Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Резистентность гонококка к антибактериальным препаратам у больных неосложненной гонококковой инфекцией и механизмы ее развития

На правах рукописи

ПРИПУТНЕВИЧ ТАТЬЯНА ВАЛЕРЬЕВНА

Резистентность гонококка к антибактериальным препаратам у больных неосложненной гонококковой инфекцией и механизмы ее развития.

14.00.11 - кожные и венерические болезни 03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва - 2005

Работа выполнена в отделе инфекций, передаваемых половым путем и отделе микробиологии Федерального государственного учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Михаил Михайлович Васильев

доктор медицинских наук Сергей Дмитриевич Митрохин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Михаил Александрович Гомберг

доктор биологических наук, профессор Сергей Владимирович Сидоренко

Ведущая организация - Российский государственный медицинский университет дружбы народов (РУДН) г.Москва.

Защита состоится «18» мая 2005 г. на заседании диссертационного совета Д 208.115.01 при Федеральном государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, корп. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Автореферат разослан апреля 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук Н.К.Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы:

Одной из наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), является гонококковая инфекция. Ежегодно в мире регистрируется около 60 миллионов случаев, а в России за 2003 год было зарегистрировано 117 572 случая этого заболевания (Госсанэпиднадзор РФ, 2003).

В диагностике гонореи ведущими остаются бактериоскопический и бактериологический методы, однако не всегда и не везде проводится культуральная диагностика гонореи, что создает дополнительные трудности в разработке системы контроля за распространением этой инфекции. Существенным недостатком в микробиологической диагностике гонореи является отсутствие регионального мониторинга чувствительности N.gonorrhoeae к применяемым антибиотикам и их штаммовой идентификации. Это приводит к увеличению процента мультирезистентных штаммов возбудителя, к изменению их биологических свойств, как следствие возрастает количество рецидивов и неуспехов при использовании общепринятых методов лечения гонореи (Кубанова А.А., 2003).

В настоящее время для лечения гонококковой инфекции применяются различные антимикробные препараты (АМП), и хотя эффективность существующих методов лечения остается высокой, чувствительность гонококка к наиболее активно применяемым антибиотикам значительно снизилась. Еще с середины 70-х годов появились сообщения о выделении штаммов гонококка, устойчивых к пенициллину, тетрациклину, а с начала 90-х - и к фторхинолонам (Гивенталь Н.И., 1979, Беднова В.Н., Зинурова Р.С., 1983, Tanaka M, 1993, Trees D.L, 1994, Ison C.A.,1998). Однако в России проводились лишь единичные исследования по изучению чувствительности гонококков к АМП (Борисен-ко К.К., 1995, Страчунский Л.С., 1998, Сехин СВ., 2000, Колиева Г.Л., 2002).

Сегодня в мире разработана и применяется система серо-и генотипирова-ния штаммов, основанная на биологических и иммунологических характеристиках возбудителя (Fox K.K., Knapp J.S., 1999), что является одним из перспективных направлений. Штаммовое типирование и проведение системного монито-

ринга за резистентностью гонококка к АМП позволит оценить эпидемиологическую картину распространения гонококковой инфекции и разработать стандартные методы её диагностики, определяющие требования по проведению лабораторных процедур, а также разработать методы лечения гонореи с учетом регионального уровня чувствительности N.gonorrhoeae (Кубанова А.А., 2002). В отечественной практике подобных нормативных документов, основанных на доказательствах, до настоящего времени не было, что определяет актуальность, научную новизну и практическую значимость настоящего исследования.

Учитывая вышеизложенное, было целесообразно провести оценку уровня резистентности N. gonorrhoeae к АМП на территории Российской Федерации, с применением клинико-лабораторных и молекулярно-биологических подходов в исследовании.

Цель исследования: Разработать методические подходы к лечению гонококковой инфекции с учетом данных регионального микробиологического мониторинга резистентности и характера генных мутаций гонококка, выделенного от больных гонореей в различных регионах РФ. Задачи исследования:

1. Разработать систему сбора и доставки клинического и биологического материала для исследования на гонококковую инфекцию из регионов Российской Федерации. Усовершенствовать методы выделения и сохранения чистой культуры N. gonorrhoeae;

2. Изучить уровень резистентности N. gonorrhoeae к различным АМП, применяемым для лечения гонококковой инфекции на территории РФ;

3. Сопоставить клинико-микробиологические результаты лечения гонококковой инфекции антибактериальными препаратами с результатами лабораторных исследований по определению к ним чувствительности N.gonorrhoeae;

4. Провести сравнительное типирование штаммов N. gonorrhoeae, полученных от больных из различных регионов РФ, а также определить характер генных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к различным АМП;

5. На основании полученных данных разработать принципы адекватного лечения больных гонококковой инфекцией антибактериальными препаратами в различных регионах РФ. Научная новизна:

• Впервые получены сравнительные данные по изучению частоты выявления резистентных к АМП штаммов N. gonorrhoeae в различных регионах РФ;

• Впервые проведены сравнительные исследования по серо- и генотипиро-ванию штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от больных гонореей из различных регионов РФ;

• Впервые разработаны принципы адекватной терапии гонококковой инфекции антибактериальными препаратами основанные на данных регионального исследования антибиотикорезистентности штаммов возбудителя гонореи. Практическая значимость:

• разработана и внедрена в практическую деятельность отдела микробиологии ФГУ ЦНИКВИ и лабораторий, принимавших участие в региональном мониторинге антибиотикорезистентности гонококка, учетно-отчетная форма (паспорт на штамм N.gonorrhoeae) и создана компьютерная база данных штаммов N.gonorrhoeae;

• разработаны и внедрены в практическую деятельность бактериологических лабораторий, принимавших участие в региональном мониторинге за анти-биотикорезистентностью гонококка, схемы - инструкции по забору и транспортированию клинического материала, по выделению и сохранению чистой культуры N.gonorrhoeae с использованием как отечественных, так и зарубежных питательных сред, а также по определению чувствительности гонококка к АМП;

• разработаны и внедрены в практическую деятельность учреждений участвующих в мониторинге практические рекомендации по лечению больных гонококковой инфекцией антибактериальными препаратами, с учетом уровня резистентности возбудителя в различных регионах РФ;

• полученные результаты генотипирования, собранные в ходе проведения регионального мониторинга штаммов гонококка, могут в дальнейшем быть

применены в молекулярной эпидемиологии для установления происхождения и путей передачи возбудителя. Точное определение серовара позволит прогнозировать возможность трансформации в диссеминированную форму заболевания, а также позволит сделать правильный выбор антибактериальных препаратов для лечения гонореи.

Внедрение результатов исследования в практику:

Результаты проведенных исследований нашли отражение в практической деятельности НКДО ФГУ ЦНИКВИ г. Москвы, ККВД г. Хабаровска и Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунологии.

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Научно - практической конференция ФГУ ЦНИКВИ, - Москва, - апрель 2003г.; 14 Международном конгрессе в Праге, посвященном проблемам клинической микробиологии, - Прага, 3 мая 2003 г; Научном семинаре но проблемам ЗППП в CDC, - Атланта, январь 2005г.

