Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунологическая реактивность организма северных оленей, привитых вакциной из штамма 61 Brucella suis

ВСЕРОССИИСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО

(ВИЭВ)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

(РАСХН)

Р Г Б О Д ^а пРавах рукописи

г ? ÖE3 ;

КОБЯКОВ Никита Тимофеевич

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ ОРГАНИЗМА СЕВЕРНЫХ ОЛЕНЕЙ, ПРИВИТЫХ ВАКЦИНОЙ ИЗ ШТАММА 61 BRUCELLA SUIS

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я- Р. Коваленко.

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник В. А. Ромахов

кандидат ветеринарных наук Е. С. Слепцов Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук,

профессор В. А. Ведерников (ВИЭВ)

кандидат ветеринарных наук В. 3. Бондаренко (ВГНКИ)

Ведущее учреждение — Московская государственная академия ветеринарной медицины и ветеринарной биотехнологии

Защита диссертации состоится / (/ 1995 г.

в /УЧ^часов на заседании специализиртвэнного совета К.020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко. Адрес: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан /Р^^г-^Л 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бруцеллез северных оленей на Крайнем Севере Российской Федерации имеет иирокоо распространение, является значительным одерживающим фактором дальнейшего развития оленевод-отва и продолжает представлять оерьезную социальную опасность.

Многолетний опыт борьбы о бруцеллезом оеверных оленей путем проведения общих хозяйственных и специальных ветеринарно-оанитар-ных мероприятий показал их недостаточную эффективность.

Борьба о этой болезнью осложняется также и наличием природных очагов бруцеллеза среди популяций диких северных оленей.

Специфическая профилактика бруцеллеза оленей о использованием вакцин в основном не вышла за рамки экспериментов.

Радом исследователей Якутии, Магаданской облаоти, Таймыра и Ямала (В.А.Забродил, 1956, 1959 ; М.И.Рудаков , 1956; В.М.Серов, Н.М.Серова, 1956; И.М.Голооов, 1956, 1963; А.Ф.Пинигин, Г.П.Шбо-ров, О.С.Петухова, 1958, I960; Л.Д.Николаевский, А.В.Лаоков,1959; • Н.Н.Давыдов, 1961} А.Ф.Пинигин, О.С.Петухова,1961,1962;Г.П.Выборов, 1962,1964; Е.С.Орлов, 1963 и др.) было проведено изучение оте-пени распространения, опоообов диагноогики, орвдогв и методов специфической профилактики бруцеллеза оеверных оленей и, в чаотнооти, была испытана иммунологическая эффективность вакцин иэ штаммов 19 И 82 Brucella abortua.

В результате этих исследований была определена огепень безвредности и иммуногеннооти указанных вакцин и отмечена целесообразность юс применения в борьбе о бруцеллезом. Однако,в силу недостаточной интеграции и неотработаннооти ряда вопросов о использовании оредотв специфической профилактики в общем комплексе про-тивобруцеллезных мероприятий производству до настоящего времени

не были рекомендованы оптимальные схемы иммунизации северных оленей указанными выше вакцинами.

Общеизвестно, что культуры бруцелл, основным хозяином которых являются северные олени, по культурально-морфологическим, тинкто-риалышм и биохимическим свойствам относятся к 4 биовару вида suis

Учитывая, что до настоящего времени нет достаточно эффективных средств специфической защити северных оленей от бруцеллеза, изыскание вакцинных штаммов из культур, гомологичных данноцу виду бруцелл, значительно возрастает,.

В 50 - 60 -е года в нашей стране изучался вакцинный штамм 61 Brucella aula для профилактики бруцеллеза овец (А.H.Касьянов, 1953). Однако, несмотря на положительный эффект, вакцина из этого штамма до оих пор не нашла практического применения.

На наш взгляд вакцина из штамма 61 в.suis представляет определенный интерес н является перспективной для изучения ее противо-зпизоотической эффективности в системе мер профилактики и борьбы с бруцеллезом северных оленей.

Таким образом, изыскание новых средств и методов специфической профилактики бруцеллеза северных оленей, позволящих существенно повысить эффективность проводимых профилактических и оздоровительных мероприятий,остается одной из актуальных проблем для отрасли и требует дальнейшего изучения.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось изучение кульгурально-морфологических.тинкториальных и агглю-гинабельных свойств вакцинного штамма 61 в.suie , сроков расселяе-мости, приживаемости бруцелл и иммунологической перестройки орга-ни&ча морских свинок и северных оленей в ответ на введение вакцины из данного иташа.

Исходя из этого на разрешение были поставлены следующие задачи:

- изучигь фенотипические и геногиютеские свойства штамма 61 B.sula.

