Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность инъекционной формы комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина

На правах рукописи

Игнатова Анна Дмитриевн —«ио^ сдд

ФАР1У1АКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИНЪЕКЦИОННОЙ ФОРМЫ КОМПЛЕКСНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ КЛИНДАМИЦИНА И СПЕКТИНОМИЦИНА

16.00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003052783

Работа выполнена в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств для животных Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

кандидат ветеринарных наук, доцент Виолин Б.В.

доктор ветеринарных наук, профессор Преображенский С.Н.;

кандидат биологических наук Сорокин М.В.

Ведущая организация - Федеральное государственное учреждение «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» Россельхознадзора МСХ РФ (г. Казань).

Защита состоится «/^ » ¿Ыь/ьС^^ 2007 года в /У ^часов на заседании диссертационного совета Д. 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан «Я? » ^•^^^2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Респираторные заболевания телят наряду с желудочно-кишечными инфекциями занимают основное место в структуре заболеваний молодняка крупного рогатого скота. Убытки, причиняемые бронхопневмонией, складываются из отставания в росте, снижения привесов, затрат на лечение и профилактику заболевания, смертности животных (Г.К. Волков, В.Д. Баранников, 1995; О. Гамелин, 2002; Е.А. Капитонова, A.C. Оспенцева, A.C. Кашин, 2003). В отдельных хозяйствах гибель молодняка в совокупности с вынужденным убоем достигает 40-55%, а прирост массы тела у больных и переболевших животных снижается в 2-3 раза (JL Слацина, 1982; В. Ардатовский, 1996; Е.С. Воронин, А.Г. Шахов, 1999; М. Полюс, Б. Гранжан, 2004).

Бронхопневмония молодняка крупного рогатого скота представляет собой сложный инфекционный процесс, в котором на разных стадиях развития патологии принимают участие вирусы, микоплазмы, ассоциации бактерий (стафилококки, стрептококки, пастереллы, гемофилюс, эшерихии, сальмонеллы и др.) в различных сочетаниях (И.И. Фельдман, М.Н. Шадрина, 1983; В.М. Данилевский, 1985; А.П. Брылин, 1986; С.К. Димов, В.И. Сайченко, 1997; S.B. Houghton, R.N. Gourlay, 1983; U. Fogarty, P.J. Quinn, J. Hannan, 1988).

Химиотерапия респираторных заболеваний, как правило, направлена на подавление патогенной микрофлоры. Широкое и часто нерациональное применение антибактериальных лекарственных средств при бронхопневмонии телят привело к распространению резистентных микроорганизмов, что является основным фактором, ограничивающим эффективность лечения (А. Жамантаев, 1984; В.Ф. Ковалев, И.Б. Волков, Б.В. Виолин, 1988; Л.И. Ефанова, 1997).

Учитывая, что применение научно-обоснованных комбинаций антибактериальных веществ является важным направлением современной химиотерапии бактериальных инфекций, позволяющим преодолеть проблему антибиотикоре-зистентности, значительно расширить спектр антимикробного действия, а также уменьшить токсическое влияние каждого антибиотика в комбинации на организм животных, нам представлялось актуальным разработать удобный в применении, малотоксичный комплексный препарат, активный в отношении основных бактериальных возбудителей респираторных заболеваний телят.

Клиндамицин - антибиотик группы линкозамидов, высоко активный в отношении грамположительной микрофлоры, микоплазм и анаэробов, в течение 30 лет успешно используется в медицине для лечения бактериальных инфекций респираторного тракта (А.Р. Ball, 1981; Т. Barragry, 1992; R.E. Lewis, М.Е. Klep-ser, 1998). Учитывая, что этот антибиотик ранее не применялся для лечения бактериальных инфекций животных в Российской Федерации и не обладает перекрестной резистентностью с большинством других антибактериальных препаратов, он был выбран в качестве одного из действующих веществ комплексного антибактериального препарата для лечения респираторных заболеваний телят.

Обладая высокой активностью в отношении грамположительной микрофлоры и анаэробов, клиндамицин не действует на грамотрицательные бактерии

(G.F. Burrows, 1980; Spizek J., Resanka Т., 2004). Поэтому, учитывая ассоциативный характер этиологии респираторных инфекций, для расширения спектра антибактериального действия в состав комплексного препарата был введен спектиномицин - антибиотик, по своей структуре и механизму действия сходный с аминогликозидами, однако не обладающий присущим им нефро - и ото-токсическим действием, подавляющий развитие эшерихий, пастерелл, сальмонелл и других грамотрицательных микроорганизмов (W.T. Holloway, 1982, Т. Barragry, 1992; J.F. Prescott, J.D. Baggot, 1993), а также, как было установлено нами в опытах in vitro, усиливающий антибактериальные свойства клиндами-цина.

Цели и задачи исследования. Разработать на основе клиндамицина и спектиномицина новый комплексный антибактериальный препарат для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Для этого было необходимо:

- обосновать состав и разработать лекарственную форму комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина;

- разработать требования к качеству препарата и методы его контроля;

- изучить стабильность препарата в процессе хранения;

- изучить острую токсичность препарата в опытах на лабораторных животных;

- изучить субхроническую токсичность препарата в опытах на лабораторных животных и телятах;

- изучить фармакокинетику клиндамицина и спектиномицина в организме телят после применения препарата;

- определить сроки выведения остаточных количеств клиндамицина и спектиномицина из организма телят после курсового применения препарата;

- определить терапевтическую эффективность комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина в производственных условиях и разработать схему его применения для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Научная новизна. Впервые разработан комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина в форме раствора для инъекций для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Установлено взаимоусиливающее действие комбинации клиндамицина и спектиномицина в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов; изучены фармако-токсикологические свойства и определена терапевтическая эффективность комплексного антибактериального препарата при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Практическая значимость работы.

Разработан и предложен для ветеринарной практики новый комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Разработаны методы контроля качества комплексного антибактериального препарата и установлен срок его годности.

Определены сроки возможного использования в пищу человеку мяса и субпродуктов телят после применения комплексного антибактериального препарата.

Разработана схема применения комплексного антибактериального препарата при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Разработана нормативная документация - технические условия и инструкция по применению комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Научное обоснование состава комплексного антибактериального препарата.

- Качественные и количественные методы контроля комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина.

- Результаты изучения стабильности комплексного антибактериального препарата при хранении.

- Результаты изучения острой и субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата в опытах на лабораторных животных и телятах.

- Результаты изучения фармакокинетики клиндамицина и спектиномицина и определения сроков выведения остаточных количеств антибиотиков из организма телят после применения препарата.

- Результаты определения терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата при лечении респираторных заболеваний бактериальной этиологии у телят.

- Практические предложения по применению комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина в ветеринарии.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 163 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа иллюстрирована 31 таблицей, 6 рисунками, 3 графиками, 6 диаграммами и 7 фотографиями. Список литературы содержит 224 источника, в том числе 105 иностранных. Приложение на 9 листах.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 2003-2007 г.г. В опытах было использовано 222 беспородные белые мыши обоего пола массой 18-22 г и 30 телят массой 45180 кг. Клиническое испытание препарата в производственных условиях проведено на 577 телятах.

