Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина

На правах рукописи

СШ345 < (

Лобова Полина Сергеевна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ТИАМУЛИНА И ДОКСШЩКЛИНА

16.00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ДЕК 2008

Москва - 2008

003457774

Работа выполнена в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств для животных Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, доцент

Виолин Б.В.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Паршин П.А.;

кандидат биологических наук Сомова Н.Н.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Защита состоится ^> декабря 2008 года в ^£^часов на заседании диссертационного совета Д. 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан «/¿у> ноября 2008 :

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Анализ структуры заболеваемости свиней по отдельным регионам Российской Федерации и в целом по стране показывает, что ежегодно более чем у 70% поросят регистрируют различные синдромы нарушения функций органов пищеварения и дыхания. Возможности развития свиноводства существенно ограничивают желудочно-кишечные и респираторные заболевания, среди которых большой удельный вес имеют дизентерия и энзоотическая пневмония (О.П. Татарчук, 2006; Голиков A.B., Скворцов В.Н., Прасолов A.A., 2001). Во многих хозяйствах страны по причине бактериальной патологии падеж поросят составляет 20-30% от общего числа поголовья (Сидоркин В.А., 2001). Цикличность промышленного свиноводства приводит к персистенции бактерий и вирусов и появлению инфекций, устойчивых к химиотерапевтическим препаратам и трудно поддающихся лечению (Martelli P., Balarini G., 2002). Наиболее часто инфекционные заболевания протекают в смешанной форме, что осложняет течение болезни и выбор эффективного лекарственного средства.

Для лечения таких ассоциированных инфекций часто недостаточно использование монопрепаратов, т.к. практически не существует антибиотиков активных против всего спектра микроорганизмов. Поэтому целесообразно применять комбинированные лекарственные средства, обладающие максимально широким спектром действия и активных в отношении как первичного этиологического фактора, например, брахиспир или микоплазм, так и в отношении вторичной бактериальной инфекции, например, эшерихий, стрептококков, стафилококков, гемофилюсов.

Одновременно с ростом количества антибактериальных препаратов, применяемых в свиноводстве, увеличивается количество возбудителей, устойчивых к антимикробным средствам. Применение научно-обоснованных комбинаций антибактериальных веществ является важным направлением современной химиотерапии бактериальных инфекций, позволяющим не только преодолеть проблему антибиотикорезистентности, но и значительно расширить спектр антимикробного действия. Исходя из анализа данных отечественных и зарубежных исследователей, нам представлялось актуальным разработать удобный в применении и безопасный комплексный антибактериальный препарат, использование которого позволит повысить эффективность лечения широкого спектра смешанных форм инфекционных заболеваний свиней, в том числе энзоотической пневмонии и дизентерии.

В настоящее время наибольшей активностью в отношении основных возбудителей респираторных и желудочно-кишечных инфекций обладают антибиотики из группы макролидов, особенно производные плевромутилина (Голиков A.B., Скворцов В.Н., Прасолов A.A., 2001; А. Cizek et al, 2004; Aarestrup F.M., Friis N.F., 1998; Kobayashi H., 1996; Barigazzi G. et al, 2001; Kinyon J. M. et al., 2002; Hannan P.C.T. et al, 1997). Поэтому в качестве одного из компонентов препарата нами был выбран антибиотик из этой группы - тиамулин, который обладает высокой активностью в отношении основных возбудителей дизенте-

рии и энзоотической пневмонии (микоплазм, серпулин, гемофилюсов, пасте-релл, бордетелл, стафилококков, стрептококков и др.), однако не действует на энтеробактерии, которые часто осложняют течение заболевания.

Антибиотики тетрациклинового ряда активны в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, но не активны или слабо активны в отношении внутриклеточных возбудителей, таких как микоплазмы. (Aranson А., 1980; Pijpers A., Van Klingeren В., Schoevers E.J., Verheijden J.H.M., Van Miert A.S.J.P.A.M., 1989; Hong-Bum Koh et al, 1994; Stipkovits L., Miller D.J.S., 1994; Burch D.G.S. et al, 1986; Stipkovits L. et al, 1992; GuilmotoH., 1996).

Доксициклин, являясь представителем группы тетрациклинов, по сравнению с другими антибиотиками этого ряда обладает более высокой биодоступностью при пероральном введении (более 90%) и способностью за счет своих липофильных свойств лучше проникать в микробную клетку (Aranson А., 1980).

Основываясь на результатах собственных исследований in vitro и анализа литературных данных, нами был предложен комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина для лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней свиней бактериальной этиологаи.

Пели и задачи исследования.

Разработать на основе тиамулина и доксициклина новый комплексный антибактериальный препарат для лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций свиней бактериальной этиологии.