- изучигь в эксперименте на лабораторных животных ангигенниа,вирулентные и иммуногенные овойства культуры данного штамма при различных методах ее введения;

- изучить орокл расселяемости и приживаемости культуры вакцинного штамма 61 В.aula в организме морских овинок и северных оленей при различных методах ее введения;

- в опытах на мороких овинках и северных оленях установить ре-актогенность вакцины из штамма 61 В.suis при различных методах введения;

- изучить динамику антителообразования у морских овинок и северных оленей и аллергическую перестройку организма северных оленей при подкожном и пероральном методах иммунизации вакциной из итамма 61 В. suie I

- изучить дииамику иммуноглобулинов M - и в - классов в сыворотке кроЕИ северных оленей пооле иммунизации.

Научная новизна. Шерше проведено изучение реакгогзншх, антигенных и вирулентных оеоЙств вакцины из штамма 61 В.aula на северных оленях.

В строго контролируемом опыте показана более низкая реактоген-ность вакцины из штамма 61 В.suie при пероральпом методе иммунизации по сраЕвению о подковным.

Впервые изучена динамика специфических антител а сыворотке крови северных оленей в зависимости от дозы и метода введения вакцины из штамма 61 В.suis.

Практическая ценность. Результаты исследований по изучению свойств и определению оптимального метода введения вакцины из штамма 61 В.aula дадуг возможность при последующем установить

ее эффективность с целью ооздания высокого иммунного фона в оленьих отадах и ослабления отрицательного влияния природных очагов инфекции на эпизоотическую обстановку по бруцеллезу м за очет этого получить противоэпизоотический, экономический и социальны! эффект.

Полученные данные открывают перспективу для разработки эффективных схем профилактики и ликвидации бруцеллеза северных оленей.

Апробация работы. Материалы исследований по диссертационной работе доложены и получили положительную оценку на:

- научной конференции молодых ученых Республики Саха (Якутия)-, г. Якуток, 12 июня 1993 г.;

- Всероссийской конференции "Пути совершенствования научного обеспечения АПК районов Крайнего Севера в условиях перехода к рыночным отношениям", г. Якутск, 2-4 сентября 1993 г.;

- научной конференции "Проблемы изыскания,оиитеза и производства новых препаратов для ветеринарии", г. Самарканд, 1994 Г.;

- заседании Ученого Совета Якутокого НИИ сельского хозяйства, г. Якутск, 1994 г.;

- заседания Ученого Совета ВИЭВ, г. Москва, 1994 г.;

- межлабораторном оовещанин ВИЭВ, г.Москва, 1994 г.

Публикации. По результатам проведенных исследований -опубликовано 3 научные статьи и 6 находятоя в печати.

Объем и структура дисоеоташга. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и ооотоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений и списка использованной литературы.

Материалы диссертации иллюстрированы 19 таблицами и 6 рисунками.

Список литературы содержит 171 наименований работ, из них 52 работы зарубежных авторов.

- 5

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Работа выполнена о 1991 по 1994 гг. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза В11ЭВ, на опытной базе Выпне-Волоцкого отдела ВИЭВ, в отделе ветеринарии научно-производственного объединения "Якутское" и на базе опыгно-производотвенного хозяйства (ОПХ) "Очюгейскоа", Оймяконского района Реопублики Саха (Якутия). При проведении экспериментов было ио-пользовано 160 мороких овинок и Б4 оеверных оленей.

Кульгурально-морфологнчеокие свойотва штамма 61 B.eule научала по методикам,, рекомендованным комитетом экопартов по бруцеллезу ОАО/ВОЗ (б-fl доклад, 1986).

Валовую принадлежность культур к бруцеллам , помимо реакции агглютинации оо стандартной бруцеллезной (з -) оыворогкой а других фенотипичеоких овойотв, определяли по генетическим признакам в реакции ДНК-ДНК гибридизации в ооогветотвии о разработанными в Ш1ЭВ (лаборатория молекулярной биологии и биохимии и лаборатория эпизоотология, даагноотшш н профзлакипш бруцеллеза) "Нетодкчео-кшж рекомендациями по идентификация бруцелл методом да-ДНК гибридизация" (1986).

Для изучения иммунологической реактивности организма морских овняок а оеверных оленей при различных дозах и методах введения вакцины из штамма 61 B.euia иопользовали олвдующие иммунологические теогн: для мороких овинок - реакцию агглютинации в пробирках (РА) в реакцию длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), а для северных оленей плаотинчагую реакцию агглютинации о роз бен-гал антигеном (роз бенгал проба-РБП) ,РА,РДЖ, реакцию агглютинации о 2-меркаптоэтанолом и аллергическую пробу о бруцеллином ВИЭВ.

Во вое сроки исследования определяли количество специфических

иммуноглобулинов М- и е- клаооов в реакции агглютинации о 2-мер-капгоэтанолом фирмы "Lob» ïeinohemio" (Авогрия).

Дня изучения вирулентных, антигенных и иммуногенных овойотв штамма 61 B.euie л «равнении о культурой штамма Рев-I B.neiiten-sle были проведены 4 опыта на 160 морских овинках.