Определение чувствительности стафилококков, стрептококков, эшери-хий, сальмонелл, пастерелл к клиндамицину, спектиномицину и их комбинаци-

ям проводили на мясо-пептонном агаре (МПА) методом серийных разведений в плотной питательной среде (С.М. Навашин, И.П. Фомина, 1982).

В качестве тест-микроорганизмов использовали музейные культуры и выделенные от больных животных и птиц изоляты: Escherichia coli (серовари-анты 09:K30, 02, 078, 04, 0111, 0139, 08, 018, 020, 015, 01; изоляты 1, 3, 4, 6/3, 4/1, 6/2, 1/5, №7, №27), Salmonella enteritidis (изоляты 1, 4, 15, G, 7, 2, 9/5, 232, 3/5, №27, №11), Salmonella thyphimurium (изолят 371), Salmonella dublin (изоляты MBA, 373, 2301, 315, ВНИИЗЖ), Salmonella gallinarum-pullorum (изоляты 24 КСТ, 10 Б, ЛБ, REV1), Pasteurella multocida (изоляты 1-8), Staphylococcus aureus (изоляты 1-20), Streptococcus spp. (изоляты 1-3).

За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) клиндамицина, спектиномицина и их комбинаций принимали наименьшую концентрацию антибиотиков, дающую полную задержку роста культуры на поверхности агара.

Разработка лекарственной формы.

Для производства инъекционной лекарственной формы было необходимо: выбрать соответствующий растворитель с учетом физико-химических свойств действующих веществ, обеспечивающий их полное растворение; выбрать консервант, позволяющий сохранять стерильность инъекционной лекарственной формы при многократном отборе препарата из флакона; установить оптимальное значение рН раствора, позволяющее обеспечить стабильность инъекционной лекарственной формы в течение срока годности, а также обеспечить наименьшее местно-раздражающее действие препарата при внутримышечном введении.

Для стандартизации и контроля качества комплексного антибактериального препарата, а также изучения его стабильности при хранении в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XI к инъекционным лекарственным формам были предложены методики качественного и количественного контроля препарата с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения подлинности и массовой доли клиндамицина фосфата и бензилового спирта, метода тонкослойной хроматографии для определения подлинности спектиномицина гидрохлорида и микробиологического метода диффузии в агар для определения массовой доли спектиномицина гидрохлорида в препарате.

Стабильность комплексного антибактериального препарата изучали в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре». Параллельно изучали стабильность препарата в условиях естественного хранения при комнатной температуре (23±2°С) и при многократном отборе раствора из флакона после первого прокола пробки иглой.

Образцы препарата, расфасованные по 20 мл в стеклянные флаконы, помещали для «ускоренного старения» в термостаты при температурах 37 и 50°С и исследовали через промежутки времени, соответствующие 6, 12, 18 и 24 месяцам хранения. При хранении препарата в естественных условиях исследование образцов проводили через 3, 6, 9, 12 и 18 месяцев после закладки на хране-

ние, а при многократном отборе препарата из флакона образцы исследовали сразу после прокола пробки и затем через 7,14,21 и 28 суток.

Оценку качества препарата в процессе хранения при повышенной и комнатной температуре проводили по показателям: внешний вид, прозрачность, окраска и рН раствора, наличие механических примесей, объем наполнения, подлинность и массовая доля клиндамицина фосфата, спектиномицина гидрохлорида и бензилового спирта, пирогенность и стерильность.

При многократном отборе препарата из флакона в течение 28 суток оценку его качества проводили по показателям: массовая доля клиндамицина фосфата, спектиномицина гидрохлорида и бензилового спирта, рН раствора, стерильность.

Острую токсичность препарата изучали на 102 беспородных белых мышах обоего пола массой 18-20 г. Препарат вводили однократно перорально в дозах: 21200, 26500, 31800, 42400, 53000 и 63000 мг/кг; подкожно в дозах: 10600, 13250, 15900, 18550 и 21200 мг/кг; внутрибрюшинно в дозах: 1590, 2650, 5300, 7950, 9540 и 10600 мг/кг. Каждую дозу препарата испытывали на 6 мышах.

Наблюдение за клиническим состоянием подопытных животных проводили в течение 14 суток после введения препарата, учитывали количество погибших мышей в зависимости от дозы и рассчитывали токсикологические параметры (ЛДо, ЛД]6, ЛДзо, ЛД84 и ЛДшо) по методу Литчифилда-Уилкоксона (МЛ. Беленький, 1969).

Субхроническую токсичность комплексного антибактериального препарата изучали на 120 беспородных белых мышах обоего пола массой 18-22 г. Подопытных животных по принципу аналогов разделили на 4 группы по 30 мышей.

Препарат мышам вводили ежедневно в течение 20 суток подкожно в следующих дозах: 1 группе - 1/5 ЛД50 (3262 мг/кг массы животного); 2 группе -1/10 ЛД5о(1631 мг/кг массы животного); 3 группе - 1/20 ЛД50 (815 мг/кг массы животного); 4 группе (контрольная) - 0,2 мл физиологического раствора.

Наблюдение за клиническим состоянием животных вели на протяжении 31 суток от начала опыта. Определение массы тела у мышей проводили до начала введения препарата и на 7, 14, 21 и 31 сутки опыта.

Для выявления возможного токсического действия комплексного антибактериального препарата на организм животных на 21 и 31 сутки от начала введения на 10 мышах каждой группы проводили определение детоксицирую-щей функции печени с помощью гексеналовой пробы. Гексенал вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг массы тела в форме 0,2% раствора. Учет времени сна начинали с момента принятия мышами бокового положения и заканчивали при появлении координированных движений. В эти же сроки на других 10 мышах каждой группы изучали общекомпенсаторные реакции организма с помощью функциональной пробы плаванием и определяли относительную массу (коэффициенты) внутренних органов: печени, почек, сердца, легких, селезенки,

учитывая, что изменение массы органа, как правило, ведет к существенному изменению его функциональных способностей (В.Н. Гацура, 1976).

Субхроническую токсичность комплексного антибактериального препарата изучали на 16 клинически здоровых телятах массой 60-70 кг, разделенных по принципу аналогов на 4 группы по 4 головы в каждой. Препарат вводили телятам внутримышечно 1 раз в сутки, в течение 20 дней в следующих дозах: 1 группе - пятикратную терапевтическую дозу (75 мг/кг массы тела); 2 группе -двух с половиной кратную терапевтическую дозу (37,5 мг/кг массы тела); 3 группе - терапевтическую дозу (15 мг/кг массы тела); 4 группе - 10 мл физиологического раствора (контроль).

В процессе опыта вели наблюдение за телятами и учитывали общеклиническое состояние, болезненность в месте введения препарата, аппетит, отправление физиологических функций. Клиническое и биохимическое исследование крови проводили до начала введения препарата, на 11 и 21 сутки опыта. О функциональном состоянии печени судили по изменению активности гепатос-пецифических ферментов (аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинотрансфе-разы (AJIT)) и содержанию общего билирубина в сыворотке крови. Функциональное состояние почек оценивали по содержанию в сыворотке крови креати-нина и мочевины. На 21 сутки опыта проводили убой телят с целью проведения гистологического исследования органов и тканей животных.