В завершенном виде диссертационная работа обсуждена и одобрена на заседании Апробационной комиссии ФГУ ЦНИКВИ,- Москва, 22 февраля 2005 г. Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана и внедрена в практику отечественного здравоохранения система мониторирования антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae на территории РФ.

2. Изучен уровень антибиотикорезистентности штаммов N. gonorrhoeae на территории РФ.

3. Сопоставление клинико-микробиологических результатов лечения гонококковой инфекции антибактериальными препаратами с результатами лабораторных исследований по определению чувствительности к ним N.gonorrhoeae позволило обнаружить взаимосвязь между эффективностью проведенной терапии и профилем резистентности гонококка к АМП.

4. При проведении типирования выделенных штаммов N. gonorrhoeae установлен характер генных мутаций гонококка, обеспечивающих его антибиотико-резистентность.

5. Разработаны практические рекомендации по лечению больных гонококковой инфекцией антибактериальными препаратами с учетом профиля резистентности гонококка к АМП в различных регионах РФ.

Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав, включающих собственные исследования и их результаты, заключения, выводов, списка литературы и приложений.

Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 таблицами, 26 рисунками и 7 фотографиями.

Указатель литературы состоит из 58 отечественных и 129 зарубежных источников.

Материалы и методы исследования:

Клинико - микробиологическое исследование проводилось на базе ФГУ ЦНИКВИ, КВД № 5, № 18 и № 20 г. Москвы, ККВД г. Хабаровска и Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунологии, НИИ физико - химической медицины МЗ РФ.

Проведено клинико-микробиологическое обследование 245 пациентов с неосложненной гонококковой инфекцией нижних отделов мочеполового тракта, обратившихся в вышеуказанные лечебные заведения, из них 205 мужчин, 36 женщин и 4 детей.

Исследовали клинический материал от больных гонококковой инфекцией различной локализации вне зависимости от пола и возраста. Забор клинического материала производили во время первичного приема пациентов при наличии клинических проявлений гонококковой инфекции одновременно для бак-териоскопической и культуральной диагностики. Для обработки и анализа социально - демографического статуса больных гонореей на каждого пациента заполнялась учетно - отчетная форма: «Индивидуальный паспорт на клиниче-

ский штамм N.gonorrhoeae» пациентов с указанием Ф.И.О, даты забора материала, семейного положения, клинической картины и диагноза заболевания, а также назначенного лечения и исхода заболевания.

Доставка материала из городов РФ осуществлялась различными способами: клинический материал доставлялся в транспортной среде Амиес с углем в течение 24 - 48 (максимум 72) часов; выделенная чистая культура N.gonorrhoeae доставлялась в термоконгейнерах с сухим льдом в течение 24 часов.

Поступивший в лабораторию материал из транспортной среды Амиес (Сорап, Италия) засевали на чашки Петри параллельно с отечественной питательной средой для выделения гонококка ( ФГУП НПО «Микроген», г. Ставрополь) и GC II - agar base (агаровая основа) с добавлением готового бычьего гемоглобина, селективной добавки VCAT (Vancomicin, Colistin, Anisomycin, Trimetoprim), а также комплексной ростовой добавки Iso Vitalex (все составляющие производства компании Бектон Диккинсон, (США)).

Принадлежность выделенных микроорганизмов к виду N.gonorrhoeae подтверждалась следующими тестами: окраской по Граму (Грам - отрицательные кокки), наличием оксидазной активности, биохимическими реакциями с использованием коммерческого набора «Кристал нейссерия/гемофилис» (Бектон Дик-кинсон, США). Учет и интерпретацию результатов видовой идентификации проводили через 6 часов автоматически с использованием анализатора «Кристал Авторидер» (Бектон Диккинсон, США). Все штаммы проверялись на способность продуцировать бета - лактамазу.

Исследовали профиль резистентности к АМП у 153 выделенных штаммов N.gonorrhoeae - 95 из г. Москвы, 24 из г. Хабаровска и 34 из г. Екатеринбурга. Чувствительность к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, эритромицину, цефтриаксону, канамицину - методом серийных разведений в агаре в соответствии с рекомендациями NCCLS (2000г.). Для контроля качества использовали референс - штамм N.gonorrhoeae ATCC 49226. Полученные результаты регистрировались и статистически обрабатывались программой WHONET версии 5.1, (2000г.), а затем заносились в компьютерную базу данных

штаммов N.gonorrhoeae. Чувствительность к спектиномицину определяли диско - диффузионным методом. Интерпретацию полученных результатов проводили с использованием уникальной автоматизированной системы чтения и интерпретации антибиотикограмм «Озирис» (BIO-RAD, США).

Молекулярное типирование штаммов N.gonorrhoeae проводили в лаборатории генной инженерии и иммуногенетики ГУ НИИ ФХМ МЗ РФ методом ПЦР. Продукты амплификации Рог 1 гена очищали с помощью Wizard PCR Preps DNA Purification System (фирма «Promega»). Секвенирование проводили модифицированным методом Сенгера с использованием ABI Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора Ge-

netic Analyzer ("Applied Biosystems", США; "Hitachi", Япония) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Полноразмерную последовательность рог гена получали путем склеивания нуклеотидных фрагментов с использованием программного продукта (Informax, Inc).

Генотип (серотип) исследуемого штамма определяли по принципу максимальной гомологии при сравнении определенной нуклеотидной последовательности рог гена с известными нуклеотидными последовательностями в базах данных EMBL и NCBI. Для идентификации точечных однонуклеотидных полиморфизмов в генах N. gonorrhoeae, ответственных за формирование лекарственной устойчивости, использовали метод минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов амплификации. Для амплификации tet(M) и Ыа генов был использован метод мультипраймерной ПЦР с целью одновременного обнаружения и идентификации различных типов tet M детерминант, присущих N. gonorrhoeae, и плазмид, несущих ген ТЕМ-1 (З-лактамазы. Результаты собственных исследований и их обсуждение: Клиническая характеристика и результаты обследования больных:

Проведен ретроспективный анализ 245 историй болезни пациентов с неосложненной гонококковой инфекцией нижних отделов мочеполового тракта в возрасте от 3 до 66 лет.

Возрастные данные исследуемых больных показали, что наибольшая инфицированность гонококковой инфекцией наблюдалась в возрасте от 18 до 25 лет (мужчины - 41,9%, женщины - 58,3%).

Анализируя семейное положение и наличие постоянного полового партнера, было выяснено, что из 241 взрослых пациентов в браке состояли 79 человек (32,7%), холосты 128 (53,2%) и 34 (14,1%) были разведены. Наличие постоянного полового партнера отмечалось у 103 (42,7%) пациентов, на беспорядочную половую жизнь указали 138(57,3%) человек.