Для этого было необходимо:

- изучить антибактериальную активность доксициклина и тиамулина, обосновать состав и разработать лекарственную форму комплексного антибактериального препарата на основе этих двух антибиотиков;

- разработать требования к качеству препарата и методы его контроля;

- изучить стабильность препарата в процессе хранения;

- определить параметры острой токсичности препарата в опытах на лабораторных животных;

- изучить субхроническую токсичность препарата в опытах на лабораторных животных и поросятах;

- изучить фармакокинетику тиамулина и доксициклина в организме поросят после применения препарата;

- установить сроки выведения остаточных количеств тиамулина и доксициклина из организма поросят после курсового применения препарата;

- определить оптимальную терапевтическую дозу и изучить терапевтическую эффективность комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина в производственных условиях и разработать схему его применения для лечения бактериальных инфекций свиней.

Научная новизна.

Теоретически и экспериментально обоснован состав антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина, установлено взаимоусили-вающее действие комбинации антибиотиков на стафилококки; определены

фармако-токсикологические свойства, доказывающие возможность безопасного использования лекарственного средства в терапевтических дозах; обоснованы сроки возможного использования в пищу человека мяса и субпродуктов после применения комплексного препарата; подобрана оптимальная схема применения комплексного антибактериального препарата и проведена оценка эффективности лечения бактериальных инфекций свиней.

Практическая значимость работы.

Разработан и предложен для ветеринарной практики новый комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина для лечения бактериальных инфекций желудочно-кишечного и респираторного тракта свиней.

Разработаны методы контроля качества комплексного антибактериального препарата и установлен срок его годности.

Определены сроки возможного использования в пищу человеку мяса и субпродуктов свиней после применения комплексного антибактериального препарата.

Разработана схема применения комплексного антибактериального препарата при лечении бактериальных инфекций свиней.

Разработана нормативная документация и инструкция по применению комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- научное обоснование состава комплексного антибактериального препарата.

- качественные и количественные методы контроля комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.

- результаты изучения стабильности комплексного антибактериального препарата при хранении.

- результаты изучения острой и субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата в опытах на лабораторных животных и свиньях.

- результаты изучения фармакокинетики тиамулина и доксициклина и определения сроков выведения остаточных количеств антибиотиков из организма поросят после применения препарата.

- результаты определения терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата при лечении дизентерии и энзоотической пневмонии свиней.

- практические предложения по применению комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 научные работы.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 157 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа иллюстрирована 49

таблицами, 5 рисунками, 3 графиками и фотографиями. Список литературы содержит 213 источников, в том числе 167 иностранных. Приложение на 9 листах.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 2005-2008 гг в ФГУ «ВГНКИ». В опытах было использовано 50 беспородных белых мышей обоего пола массой 18-22 г, 78 крыс массой 165-205 г и 38 поросят массой 6,5-10 кг. Клиническое испытание препарата в производственных условиях проведено на 3800 поросятах в Белгородской, Курской, Новгородской и Воронежской областях.

Определение специфической активности.

Определение чувствительности стафилококков, эшерихий и сальмонелл к тиамулину, доксициклину и их комбинациям проводили на мясо-пептонном агаре (МПА) методом серийных разведений в плотной питательной среде (С.М. Навашин, И.П. Фомина, 1982).

В качестве тест-микроорганизмов использовали культуры, выделенные от больных животных и птиц: 25 изолятов Escherichia coli, 3 изолята Salmonella en-teritidis, 2 изолята Salmonella thyphimurium, 7 изолятов Salmonella choleraesuis, 24 изолята Staphylococcus aureus, 2 изолята Staphylococcus epidermidis.

За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) тиамулина, докси-циклина и их комбинаций принимали наименьшую концентрацию антибиотиков, дающую полную задержку роста культуры на поверхности агара.

Разработка лекарственной формы и методов контроля качества препарата.

В качестве действующих веществ в состав препарата включены докси-циклина гидрохлорид 5% и тиамулина гидроген фумарат 5%. Соотношение антибактериальных компонентов в препарате устанавливали на основании исследований специфической активности и фармакокинетики. Лекарственную форму - порошок - выбрали, исходя из возможности применения ее в смеси с кормом для одновременной обработки большого поголовья свиней.

Для стандартизации комплексного антибактериального препарата в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XI к порошкам были предложены методики качественного и количественного контроля препарата с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), спекторофотометрического метода и микробиологического метода диффузии в агар.

Изучение стабильности лекарственной Формы

Стабильность комплексного антибактериального препарата изучали в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре». Параллельно изучали стабильность препарата в условиях естественного хранения при комнатной температуре (25±3 °С) и при воздействии высокой температуры (80±1°С) в течение 10 минут.

Образцы препарата, расфасованные по 100 г в двухслойные бумажные пакеты, помещали для «ускоренного старения» в термостаты при температурах 37 и 50 °С и исследовали через промежутки времени, соответствующие 6, 12, 18, 24, 30 и 36 месяцам хранения. При хранении препарата в естественных условиях исследование образцов проводили через 6, 9, 12, 18 и 24 месяца после закладки на хранение.

Оценку качества препарата в процессе хранения проводили по показателям: внешний вид, потеря в массе при высушивании, растворимость и рН раствора, подлинность и массовая доля доксициклина гидрохлорида и тиамулина гидроген фумарата, количество эпи-доксициклина.