Фармакокинетику клиндамицина и спектиномицина в сыворотке крови после однократного внутримышечного введения комплексного антибактериального препарата в терапевтической дозе 15 мг/кг массы тела изучали на 5 клинически здоровых телятах массой 45-60 кг.

Все животные находились в одинаковых условиях кормления и содержания и в течение 14 дней до опыта и на протяжении опыта не получали никаких лекарственных препаратов.

Образцы крови отбирали в объеме 10 мл до введения и через 15; 30; 45 минут; 1; 1,5; 2; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21; 24 ч после введения препарата. После центрифугирования крови в течение 10 минут при 2000 об/мин. сыворотку отбирали в пробирки и замораживали при температуре минус 18 °С до исследования.

Определение клиндамицина в сыворотке крови проводили с использованием микробиологического метода диффузии в агар с тест-культурой Micrococcus luteus АТСС 9341 (В.Ф. Ковалев и др., 1988). Предел количественного определения - 0,08 мкг/мл. Определение спектиномицина в сыворотке крови проводили после дериватизации предложенным нами методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с UV-детектированием. Предел количественного определения — 0,1 мкг/мл.

Определение сроков выведения остаточных количеств клиндамицина и спектиномицина после курсового применения препарата проводили на 9 телятах массой 160-180 кг. Животным один раз в сутки внутримышечно в течение 5 дней вводили комплексный антибактериальный препарат в дозе 15 мг/кг массы тела.

На 3, 14 и 21 сутки после последнего введения препарата проводили убой 3 телят. От каждого животного отбирали для исследования пробы печени, почек, мышечной ткани, мышечной ткани из места инъекции, жира, легких, сердца массой около 50 г, а также сыворотку крови.

Содержание клиндамицина и спектиномицина в биосубстратах определяли теми же методами, что и при изучении фармакокинетики.

Терапевтическую эффективность комплексного антибактериального препарата изучали на 577 телятах при бронхопневмонии бактериальной этиологии в хозяйствах Московской, Белгородской и Свердловской областей.

При постановке диагноза учитывали эпизоотическую ситуацию в хозяйствах, клиническую картину заболевания, результаты патологоанатомического, бактериологического исследований, проведенных областными ветлаборатория-ми.

Терапевтическую эффективность препарата на основе клиндамицина и спектиномицина изучали в сравнении с комплексными антибактериальными препаратами в форме раствора для инъекций: зинапримом (сульфаметазин + триметоприм); сульфетримом (эритромицин + триметоприм + сульфадиметок-син) и ультрадиазином (сульфадиазин + триметоприм), зарегистрированными в Российской Федерации для лечения респираторных заболеваний крупного рогатого скота бактериальной этиологии.

Больные животные были разделены на группы по принципу аналогов, учитывая возраст, пол, массу тела, тяжесть заболевания. Все телята находились в одинаковых условиях кормления и содержания.

Комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина телятам вводили внутримышечно. Препараты сравнения применяли в соответствии с утвержденными Россельхознадзором инструкциями по применению. Для определения наиболее эффективной дозы комплексного антибактериального препарата первоначально были испытаны следующие схемы применения: 0,5 мл/10 кг массы тела (7,5 мг/кг по сумме действующих веществ) один раз в сутки; 1 мл/10 кг массы тела (15 мг/кг по сумме действующих веществ) один раз в сутки; 1,25 мл/10 кг массы тела (18,75 мг/кг по сумме действующих веществ) один раз в сутки. Дальнейшие исследования продолжили с наиболее эффективными дозами.

За подопытными животными вели ежедневные клинические наблюдения, регистрируя температуру тела, частоту дыхания и сердечных сокращений. Проводили аускультацию животных. При оценке терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина учитывали: сохранность животных, а также продолжительность курса лечения.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики, используя руководство Ю.С. Малеты и В.В. Тарасова (1982).

Результаты исследований

Антибактериальная активность клиндамицина. спектиномицина и их комбинаций. Полученные в опытах in vitro результаты (таблица 1) свидетельствуют о высокой чувствительности грамположительных микроорганизмов к клиндамицину. Минимальная подавляющая концентрация антибиотика, действующая на 90% изолятов стафилококков (МПК90), составила 0,155 мкг/мл, а на 50% (МПК50) - 0,076 мкг/мл. Для стрептококков эти показатели соответственно были равны 0,31 мкг/мл и 0,155 мкг/мл.

Табл. 1. Чувствительность микроорганизмов к клиндамицину и спектиномицину

Род микроорганизмов МПК, мкг/мл

Клиндамицин Спектиномицин

МПК50 МПК90 МПК50 МПК90

Staphylococcus (п=20) 0,076 0,155 25,0 25,0

Streptococcus (п=3) 0,155 0,31 6,25 12,5

Escherichia (п=22) >200 >200 12,5 25,0

Salmonella (п=21) >200 >200 12,5 25,0

Pasteurella (п=8) >200 >200 6,25 12,5

Низкую активность клиндамицина в отношении грамотрицательных микроорганизмов компенсирует второй компонент препарата - спектиномицин. В наших исследованиях МПК90 спектиномицина находилась в диапазоне 12,5-25,0 мкг/мл, а МПК50- 6,25-25,0 мкг/мл, причем наибольшей активностью антибиотик обладал в отношении пастерелл и стрептококков.

При изучении антибактериального эффекта сочетания клиндамицина и спектиномицина in vitro нами было установлено, что минимальная подавляющая концентрация каждого из антибиотиков в присутствии другого снижается в 2-8 раз в зависимости от вида микроорганизма.

Например, в присутствии спектиномицина в концентрациях 3,12-6,25 мкг/мл МПК клиндамицина в отношении стафилококков снижается до 0,019 мкг/мл (в 8 раз). И наоборот, наличие в комбинации клиндамицина в концентрациях 0,019-0,038 мкг/мл снижает МПК спектиномицина в отношении стафилококков до 3,12 мкг/мл (в 8 раз).

При добавлении к спектиномицину клиндамицина в концентрации 100 мкг/мл МПК первого в отношении пастерелл снижается до 1,56 мкг/мл (в 8 раз). В то же время, присутствие спектиномицина в концентрациях 3,12-6,25 мкг/мл снижает МПК клиндамицина в отношении пастерелл до 50 мкг/мл (в 4 раза).

Взаимоусиливающий эффект клиндамицина и спектиномицина в комбинации, вероятно, обусловлен тем, что они блокируют различные стадии белкового синтеза в бактериальной клетке. Так, спектиномицин связывается с 30S

субъединицей рибосомы, подавляя инициацию синтеза белка, в то время как клиндамицин связывается с 50S субъединицей рибосомы, нарушая процесс элонгации пептидной цепи.

Установленное взаимоусиливающее действие комбинации клиндамицина и спектиномицина в отношении изученных нами этиологически значимых в развитии респираторных заболеваний телят микроорганизмов, а также расширение спектра антибактериальной активности при их совместном применении позволили включить эти антибиотики в состав комплексного препарата.