В первом опыте для изучения ороков расселяемости и приживаемости культуры штамма 61 В.suie 20 морских овинок иммунизировали подкожным и пероральным методами введения одномиллиардной взвеси культуры данного штамма. Через 30 и 60 дней пооле введения культуры бруцелл. по Б морских свинок из каждой группы убивали и лимфатические узлы и органы (по 10 объектов от каждого животного) подвергали бактериологическому исследованию по методике принятой в лаборатории эпизоотологии.диагностики и профилактики бруцеллеза.

Во втором опыте на 60 мороких овинках изучали в динамике антигенные свойства вакцины из штамма 61 В.suis в сравнении о вакциной ив штамма Рев-I В.aeiiteneia при подкожном,пероральном и конызнк-тивальном методах их введения. Наблюдение за животными вели в течение 90 дней, на протяжении которых через 7,15,30,70 и 90 суток сыворотку крови последовали в РА и РДСК о единым бруцеллезным антигеном. По результатам исследований определяли средний титр антител по каждой группе животных и путем статистической обработки устанавливали их колебания.

В третьем опыте на 70 морских свинках наряду о изучением антигенных свойств определяли иммуногеннооть вакцины из шташа 61 В. eui« в сравнении с вакциной из штамма Рев-I B.melxteftsia.Через 60 дней пооле иммунизации животных опытных и контрольной групп с целью проверки состояния иммунитета заразили культурой вирулентного штамма 102 H В.me Iltensla ( ВТИКИ ветпрепаратов ) в дозе 500

живых микробных клеток (100 минимальных инфицирующих доз, вызывающих заражение всех интактных животных - ИД100). В течение 45 дней пооле заражения животных опытных и контрольной групп иооледовали на бруцеллез серологическими методами - РА и РДСК (через 15 и 45 дней), затем их убивали и лимфатические узлы и органы последовали бактериологическим методом.

Средний индекс инфицированнооти по каждой группе внчиоляли в процентах по формуле: ИИ =-д- х 100, где

ИИ - индекс инфицированнооти-, А - количество выделенных культур; В - количеотво объектов, из которых проведены высевн.

В опыте на 54 головах оеверных оленей изучили реактогвннооть, ороки расоеляемооти и приживаемости культуры вакцинного штамма 61 В.ви±в , а также иммунологкчеокий ответ организма животных (по данным серологических и аллергичеоких яоолэдований) в динамике в различные сроки пооле иммунизации.

С целью изучения указанных овойотв вакцины из штамма 61 животных по принципу аналогов разделили на 6 групп по 9 голов в каждой. Оленям I, 2 и 3-ей групп вакцину (пооле разведения отерильннм физиологическим раотвором) вводили подкожно в облааги средней трети шеи, в дозах 5 млрд., 10 млрд. и 50 млрд.м.к., животным 4, 5 и 6 групп - перорально на корень языка, в дозах 10 млрд., 25 млрд. и 50 млрд.м.к.

Пооле иммунизации у животных в течение 6 дней определяли общую и меотную (при подкожном методе) реакции организма на введение вакцины путем наблюдения за состоянием животных , измерения температуры тела в течение 6 суток и определения размеров и кон-оиотенции воспалительного отека (в течение 14 дней) в области инокуляция препарата.

Гуморальный иммунный ответ организма северных оленей изучали в динамике через 10, 15, 40, 73 и 115 дней после введения вакцины путем исследования сыворотки крови животных на бруцеллез в роз бен-гал пробе (РБП), реакции агглютинации (РА) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Уровень иммуноглобулинов М- и 0-клаосоБ определяли в реакции агглютинации о 2-меркалтоэтанолом.

Аллергическое исследование путем постановки пальпебральной пробы о бруцеллином ВИЭВ проводили через 40 и 73 дня после иммунизации животных.

Спустя 10, 73 и 115 дней после иммунизации по 3 головы северных оленей из каждой группы были убиты, а органы и лимфатические узлы повергнуты бактериологическому исследованию.

Выделенные культуры идентифицировали по фенотипическим свойствам (по общепрлнягвм методикам) и по генетическим признакам методом Д1К-ДНК гибридизации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Фенотипические и генотипические свойства вакцинного штамма 61 В.suis

Изучение культурально-морфологических, тинкториальных, агглю-тинабельных свойств культуры штамма 61 B.suia показало, что изучаемая нами культура штамма 61 по фенотипическим свойствам, по всем показателям соответствует референтному штамму 1330. Средние значения нуклеотидного состава у штамма 61 практически не, отличаются от таковых у других штаммов бруцелл (содержание ГЦ-основалкй составило 57,2-^0,1 Мол.^Щ, результат гибридизации с ДНК штамма 6 B.suis - 96,0^4,0 показатель достоверности трех опытов Р< 0,05).

По результатам, изучения ген о типических свойств подтверждена принадлежность штамма 61 к рода Brucella , а далные сравнительно-

го анализа фенотипичеоких свойств подтвердили, что данный птамм . относится к бруцеллам вида aula биоварианта 1.