При изучении влияния высокой температуры на стабильность действующих веществ в препарате определяли массовую долю тиамулина, доксициклина и наличие возможных продуктов распада методом ВЭЖХ.

Изучение фармако-токсикологичесих свойств.

Острую токсичность препарата изучали на 50 беспородных белых мышах обоего пола массой 18-20 г и 30 крысах массой 165-205 г. Препарат вводили однократно перорально в дозах: 1000, 2000, 3000, 5000, 7000 мг/кг. Каждую дозу препарата испытывали на 10 мышах и 6 крысах.

Наблюдение за клиническим состоянием животных проводили в течение 14 суток после введения препарата. В процессе опыта учитывали клиническое состояние животных, двигательную активность, отмечали особенности поведения; оценивали прием корма и воды, а также состояние шерстного покрова.

Субхроническую токсичность комплексного антибактериального препарата изучали на 48 белых крысах обоего пола массой 165-205 г. Подопытных животных по принципу аналогов разделили на 4 группы по 12 крыс.

Препарат в 2% растворе крахмала вводили ежедневно в течение 30 суток перорально при помощи зонда в желудок в следующих дозах: 1 группа - двенадцатикратная терапевтическая (1400 мг/кг); 2 группа - шестикратная терапевтическая (700 мг/кг); 3 группа - трехкратная терапевтическая (350 мг/кг). Крысам 4 группы вводили 2% раствор крахмала.

В течение всего периода введения препарата наблюдали за общим состоянием и поведением животных, приемом корма и воды, видимыми физиологическими функциями. Крыс взвешивали на 1, 3, 5, 7, 9, 14, 21, и 30 сутки от начала введения препарата.

Токсическое действие препарата на организм крыс оценивали при определении биохимических, гематологических показателей и массовых коэффициентов органов (на 6 крысах); детоксицирующей функции печени с помощью гексеналовой пробы (на 3 крысах); диуреза и клинического анализа мочи (на 3 крысах) из каждой группы.

Через 1,2, 5 и 10 суток после окончания введения препарата крысам вводили внутрибрюшинно гексенал в дозе 60 мг/кг на дистиллированной воде (В.Н. Га-цура, 1976). Продолжительность сна учитывали от момента принятия животными бокового положения до первых попыток крыс изменить его на положение «спиной вверх». Функциональное состояние почек оценивали по диурезу в течение 3 часов с водной нагрузкой дистиллированной водой (2,5% от массы тела) и клини-

ческому анализу мочи. Также проводили макро- и микроскопическое исследование органов (печени, легких, почек, сердца и селезенки), пробы которых отбирали у 3 крыс из каждой группы. Материал фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Субхроническую токсичность комплексного антибактериального препарата изучали на 20 клинически здоровых поросятах 1,5-2,5 месячного возраста с начальной массой тела 6,0-7,2 кг, которых разделили по принципу аналогов на 4 группы по 5 голов в каждой. Перед началом опыта поросят взвешивали и исследовали клинические и биохимические показатели крови. Препарат вводили пе-рорально в смеси с кормом в течение 30 дней в следующих дозах: 1 группе - четырехкратную терапевтическую дозу (500 мг/кг массы тела); 2 группе - двукратную терапевтическую дозу (250 мг/кг массы тела); 3 группе - терапевтическую дозу (120 мг/кг массы тела); 4 группа была контрольной и препарат не получала.

В процессе опыта вели наблюдение за поросятами и учитывали общеклиническое состояние, аппетит, прирост массы тела. На 15, 31 и 41 сутки от начала опыта животных взвешивали и до кормления брали кровь из ушной вены для определения клинических (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, гематок-рит, тромбоциты, СОЭ, лейкоцитарная формула) и биохимических показателей. О влиянии лекарственного средства на печень судили по определению активности гепатоспецифических ферментов (аланинаминотрасферазы (АЛТ), аспарта-таминострасферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ)), общего билирубина и глюкозы в сыворотке крови. Функциональное состояние почек оценивали по изменению сывороточной концентрации мочевины.

Фармакокинетику тиамулина и доксициклина в организме поросят после введения антибактериального препарата изучали при однократном и курсовом введении.

В первом опыте 5 клинически здоровым поросятам 20-дневного возраста лекарственное средство вводили однократно перорально в терапевтической дозе 120 мг/кг массы тела. Все животные находились в одинаковых условиях кормления и содержания и в течение 14 дней до опыта и на протяжении опыта не получали никаких лекарственных препаратов.

Образцы крови отбирали в объеме 5 мл до введения и через 0,5; 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 часа после введения комплексного препарата. Сыворотку отделяли и замораживали до момента исследования при температуре -18 °С.

Для оценки фармакокинетики тиамулина и доксициклина при курсовом применении, комплексный препарат вводили в течение 10 дней в смеси с кормом в терапевтической дозе 120 мг/кг массы тела. Кровь у поросят брали перед началом опыта и далее каждый день перед утренней дачей корма в течение 10 дней.