При разработке лекарственной формы препарата учитывали, что при септических и респираторных инфекциях наиболее предпочтительно парентеральное введение антибактериальных лекарственных средств, что позволяет обеспечить быстрое достижение терапевтического эффекта за счет поступления действующего вещества в кровь, а затем в органы и ткани, минуя желудочно-кишечный тракт. Поэтому комплексный антибактериальный препарат предложен нами в форме раствора для инъекций.

По внешнему виду лекарственное средство представляет собой бесцветный или светло-желтый прозрачный раствор, содержащий 5% клиндамицина фосфата и 10% спектиномицина гидрохлорида.

Разрешенные Государственной Фармакопеей вспомогательные вещества в составе препарата (бензиловый спирт - 1%, гидроокись натрия для коррекции рН до 3,8-5,5, вода для инъекций до 100%) обеспечивали хорошую растворимость действующих веществ, стерильность препарата при многократном отборе раствора из флакона, стабильность на протяжении всего срока хранения, а также наименьшее местно-раздражающее действие препарата при внутримышечном введении.

Для стандартизации и контроля качества комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина, а также определения его стабильности при хранении нами были предложены количественные методы контроля, позволяющие определить содержание одного антибиотика в присутствии второго.

Для определения подлинности и массовой доли клиндамицина фосфата, как наименее стабильного компонента, а также бензилового спирта предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Этот метод позволяет определить не только количество действующего компонента, но и обнаружить, в случае их наличия, продукты его распада.

Подобранные нами оптимальные условия хроматографирования (длина волны - 210 нм и элюент - ацетонитрил/раствор калия фосфорнокислого дву-замещенного - 350/800 мл) позволяют одновременно идентифицировать и количественно определять в одной пробе клиндамицин и бензиловый спирт, что значительно сокращает время анализа. Установлено, что при подобранных условиях время выхода пика клиндамицина составляет 3-4 минуты, бензилового спирта - 6-7 минут.

Учитывая то, что клиндамицина фосфат микробиологически не активен, его присутствие в препарате не влияет на результаты количественного опреде-

ления спектиномицина гидрохлорида микробиологическим методом диффузии в агар с тест-культурой Escherichia coli АТСС 26.

Для определения подлинности спектиномицина мы предложили методику хроматографии в тонком слое на пластинках Silufol. Наилучшие результаты дала система растворителей этиловый спирт - аммиак водный (25%) в соотношении 2:1. Пятно, полученное при хроматографировании на пластине Silufol спектиномицина в исследуемом образце препарата, соответствовало пятну стандарта спектиномицина по величине и высоте прохождения (Rf~0,23).

На основании проведенных исследований были установлены требования к качеству готовой инъекционной лекарственной формы препарата на основе клиндамицина и спектиномицина, которые вошли в технические условия (таблица 2).

Табл. 2. Требования к качеству комплексного антибактериального препарата

Наименование показателя Характеристики и нормы

Внешний вид Бесцветный или светло-желтый прозрачный раствор

Прозрачность раствора Должен выдерживать сравнение с растворителем или эталоном № I

Окраска раствора Не должен по интенсивности превышать эталон №26

Объем заполнения, мл Должен быть не менее номинального

рН раствора 3,8-5,5

Наличие механических включений Должно соответствовать установленным требованиям

Подлинность спектиномицина гидрохлорида Пятно спектиномицина в исследуемом образце препарата должно соответствовать пятну стандарта спектиномицина по величине и высоте прохождения (ЯГ~0,23)

Подлинность клиндамицина фосфата и бензилового спирта Время выхода пиков клиндамицина и бензилового спирта в образце препарата должно соответствовать времени выхода пиков в стандартном образце

Массовая доля спектиномицина гидрохлорида, % 9,0-11,0

Массовая доля клиндамицина фосфата, % 4,5-5,5

Массовая доля бензилового спирта, % 0,9-1,1

Пирогенность в тест-дозе 1 мл/кг массы кролика Должен быть апирогенен

Стерильность Должен быть стерилен

Предложенные качественные и количественные методы контроля комплексного антибактериального препарата, позволяют обеспечить оптимальный уровень качества лекарственного средства в процессе его производства, хранения и применения.

Результаты изучения стабильности трех экспериментальных серий лекарственного средства показали, что метод «ускоренного старения» не может быть использован для изучения стабильности инъекционной формы препарата вследствие деградации клиндамицина фосфата в условиях повышенной температуры.

Качественные и количественные показатели препарата при хранении его в условиях комнатной температуры в течение 18 месяцев и при многократном отборе раствора из флакона в течение 28 дней оставались без изменения. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было определено, что продуктов распада клиндамицина, наименее стабильного компонента в препарате, в период вышеуказанных сроков не образуется.

Результаты проведенных исследований позволили включить в инструкцию по применению и технические условия срок годности препарата 1,5 года и срок использования флакона с препаратом после его первого вскрытия - 4 недели при хранении при температуре не выше 25°С.

В результате изучения острой токсичности комплексного антибактериального препарата на лабораторных животных нами установлено (таблица 3), что независимо от пути введения, по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12.1.007-76 препарат относится к IV классу опасности - веществам малоопасным (ЛД5О>5000 мг/кг), а в соответствии с классификацией Медведя (1977) -к 4-му классу токсичности - малотоксичным соединениям (ЛД5О>1000 мкг/кг).

Табл. 3. Токсикологические параметры препарата

Максимально переносимая доза, мг/кг лд16, мг/кг лд50, мг/кг лд84, мг/кг Абсолютно смертельная доза, мг/кг

Внутрибрюшинно

1590 4305 8878 (5969 — 10399) 11450 10600

Подкожно

10600 13813 16309 (14562 - 18266) 18806 21200

Перорально

21200 28260 47091 (37976-58392) 65921 >65921

При изучении субхронической токсичности препарата на лабораторных животных было определено, что суммарно введенная в течение 20 дней доза

препарата (65240 мг/кг) не вызывала гибели мышей, поэтому точно рассчитать коэффициент кумуляции не представлялось возможным. Но, учитывая, что эта доза в 4 раза больше среднесмертельной дозы (16309 мг/кг) при однократном введении, по классификации Л.И. Медведя (1968) препарат предположительно можно отнести к веществам с умеренной кумуляцией (КкуМ 3-5).

Достоверное (р<0,05) по сравнению с контрольной группой снижение прироста массы мышей опытных групп, установленное на 14 и 21 сутки, при введении препарата во всех испытанных дозах свидетельствует об угнетении темпов анаболических процессов в организме грызунов при длительном применении лекарственного средства.

Нарушение компенсаторно-приспособительных способностей организма мышей (таблица 4) при введении препарата в дозе 1/5 ЛД5о(3262 мг/кг) выражалось достоверным (р<0,05) по сравнению с контролем уменьшением продолжительности их плавания на 21 день опыта, что, очевидно, связано с угнетением препаратом в наивысшей дозе биохимических реакций в печени, ведущем к снижению скорости утилизации продуктов обмена, образующихся вследствие мышечной нагрузки.