При анализе характера жалоб и клинических проявлений у пациентов с неосложненной гонококковой инфекцией было установлено: наличие уретральных выделений у 205 (100 %) мужчин и 3 (8,3 %) женщин; вагинальные выделения отмечены у 28 (77,7 %) женщин и у 2 (50 %) девочек; покраснение и отечность наружных половых органов у 160 (65,3 %) пациентов; дизурические явления у 147 (71,7 %) мужчин, у 9 (25 %) женщин и у 2 (50 %) девочек; на зуд и жжение в области наружных половых органов предъявляли жалобы 153(74,5 %) мужчины, 23 (63,8 %) женщины и 3 (75 %) девочки.

При анализе анамнестических данных обследуемых пациентов было установлено, что причиной поражения гонококковой инфекцией у 37 (18 %) мужчин явился половой контакт с лицами, практикующими коммерческий секс; случайная половая связь была у 141 (68,7 %) мужчин и у 24 (66,6 %) женщин; половой контакт с постоянным половым партнером - у 27 (13,1 %) мужчин и у 12 (33,3 %) женщин; заражение во время изнасилования 4 детей.

На основании наблюдаемой клинической картины, а также бактериоскопи-ческого и культурального обследования у 147 мужчин (71,7 %) был установлен диагноз - тотальный гонококковый уретрит, а у 58 (28,3 %) - передний гонококковый уретрит. Среди женщин диагноз гонококковый цервицит установлен 5 (23,8 %) пациенткам, гонококковый уретрит - 8 (38 %), гонококковый уретрит и цервицит - 8 (38%).

В соответствии с требованиями исследования, 153 пациента, включенных в наше исследование, были распределены на восемь групп в зависимости от назначенной терапии (табл.1).

Таблица 1.

Антибиотикотерапия пациентов, включенных в исследование, и исход заболевания.

Препараты Количество больных, получивших терапию Результат лечения

Абс. число % Выздоровление Рецидив

Цефалосиорины 69 45,1% 69 (100%)

Спектиномицин 30 19,6% 30(100%) -

Фторхинолоны 16 10,5% 12 (75%) 4 (25%)

Аминогликозиды 20 13,7% 14 (60%) 6 (30%)

Тетрациклины 3 1,9% 3 (100%) -

Макролиды 4 2,6% 4 (100%) -

Пенициллины 3 1,9% - 3 (100%)

П-т не установл. 8 5,2% - -

В результате проведенного лечения клинико - микробиологическое выздоровление отмечено у 140 (91,5%) пациентов, при этом рецидив заболевания отмечен у 13 (8,5%) пациентов

Результаты исследования качества роста N. gonorrhoeae на отечественной питательной среде с применением комплекса антибиотиков.

Нами были проведены исследования по улучшению селективных свойств отечественной питательной среды для выделения гонококков производства ФГУГ1 НПО «Микроген», г. Ставрополь, а также проведены сравнительные исследования качества роста гонококка на отечественных и международно рекомендуемых питательных средах.

Путем применения, вместо ранее используемой селективной добавки, состоящей из линкомицина гидрохлорида и полимиксина М сульфата (в настоящее время этот препарат снят с производства) другого комплекса антибиотиков-

ванкомицин, колистин, анизомицин, триметоприм (УСАТ, производства фирмы «Бектон Диккинсон», США), были повышены селективные свойства отечественной питательной среды.

В результате проведенных исследований на клиническом материале от 52 - х больных гонококковой инфекцией через 24 часа наличие роста гонококка наблюдалось на всех питательных средах в 100% случаев, обильный рост колоний отмечен в 100% случаев на селективных средах отечественного и зарубежного производства, тогда как на неселективной отечественной питательной среде обильный рост отмечался лишь в 85% случаев. Наличие посторонней микрофлоры на селективных средах отмечено не было, тогда как на неселективной отечественной среде в 96% случаев зафиксирован рост К^опоггИоеае в смешанной культуре (стафилококк, стрептококк и др.) (табл.2).

Таблица 2.

Результаты сравнительного бактериологического исследования отделяемого из уретры от 52 больных гонореей мужчин на наличие роста N.gonorrhoeae на отечественной и зарубежной селективных

питательных средах.

Качество роста N.gonorrhoeae Отечественная питательная среда для выделения гонококков производства ФГУП НПО «Микроген», г. Ставрополь Гонококковый шоколадный агар (селективная питательная среда)

селективная неселективная

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

Наличие роста (24ч) 52 100 52 100 52 100

Интенсивное, роста ни 52 100 44 85 52 100

Посторонняя микрофлора 0 0 50 96 0 0

В качестве контроля использовали питательную среду на основе GCII- agar base с гемоглобином, ростовой и селективной добавками (гонококковый шоко-

ладный агар, Бектон Диккинсон, США), а также неселективную среду производства ФГУП НПО «Микроген», г. Ставрополь

Таким образом, исходя из результатов этой части исследования, можно сделать вывод о том, что отечественная среда ФГУП НПО «Микроген», г. Ставрополь, с добавлением селективной добавки VCAT (Бектон Диккинсон, США) может быть использована для выделения чистой культуры N.gonorrhoeae. Сравнение результатов лечения гонококковой инфекции с полученными данными чувствительности N. gonorrhoeae к АМП.

Терапию гонококковой инфекции пенициллинами из 153 исследованных больных получили 3 пациента. Сравнение результатов лечения этих пациентов с данными микробиологического исследования показало, что у всех был отмечен рецидив заболевания и штаммы N.gonorrhoeae, выделенные от этих больных оказались резистентными к пенициллину (МПК составляла 4 мг/мл). При анализе активности пенициллина по отношению ко всем 153 исследованным штаммам гонококка, было установлено, что МПКад составила 4-16 мкг/мл, это явилось дополнительным подтверждением отсутствия эффекта воздействия пенициллина на N.gonorrhoeae.

Учитывая слишком малое количество проанализированных в этом исследовании клинических исходов лечения гонореи пенициллинами, нельзя говорить о 100% вероятности клинических результатов. Вместе с тем результаты микробиологического исследования 153 изолятов, позволившее обнаружить высокий процент резистентности к пенициллину, выделенных штаммов N.gonorrhoeae у подавляющего большинства пациентов, может все же дать основание для рекомендаций не использовать препараты этой группы в лечении гонореи.

Немалую группу составили пациенты, пролеченные препаратами группы аминогликозидов, - 20 (13%) пациентов. У 6 (30%) из них после терапии аминогликозидами наблюдался рецидив заболевания. Микробиологическая оценка резистентности также показала неэффективность канамицина у данных пациентов (МПК составила от 64 до 128 мкг/мл), из чего следует вывод, что ан-

тибиотики данной группы не могут быть рекомендованы для терапии гонококковой инфекции.