Определение тиамулина в сыворотке крови проводили с использованием микробиологического метода диффузии в агар с тест-культурой Micrococcus lu-teus АТСС 9341. Предел количественного определения - 0,1 мкг/мл. Определение доксициклина в сыворотке крови проводили микробиологическим методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus cereus АТСС 11778 и методом ВЭЖХ. Предел количественного определения микробиологического метода составил 0,05 мкг/мл, а метода ВЭЖХ - 0,1 мкг/мл. Для оценки досто-

верности предложенных методов была определена их воспроизводимость, линейность и степень экстракции антибиотиков из сыворотки крови.

Определение сроков выведения остаточных количеств тиамулина и док-сициклина из организма свиней после курсового введения препарата в дозе 120 мг/кг массы тела проводили на 13 животных, которым препарат вводили в течение 10 дней. Через 5, 7, 10 и 15 дней после последнего введения препарата убивали по 3 животных и отбирали для исследования печень, почки, сердце, легкие, мышечную и жировую ткань.

Остаточные количества тиамулина в биосубстратах определяли методом газовой хроматографии с пределом детектирования 0,01 мкг/г. Принцип метода заключается в гидролизировании метаболитов тиамулина и самого тиамулина до 8-а-гидроксимутилина, с последующей дериватизацией пентафтор-пропионовым ангидридом.

Остаточные количества доксициклина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Принцип метода заключается в экстракции доксициклина из тканей при помощи Mcllvaine буфера с последующей очисткой на SPE-картриджах. Предел количественного определения метода составил 0,01 мкг/г. Дня оценки достоверности предложенных методов была определена их воспроизводимость, линейность и степень экстракции антибиотиков из биосубстратов.

Терапевтическую эффективность препарата изучали в производственных условиях при бактериальных инфекциях в хозяйствах Курской, Белгородской, Новгородской и Воронежской областей, в том числе при энзоотической пневмонии свиней на 1910 животных и при дизентерии свиней - на 1890 животных.

При постановке диагноза учитывали эпизоотическую ситуацию в хозяйствах, клиническую картину заболевания, результаты патологоанатомического и бактериологического исследований, проведенных областными ветлаборато-риями.

Терапевтическую эффективность препарата на основе доксициклина и тиамулина изучали в сравнении с препаратами, которые обычно используются в хозяйствах для лечения этих заболеваний (тилозин, метронидазол, колистин, Спелинк 44).

Больные животные были разделены на группы по принципу аналогов, учитывая возраст, пол, массу тела, тяжесть заболевания. Все животные находились в одинаковых условиях кормления и содержания.

Комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина вводили в смеси с кормом. Для определения наиболее эффективной дозы лекарственное средство вводили в дозах 2, 2,5 и 3 кг/т корма. Препараты сравнения применяли в соответствии с утвержденными Россельхознадзором инструкциями по применению.

За животными вели ежедневное наблюдение, учитывая количество павших и вынужденно убитых животных, наличие клинических признаков заболевания, сроки выздоровления, среднесуточный привес и привес за весь период наблюдения. Терапевтическую эффективность оценивали по количеству выздоровевших животных.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики, используя руководство Ю.С. Малеты и В.В. Тарасова (1982).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Антибактериальная активность тиамулина. доксициклина и их комбинаций.

Полученные в опытах in vitro результаты свидетельствуют о высокой чувствительности грамположительных стафилококков как к тиамулину, так и к доксициклину. Минимальная подавляющая концентрация доксициклина, действующая на 90% изолятов стафилококков (МПК90), составила 0,25 мкг/мл и практически не отличалась от МПК50 - 0,2 мкг/мл. МПК90 доксициклина была значительно ниже аналогичных показателей окситетрациклина (100 мкг/мл), тетрациклина (50 мкг/мл) и хлортетрациклина (10 мкг/мл).

МПК90 тиамулина (0,75 мкг/мл) в отношении стафилококков была в 1,3 раза ниже, чем МПК90 клиндамицина (1,0 мкг/мл); в 3,3 раза ниже, чем МПК90 линкомицина (2,5 мкг/мл), и в 6,6 раза ниже, чем МПК90тилозина (5,0 мкг/мл).

Грамотрицательные микроорганизмы были менее чувствительны к тетра-циклинам, чем стафилококки. МПК только 48% штаммов находилась в пределах 0,1-2,0 мкг/мл. 52% эшерихий и 23% сальмонелл оказались устойчивы к доксициклину и другим антибиотикам тетрациклинового ряда (МПК>10 мкг/мл), 13% изолятов проявили умеренную чувствительность (МПК 2,5-5 мкг/мл). При сравнении чувствительности. изученных изолятов эшерихий и сальмонелл к антибиотикам разных групп было установлено, что резистентные к тетрациклинам эшерихии, выделенные от больных свиней, были устойчивы к антибактериальным соединениям других групп (энрофлоксацину, гентамицину, флорфениколу, амоксициллину).