Табл. 4. Влияние комплексного антибактериального препарата на функциональное состояние организма мышей

№ группы Доза препарата Продолжительность плавания (минуты) Время сна (минуты)

21 сутки 31 сутки 21 сутки 31 сутки

1 1/5 ЛДзо 9,36±0,46* 14,53+0,46 37,26+1,88* 32,2912,03

2 1/10 лд50 12,51±0,54 15,26±0,49 39,1013,17* 32,3412,37

3 1/20 ЛД50 12,56±0,67 15,40±0,44 32,10±1,53 33,1812,17

4 Контроль 13,15±0,55 15,00±0,50 28,3112,30 30,2312,17

* - р<0,05

При оценке детоксицирующей функции печени было установлено, что препарат в дозах 1/5 (3262 мг/кг) и 1/10 ЛД50 (1631 мг/кг) вызывает функциональные изменения, выражающиеся достоверным (р<0,05) по сравнению с контролем увеличением продолжительности гексеналового сна мышей на 21 день опыта (таблица 4) Видимо, высокие дозы препарата ингибируют активность микросомальных ферментов гепатоцитов, что приводит к снижению темпов разрушения гексенала, проявляющемся в увеличении времени сна. Увеличение (р<0,05) весовых коэффициентов печени мышей при длительном введении препарата в этих же дозах (1/5 и 1/10 ЛДзо) подтвердило его гепатотоксическое влияние на организм грызунов.

Все изменения в организме мышей, вызванные двадцатидневным введением комплексного антибактериального препарата в высоких дозах, носили обратимый характер, о чем свидетельствует восстановление функций организма животных до нормы через 10 суток после прекращения применения препарата.

В процессе изучения субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата на телятах гибели животных не отмечали.

Физиологические показатели (температура тела, частота дыхательных движений и сердечных сокращений) телят, а также основные клинические показатели крови (таблица 5) (за исключением количества тромбоцитов) в течение опыта находились в пределах физиологической нормы и достоверно (р>0,05) не отличались от контроля.

Двадцатидневное введение препарата в двух с половиной кратной терапевтической дозе приводило к достоверному (р<0,05) по сравнению с контролем уменьшению количества тромбоцитов в крови животных.

Табл. 5. Клинические показатели крови телят на 21 сутки опыта

Исследуемые показатели Группа животных

Пятикратная терапевтическая доза 2,5-кратная терапевтическая доза Терапевтическая доза Контроль

Гемоглобин, г/л 107,00±7,24 108,00±5,23 107,75±9,23 101,50±5,43

Гематокрит, % 28,48±2,08 31,43±2,13 29,98±2,66 28,03±0,96

Цветной показатель 0,90±0,09 0,85±0,06 0,79±0,11 0,86±0,12

Эритроциты, млн./мкл 8,02±0,35 8,29±0,54 7,67±0,37 7,36±0,54

Лейкоциты, тыс./мкл 7,00±0,90 8,20±0,34 7,80±0,76 6,98±0,45

Тромбоциты, тыс./мкл 458,75±76,52 392,33±32,13* 425,00±26,67 454,25±28,40

*- р<0,05

Учитывая, что данный эффект не являлся дозозависимым, и количество тромбоцитов находилось в пределах физиологической нормы (260-700 тыс./мкл), полученные результаты могут указывать только на тенденцию возможного угнетающего влияния препарата на гемопоэз при длительном применении.

Содержание общего билирубина в сыворотке крови телят на 21 сутки соответствовало физиологической норме (таблица 6), что свидетельствует об отсутствии влияния препарата на экскреторную функцию печени.

Наблюдаемое на 21 сутки опыта достоверное (р<0,05) повышение активности ACT в пределах физиологической нормы (45,3-110,2 мкмоль/л) в сыворотке крови телят всех опытных и контрольной групп в 1,4-1,5 раз по сравнению с показателем до начала введения, очевидно, было связано с физиологической перестройкой в организме растущих животных, а не с токсическим влиянием препарата. Тем более нарушение функционального состояния печени чаще всего сопровождается одновременным повышением активности ACT и AJIT. Однако активность АЛТ после двадцатидневного введения комплексного

антибактериального препарата у всех животных находилась в пределах физиологической нормы и не была повышена по сравнению с аналогичным показателем до введения препарата.

Табл. 6. Влияние препарата на функциональное состояние печени и почек телят

Показатель Пятикратная терапевтическая доза 2,5-кратная терапевтическая доза Терапевтическая доза Контроль

До введения

Общий билирубин, мкмоль/л 4,75±0,63 4,00±0,72 5,00±0,72 4,50±0,72

АЛТ, мкмоль/л 22,75±5,16 24,00±7,60 31,25±6,60 23,00±5,79

ACT, мкмоль/л 55,25±7,15 62,75±7,06 50,25±7,06 52,50±6,51

Креатинин, мкмоль/л 115,50±11,58 107,00±3,62 103,25±7,78 96,25±7,78

Мочевина, ммоль/л 6,43±0,86 6,90±0,62 8,80±1,64 8,20±2,71

На 21 сутки

Общий билирубин, мкмоль/л 5,00±0,36 5,66±1,93 4,75±0,63 5,50±0,72

АЛТ, мкмоль/л 28,00±5,79 28,67±б,58 31,35±5,15 25,75±4,61

ACT, мкмоль/л 83,25±9,23* 87,67±3,10* 70,75±7,05* 83,25±5,61*

Креатинин, мкмоль/л 94,75±4,43 93,25±4,25 91,67±6,20 89,75±2,71

Мочевина, ммоль/л 8,70±0,44 8,80±0,92 8,47±0,91 8,40±0,43

*- р<0,05

Отсутствие гепатотоксического действия препарата на организм телят подтвердили результаты гистологических исследований, не выявившие каких-либо патологических изменений в ткани печени животных опытных групп даже при введении лекарственного средства в пятикратной терапевтической дозе в течение 20 дней.

При длительном введении препарат не оказывал негативного влияния на функциональное состояние почек животных, о чем свидетельствовали физиологические уровни содержания креатинина и мочевины в сыворотке крови телят

опытных групп (таблица 6) и отсутствие патологических изменений в почечной ткани животных.

При гистологическом исследовании было установлено, что даже в пятикратной терапевтической дозе внутримышечное введение препарата не вызывает деструктивных изменений мышечных волокон, что свидетельствует об отсутствии его местно-раздражающего действия.

Результаты оценки безопасности комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина для телят при его двадцатидневном введении в терапевтической дозе и дозах, превышающих терапевтическую в 2,5 и 5 раз (соответственно 15, 37,5 и 75 мг/кг массы тела по сумме действующих веществ), показали, что лекарственное средство не оказывает токсического действия на организм животных.

Выявленное в конце опыта снижение количества тромбоцитов в пределах физиологической нормы свидетельствует о возможном угнетающем влиянии препарата при длительном применении на гемопоэз, что было учтено при разработке инструкции по применению лекарственного средства.

Учитывая, что комплексный антибактериальный препарат на практике будет применяться не более 5 дней, даже при случайной передозировке лекарственного средства проявление побочного действия практически исключается.