Изучение вирулентных свойств вакцинного штамма 61 В.suis в опыте на морских свинках при подкожном и пероральпом методах введения

Изучение вирулентных свойств штамма 61 В.aula в опытах на 20 морских свинках в дозе I млрд.м.к. в объеме I мл. при подкожном (в области правого паха), гак и при пероральном (на корень языка) методах показало, что более широко и на более продолжительное время она пероистирует у животных, привитых подкожным методом (через 30 дней она выделена от всех животных при ИИ = 65,7 %, а через 60 дней от 40 % жиеотпых при ИИ * 6,8 %). При пероральном методе введения было получено через 30 дней только 6 культур вакцинного штамма из лимфатических узлов от 75 % животных (ИИ = 16,6), а через 60 дней - из 5 животных только от одной морокой свинки (20 %) была выделена только одна культура (ИИ « 2,2 %).

По результатам проведенных исследований можно отметить,что при подкожном методе она расселяягея довольно широко, а при пероральном поражаются только лимфатические узлы головы и у большинства животных культура задерживается на непродолжительное время.

Изучение антигенных овойотв вакцинного штамма 61 В.suie в сравнении со штаммом Рев-I B.meiitenaia в опытах на морских свинках при разных методах введения

Для выяснения данного вопрооа наш было проведено на 60 морских свинках изучение в течение 90 дней динамики антител в сыворотке крови пооле подкожного, коньшкгивального и перорального методов введения культур штаммов 61 B.suia и Рев-I B.meiitensis в дозе I млрд.м.к. Сыворотку крови опытных животных исследовали по РА и РДСК о бруцеллезным антигеном через 7,15,30,70 и 90 дней

после инокуляции вакцинных культур и через 15 и 45 дней после экспериментального заражения культурой вирулентного штамма 102 - Н

В. BSlitenSiS.

Результаты этих исследований показывают, что как по уровню агглютининов, так и по количеству комплементсвязывающих антител достоверной разницы у животных,привитых культурами штаммов 61 В. suis и Рев-I В. шэIltensis во все сроки исследования не установлено. В то же время показатели РА в зависимости от метода введения культур были различными, особенно при сравнении подкожного метода введения с конъюнктивалыюй и пероральной иммунизацией

Следовательно можно сделать вывод, что культура штамма 61 В. euiB обладает умеренной антигенносгью (на 15 день после введения положительные показатели РА установлены у 100 % животных при среднем татре антител от 142-33,8 ME/мл при подкожном введении, 133* ¿35,6 - при кояъклктивальнм и 80,5-^19,6 - при пероральном). В последующие сроки исследований этот показатель существенно снизился и на 90 день составил соответственно 12,7±4,6; 20,5*13,4 и 8,0± -3,9 , т.е. преимущество по данному показателю можно отдать перо-рольному методу иммунизации.

Изучение иммуногенных свойств на морских свинках культуры вакцинного штамма 61 В. aula в сравне- • нии о вакциной из штамма Рев-I В. maiitenaia при различных методах их введения

В опыте было использовано 70 морских свинок, которых разделили на 7 групп по 10 голов в каздой и иммунизировали в дозе I млрд. м.к. по схеме: живртных I, 2 и 3-ей груш культурой штамма 61 .подкожно, коньюнктивально и перорально, 4, 5 и 6 групп культурой штамма Рев-I B.meiitenoiB , подкожно, конъюнктивально и перорально соответственно, а животные 7 группы служили контролем.

Через 90 дней пооле вакцинации всех животных заразили культурой вирулентного штамма 102—Н В.ив11гвпв1з .

Через 45 дней пооле заражения всех животных опытных и контрольной групп убили и исследовали бактериологическим методом. Результаты исследований представлены в таблице I.

Таблица I

Сравнительные данные о иммуногенности культуры вакцинного штамма 61 В.аШа и вакцины из штамма Рев-1 В.тв1иепз1в в опыте на морских овинках

1-Г

I Вак-1

Т

Из них

Методы ' Коля-!

** | ЦЩЧ ЙЗДйодвнге | ^

! вакци- }дован-|-1-Ьг-т-

|ных Iго-| _ | _

групп

ный штамм

нации !™°т~!лов!

, НЫХ I I

!лов! ! !

-1-

Выделено ¡Индекс культур ¡инфи-

! в т.ч.!Чиро-Все! из ¡ваннос-

!ор-!ти по -го! л/у! га-! г?$Ре' !_!нов! и°>

I. 61 подкожно 8 8 100,0 0 0,0 - - - 0,0

2. 61 конъюнк-тивально 8 8 100,0 0 0,0 - — — 0,0

3. 61 перо-рально 2 2 100,0 0 0,0 — - - 0,0

4. Еев-1 подкожно 4 3 75,0 Г 25,0 7 6 I 19,4

5. Рев-1 конъпнк-тивально 7 7 100,0 0 0,0 - — — 0,0

6. Рев-1 перо-рально 6 4 66,7 2 33,3 3 6 2 14,9

7. Не вакцинировано 9 0 0,0 9 100,0 33 21 12 41,8

(контроль)

Как видно из данных таблицы I все животные, привитые культурой вакцинного штамма 61 В.ви1э , независимо от метода иммунизации, противостояли экспериментальному заражению вирулентной культурой бруцелл.