Воздействие комбинации доксициклина и тиамулина на эшерихии и сальмонеллы не привело к существенному снижению МПК каждого из этих антибиотиков.

В тоже время был установлен взаимоусиливающий эффект от применения комбинации тиамулина и доксициклина в отношении стафилококков -МПК тиамулина удалось снизить в 2-5 раз (с 0,5 до ОД мкг/мл), МПК доксициклина для 10 изолятов уменьшить в 5 раз (с 0,1 до 0,02 мкг/мл), для 12 изолятов - в 10 раз (с 0,1 до 0,01 мкг/мл), для 3 - в 20 раз (с 0,2 до 0,01 мкг/мл).

Взаимоусиливающий эффект доксициклина и тиамулина в комбинации, вероятно, обусловлен тем, что два антибиотика блокируют различные стадии белкового синтеза в бактериальной клетке. Так, доксициклин связывается с 30S субъединицей рибосомы, подавляя инициацию синтеза белка, в то время как тйамулин связывается с 50S субъединицей рибосомы, нарушая процесс элонгации пептидной цепи (Hogenauer G., Rif С., 1981).

Доксициклин оказался более активным, чем другие антибиотики тетрациклинового ряда, в отношении стафилококков, и не уступал им по эффективности в отношении энтеробактерий. Кроме того, тиамулин и доксициклин при пероральном введении обладают сходными фармакокинетическими свойства-

ми, что позволяет использовать их в составе одной лекарственной формы. Установленное взаимоусиливающее действие комбинации тиамулина и доксицик-лина в отношении стафилококков, а также расширение спектра антибактериальной активности при их совместном применении позволили включить эти антибиотики в состав комплексного препарата.

2.2.2. Разработка лекарственной формы и методов контроля качества препарата.

Современное промышленное свиноводство требует применения наиболее рациональных способов введения лекарственных веществ. Одним из таких способов является назначение лекарственных средств в смеси с кормом, которое позволяет одновременно обрабатывать большое поголовье животных. Поэтому в качестве лекарственной формы мы выбрали порошок.

Для получения готовой лекарственной формы использовали лактозу, которая по величине частиц соответствовала субстанциям тиамулина гидроген фумарата и доксициклина гидрохлорида, и при смешивании с ними позволяла получить однородный порошок, который оставался гомогенным при хранении и транспортировке.

По внешнему виду лекарственное средство представляет собой светло-желтый порошок, содержащий 5% тиамулина гидроген фумарата и 5% доксициклина гидрохлорида.

Для стандартизации и контроля качества комплексного антибактериального препарата, а также определения его стабильности при хранении нами были использованы количественные методы контроля, позволяющие установить содержание одного антибиотика в присутствии второго, а также возможные продукты распада доксициклина и тиамулина.

Для определения массовой доли входящих в состав препарата антибактериальных соединений нами были предложены 3 метода: микробиологический, спектрофотометрический и хроматографический. При определении воспроизводимости было установлено, что спектрофотометрический и хроматографический методы позволяют получить однородные результаты (стандартное отклонение для доксициклина не превышало ±0,095, а для тиамулина - ±0,097) в то время как микробиологическим методом получить стабильные результаты не удавалось (стандартное отклонение для доксициклина составляло ±0,343, а для тиамулина-±0,431). Поэтому в нормативную документацию на препарат были включены методы ВЭЖХ и спектрофотометрический.

Метод ВЭЖХ дает возможность одновременно определять подлинность и массовую долю антибиотиков в препарате, а также возможные продукты их распада, но достаточно сложен в исполнении и требует дорогостоящих реактивов. Поэтому для экспресс-определения содержания действующих веществ в готовой лекарственной форме и в процессе производства нами был предложен спектрофотометрический метод. Разные максимумы поглощения позволяют одновременно определять доксициклин и тиамулин этим методом при разных длинах волн (соответственно 350 и 210 нм).

Нами были подобраны оптимальные условия для хроматографирования доксициклина (длина волны 345 нм; элюент - смесь буферного раствора, ацето-

нитрила и метанола в соотношении 100:42,5:165,8) и тиамулина (длина волны 212 нм, элюент - смесь буферного раствора, ацетонитрила и метанола в соотношении 30: 27:49). ВЭЖХ позволяет одновременно определять и основной продукт деградации доксициклина - эпи-доксициклин. Метод обладает хорошей селективностью относительно других антибиотиков тетрациклинового ряда (рис. 1).

На основании проведенных исследований были установлены требования к качеству готовой лекарственной формы препарата на основе тиамулина и доксициклина, которые вошли в нормативную документацию (таблица 1).

Предложенные качественные и количественные методы контроля комплексного антибактериального препарата позволяют обеспечить оптимальный уровень качества лекарственного средства в процессе его производства, хранения и применения.