Терапию гонореи препаратами тетрациклинового ряда получили 3 пациента. При сравнении клинических результатов лечения заболевания с данными микробиологического исследования, установлено, что в этой выборке пациентов результаты определения чувствительности N.gonorrhoeae к тетрациклину (все 3 штамма оказались чувствительными, МПК - 0,5 мкг/мл) коррелировали с положительным эффектом терапии. Однако утверждение об эффективности этого препарата при лечении гонореи не может являться правомочным в виду недостаточного количества проанализированных случаев. Изучение активности in vitro тетрациклина по отношению ко всем 153 исследованным штаммам показало высокий уровень резистентности гонококка к этому антибиотику (от 41,9% до 63,2%). При этом МПК90 составила 1 мкг/мл. Полученные данные свидетельствуют о том, что препараты данной группы не могут являться специфическими противогонококковыми средствами.

Терапию гонококковой инфекции препаратами фторхинолонового ряда получили 16 пациентов. Позитивный эффект терапии (выздоровление) отмечен у 12 пациентов (75%), негативный (отсутствие эффекта) у 4 (25%) пациентов. Анализ чувствительности всех 153 штаммов к ципрофлоксацину, показал, что резистентность к этому препарату составляла 55 - 70% (в зависимости от региона), МПК90 из 153 выделенных штаммов гонококка находилась в пределах от 16 до 32 мкг/мл. Сравнение данных клинического исхода заболевания с данными микробиологического исследования показало, что эффект лечения зависел от уровня чувствительности N.gonorrhoeae к ципрофлоксацину, при МПК - 8-16 мг/мл наблюдалось отсутствие действия препаратов группы фторхинолонов на данную инфекцию, при низких значениях МПК (< 4) клинико-микробиологическое излечение было достигнуто у всех пациентов.

Терапию гонококковой инфекции препаратами группы макролидов получили 4 пациента. Сравнение данных клинического исхода заболевания с результатами микробиологического исследования показало, что все штаммы оказались

чувствительными к эритромицину (МПК-0,5мкг/мл), при этом исходом заболевания у всех пациентов явилось выздоровление. Анализ резистентности 153 штаммов к эритромицину позволил обнаружить достаточно высокую чувствительность N. gonorrhoeae к этому препарату в г. Москве (86%) и в г. Екатеринбурге (81,1%), при этом резистентность была за счет умеренно-резистентных штаммов, МПК90 составила 1 мкг/мл. Вместе с тем, рекомендации использования макролидов для широкого применения не являются правомочными, т.к. требованием ВОЗ к назначению препарата является его эффективность не менее 95%, что в данном случае не соблюдается.

Терапию гонококковой инфекции спектиномицином получили 30 пациентов. Результаты лечения инфекции (100% выздоровление) четко коррелировали с данными микробиологического исследования (98,7% чувствительных штаммов в общей группе), а в выборке пациентов, пролеченных спектиномицином, -100% штаммов оказались чувствительными к этому препарату. Это подтвердило его эффективность в отношении гонококковой инфекции и обоснованность рекомендаций к использованию спектиномицина при лечении гонореи.

Терапию гонококковой инфекции препаратами цефалоспоринового ряда получили 69 пациентов. Результатом лечения во всех случаях (100%) было выздоровление. Сравнение их с данными микробиологического исследования показало, что МПК для цефтриаксона варьировало в пределах от 0,002 до 0,125 мг/мл что определяло высокую чувствительность

N.gonorrhoeae к данному препарату.

Таким образом, из приведенных данных следует, что на сегодняшний день цефтриаксон является наиболее эффективным препаратом и может быть рекомендован как препарат выбора в лечении гонококковой инфекции. Результаты проведенного регионального мониторинга антибиотикорези-стентности штаммов N. gonorrhoeae.

Результаты проведения исследований по определению профиля резистентности штаммов гонококка, выделенных от 153 больных гонореей, в том

числе от 95 - из г. Москвы, 34 - из г. Екатеринбурга, 24 - из г. Хабаровска представлены на рис. 1.

Наибольшее количество изученных в настоящей работе штаммов N.gonorrhoeae проявляло резистентность по отношению к пенициллину, при этом обнаруживались региональные различия её значений. Так, в г. Хабаровске уровень устойчивых к пенициллину штаммов (95,8%) был самым высоким, тогда как в г. Москве и г. Екатеринбурге - более низким и близким в процентном соотношении (85,9% , 84,9% соответственно). Среди исследованных клинических штаммов N. gonorrhoeae плазмидные гены ТЕМ-1 /3-лактамазы были обнаружены у 11 (11 %) штаммов (6 из г. Москвы, 3 из г. Хабаровска и 2 из г. Екатеринбурга). Такой результат согласуется с данными микробиологического определения чувствительности: для большинства этих штаммов МПК для пенициллина составляет 8 мкг/мл и выше и при постановке теста с нитроцефином наличие /?-лактамазы обнаружено у 11 штаммов.

Отмеченный нами «средний» уровень резистентности N.gonorrhoeae к тетрациклину позволил также выявить ряд региональных различий, заключавшихся в меньшем числе антибиотикорезистентных штаммов в г. Хабаровске (36,8%) в сравнении с г. Москвой и г. Екатеринбургом (соответственно 56 и 58,1%), что может аргументировать дифференцированный подход к терапии гонококковой инфекции этим препаратом в отмеченных регионах.

Рис.1. Совокупный профиль резистентности (I + R) N. gonorrhoeae к АМП(%).

ПЕН - пенициллин ТЕТ - тетрациклин

ЦИП - ципрофлоксацин ЭРИТ - эритромицин ЦЕФ - цефтриаксон

Несколько неожиданной оказалась полученная в процессе исследования высокая резистентность N.gonorrhoeae к представителю группы фторхинолонов -ципрофлоксацину. Сравнение наших данных с результатами, полученными в конце 90-х г.г. Л.С.Страчунским, показали существенное (с 2 % до 60 %) нарастание резистентности гонококка к ципрофлоксацину, что может быть объяснено широкой доступностью и нерациональным использованием этого препарата в клинической практике для терапии гонококковой инфекции. Следует отметить также ряд региональных различий резистентности гонококка к ципрофлоксацину с более высоким уровнем в г. Хабаровске (70,9%) и менее высоким в г. Москве (61,4%) и г. Екатеринбурге (54,6%).

Высокий уровень резистентности штаммов N.gonorrhoeae к эритромицину в г. Хабаровске (33,3%) требует полного исключения этого препарата для лечения гонореи в этом городе. В г. Москве и г. Екатеринбурге штаммы N.gonorrhoeae показали более высокую чувствительность к эритромицину in vitro (85,9% и 84,9), что также не позволяет рекомендовать его использование в указанных регионах.

По отношению к спектиномицину из 153 протестированных штаммов N.gonorrhoeae 98,9% оказались чувствительными. Устойчивыми к данному препарату оказались 3 штамма (1 из г. Москвы и 2 из г. Екатеринбурга), что составило лишь 1,9% от общей выборки.