Таким образом, несмотря на длительное хранение культуры штам-

ма 61 В.suis ( в течение более 40 лег) в лабораторных условиях (ВИЭВ) в лиофщшзированном в ампулах под вакуумом виде с периодической пересушкой, результаты проведенного нами изучения фено-типичеоких, генотипических, антигенных, вирулентных п иммуноген-ных (на морских свинках) свойств, показали что данный штамм оставался стабильным и по всем показателям соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам бруцелл.

Положительные результаты изучения основных свойств культуры вакцинного штамма 61 В.suis в лабораторных условиях в опытах на морских овннках послужили основанием для изготовления опытной серии сухой живой вакцины из этого штамма и изучения его реактоген-ных и антигенных свойотв в опытах на северных оленях.

Иммунологическая реактивность организма северных оленей при подкожном и пероральном методах введения вакцины из штамма 61 В.suis

Ддя решения поставленной задачи нами был проведен опыт на 54 головах северных оленей, у которых определяли местную и общую реакцию организма в ответ на введение вакцины, уровень специфических антител в сыворотке крови (в динамике), количество иммуноглобулинов М- и 6- классов и степевь аллергической перестройки организма животных в зависимости от метода и дозы введения вакцины.

С целью изучения указанных свойств вакцины из штамма 61 В.эШз животных по принципу аналогов разделили на 6 групп по 9 голов в каждой. Оленям I, 2 и 3-ей групп вакцину (после разведения стерильным физиологическим раствором) вводили подкожно в области средней трети шеи, в дозах 5 млрд., 10 млрд. и 50 млрд.м.к., животным 4, 5 и 6-ой групп - перорально, в дозах 10 млрд., 25 млрд. и 50

шфд.м.к.

Результат изучения реакгогетшх свойотв вакцины из штамма 61 В.aula в опыте на северных оленях

После иммунизации е точение 2-х недель определяли местную и общую реакции организма северных оленей на введение вакцины путем на-владения за общим состоянием, измерения температуры тела и определения консистенции и размеров воспалительного отека в области инокуляции вакцины.

При учете реакции через 24 часа после подкожного Еведения вакцины на месте введения отмечали выраженную припухлость плотной на ощупь консистенции, горячей и болезненной. В последующем развивался разлитой отек, достигающий максимальных размеров на 6 день после иммунизации. При этом существенной разницы при введении вакцины в дозах 10 млрд.м.к. ж 50 млрд.м.к. не отмечали '(размер отека в мм. соответственно 39,0^3,5 и 44,Г±2,6 , Р>0,05). В то же время у 2-х оленей, привитых в дозе 50 млрд.м.к.на месте введения развились гнойные абсцессы, сохраняющиеся более двух недель.

На дозу 5 млрд.м.к. (3 группа) отек на месте введения был менее выражен, чем у животных I и 2 групп (29,5^1,5 на 6 день,КО,05).

При учете в последующие сутки размеры отека снижались и на Г4 день составили на дозу 5 млрд.м.к. - 28,8^2,3 , 10 млрд.м.к. -32,1-1,8 и 50 млрд.м.к. - 35Д±1,7 мм.

Общая реакция организма оленей отмечена только при подкожном методе иммунизации и выражалась снижением аппетита и угнетенным состоянием . У трех оленей, иммунизированных подкожно в дозе 50 млрд.м.к. ,в течение 10-12 дней наблюдалось хромота передних конечностей. Абортов у стельных важенок не было в течение всего срока наблюдения (115 дней).

При пероральной Еакцинацин температура тела у оленей, независимо от дозы вакцины, была в пределах нормы, также как и другие

физиологические показатели (сохранение аппетита, отсутствие угнетения и т.д.). В то время как при подкожном методе введения вакцины уже через I сутки температура у животных повысилась до 40,5 -40,8°С. Максимальный подъем температуры отмечали на 2-е сутки (40,7 - 41,9°С), после чего она спадала и на 6 сутки достигла физиологической нормы.

При статистической обработке полученных данных установлено,что, разница показателей при подкожном и пероральном методах иммунизации достоверна (Р<0,05), а в зависимости от величины дозы вакцины статистической достоверности не установлено (Р>0,05).

Результаты изучения ревктогенных овейотв вакцины из штамма 61 В.guie на северных оленях свидетельствуют о том, что показатели физиологического состояния организма в ранние сроки после иммунизации зависят от метода введения препарата (подкожный или перораль-Hiitt), а при подкожной вакцинации - от дозы препарата (реакгоген-ность была менее-внражена при введении 5 млрд.м.к., чем при введении большой дозы - 50 млрд.м.к.).

Изучение расселяемооти и сроков элиминации культуры вакцинного штамма 61 B.suIb из организма оеверных оленей прй подкожном и пероральном методах введения

В опыте на северных оленях сравнили подкожный и пероральный метода иммунизации разными дозами (по количеству микробных клеток) вакцины из штамма 61 B.ouis .