Таблица 1. Требования к качеству комплексного антибактериального препарата

Показатель Норма Метод

Внешний вид Сыпучий порошок светло-желтого цвета Визуально

Растворимость 2% водный раствор прозрачный слегка опалесцирующий, не содержит нераство-ренных частиц Визуально

рН 2% раствора 2,8-4,2 Потенциометрически

Потеря в массе при высушивании, %, не более 7 Высушивание

Подлинность тиамулина Время выхода пика образца должно соответствовать времени выхода пика стандарта ВЭЖХ

Подлинность доксициклина Время выхода пика образца должно соответствовать времени выхода пика стандарта ВЭЖХ

Содержание тиамулина, % 4,5-5,5 ВЭЖХ, спектрофо-тометрия

Содержание доксициклина, % 4,5-5,5 ВЭЖХ, спектрофо-тометрия

2.23. Изучение стабильности.

При изучении стабильности препарата методом «ускоренного старения» в течение времени, эквивалентного 3 годам, было установлено, что в процессе хранения количество доксициюшна и тиамулина остается в пределах установленной нормы, не наблюдается повышения уровня продуктов распада и физико-химические свойства препарата остаются без изменений. Показатели качества препарата также не изменялись в течение 2 лет при хранении препарата в естественных условиях. Количество эпи-формы доксициклина существенно не возрастало во все периоды исследования.

Кратковременное воздействие высоких температур (80±2 °С в течение 10 минут) также не приводит к распаду действующих веществ препарата и изменению его физико-химических свойств.

На основании данных, полученных при изучении стабильности при повышенных температурах можно установить срок годности препарата 3 года при хранении в защищенном от света месте при температуре до 25 °С.

2.2.4. Изучение острой и субхронической токсичности на лабораторных животных.

Изучение острой токсичности показало, что введение даже самой высокой дозы 7000 мг/кг не приводило к гибели крыс и мышей. Так как большие дозы было невозможно ввести перорально, параметры острой токсичности рассчитать не удалось. Тем не менее, согласно ГОСТ 12.1.007-76 препарат можно отнести к 4 классу опасности - веществам малоопасным (ЛД5О>7000 мг/кг), а в соответствии с классификацией Медведя (1977) - к 4-му классу токсичности -малотоксичным соединениям (ЛДз0>ЮОО мкг/кг).

Результаты изучения субхронической токсичности препарата в опытах на лабораторных животных показали, что неблагоприятное влияние лекарственного средства на организм крыс носит дозозависимый характер. Тридцатидневное введение препарата в дозе 350 мг/кг (трехкратная терапевтическая), не вызывает функциональных изменений в организме крыс, следовательно, эту дозу можно считать недействующей.

Таблица 2. Гематологические и биохимические показатели крови крыс

при изучении субхронической токсичности.

Показатели Группы

1400 мг/кг 700 мг/кг 350 мг/кг контроль

Гемоглобин, г/л 136,33±1,33' 137,67±2,58' 148,33±4,17 146,66±1,58

Эритроциты, 10'7л 6,20±0,23 7, №0,16 6,66±0,11 б,80±0,1

Тромбоциты,107л 505,00±25Д7 695,67±53,31 593,33±35,82 572,00±24,03

Лейкоциты, 10а/л 9,48±0,93 6,75±0,20 б,43±0,80 б,43±0,87

Лейкоцитарная формула, % Сегментоя-дерные 35,33±0,98' 32,33±0,88 32,17±0,75 3 0,5 0± 1,43

Моноциты 9,00±0,58" 4,67±0,49 3,33±0,33 3,00±0,8б

Эозинофилы 2,17±0,47" 2,17±0,48 1,33±0,21 1,83±0,31

Лимфоциты 53,50±1,40' 60,83±1,30 63,17±0,60 64,67±1,76

АЛТ, Ед/л 7б,бб±4,04' 55,66± 2,95' 42,67±2,99 38,33±3,11

ACT, Ед/л 166,66±12,82' 125,00±4,28' 10б,бб±б,03 98,33±2,8б

Билирубин общий, мкмоль/л 10,55±0,38 11,12±0,27 10,80±0,33 10,98±0,18

Мочевина, мкмоль/л 8,57±0,42 9,17±0,07 8,43±0,28 8,03±0,72

Креатинин, мкмоль/л 82,33±1,61 80,бб±3,77 80,бб±3,77 84,33±1,72

♦Различие по данному показателю статистически достоверно (р < 0,05).

При введении крысам дозы, в 6 раз превышающей терапевтическую (700 мг/кг), появляются первые признаки токсического действия препарата, проявляющиеся в повышении в сыворотке крови уровня ферментов печени, а также в снижении концентрации гемоглобина (таблица 2). Следовательно, дозу комплексного препарата 700 мг/кг массы тела можно считать пороговой.

У животных, получавших препарат в двенадцатикратной терапевтической дозе (1400 мг/кг массы тела), на протяжении опыта отмечали наименьший прирост массы тела, свидетельствующий о неблагоприятном действии препарата на развитие крыс. Также у животных этой группы наблюдали достоверное (р<0,05) увеличение массового коэффициента печени, изменения гематологических показателей (уменьшение количества гемоглобина и лимфоцитов, увеличение количества сегментоядерных клеток и моноцитов), повышение уровня ферментов печени (содержание AJIT по сравнению с контрольной группой повысилось в два раза) и содержания белка в моче (таблица 2). Следовательно, эту дозу можно считать токсической.