Проведенные исследования показали, что наиболее активным антибиотиком по отношению ко всем протестированным штаммам N.gonorrhoeae остается цеф-триаксон, МПКад которого по отношению к 153 штаммам (99%) составила 0,06 мкг/мл. Устойчивым к данному препарату оказался 1 штамм (МПК=2 мкг/мл), выделенный из клинического материала от больного из г. Москвы. Это обстоятельство вызывает настороженный интерес, поскольку случаи резистентности N.gonorrhoeae к цефалоспоринам в России ранее не отмечались. Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать ряд заключений: 1. Клиническая эффективность применявшихся в лечении гонореи препаратов в плане «выздоровление» в 100% случаев отмечена у препаратов групп цефтриак-

сона, спектиномицина, тетрациклина и макролидов, а «неудачи в лечении» отмечены у аминогликозидов и пенициллинов.

2. Сравнительный анализ клинико-микробиологических результатов антибактериальной терапии гонореи показал четкую корреляцию с данными лабораторных исследований определения чувствительности N. gonorrhoeae к АМП.

3. На основании определения МПК можно прогнозировать успех, либо неуспех терапии, что переводит определение чувствительности N.gonorrhoeae к АМП в разряд обязательных исследований.

Результаты молекулярно-генетических методов исследования штаммов N. gonorrhoeae.

Проведено типирование 100 клинических изолятов N.gonorrhoeae, выделенных при бактериологическом исследовании у пациентов г. Москвы (60), г. Хабаровска (20), г. Екатеринбурга (20). Суммарные результаты роr-типирования клинических изолятов N.gonorrhoeae приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Генетическая гетерогенность выделенных штаммов

N.gonorrhoeae.

Анализ результатов секвенирования Рог генов обнаружил значительный генетический полиморфизм нуклеотидных последовательностей, выражающийся в обнаружении преобладающего количества штаммов PIB - серовара (87 %) на фоне небольшого числа PIA - серовара (13 %). При проведении сравнительного серотипирования штаммов гонококка, выделенных от больных из различных городов РФ, существенных отличий выявлено не было. На всех территориях значительно преобладал PIB - серовар, более 85% (рис. 2).

Рис. 2. Распределение основных сероваров среди Российской популяции N. gonorrhoeae.

87%

13%

□ PIA ■ PIB

3,5% 3,5%*

9,'

3,5%4'ff,1%

41,4%

26,4%

■ PIB2

■ PIB3

■ PIB3/5 BPIB4

■ PIB5 ШР1В7 ШР1В8 □ PIB9

■ PIB3/6

По некоторым клиническим данным PIA штаммы чаще ассоциированы с диссеминированной формой гонококковой инфекции, тогда как для PIB штаммов характерна мультирезистентность к широкому спектру антибактериальных препаратов. Большинство штаммов из исследованной группы, относящихся к PIA серовару, оказались чувствительными к фторхинолонам и проявляли умеренную, либо полное отсутствие устойчивости к пенициллину и тетрациклину, что подтверждает теорию об отсутствии взаимосвязи PIA - сероваров с резистентностью гонококка к антимикробным препаратам. Однако в нашем исследовании не было отмечено взаимосвязи PIA - сероваров с развитием диссеминированной гонококковой инфекции. С другой стороны, 62% исследованных нами штамма гонококка, проявили устойчивость к представителям более чем одной группы антибиотиков, т.е. оказались мультирезистентными, и превалирование PIB- серова-ра среди них говорит в пользу предположения об ассоциированности PIB - се-ровара с мультирезистентностью.

Молекулярной основой наблюдаемой резистентности служат изменения в белках - поринах, обусловленные генетическими перестройками в Рог гене и приводящие к снижению проницаемости мембраны бактерий для большинства антимикробных препаратов. В исследованной нами выборке 45,3 % штаммов, относящихся к IB серовару, имели соответствующие мутации в локусе, кодирующем 3-ю петлю Рог-белка. При эгом 59 % из них были резистентны в отношении пенициллинов, тетрациклинов и фторхинолонов.

При проведении исследований по изучению молекулярно - биологических механизмов устойчивости выделенных штаммов N.gonorrhoeae нами была установлена зависимость наблюдаемой микробиологической устойчивости с наличием соответствующих механизмов резистентности в исследованных локусах.

Анализ полиморфизма аминокислотной последовательности белка Рог IB показал, что по мере возрастания МПК пенициллина в исследуемых штаммах появляются мутации в 120 и в 121 положениях, ассоциированные со снижением проницаемости клеточной мембраны и, как следствие, с развитием устойчивости к антибактериальным препаратам. Все штаммы, чувствительные к пенициллину (МПК до 0.06 мкг/мл) не имели мутаций ни в одном из проанализированных ло-кусов. Мутация в репА обнаружена в умеренно устойчивых штаммах, что согласуется с литературными данными. Сочетанные мутации в ропА и репА локусах обнаружили также в умеренно устойчивых штаммах с МПК не более 0.5 мкг/мл. Устойчивые штаммы (МПК< 1 мкг/мл) имели значащие мутации во всех трех исследованных локусах (репА, ропА, репВ - мутанты). Следует отметить, что среди штаммов, относящихся к группе CMRNG, все имели тот или иной мутантный генотип по маркерам резистентности к пенициллинам.

По результатам сравнительного анализа представленных в Gene Bank нук-леотидных последовательностей плазмид, содержащих ген tet M детерминанты, подобраны праймеры для выявления всех, встречающихся у N. gonorrhoeae типов плазмид - "American" и "Dutch" - несущих ген устойчивости к тетрациклину. По результатам амплификации в 4 (4%) штаммах выявлены tet M детерминанты.

Наиболее многочисленной оказалась группа штаммов, устойчивость которой к пенициллинам и тетрациклинам обусловлена хромосомными генами (складывается из групп PenR, TetR и CMRNG). В общей сложности процент CMRNG среди обследованных штаммов составил 73 %.

Среди штаммов, устойчивых к ципрофлоксацину, у 25 (53%) были выявлены ранее описанные мутации в генах gyrA и рагС, в районах, детерминирующих устойчивость к фторхинолонам. В белке GyrA обнаруживались в 67 % случаев, в белке РаЮ - в 48 % случаев. Мутации в обеих мишенях присутствовали в

46 % случаев и отсутствовали в 31 % (15 штаммов) случаев. Среди мутаций в белке GyrA преобладали замены S91F, D95G (87,5% от общего числа выявленных мутаций), в белке ParC - S87R (70% от общего числа выявленных мутаций).

Таким образом, проведенные исследования с использованием клинико-микробиологических и молекулярно-генетических методов позволили обосновать причины неуспешного лечения гонококковой инфекции, а также причины возникновения антибиотикорезистентности N.gonorrhoeae как одного из факторов явления. Мы считаем, что полученные данные необходимо учитывать при проведении антибактериальной терапии гонореи, особенно в случаях рецидивов заболевания и при разработке новых противогонококковых препаратов. ВЫВОДЫ:

1. Разработана и внедрена в практику система мониторинга за антибиотико-резистентностью гонококка на территории Российской Федерации. Усовершенствованы методы выделения и сохранения чистой культуры N. gonorrhoeae с последующим определением чувствительности к АМП, используемым в лечении гонореи.