Фармакокинетические исследования показали, что уже через 15 минут после внутримышечного введения клиндамицин обнаруживался в крови телят в концентрациях, в 5-10 раз превышающих антибактериальные (график 1), что, учитывая бактерицидный характер действия его в высоких концентрациях, позволяет контролировать развитие устойчивых штаммов. Уровень клиндамицина, достаточный для ингибирования чувствительных микроорганизмов, в т.ч. микоплазм, сохранялся в сыворотке до 18 часов

График 1. Фармакокинетика клиндамицина в сыворотке крови телят

■с 3,25

I з

я 2,75 I 2,5 I 2,25

| 1,75

5 1'5 ? 1,25

I 1

га 0,75 £ 0,5 § 0,25

§ о

* 012345678 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Время после введения, ч

Концентрация спектиномицина в сыворотке достигала антибактериальных значений для большинства чувствительных микроорганизмов через 15-30 минут (график 2) и, учитывая взаимоусиливающее действие антибиотиков, установленное нами ранее в опытах in vitro, поддерживалась в крови в ингиби-рующих концентрациях до 9 ч.

График 2. Фармакокинетика спектиномицина в сыворотке крови телят

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Время после введения, ч

Полученные средние значения концентраций клиндамицина и спектиномицина в сыворотке крови телят, изменяющиеся во времени, подвергались фармакокинетической оценке методом последовательного логарифмирования и описывались в рамках двухкамерной модели с учетом всасывания следующим уравнением:

С = Ae'at + Be pt -

(А+В)е

где С - концентрация антибиотика в сыворотке;

А и В - величины отрезка на оси ординат при экстраполяции прямой к моменту времени 1=0 в фазу распределения и элиминации, соответственно; а, р, к, е - фармакокинетические константы.

Фармакокинетические параметры клиндамицина и спектиномицина характеризовались высокими значениями максимальных концентраций (Стах-2,89 и 28,27 мкг/мл, соответственно) и быстрым временем их достижения (1тах=45 мин).

Очевидно, малый объем распределения спектиномицина в периферических тканях (Ус155=286 мл/кг) при одновременно малой степени связывания с белками крови (6-8,5%) объясняется тем, что вследствие высокой ионизации и низкой липофильности антибиотик слабо проникает через клеточные мембраны, попадая, главным образом, в межклеточное пространство. Короткий период

полувыведения спектиномицина (11/2р-130,7мин) обусловлен его высокой водо-растворимостью, вследствие чего он выводится из организма за счет гломеру-лярной фильтрации, не подвергаясь биотрансформации.

Высокий показатель объема распределения клиндамицина в периферической (Vdss=5202,9 мл/кг) камере свидетельствует о его хорошем проникновении в клетки тканей, что позволило нам прогнозировать высокую эффективность препарата в отношении микоплазм, являющихся внутриклеточными паразитами. Достаточно продолжительный период полувыведения (ti/2p=330,8 мин) клиндамицина фосфата, очевидно, объясняется постепенным гидролизом антибиотика щелочной фосфатазой крови до активной формы, а также постепенным высвобождением его из белковых комплексов в крови.

Учитывая, что клиндамицин и спектиномицин in vitro обладают постантибиотическим эффектом, проявляющемся в продолжении подавления роста бактерий при удалении антибиотиков из инкубационной среды (S.C. Ebert, W.A. Craig, 1990; R.E. Lewis, M.E. Klepser, 1998), мы предположили, что препарат оказывает антибактериальный эффект в организме телят при его назначении с более длительными интервалами введения по сравнению с рассчитанными. Как было позже подтверждено в производственных условиях, применение препарата с 24 часовым интервалом оказалось эффективным при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

При изучении сроков выведения антибиотиков из организма телят после курсового пятидневного применения препарата в дозе 15 мг/кг массы тела было установлено, что клиндамицин не накапливался и достаточно быстро выводился из организма животных. На третьи сутки его обнаруживали в печени, почках, месте инъекции, легких, жире в концентрациях 0,14-0,21 мкг/г, а на 14 сутки его содержание во всех исследованных биосубстратах было ниже предела количественного определения метода (0,08 мкг/г). Спектиномицин обнаруживали в организме телят на 3 и на 14 сутки после окончания курсового применения препарата. Причем наибольшие его количества регистрировали в месте инъекции и в почках. Через 3 недели содержание спектиномицина во всех исследованных биосубстратах находилось ниже предела количественного определения метода (0,1 мкг/г), что дало основание рекомендовать использовать в пищу человека мясо и субпродукты телят, не ранее, чем через 21 день после окончания курсового применения препарата.

При изучении терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина в производственных условиях было установлено, что при введении один раз в сутки в течение 3-5 дней в дозе 0,5 мл/10 кг массы тела (7,5 мг/кг по сумме действующих веществ) лекарственное средство оказалось недостаточно эффективным и обеспечивало сохранность только 89,7% животных (таблица 7).

Увеличение дозы препарата до 1,0 и 1,25 мл/10 кг массы тела (15 и 18,75 мг/кг по сумме действующих веществ) приводило к повышению эффективности лечения бронхопневмонии телят до 96,3 и 96,9 % соответственно, при этом достоверных различий в эффективности применения этих доз не установлено (р>0,05).

Эффективность применения препарата на основе клиндамицина и спекти-номицина в дозах 1,0 и 1,25 мл/10 кг массы тела превышала эффективность лечения телят препаратами сравнения на 2,4-6,9%, а курс лечения при этом сокращался на 0,8-3,3 дня.

Табл. 7. Эффективность комплексного антибактериального препарата при бронхопневмонии бактериальной этиологии у телят

Показатели Препарат на основе

клиндамицина и 2 2 Я к а к Е(

спектиномицина О. С л К к о. <0

0,5 1,0 1,25 -ел ч « О. н

мл/10 мл/10 мл/10 со и ч >,

кг кг кг

Количество животных, голов 39 178 185 40 66 69

Продолжительность лечения, дней 7,4±0,5 4,2±0,8 4,0±0,7 7,3±0,7 4,0±0,5 5,0±0,7

Эффективность, % 89,7 96,3 96,9 90,0 93,9 91,3

Таким образом, результаты изучения терапевтической эффективности в производственных условиях позволяют считать, что разработанное нами комплексное антибактериальное лекарственное средство на основе клиндамицина и спектиномицина в дозе 1,0 мл/10 кг массы тела (15 мг/кг по сумме действующих веществ) при внутримышечном введении один раз в сутки в течение 3-5 суток может быть использовано для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Результаты проведенных нами исследований по разработке лекарственной формы, методов контроля качества, изучению антибактериальных, фарма-ко-токсикологических свойств и терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина были использованы при разработке технических условий и инструкции по применению лекарственного средства в ветеринарии.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина в форме раствора для инъекций для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии. Комбинация клиндамицина и спектиномицина обладает взаимоусиливающим действием в отношении грамположительных (стафилококки, стрептококки) и грамотрица-тельных (пастереллы, сальмонеллы, эшерихии) микроорганизмов. Установлено,

что минимальная подавляющая концентрация каждого из антибиотиков в присутствии другого снижается в 2-8 раз в зависимости от вида чувствительного микроорганизма.

2. Комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина отвечает стандартным требованиям, предъявляемым к инъекционным лекарственным формам, и стабилен в течение 18 месяцев при хранении в условиях комнатной температуры и в течение 28 суток после первого вскрытия флакона.

3. Комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина по параметрам острой токсичности независимо от пути введения (перорально, подкожно, внутрибрюшинно) согласно ГОСТ 12.1.007-76 относится к IV классу опасности - веществам малоопасным. ЛД50 для белых мышей при пероральном введении составляет 47091 мг/кг, при подкожном введении - 16309 мг/кг, при внутрибрюшинном введении - 8878 мг/кг.

4. Двадцатидневное введение комплексного антибактериального препарата в форме раствора для инъекций в дозе 1/5 от ЛД50 приводит к временному нарушению компенсаторно-приспособительных способностей, а в дозах 1/5 и 1/10 от ЛД50 к временному нарушению детоксицирующей функции печени белых мышей, восстанавливающихся через 10 дней после прекращения применения препарата.

5. Двадцатидневное введение комплексного антибактериального препарата в терапевтической дозе и в дозах, в 2,5 и 5 раз превышающих терапевтическую (соответственно, 15, 37,5 и 75 мг/кг массы тела по сумме действующих веществ), не оказывает токсического действия на организм телят. Снижение количества тромбоцитов в пределах физиологической нормы в конце опыта свидетельствует о возможном угнетающем влиянии препарата на гемопоэз при длительном применении.

6. Фармакокинетика клиндамицина и спектиномицина после однократного внутримышечного введения препарата в дозе 15 мг/кг массы тела характеризуется высокими значениями максимальных концентраций антибиотиков (Сщах клинД=2,89; Стах СПСКТ=28,27 мкг/мл), быстрым временем их достижения (^тах==45 мин), малым объемом стационарного распределения спектиномицина (Ус155=286 мл/кг) и высоким объемом стационарного распределения клиндамицина (Ус155=5202,9 мл/кг) в организме телят.

7. Остаточные количества клиндамицина и спектиномицина после пятидневного внутримышечного введения комплексного антибактериального препарата в дозе 15 мг/кг массы тела полностью выводятся из организма телят через 21 сутки.

8. Комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина в дозе 1 мл/10 кг массы тела (15 мг/кг по сумме действующих веществ) при применении в течение 3-5 дней обладает 94,4-97,6 % эффективностью при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработан и предложен для ветеринарной практики новый комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

2. Результаты исследований нашли отражение в разработанной нормативной документации, переданной для регистрации лекарственного средства в Российской Федерации в Россельхознадзор:

- технических условиях ТУ 9348-054-47611900-2007 «Клиндаспектин раствор для инъекций»;

- инструкции по применению Клиндаспектина раствора для инъекций в ветеринарии.

3. На лекарственное средство, содержащее в качестве действующих веществ клиндамицин и спектиномицин, получен патент РФ на изобретение № 2227741 «Препарат для профилактики и лечения инфекционных заболеваний животных и птиц бактериальной этиологии».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С. Ионов, А. Игнатова, Е. Елисеева. Клиндаспектин - препарат против ассоциированных инфекций. // Птицеводство. - 2005. - № 4. - С. 53-54.

2. Б.В. Виолин, А.Д. Игнатова, И.Д. Игнатова. Изучение токсичности комплексного инъекционного препарата на основе клиндамицина и спектиномицина в опытах на лабораторных животных. // Сборник научных трудов ВГНКИ. - 2006. - Т. 67. - С. 182-188.

3. А.Д. Игнатова, Б.В. Виолин. Изучение субхронической токсичности инъекционной формы клиндаспектина в опытах на телятах. // Аграрная наука,-2006. - № 7. - С. 25-28.

4. С.Н. Ионов, А.Д. Игнатова, E.H. Елисеева. Клиндаспектин при бактериальных инфекциях птиц. // Ветеринария. - 2007. - № 1. - С. 13-17.

Заказ № 99/02/07 Подписано в печать 19 02 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,25

000 "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 " у/ www.cfr.ru ; е-таИ:т/о@с/г.ги

Актуальность проблемы

Бронхопневмония телят наряду с желудочно-кишечными инфекциями занимает основное место в структуре заболеваний молодняка крупного рогатого скота [1, 3,11,20, 111,115, 117].

До 90% телят в послеотъемный период подвержено респираторным инфекциям. Убытки, причиняемые бронхопневмонией, складываются из отставания в росте, снижения привесов, стоимости лекарств, затрат труда на лечение и профилактику заболевания, смертности животных [2, 22, 50, 79]. В отдельных хозяйствах гибель молодняка в совокупности с вынужденным убоем достигает 40-55%, а прирост массы тела у больных и переболевших снижается в 2-3 раза [80, 93].

В возникновении и развитии респираторных заболеваний молодняка важную роль играет бактериальная микрофлора (стрептококки, стафилококки, пастереллы, сарцины, протей, гемофилюс, эшерихии и др.), которая часто осложняет течение вирусных и микоплазменных инфекций [85, 107, 120, 145].

При определенных условиях бактериальная микрофлора является первопричиной для возникновения респираторной патологии (при усилении вирулентности или токсигенности, изменениях ассоциаций микробов, высокой концентрации бактерий и др.) Но обычно микроорганизмы являются вторичным фактором, вызывающим бронхопневмонию, развиваясь после первичного повреждения слизистой респираторного тракта телят вирусами и мико-плазмами [15, 29,152].

Массовые респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота представляют собой сложные инфекционные процессы, в которых на разных стадиях развития патологии принимают участие вирусы, микоплазмы, бактерии и другие возбудители в различных сочетаниях [31].

Химиотерапия респираторных заболеваний, как правило, сконцентрирована на подавлении патогенной микрофлоры [16,18].

Широкое и часто нерациональное применение антибактериальных лекарственных средств при респираторных болезнях телят привело к распространению резистентных микроорганизмов, что является основным фактором, ограничивающим эффективность лечения. В связи с этим возникает необходимость поиска новых эффективных средств для лечения бронхопневмонии телят [44,45, 155, 163].

Учитывая, что бронхопневмония редко протекает в виде моноинфекции, а чаще при участии сочетаний различных патогенов, для ее лечения недостаточно применения одного антибактериального вещества, требуются комплексы антибиотиков, одновременно действующих на всю ассоциацию возбудителей патологического процесса [7, 40, 44, 147].

Клиндамицин, антибиотик группы линкозамидов, высоко активный в отношении грамположительной микрофлоры, микоплазм и анаэробов, в течение 30 лет успешно применяется в медицине для лечения бактериальных инфекций респираторного тракта. [123,129,172,181].

