-Vol.54.-P.537-542.

56. Jackson, PJ., Walthers, E.A., Kalif, A.S. et al. Characterization of the variable-number tandem repeats in vrrA from different Bacillus anthracis isolates. // Applied and Environmental Microbiology. 1997 - 63, 1400-1405.

57. Jaton K. Development of reserch works by using PCR for detection Listeria monocytogenes in clinical samples in spinal fluid. // Journal of clinical microbiology, 1992.

58. Jensen J. PCR for detection Mycoplasma-genitalium in clinical samples. // Journal of clinical microbiology, 1992.

59. Johns-M Harrington-L Titball-RW Leslie-DL Improved Methods for the Detection of Bacillus-Anthracis Spores by the Polymerase Chain-Reaction Letters in Applied Microbilogy. // 1994, Vol 18, Iss 4, pp 236-238

60. Karch H., Schwarzkopf A. and Schmidt H. Amplification methods in diagnostic bacteriology (selected examples) //. J. Microbiol. Meth. 1995.- N 23,- P. 55-73.

61. Keim, P., Kalif, A., Schupp, J. et al. Molecular evolution and diversity in Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length polymorphism markers. // Journal of Bacteriology. 1997 - 179, 818-824.

62. Kempf I. DNA amplification methods for diagnosis and epidemiological investigations of avian mycoplasmosis. // Acta Veterinaria Hungarica.- 1997.-V 45,- N 3,- P.373-386.

63. Kleine-Albers C., Böhm R// International Workshop on Anthrax— Winchester, 1989 —P 93—94.

64. Koehler T., Thorne C. Bacillus subtilis (natto) Plasmid pLS 20 Mediates Interspecies Plasmid Transfer. // J.Bact.-1987. Vol. 169.- P. 5271-5278.

65. Leppla S.H. Bacillus anthracis calmodulin-dependent adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties and interactions with eucaryotic cells. // Ad-vanc. Cycl.Nucl.Prot. Phosphoryl.Res.-1984.-Vol.l7.-P.189-198.

66. Leppla S.H., Friedlander A.M., Singh Y. et al. // International Worshop on Anthrax.- Winchester,1989.-P.49-50.

67. Little-SF., Leppla-SH., Burnett-JW., Friedlander-AM. Structure-Function Analysis of Bacillus-Anthracis Edema Factor by Using Monoclonal-Antibodies Biochemical and Biophysical research Communications. // 1994, Vol 199, Iss 2,pp 676-682

68. Limeberg E. Detection Mycoplasma-pneumoniae by using PCR and nonradioactive hybridisation. // Journal of clinical microbiology, 1993.

69. Makino-S., Iinumaokada-Y., Maruyama-T., Ezaki-T., Sasakawa-C., Yoshi-kawa-M. Direct Detection of Bacillus-Anthracis DNA in Animals by Polymerase Chain-Reaction. // J.Clin. Microb. 1993, Vol 31, p. 547-551

70. Maurelli A T. Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences. // Microb Path — 1989 — Vol 7 — P 1—10

71. Mock M II International Workshop on Anthrax — Winchester, 1989—P 61— 62

72. Naccimeno E. PCR for detection Mycoplasma-gallisepticum. // Avian diseases, 1991.

73. Nagai S., Kazama S. and Yagihashi T. Ribotyping of Mycoplasma gallisepticum strains with a 16 S ribosomal RNA gene probe. // Avian Pathol.-1995,- N 24,-P. 633-642.

74. Nascimento E.R., Yamamoto R. and Khan M.I. Mycoplasma gallisepticum -vaccine strain-specific polymerase chain reaction. // Avian Dis. 1993.- N 37.-P. 203-211.

75. Olsen G.J., Woese C.R. Ribosomal RNA: a key to philogeny. // FASEB J.-1993,- N 7,- P.113-123.

76. Patra G; Sylvestre P; Ramisse V; Thurasse J; Guesdon JL FEMS Isolation of a specific chromosomic DNA sequence of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosis. // Immunol Med Microbiol, 1996 Oct, 15:4, 223-31

77. Patra, G., Vaissaire, J., Weber-Levy, M., Le Doujet, C. and Mock, M. Molecular characterization of Bacillus strains involved in outbreaks of anthrax in France in 1997.// Journal of Clinical Microbiology. 1998 - 36, 3412-3414.

78. Popovic, T., Bopp, C., Olsvik, 0. and Wachsmuth, K. Epidemiologic application of a standardized ribotype scheme for Vibrio cholerae 01. // Journal of Clinical Microbiology. 1993 - 31, 2474— 2482.

79. Priest, F.G., Goodfellow, M. and Todd, C. A numerical classification of the genus Bacillus. // Journal of General Microbiology. 1988 - 134, 1847-1882.

80. Priest, F.G., Kaji, D.A., Rosato, Y.B. and Canhos, V.P. Characterization of Bacillus thuringiensis and related bacteria by ribosomal RNA gene restriction fragment length polymorphisms. // Microbiology. 1994 - 140, 1015-1022.

81. Ramisse V., Patra G., Garrigue H., Guesdon J., Mock M. Identification and characterization of Bac.anthracis by multiplex PCR analysis of sequence on plasmids pXOl and pX02 and chromosomal DNA. // FEMS Microb.Lett, -1996 145,9-16.

82. Razin-S. DNA Probes and PCR in Diagnosis of Mycoplasma Infections. // Molecular and cellular probes. 1994,- V 8,- N6,- P. 497-511.