Анализ данных показывает, что при подкожном методе введения культура вакцинного штамма 61 B.auis уже на- IO-й день хорошо расселяется в организме с развитием генерализованного процесса.' При этой культуры бруцеДл вакцинного штамма были выделены от всех животных, иммунизированных в дозе 50 к 10 млрд.м.к. и ох- дъух ил 4-х, привитых в дозе 5 млрд.м.к., при этом индекс инфицированности в "

группах Ji 2 и 3 оказался довольно высоким (соответственно 18,7 % и 25,0 %) и значительно ниже в группе Ji I (8,6 %). Почти во всех случаях вакцинальный процесс протекал гонерализовашю (из 9 исследованных оленей от 6-ти культуру выделили из селезенки).

При ydoe животных из этих групп в более отдаленные сроки после вакциннции (73 и 115 дней) было установлено, что практически к этому времени бруцеллн вакцинного штамма полностью элиминируются из организма оленей. Только от одной головы, из 3-х, иммунизированных в дозе 50 млрд.м.к., на 73 день была получена одна культура из селезенки.

Несколько иную картину наблюдали при пероральном методе иммунизации. На 10 день из 9 исследованных оленей культуру бруцелл вакцинного штамма выделили только от трех из лимфатических узлов головы (подчелюстных, заглоточных или околоушных), а при убое в последующие сроки во всех случаях результат бактериологического исследования был отрицательным.

Для уточнения видовой принадлежности выделенных культур к бру-целлам, помимо изучения их фен оптических свойств, дополнительно проводили идентификацию по молекулярно-биологическта (генетическим) характеристикам: нуклеотидному составу ДНК (Мол.^ ГЦ) и гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК.

Результаты определения нуклеогидного состава и гомологий нуклеотидных последовательностей ДНК показывают, что исследуемые культуры были идентичными и соответствовали таковым у микроорганизмов рода Brucella .

Таким образом, результаты данного опыта показали, что при пероральном методе иммунизации культура бруцелл вакцинного штамма 61 В.suis , независимо от дозы препарата, введенного в объеме I мл., проникает через неповрежденную слизистую оболочку ротовой полости,

о чем свидетельствовало установление гипертрофии лимфатических узлов в области головы и выделение из них исходных культур.

Результаты.изучения гуморального иммунного ответа организма северных оленей при подкожном и перораль-ном методах введения вакцины из штамма 61 B.suio в разных дозах

Мы провели сравнительное изучение динамики антител в сыворотке крови северных оленей после подкожной и пероральной их иммунизации вакциной из штамма 61 В.suis .

Сыворотку крови от иммунизированных оленой исследовали в РЕП, РА и РДСК через 10, 15, 40, 73 и 115 дней после вакцинации.

При исследовании сыворотки крови животных в РБП после подкожного введения вакцины в дозах 5, 10 и 50 млрд.м.к. положительные реакции отмечены у всех животных уже на 10-й день и сохранялись до 40 дней (доза 5 и 10 млрд.м.к.) и до 73 дней (доза 50 млрд.м.к.). Затем количество реагирующих постепенно снижалось и достигло нулевых значений к 115 дню после прививки в группах животных.иммунизированных в дозах 5 и 10 млрд.м.к. и сохранилась у 33,3 % из числа привитых вакциной в дозе 50 млрд.м.к. При пероральной иммунизации антитела в РБП выявляли только в первые 10-15 дней после прививки.

При исследовании сыворотки крови опытных животных в реакции агглютинации (РА) была отмечена определенная закономерность сроков появления, максимального подъема и угасания титров агглютинирующих антител в зависимости от дозы и метода введения вакцины из штамма 61 В.aula .

Так,на 10 день после иммунизации агглютинины были выявлены во всех группах.кроме привитых перорально в дозе 10 млрд.м.к.

Значительный уровень антител в крови подопытных оленей был вы- ' явлен на 15 день после вакцинации (таблица 2),при этом наиболее

Таблица 2

Дднамика уровня агглютинирующих антител в сыворотке крови северных оленей, привитых вакциной из штамма 61 ВкнсеИл ЬИ(§

т

Сроки после вакцинации (дни)

Процент положительно реагирующих / средний титр антител _ Метод и роза вакцинации (млрд.м.к.)_

Подкожно 10

50

10

Пероралъно 25

50

5

10 100,0/125,0 100,0/233,3 100,0/433,3

15 Ю0,(У166,6 - 100,0/200,0 100,0/466,6

40 100,0/75,0 100,0/150,0 100,0/300,0

73 33,3/33,3 33,3/16,6 100,0/301,0

115 50,0/12,5 Ц/0 33,3/33,3

0/0 100,0/50,0

50,0/100,0 0/0

0/0 0/0

50,0/12,5 0/0

0/0 0/0

50,0/100,0 , 100,0/150,0 0/0 ' о/о о/о

высокий титр антител отмечали при подкожном введении вакцины.

При сопоставлении этих данных с данными, полученными в группе животных, привитых пероральным способом, разница в показателях уровня антител была достоверной (Р<0,05).