Увеличение активности ферментов АЛТ и ACT в сыворотке крови, несомненно, свидетельствует о влиянии препарата в дозах 1400 и 700 мг/кг на функциональное состояние печени. Наиболее вероятно, что повышение активности указанных ферментов и достоверное (р<0,05) увеличение относительной массы печени у крыс, получавших лекарственное средство в дозе 1400 мг/кг, носит адаптационный характер и связано с большой и длительной нагрузкой на организм действующих веществ комплексного препарата, выделяющихся через печень. Эти изменения, видимо, относятся к функциональным и не затрагивают структуру печеночной ткани, о чем свидетельствует ненарушенная детоксици-рующая функция органа при гексеналовом сне и отсутствие изменений при гистологических исследованиях печени.

Введение препарата не вызывало изменений диуреза и гистологической картины почек в группах, получавших препарат в трех- и шестикратной терапевтической дозах. Наблюдаемые в группе, получавшей максимальную дозу препарата 1400 мг/кг, функциональные изменения почек (появление белка в моче) связаны с обеспечением скорейшей элиминации избыточного количества антибиотиков из организма. Как и в случае с печенью, введение препарата не приводило к появлению органических изменений в почках и признаки функциональной нагрузки на этот орган являлись обратимыми и восстанавливались после отмены препарата.

2.2.5. Изучение субхронической токсичности на сельскохозяйственных животных.

При изучении субхронической токсичности комплексного препарата на основе тиамулина и доксициклина в опыте на поросятах нами было установлено, что введение препарата в терапевтической дозе в течение 1 месяца не оказывает негативного влияния на организм подопытных животных. Во всех группах, получавших лекарственное средство, были отмечены более высокие по сравнению с контрольной группой привесы, что можно объяснить ростостиму-лирующим влиянием антибактериального средства.

Изменения гематологических показателей, хотя и отмечались в некоторые периоды времени, но находились в пределах физиологической нормы, не носили дозозависимый характер и вряд ли могли быть обусловлены введением лекарственного средства.

Более выраженные изменения регистрировались при биохимическом исследовании крови (табл. 3). На 31 день опыта уровни АЛТ и щелочной фосфа-тазы в группах, получавших четырехкратную и двукратную терапевтические дозы, были выше, чем в контрольной группе. В группе, получавшей максимальную дозу, также отмечали достоверное (р<0,05) увеличение уровня ACT на 15 день опыта и глюкозы на 31 день опыта. Эти изменения носили временный характер и приходили в норму после отмены препарата. Таблица 3. Гематологические и биохимические показатели крови поросят

при изучении субхронической токсичности.

Груп па Срок исследования (сутки) АЛТ, мкмоль/с.л ACT, мкмоль/с>л Щелочная фосфата-за, нмоль/с л Мочевина, моль/л Глюкоза, ммоль/л

500 мг/кг 0 0,254±0,044 0,133±0,028 1275,8±85,б 4,46±0,46 2,94±0,18

15 0,286±0,03 0,210±0,03» 1480,6±98,03 4,84±0,28 3,28±0,27

31 0,378±0,05* 0,206±0,06 2160,8±78,54* 6,08±0,16 6,63±0,18

41 0,28±0,03 0,182±0,02 1309,б±100,94 3,28±0,11 5,85±0,59

250 мг/кг 0 0,241±0,027 0,123±0,015 1287,2±59,54 3,52±0,31 3,14±0,24

15 0,288±0,04 0,153±0,03 1326, б±113,07' 5,62±0,36 3,36±0,19

31 0,353±0,02* 0,153±0,02 2400,8±254,2* 4,70±0,43 6,09±0,17

41 0,291±0,02 0,166±0,02 1721,4±173,21 3,78±0,24 5,07±0,31

120 мг/кг 0 0,244±0,039 0,138±0,02 1059,2±57,29 4,32±0,92 3,36±0,23

15 0,303±0,04 0,197±0,03 1392,8±92,82 5,12±0,54 3,63±0,35

31 0,289±0,01 0,138*0,04 1583,4±156,42 4,77±0,85 6,22±0,27

41 0,249=ь0,018 0,182±0,02 1389,6±153,72 4,02±0,24 5,24±0,41

контроль 0 0,241 ±0,046 0,150±0,03 1283,6±92,42 3,54±0,38 3,08±0,11

15 0,286±0,05 0,164±0,03 1560,6±237,27 4,54±0,35 3,32±0,29

31 0,305±0,03 0,184±0,04 1587,4±100,89 5,81±0,2 5,84±0,23

41 0,250±0,02 0,190±0,03 1517,2±207,65 3,62±0,29 4,88±0,44

*Различие по данному показателю статистически достоверно (р -й 0,05).