2. По результатам проведенного микробиологического исследования отмечен высокий уровень устойчивости штаммов N.gonorrhoeae к пенициллину и тетрациклину. К ципрофлоксацину и эритромицину отмечен средний уровень устойчивости. Наиболее активными по отношению к N.gonorrhoeae оказались цефтри-аксон и спектиномицин. Отмечены некоторые региональные особенности в профиле резистентности гонококка к АМП.

3. Выявлена зависимость между клинико-микробиологическими значениям исследования пенициллина, препаратов групп аминогликозидов и фторхинолонов и значениями МПК N.gonorrhoeae: при низких значениях МПК успех лечения отмечен у всех пациентов, при высоких - у всех обследованных больных эффект лечения не наблюдался.

4. Сравнительное молекулярное типирование региональных штаммов N.gonorrhoeae, проведенное на основании нуклеотидного полиморфизма рог гена показало генетическую гетерогенность клинических изолятов в Российской по-

пуляции. Преобладание PIB серовара по данным генотипирования согласуется с высоким процентом мультирезистентных штаммов N.gonorrhoeae. Определен соответствующий характер генных мутаций у резистентных к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину штаммов.

5. На основании полученных данных разработаны практические рекомендации по лечению больных гонококковой инфекцией антибактериальными препаратами в соответствии с полученным региональным профилем резистентности к ним штаммов N.gonorrhoeae. Пенициллин и тетрациклин не могут быть рекомендованы для лечения гонореи в городах Хабаровске, Екатеринбурге, Москве. Ци-профлоксацин рекомендуется назначать только после определения к нему индивидуальной чувствительности выделенного от больного штамма гонококка. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Лечение гонококковой инфекции современными антибактериальными препаратами рекомендуется назначать на основании изученного регионального профиля антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae.

2. Показанием к применению антибактериальной терапии больных гонореей является наличие диагноза гонококковой инфекции, установленного на основании данных клинического и микробиологического обследования.

3. Учитывая некоторые региональные различия в результатах по определению профиля резистентности штаммов гонококка, выделенных в Дальневосточном, Уральском и Центральном регионах РФ, лечение в этих районах необходимо проводить дифференцированно:

I. Рекомендации для Дальневосточного региона:

Препаратами выбора в лечении гонококковой инфекции следует определить цефтриаксон и спектиномицин.

Ввиду распространения бета - лактамных штаммов гонококка, штаммов, резистентных к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину, а также муль-тирезистентных штаммов следует исключить из применения в лечении гонококковой инфекции пенициллин, тетрациклин и ципрофлоксацин, эритромицин и канамицин.

В качестве препарата резерва использовать офлоксацин. П. Рекомендации для Уральского и Центрального регионов России:

Препаратами выбора в лечении гонококковой инфекции следует определить цефтриаксон и спектиномицин.

Препараты группы фторхинолонов рекомендуется использовать в резервных случаях. Применять ципрофлоксацин следует только после определения индивидуального профиля резистентности гонококка к этому препарату.

Исключить из применения в лечении гонококковой инфекции пенициллин, тетрациклин и канамицин.

Эритромицин - применять только при непереносимости всех остальных препаратов, либо после определения к нему индивидуального профиля резистентности гонококка.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. А.А.Кубанова, М.М.Васильев, В.М.Говорун, Т.В. Припутневич и др./ Современные подходы к типированию штаммов N.gonorrhoeae // Вестник дерматологии и венерологии.: Москва.-2004г.-№№1.-С.4-8.

2. А.А.Кубанова, М.М.Васильев, Т.В. Припутневич и др./ Антибиотикорези-стентность in vitro штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от больных неосложнен-ной гонококковой инфекцией.// Вестник дерматологии и венерологии.: Москва.-2005г.-№2.-С.40-44.

3. АА.Кубанова, М.М.Васильев, А.А.Кубанов, Т.В. Припутневич и др./ Микробиологический мониторинг антибиотикорезистентности гонококков в г.Москве и Московской области.// Тезисы научных работ I Российского конгресса дерматовенерологов.: Санкт -Петербург.-2003г.-том 2,- С. 14.

4. С.Д.Митрохин, М.М.Зубков, Т.В. Припутневич./ Резистентность N.gonorrhoeae к антимикробным препаратам в Москве и Московской области.// Тезисы V Российская конференция «Современные проблемы антимикробной химиотерапии». -Москва.-2003г.-С.7-8.

5. А.А.Кубанова, М.М.Васильев, В.И.Кисина, Т.В. Припутневич и др./ Резистентность N.gonorrhoeae к антимикробным препаратам в различных регионах

РФ и результаты генотипрования.// Тезисы Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов».- Нижний Новгород.-2004.-С. 69.

6. М.М.Васильев, Т.В. Припутневич, Т.Е.Вахнина и др./Сравнительное исследование антибиотикорезистентности N.gonorrhoeae, выделенных от больных не-осложненной гонореей в Москве и Хабаровске.// Тезисы VIII Всероссийской конференции дерматовенерологов «Новые технологии в организации дерматологической помощи населению Российской Федерации». Москва.- 2004.-С. 29-30.

7. Kubanova A.A., Zubkov M.M., Piiputnevich T.V./ Antimicrobial Resistance of Neisseria gonorrhoeae and Emerging Fluoroquinolone Resistance in Russia.// 14 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases.-Praga.- 2004.

Подписано в печать 14.04.05. Заказ № 64. Тираж 140 экз.

ООО "Фирма Печатный двор" г. Москва Лопухинский пер.,6 Тел.:269-80-41

0G5

Актуальность проблемы:

Инфекции, передаваемые половым путем (ШИШ), несмотря на растущий уровень жизни, остаются важной медико-социальной проблемой как в развитых, так и в развивающихся странах. Согласно данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 340 млн. больных ИППП [30]. В России количество зарегистрированных случаев ИППП в 2003 году составило 933579 человек [48].

Одной из наиболее распространенных инфекций является гонорея.

Ежегодно в мире регистрируется около 60 миллионов случаев этого заболевания, а в России за 2003 год было зарегистрировано 117 572 или 82,5 случаев на 100 ООО населения [31, 46, 48].

Гонорея, несмотря на наличие эффективных противогонококковых препаратов, считается трудно контролируемым заболеванием: во многом этому способствуют сложившаяся в России и странах СНГ экономическая и демографическая ситуация (снижение социально — экономического уровня жизни населения, создание рынка интимных услуг, наличие неконтролируемых миграционных потоков населения). Отчасти распространению инфекции способствует отсутствие возможностей применения современных методов выявления и типирования N. gonorrhoeae [30].

В диагностике гонореи ведущими остаются бактериоскопический и бактериологический методы, однако не всегда и не везде проводится куль-туральная диагностика гонореи, что создает дополнительные трудности в разработке системы контроля за распространением этой инфекции [11].

Существенным недостатком в микробиологической диагностике гонореи является отсутствие регионального мониторинга чувствительности гонококков к применяемым антибиотикам и штаммовой идентификации N.gonorrhoeae. Это приводит к увеличению процента мультирезистентных штаммов возбудителя, к изменению их биологических свойств, как следствие возрастает количество рецидивов и неуспехов в применении традиционной терапии.