83. Reif-TC Johns-M Pillai-SD Carl-M Identification of Capsule-Forming Ba-cillus-Anthracis Spores with the PCR and a Novel Dual-Probe Hybridization // Format Applied and Environmental Microbiology 1994, Vol 60, Iss 5, pp 16221625

84. Robertson D.L., Leppla S.L. Molecular cloning and expression in E.coli of the lethel factor gene of Bacillus anthracis. // Gene. 1986 -Vol.44.-P.71-78.

85. Robertson D.L.,Tippets M.T.,Leppla S.H. Nucleotide sequence of the Bac.anthracis edema factor gene (cya):a calmodulin dependent adenylate cyclase.// Gene.-1989,- V.73.-P. 363-371.

86. Robillard N J Koehler T M Murray R Thorne C B // American Society of Microbiology Annual Meeting, Abstracts — Washington 1983— H54 — P 115

87. Rodriguez-Barradas, M.C., Hamill, R,J., Houston, E.D. et al.Genomic fingerprinting of Bartonella species by repetitive element PCR for distinguishing species and isolates. // Journal of Clinical Microbiology. 1995 -33, 1089-1093.

88. Rodwell A.W. The protein fingerprints of mycoplasma. // Rev. Inf. Dis. Suppl. 1982.- N 4,- P.8-17.

89. Salzano B. Detection of Listeria monocytogenes in food and environmental by using PCR. // Journal of environmental science, 1995.

90. Sandvig K., Brown J.E. Jonic Reguirements for Enthy of Shiga Toxin from Shigella dysenteriae into Cell. // Infec.Immun. 1987 - Vol. 55 -P.298-303.

91. Scheinert P., Krausse R., Ullmann U., Soller R., Krupp G./Molecular Differentiation of Bacteria by PCR Amplification of the 16S-23S Ribosomal-RNA Spacer. // Journal of Microbiological Methods.- 1996.- V.26. N 1-2.-P.103-117.

92. Seki, T., Chang, C., Mikami, H. and Oshima, Y. Deoxyribonucleic acid homology of the genus Bacillus. // International Journal of Systematic Bacteriology. 1978 - 28, 182-189.

93. Shangkuan, Y.H., Tsao, C.M. and Lin, H.C. Comparison of Vibrio cholerae 01 isolates by polymerase chain reaction fingerprinting and ribotyping. //Journal of Medical Microbiology. 1997 - 46, 941-948.

94. Snigh-JS., Doyle-RJ. Salt-Enhanced Enzyme-Linked Lectinosorbent Assay (Sella). // Journal of Microbiology Methods. 1993 - Vol 17, Iss 1, pp 61-65

95. Starbuck H. Ultrasensivity method for detectionin Listeria monocytogenes in milk by using PCR. // Letters in applied microbiology, 1992.

96. Tenover, F.C., Arbeit, R., Archer, G. et al. Comparison of traditional and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. // Journal of Clinical Microbiology. 1994 - 32, 407-415.

97. Turnbull, P.Q, Hutson, R.A., Ward, MJ. et al. Bacillus anthracis but not always anthrax. // Journal of Applied Bacteriology 1992 - 72, 21-28.

98. Veilleux C., Razin S. and May L.H. Detection of Mycoplasma infection by PCR. In: Tully J.G. and Razin S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. // Academic Press, London, UK.- 1996.- P.431-438.

99. Versalovic, J., Koeuth, T. and Lupski, J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. // Nucleic Acids Research. 1991 - 19, 6823-6831.

100. Vietri-NJ., Marrero-R., Hoover-TA., Welkos-SL. Identification and Characterization of a Transact!vator Involved in the Regulation of Encapsulation by Bacillus-Anthracis. // Gene. 1995 - Vol 152, Iss 1, pp 1-9

101. Visser M.R. and Fluit A.C. Amplification methods for the detection of bacterial resistance genes. // J.Microbiol.Meth. 1995.- N 23. - P. 105-116.

102. Vodkin M.H., Leppla S.H. Cloning of the Protective Antigen Gene of Bacillus anthracis. //Cell.-1983.-Vol.34.-P. 693-697.

103. Wang R. PCR method based on 16S rRNA for rapid specific detection Clostridium-Pertringens in food. // Molecular and cellular probes, 1994.

104. Welkos, S.L. Plasmid-associated. virulence factors of non-toxigenic (pXOl) Bacillus anthracis. //Microbial Pathogenesis 1991 - 10, 183-198.

105. Wernars K. Using PCR method for direct detection Listeria monocytogenes in cheese. // Journal of applied microbiology, 1991.

106. White T.J., Madej R. and Persing D.H. The polymerase chain reaction: clinical applification.//Adv. Clin. Chem. 1992,-N 29,-P. 161-196.

107. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

108. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ1. УТВЕРЖДАЮ1. Директору вирусолеринарнои ологии1. Ро^лщшака^йии* а I- 1. Котляров 2000 г.1. V ° Чо1. V •>' 0 „х%4

109. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ1. Покров 2000 г.

110. Д.В, Колбасов А.П. Конвисарев1. Н.С. Косяченко1. С.Ж. Цыбанов

111. Материалы по разработке' методических указаний рассмотрены и одобрены на заседании ученого совета ВНИИВВиМ1. Протокол № от г.

112. Ученый секретарь п^й В.Я.Савукова