Снижение уровня агглютинирующих антител ниже диагностического было отмечено в крови северных оленей, привитых подкожно в дозе 50 млрд.м.к. через 115 дней, а у животных привитых пероральным методом исчезновение агглютининов началось о 40 дня после иммунизации.

Комплементсвязывакщие антитела были выявлены в РДСК на 10 день после введения вакцины, доститали максимального уровня к 40 дню и минимальных показателей к 115 дню в сыворотке крови северных оленей, привитых подкожным методом. При этом титр антител у животных, привитых подкожно были значительно выше, чем у животных, иммунизированных пероральным методом (Р<0,05).

У животных, привитых пероральным методом, комплементсвязываю-ище антитела в крови, в основном, появлялись в более поздние сроки, в низких тиграх и исчезали через 73 дня после иммунизации.

Таким образом прослеживается определенная зависимость уровня специфических антител в сыворотке крови исследованных животных от дозы и метода введения вакцины из штамма 61 B.sula.

Для дифференцированного определения иммуноглобулинов М- и си-классов применили реакцию агглютинации о 2-меркаптоэт8Нолом, постановку и учет которой проводили по общепринятой методике.

В группе животных,привитых подкожно,оба класса иммуноглобулинов были выявлены уже на 10 день после вакцинации.причем наиболее высокий их уровень был в сыворотке крови оленей.привитых в дозе 50 млрд.м.к. Нарастание уровня lg М- и ig о-антител ваблвдали до 15 дня после иммунизации, а при исследовании в последующие сроки ко-

личество их в сыворотке крови постепенно снижалось. В количественном отношении можно отметить закономерную зависимость от дозы введенного препарата.

У животных, привитых перорально, выявляли только иммуноглобулины М- класса в первые 10 - 15 дней после вакцинации.

Полученные результаты изучения динамики специфических иммуноглобулинов М- и о- классов в сыворотке крови животных, иммунизированных вакциной ив штамма 61 В. sais , показало, что их уровень. я сроки появления н угасания находятся в прямой зависимости от до-вы вакцины х метода ее введения.

Развитие реакции лшерчувствительвооти замедленного типа у северных оленей пооле иммунизация вакциной из штамма 61 В. aula

Выявление реакции пшерчувотвительнооти замедленного типа (ГЗТ) у животных in vivo оонована на применении метода аллергического исследования специфическим аллергеном.

В нашем эксперименте аллергичеокое исследование подопытных животных пальпебрально! пробел проводили бруцеллином ВИЭВ (Табл. 3).

Как видно se данных таблицы 3, процент положительно реагирующих животных на 40 день пооле вакцинации в целом не зависит от метода иммунизации и от дозы вакцины.

В дальнейшем угасание реакций (73 день после иммунизации) происходит в зависимости от метода введения вакцины ив штамма 61 В. suis , т.е. к этому сроку при пероральном методе введения препарата не было выявлено животных, реагирующих на аллерген, в то время как при подкожном методе реакции еще сохранялись у 50,0 - 62,5 % опытных оленей.

Таким образом, на основании полученных результатов можно отметить, что несмотря на непродолжительную по времени аллергичес-

Таблица 3

Результаты аллергических исследований северных оленей после иммунизации

I V I 1 1 I " "" 1 ""

И |Вакцина| Метод 1 Доза ¡Процент положительно реагирующих % груп-1 из 1 введения !(млрд.I Сроки после иммунизации (дни) пы ¡штамма | вакцины | м.к.)] 40 { 73

I. Вакцина подкожно 50 88,8 33,3

2. из подкожно 10 75,0 25,0

3. штамма подкожно 5 55,5 22,2

4. 61 В. перорально 50 55,5 0,0

Б. 8й1в . перорально 25 62,5 0,0

6. перорально 10 50,0 0,0

ку» реакцию при пероральном методе введения вакцины, в организме привитых северных оленей происходит активная иммунологическая перестройка. •

Учитывая, что в иммуногенезе бруцеллеза главенствующую роль играет клеточные факторы, обусловленные активизацией Т-оиотемы, . можно полагать , что при пероральном введении вакцины у северных оленей развивается уотойчквооть к бруцеллезу.

. . шведа:

1. Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу северных оленей в Реопублике Саха (Якутия), остается сложной. Из 14 оленеводческих районов Республики бруцеллез регистрируется в 10. Однако процент пораженности за последние II лег снизился в 7,6 раз (о 3,6 % в 1833 г. до 0,5 % - в 1993 г.).

2. Специфическая профилактика бруцеллеза оеверннх оленей о использованием вакцин И8 штаммов 19 и 82 до наотоящего времени не нашла вшрохого применения в практике в связи о юс высокой раакто-генностью при подкожном применении. Поэтому поиск других вакцин-

ных штаммов бруцелл и охем применения приготовленных из них вакцин являются важной проблемо!. Результаты ваших иооледоваяий показали, что дам это! цели может быть рекомендован штамм 61 В.aula.