В настоящее время для лечения гонококковой инфекции применяются различные антибактериальные препараты (пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, фторхинолоны и др.), и хотя эффективность существующих методов лечения остается высокой, чувствительность гонококка к наиболее активно применяемым антибиотикам за последние годы значительно снизилась [4, 12, 13, 19, 22, 26,31]. Участились случаи рецидивов и осложнений после лечения [10,24,26,28,31,36].

Несмотря на большую медицинскую и социальную значимость гонореи и появление в мировой литературе еще с середины 70-х годов сообщений о выделении штаммов гонококка, устойчивых к пенициллину, тетрациклину, а с начала 90-х и к фторхинолонам [28, 58, 59, 64, 67, 69, 72, 100, 104, 159], в России проводились лишь единичные исследования по изучению чувствительности гонококков к антибактериальным препаратам [8, 24, 29, 36, 46]. Это связано с фактическим отсутствием как культуральной диагностики, так и стандартов по исследованию антибиотикорезистентности.

Современное развитие медицины подразумевает использование во врачебной практике новых методов и подходов к диагностике и лечению гонококковой инфекции.

Сегодня в мире разработана и применяется система типирования штаммов, основанная на биологических и иммунологических характеристиках возбудителя (A\S типирование). В основу этого подхода положено определение типа питания (ауксотипа) и серотипа возбудителя [123].

Наиболее информативным подходом к генотипированию N.gonorrhoeae признано мультилокусное секвенирование Рог I гена, что позволяет дискриминировать клинические изоляты гонококка аналогично определению серотипа. В ходе подобных исследований появляется возможность контролировать эпидемиологическую картину распространения гонококковой инфекции, проводить сравнительную характеристику гетерогенности популяции

N.gonorrhoeae в разных географических регионах, отслеживать генетиче7 скую изменчивость штаммов гонококка в ходе культивирования, при заражении полового партнера, при проведении курса антибиотикотерапии [21, 33].

Штаммовое типирование и проведение комплексного определения чувствительности к наиболее применяемым в настоящее время антимикробным препаратам позволит оценить эпидемиологическую картину распространения гонококковой инфекции и разработать стандартные протоколы лабораторного обследования и терапии пациентов [21, 30].

Таким образом, целью настоящего исследования явилось: Разработать методические подходы к лечению гонококковой инфекции с учетом данных регионального микробиологического мониторинга резистентности и характера генных мутаций гонококка, выделенного от больных гонореей в различных регионах РФ.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Разработать систему сбора и доставки клинического и биологического материала для исследования на гонококковую инфекцию из регионов Ррс-сийской Федерации. Усовершенствовать методы выделения и сохранения чистой культуры N. gonorrhoeae;

2. Изучить уровень резистентности N. gonorrhoeae к различным АМП применяемым для лечения гонококковой инфекции на территории РФ;

3. Сопоставить клинико-микробиологические результаты лечения гонококковой инфекции антибактериальными препаратами с результатами лабораторных исследований по определению к ним чувствительности N.gonorrhoeae;

4. Провести сравнительное генотипирование штаммов N. gonorrhoeae, полученных от больных из различных регионов РФ, а также определить характер генных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к различным АМП;

5. На основании полученных данных разработать принципы адекватного лечения гонококковой инфекции антибактериальными препаратами в различных регионах РФ.

Научная новизна работы:

Впервые получены сравнительные данные по изучению частоты выявления резистентных к АМП штаммов N. gonorrhoeae в различных регионах/РФ;

Впервые проведены сравнительные исследования по серот и генотипированию штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от больных гонореей из различных регионов РФ;

Впервые разработаны принципы адекватной терапии гонококковой инфекции антибактериальными препаратами основанные на данных регионального исследования антибиотикорезистентности штаммов возбудителя гонореи.

Практическая значимость: разработана и внедрена в практическую деятельность отдела микробиологии ФГУ ЦНИКВИ и лабораторий, принимавших участие в региональном мониторинге антибиотикорезистентности гонококка, учетно-отчетная форма (паспорт на штамм N.gonorrhoeae); создана компьютерная база данных штаммов N.gonorrhoeae, используемая в мониторинге за антибиотикорезистентностью гонококка; разработаны и внедрены в практическую деятельность бактериологических лабораторий, принимавших участие в региональном мониторинге за антибиотикорезистентностью гонококка, схемы - инструкции по забору и транспортировке клинического материала, по выделению и сохранению чистой культуры N.gonorrhoeae с использованием как отечественных, так и зарубежных питательных сред, а также по определению чувствительности гонококка к АМП; разработаны и внедрены в практическую деятельность учреждений участвующих в мониторинге практические рекомендации по лечению больных гонококковой инфекцией антибактериальными препаратами, с учетом уровня резистентности возбудителя в различных регионах РФ; ■ полученные результаты генотипирования, собранные в ходе проведения регионального мониторинга штаммов гонококка, могут в дальнейшем быть применены в молекулярной эпидемиологии для установления происхождения и путей передачи возбудителя. Точное определение серовара позволит прогнозировать возможность трансформации в диссеминированную форму заболевания, а также позволит сделать правильный выбор антибактериальных препаратов для лечения гонореи.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В результате проведенной работы разработаны схемы-инструкции по методам забора и транспортирования клинического материала, по выделению и сохранению чистой культуры N. gonorrhoeae, а также по определению чувствительности гонококка к АМП. Повышены селективные свойства отечественной питательной среды для выделения гонококка производства ФГУП НПО «Микроген», г. Ставрополь.

2. Изучен уровень антибиотикорезистентности штаммов N. gonorrhoeae на территории РФ, был отмечен высокий уровень устойчивости штаммов N.gonorrhoeae к пенициллину и,тетрациклину. К ципрофлоксацину и эритромицину отмечен средний уровень устойчивости. Цефтриаксон и спектино-мицин показали наибольшую активность по отношению к N.gonorrhoeae. Отмечены некоторые региональные особенности в профиле резистентности гонококка к АМП.

3. Проведено сопоставление данных клинического исхода гонококковой инфекции после лечения антибактериальными препаратами с результатами лабораторных исследований по определению чувствительности к ним N.gonorrhoeae, в результате чего обнаружена корреляция эффективности проведенной терапии с микробиологическим профилем резистентности гонококка к АМП. Выявлена зависимость между клинико

10 микробиологическими значениями исследования пенициллина, препаратов групп аминогликозидов и фторхинолонов и значениями МПК N.gonorrhoeae: при низких значениях МПК успех лечения отмечен у всех пациентов; при высоких значениях МПК у всех обследованных больных эффект лечения не наблюдался.

4. При проведении типирования выделенных штаммов N. gonorrhoeae, а также определения характера генных мутаций, обусловливающих устойчивость к различным АМП, был установлен характер генных мутаций, соответствующий известным механизмам развития антибиотикорезистентности гонококка.