Отсутствие резистентных штаммов и перекрестной устойчивости с большинством других антибактериальных препаратов, хорошая биодоступность при парентеральном пути введения, высокая эффективность, возможность проявления синергизма в комбинации с другими антибиотиками [119, 124, 153, 189], а также то, что клиндамицин ранее не применялся для лечения бактериальных инфекций крупного рогатого скота в Российской Федерации, позволило нам выбрать этот антибиотик в качестве одного из действующих веществ комплексного препарата для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Обладая высокой активностью в отношении грамположительной микрофлоры и анаэробов, клиндамицин не действует на грамотрицательные бактерии [124, 127, 138]. Поэтому, учитывая ассоциативный характер этиологии респираторных инфекций, для расширения спектра антибактериального действия в состав комплексного инъекционного препарата введен спектиноми-цин - антибиотик, подавляющий развитие эшерихий, пастерелл, сальмонелл и других грамотрицательных микроорганизмов [140, 220, 223], а также, по нашим данным, усиливающий антибактериальные свойства клиндамицина.

Разработанный нами комплексный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина обладает широким спектром антибактериального действия в отношении большинства микроорганизмов, играющих роль этиологического фактора в возникновении респираторных заболеваний телят.

Цель работы

Разработать на основе клиндамицина и спектиномицина новый комплексный антибактериальный препарат для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Задачи исследования

- Обосновать состав и разработать лекарственную форму комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина.

- Разработать требования к качеству комплексного антибактериального препарата и методы его контроля.

- Изучить стабильность комплексного антибактериального препарата в процессе хранения.

- Изучить острую токсичность комплексного антибактериального препарата в опытах на лабораторных животных.

- Изучить субхроническую токсичность комплексного антибактериального препарата в опытах на лабораторных животных и телятах.

- Изучить фармакокинетику клиндамицина и спектиномицина в организме телят после применения комплексного антибактериального препарата.

- Определить сроки выведения остаточных количеств клиндамицина и спектиномицина из организма телят после курсового применения препарата;

- Определить терапевтическую эффективность комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина в производственных условиях и разработать схему его применения для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

- На основе результатов исследований разработать технические условия и инструкцию по применению комплексного антибактериального препарата и представить на утверждение в установленном порядке.

Научная новизна

- Впервые разработан комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина в форме раствора для инъекций для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

- Установлено взаимоусиливающее действие комбинации клиндамицина и спектиномицина в отношении грампололсительных и грамотрицатель-ных микроорганизмов; изучены фармако-токсикологические свойства и определена терапевтическая эффективность комплексного антибактериального препарата при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

Практическая значимость работы

- Разработан и предложен для ветеринарной практики новый комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

- Разработаны количественные и качественные методы контроля комплексного антибактериального препарата, позволяющие обеспечить оптимальный уровень качества лекарственного средства в процессе его производства, хранения и применения.

- Установлен срок годности препарата.

- Определены сроки возможного использования в пищу человеку мяса и субпродуктов телят после курсового применения комплексного антибактериального препарата.

- Разработана схема применения комплексного антибактериального препарата при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

- Разработана нормативная документация - технические условия и инструкция по применению комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина.

Основные положение, выносимые на защиту:

- Научное обоснование состава комплексного антибактериального препарата.

- Качественные и количественные методы контроля комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина.

- Результаты изучения стабильности комплексного антибактериального препарата при хранении.

- Результаты изучения острой и субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата в опытах на лабораторных животных и телятах.

- Результаты изучения фармакокинетики клиндамицина и спектиномицина и определения сроков выведения остаточных количеств антибиотиков из организма телят после применения препарата.

- Результаты определения терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

- Практические предложения по применению комплексного антибактериального препарата на основе клиндамицина и спектиномицина в ветеринарии.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

выводы

1. Разработан новый комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина в форме раствора для инъекций для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии. Комбинация клиндамицина и спектиномицина обладает взаимоусиливающим действием в отношении грамположительных (стафилококки, стрептококки) и грамотрицательных (пастереллы, сальмонеллы, эшерихии) микроорганизмов. Установлено, что минимальная подавляющая концентрация каждого из антибиотиков в присутствии другого снижается в 2-8 раз в зависимости от вида чувствительного микроорганизма.

2. Комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина отвечает стандартным требованиям, предъявляемым к инъекционным лекарственным формам, и стабилен в течение 18 месяцев при хранении в условиях комнатной температуры и в течение 28 суток после первого вскрытия флакона.

3. Комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина по параметрам острой токсичности независимо от пути введения (перорально, подкожно, внутрибрюшинно) согласно ГОСТ 12.1.007-76 относится к IV классу опасности - веществам малоопасным. ЛД5о для белых мышей при пероральном введении составляет 47091 мг/кг, ЛД50 при подкожном введении - 16309 мг/кг, ЛД50 при внутрибрюшинном введении - 8878 мг/кг.

4. Двадцатидневное введение комплексного антибактериального препарата в форме раствора для инъекций в дозе 1/5 от ЛД50 приводит к временному нарушению компенсаторно-приспособительных способностей, а в дозах 1/5 и 1/10 от ЛД50 к временному нарушению детоксицирующей функции печени белых мышей, восстанавливающихся через 10 дней после прекращения применения препарата.

5. Двадцатидневное введение комплексного антибактериального препарата в терапевтической дозе и в дозах, в 2,5 и 5 раз превышающих терапевтическую (соответственно, 15, 37,5 и 75 мг/кг массы тела по сумме действующих веществ), не оказывает токсического действия на организм телят. Снижение количества тромбоцитов в пределах физиологической нормы в конце опыта свидетельствует о возможном угнетающем влиянии препарата на гемопоэз при длительном применении.

6. Фармакокинетика клиндамицина и спектиномицина после однократного внутримышечного введения препарата в дозе 15 мг/кг массы тела характеризуется высокими значениями максимальных концентраций антибиотиков (Стах клинд =2,89; СтахСПСКТ=28,27 мкг/мл), быстрым временем их достижения (tmax=45 мин), малым объемом стационарного распределения спектиномицина (Vdss=286 мл/кг) и высоким объемом стационарного распределения клиндамицина (Vdss=5202,9 мл/кг) в организме телят.

7. Остаточные количества клиндамицина и спектиномицина после пятидневного внутримышечного введения комплексного антибактериального препарата в дозе 15 мг/кг массы тела полностью выводятся из организма телят через 21 сутки.

8. Комплексный антибактериальный препарат на основе клиндамицина и спектиномицина в дозе 1 мл/10 кг массы тела (15 мг/кг по сумме действующих веществ) при применении в течение 3-5 дней обладает 94,4-97,6 % эффективностью при лечении респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате проведенных исследований разработано и предложено для использования в ветеринарии новое комплексное антибактериальное лекарственное средство на основе клиндамицина и спектиномицина для лечения респираторных заболеваний телят бактериальной этиологии.

2. Результаты исследований нашли отражение в разработанной нормативной документации (технические условия ТУ 9348-054-476119002007 «Клиндаспектин раствор для инъекций» и инструкция по применению Клиндаспектина раствора для инъекций в ветеринарии), которая передана для регистрации лекарственного средства в Российской Федерации в Рос-сельхознадзор.

3. На лекарственное средство, содержащее в качестве действующих веществ клиндамицин и спектиномицин, получен патент РФ на изобретение № 2227741 «Препарат для профилактики и лечения инфекционных заболеваний животных и птиц бактериальной этиологии».