3. На оонованин изучения феногиотчеоких и геногипичеоких овойотв подтверждена принадлежность культуры вакцинного штамма . 61 к роду Bruoaii» и ооответотвие виду В. suis 1-го биоварианта. Штамм 61 В.aula легко дифференцируется от полевых культур бруцелл по отепенн задержки роота на питательных оредах о добавлением пенициллина (I ед/мл) и эритритола (2 мг/ил).

4. Показано, что в организме мороких свинок культура вакцинного штамма 61 В. aula, независимо от метода ее введения (подковный или пероральный), приживается только в лимфатических узлах. Однако, более широко она раооеляется и задерживавтоя на более продолжительный срок у завогных при подкожном методе введения.

5. Установлено, что степень выраженности гуморального иммунного ответа организма мороких свинок зависит or метода введения вакцины из штамма 61 В. suis. Наименее он был выражен у животных, иммунизированных пероральным методом.

6. Проверка состояния иммунитета через 3 мво. пооле вакцинации показала, что все морские свинки, яе зависимо от метода введения культуры штамма 61 В. aula (подкожно, коньюнктивально, перораль-яо) противостояли экспериментальному заражению культурой вирулентного штамма 102 Н В. me-Htenaia .

7. Изучение реактогенных свойств вакцины из штамма 61 В. aula

в опыте на северных оленях показало, что при подкожном методе введения она вызывает местную и общую реакцию организма северных оленей, аналогичную таковой при иммунизации животных вакцинами из штаммов 19 и 82 В. abortua.

8. Пероральный метод иммунизации позволяет устранить все по-

бочные явления (отсутствует угнетение общего состояния, температура тела остается в пределах нормы, олени не хромают, у них не развиваются тендовагпнигы, артриты и т.д.).

9. При подкожном методе иммунизации уже в первые 10 дней культура вакцинного штамма 61 широко расселяется в организме северных оленей с развитием генерализованной формы вакцинального процесса и персистирует до 73 дней , в то время как при пероральном методе она,проникая через не поврежденную слизистую оболочку ротовой полости, не распространяется дальше лимфатических узлов головы и элиминируется полностью спустя 10 дней после введения.

10. Сроки появления, персистенции и титры специфических антител в сыворотке крови иммунизированных оленей находятся в прямой зависимости от дозы и метода введения вакцины. Более раннее появление, высокий уровень и длительное сохранение поогвакцинальных антител отмечены при подкожном методе введения вакцины (до 115 дней), а при пероральной вакцинации антитела выявляли в низких ' титрах, и при исследовании сыворотки крови оленей на 73 оутки их выявить не удалось.

11. Несмотря на слабовыраженную и непродолжительную оеропови-тивность при пероральном методе введения вакцины, в организме северных оленей происходит активная иммунологическая переотройка, проявляющаяся реакцией гиперчувствительнооти замедленного типа. При этом значительных количественных различий в зависимости от дозы и метода введения вакцины отмечено не было.

12. Учитывая, что основными воротами инфекции при бруцеллезе являются слизистые оболочки,теоретически и экспериментально обоснована перспективность перорального метода применения вакцины из штамма 61 В.suis для специфической профилактики бруцеллеза северных оленей.

- 23 -

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Преимущества перорального метода введения вакцины нз штамма 61 В.suie по сравнению с подкожным (отсутствие реактогенншс и снижение антигенных свойств вакцины), вследствие чего диагностические исследования становятся возможными в значительно ранние сроки чем после подкожной иммунизации, а также простота применения свидетельствуют о его перспективности и позволяют нам рекомендовать данный способ вакцинации для более широкого изучения с целью применения для специфической профилактики бруцеллеза северных оленей.

2. Разработан "Лабораторный регламент на изготовление и копт-роль вакцины живой сухой из штамма 61 Бруцелла суис против бруцеллеза мелкого рогатого скота и северных оленей" (Одобрена ме-тодкомиссией, протокол * 6 от 3 ноября 1994 г. и утв.зам.директора ВИЭВ 29.II.94 г.).

СПИСОК (ШБЛИКОВАННСЙ ЛИТЕРАТУШ

1. Слепцов F..C., Кобяков Н.Т. Диснамика антйтел ig М- и igG-классов у северных оленей в зависимости от дозы и метода введения вакцины из штамма 61 B.suia.// Тез. докл. 2 респуб. научно-практ. конференции молодых ученых и аспирантов.- Якутск, 1993.-С.67-68.

2. Слепцов Е.С., Кобяков Н.Т., Хоч А.А. Проблема бруцеллеза северных оленей в Республике Саха (Якутия) // Тез.докл. Всеросо. научно-практ. конференции по проблемам АПК Крайнего Севера.-Якутск, 1993.

3. Яхтдин Р.Г., Ромахов В.А., Слепцов Е.С., Кобяков Н.Т. Культу ралъные, антигенные и иммуногенные овойства вакцинных штаммов 2 и 61 В.suis и Рев-I B.oelitenais Л Тез.докл.науч.конф.- Самарканд, 1994.- С, 126 - 127.