5. Разработаны схемы лечения гонококковой инфекции антибактериальными препаратами с учетом профиля резистентности к ним N.gonorrhoeae в различных регионах РФ.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения:

Результаты проведенных исследований нашли отражение в практической деятельности НКДО ФГУ ЦНИКВИ г. Москвы, ККВД г. Хабаровска и Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунологии.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Научно - практической конференция ФГУ ЦНИКВИ. - Москва.- апрель 2003г.; 14 Международном конгрессе в Праге, посвященном проблемам клинической микробиологии,- Прага, 3 мая 2003г; На научном семинаре по проблемам ЗППП в CDC.- Атланта, январь 2005г.

В завершенном виде диссертационная работа обсуждена и одобрена на заседании Апробационной комиссии ФГУ ЦНИКВИ.- Москва, 22 февраля 2005 г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав, включающих собственные исследования и их результаты, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана и внедрена в практику система мониторинга за антибиотикорезистентностью гонококка на территории РФ. Усовершенствованы методы забора и транспортировки клинического материала от больного, выделения и сохранения чистой культуры N. gonorrhoeae, с последующим определением чувствительности к АМП, используемым в лечении гонореи.

2. По результатам проведенного микробиологического исследования отмечен высокий уровень устойчивости штаммов N.gonorrhoeae к пенициллину и тетрациклину. К ципрофлоксацину и эритромицину отмечен средний уровень устойчивости. Наиболее активными по отношению к N.gonorrhoeae оказались цефтриаксон и спектиномицин. Отмечены некоторые региональные особенности в профиле резистентности гонококка к АМП.

3. Выявлена зависимость между клинико-микробиологическими значениям исследования пенициллина, препаратов групп аминогликози-дов и фторхинолонов и значениями МПК N.gonorrhoeae: при низких значениях МПК успех лечения отмечен у всех пациентов; при высоких - у всех обследованных больных эффект лечения не наблюдался.

4. Сравнительное молекулярное типирование региональных штаммов N.gonorrhoeae, проведенное на основании нуклеотидного полиморфизма рог гена показало генетическую гетерогенность клинических изолятов в Российской популяции. Преобладание PIB серовара по данным генотипирования согласуется с высоким процентом мультирези-стентных штаммов N.gonorrhoeae. Определен соответствующий характер генных мутаций у резистентных к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину штаммов.

5. На основании полученных данных разработаны практические рекомендации по лечению больных гонококковой инфекцией антибактериальными препаратами в соответствии с полученным региональным профилем резистентности к ним штаммов N.gonorrhoeae. Пенициллин и тетрациклин не могут быть рекомендованы для лечения гонореи в городах Хабаровске, Екатеринбурге, Москве. Ципрофлоксацин рекомендуется назначать только после определения к нему индивидуальной чувствительности выделенного от больного штамма гонококка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ТЕРАПИИ

ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ С УЧЕТОМ РЕГИОНАЛЬНОГО УРОВНЯ АНТИ-БИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ N.GONORRHOEAE. Принцип метода:

Лечение гонококковой инфекции современными антибактериальными препаратами назначается на основании результатов мониторинга региональной антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae.

Показания и противопоказания к применению метода.

Показанием к применению антибактериальной терапии больных гонореей является наличие диагноза гонококковой инфекции, установленного на основании данных клинического и микробиологического обследования.

Противопоказанием к применению антимикробных препаратов является их индивидуальная непереносимость.

Учитывая некоторые региональные различия в результатах по определению профиля резистентности штаммов гонококка, выделенных в Дальневосточном, Уральском и Центральном регионах РФ, лечение в этих районах необходимо проводить дифференцированно.

I. Рекомендации для Дальневосточного региона: Препаратами выбора в лечении гонококковой инфекции следует определить цефтриаксон и спектиномицин.

Ввиду распространения бета - лактамных штаммов гонококка, штаммов, резистентных к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину, а также мультирезистентных штаммов следует исключить из применения в лечении гонококковой инфекции пенициллин, тетрациклин и ципрофлоксацин.

В качестве препарата резерва использовать офлоксацин.

Лечение неосложненной гонококковой инфекции. Препараты выбора:

- Цефтриаксон - 250 мг однократно внутримышечно;

- Спектиномицин - 2,0 г однократно внутримышечно; Альтернативные препараты:

- Офлоксацин - 400 мг однократно Лечение осложненной гонококковой инфекции №1.

Основной препарат:

- Цефтриаксон - 1г внутримышечно или внутривенно каждые 24 часа Альтернативные препараты:

- Цефотаксим - 1,0 внутривенно каждые 8 часов

- Спектиномицин - 2 г внутримышечно каждые 12 часов №2.

На начальном этапе проводится внутривенная или внутримышечная терапия основным или одним из альтернативных препаратов (см. №1).

Начатую терапию продолжают в течение 24-48 часов, при разрешении клинической симптоматики переходят на пероральную терапию:

- Офлоксацин - 400 мг внутрь через каждые 12 часов

Курсовое лечение проводят в течение 14 дней, удлинение сроков лечения должно быть аргументировано лечащим врачом.

II. Рекомендации для Уральского и Центрального регионов России:

Препаратами выбора в лечении гонококковой инфекции следует определить цефтриаксон и спектиномицин.

Препараты группы фторхинолонов рекомендуется использовать в резервных случаях. Следует применять ципрофлоксацин только после определения индивидуального профиля резистентности гонококка к этому препарату.

Исключить из применения в лечении гонококковой инфекции пенициллин и тетрациклин.

Эритромицин - применять только при непереносимости всех остальных препаратов, либо после определения индивидуального профиля резистентности.

Лечение неосложненной гонококковой инфекции.

Используется один из предложенных препаратов: Препараты выбора:

- Цефтриаксон — 250 мг однократно внутримышечно;

- Спектиномицин - 2,0 г однократно внутримышечно; Альтернативные препараты:

- Офлоксацин - 400 мг однократно

- Ципрофлоксацин - 500 мг однократно внутрь

Лечение осложненной гонококковой инфекции №1.

Внутривенная или внутримышечная терапия основным или одним из альтернативных препаратов должна продолжаться 7 дней, желательно в стационаре.

Основной препарат:

- Цефтриаксон - 1г внутримышечно или внутривенно каждые 24 часа Альтернативные препараты:

- Цефотаксим - 1,0 внутривенно каждые 8 часов

- Спектиномицин - 2 г внутримышечно каждые 12 часов №2.

На начальном этапе проводится внутривенная или внутримышечная терапия основным или одним из альтернативных препаратов (см. №1).

Начатую терапию продолжают в течение 24-48 часов, при разрешении клинической симптоматики, переходят на пероральную терапию:

- Офлоксацин - 400 мг внутрь через каждые 12 часов

- Ципрофлоксацин - 500 мг внутривенно каждые 12 часов Курсовое лечение проводят в течение 14 дней, удлинение сроков лечения должно быть аргументировано лечащим врачом.