Содержание билирубина в сыворотке крови поросят во все сроки исследования соответствовало физиологической норме и не отличалось от контрольной группы, что свидетельствует об отсутствии влияния препарата на экскреторную функцию печени. Увеличение концентрации гепатоспецифических ферментов, скорее всего, связано с повышенной нагрузкой на печень избыточных количеств доксициклина и метаболизированного тиамулина.

Выявленные изменения носили функциональный характер, о чем свидетельствует отсутствие различий в показателях опытных и контрольной группы на 41 сутки опыта, т.е. через 10 дней после отмены препарата.

Результаты изучения субхронической токсичности показали, что препарат на основе тиамулина и доксициклина в терапевтической дозе не оказывает токсического действия на организм животных даже при сроке применения в 3-6 раз превышающем рекомендуемый курс лечения. Но учитывая, что наиболее

чувствительными органами при передозировке препарата являются печень и почки, в случае патологии этих органов препарат следует назначать с осторожностью.

2.2.6. Фармакокинетика доксициклина и тиамулина в организме поросят.

Фармакокинетическими исследованиями установлено, что действующие вещества препарата хорошо всасываются из желудочно-кишечного тракта, достигая терапевтических концентраций в сыворотке крови в течение 30 минут и максимальных концентраций - через 2-3 часа после введения препарата: докси-циклин 1,7 мкг/мл и тиамулин 1,2 мкг/мл (график 1).

В дальнейшем наблюдалось постепенное снижение количества антибиотиков и через 9 ч их уровень уменьшался почти в три раза (0,4-0,6 мкг/мл). Через 12 часов после введения препарата концентрация антибактериальных соединений снова повышалась до 0,7-0,9 мкг/мл, и затем плавно снижалась до 0,2 мкг/мл через 24 часа. Появление вторых подъемов уровней доксициклина и тиамулина в крови поросят, видимо, связано с выделением антибиотиков с желчью в кишечник и повторным их всасыванием в кровь. При подобранной дозе препарата 120 мг/кг происходило параллельное всасывание, распределение и выведение тиамулина и доксициклина из организма поросят. Терапевтический уровень антибиотиков поддерживался на протяжении 21-24 часов.

График 1. Фармакокинетика тиамулина и доксициклина в организме поросят после однократного введения препарата

время, ч

-«—тиамулин -в-доксициклим

—*-МПКтиамулина в отношении микоплазм

—МПКтиамулина и доксициклин в отношении основных возбудителей

На основании полученных результатов были рассчитаны основные фар-макокинетические параметры доксициклина и тиамулина с использованием однокамерной модели со всасыванием, описываемые уравнением:

С = А* (е"®' + е"р'), где а и Р - константы скоростей распределения (альфа-фаза) и элиминации (бета-фаза) соответственно; А - значение, полученное путем обратного логарифмирования точки пересечения линейной части графика с осью ординат в альфа- и бета- фазы соответственно; I - время после введения препарата, мин.

Объем распределения как доксициклина так и тиамулина в организме поросят поддерживался на высоком уровне (3149,18 и 5293,78 мл/кг соответственно), что говорит о способности антибиотиков проникать внутрь клетки и накапливаться в тканях в более высоких концентрациях, чем в сыворотке крови. Такое распределение антибиотиков играет важную роль при терапии респираторных и желудочно-кишечных инфекций, особенно вызванных внутриклеточными возбудителями, такими как микоплазмы.

Полученные данные свидетельствуют также о высокой степени связывания и доксициклина и тиамулина с белками плазмы и постепенном высвобождении антибактериальных соединений. Большая площадь под фармакокинети-ческой кривой (21,7 мкг.ч/мл у доксициклина и 13,59 мкг.ч/мл у тиамулина) также говорит о постепенном всасывании и длительном нахождении антибиотиков в организме животных.

Период полувыведения антибиотиков в наших исследованиях был достаточно продолжительным (7,9 и 8,3 часа), что, возможно, обусловлено высокой степенью связывания доксициклина и тиамулина с белками плазмы, а также их липофильными свойствами.

Так как при обработке большого поголовья животных препарат задают в смеси с кормом, нами было проведено изучение фармакокинетики доксициклина и тиамулина в организме поросят при курсовом введении лекарственного средства.

В результате опыта было установлено, что при даче комплексного препарата в смеси с кормом терапевтические концентрации доксициклина (0,45-0,85 мкг/мл) и тиамулина (0,3-0,6 мкг/мл) в сыворотке крови поддерживаются в течение всего курса лечения и превышают МПК для большинства возбудителей респираторных и желудочно-кишечных инфекций на протяжении всего периода исследования (график 2). Колебания уровней антибиотиков в процессе опыта имеют недостоверный характер (р>0,05).

График 2. Фармакокинетика тиамулина и доксициклина в организме поросят после курсового введения препарата

123456789 10

Дни

—Ф— концентрация тиамулина концентрация доксициклина

2.2.7. Определение сроков выведения доксициклина и тиамулина из организма поросят.

При изучении сроков выведения тиамулина и доксициклина из организма поросят после курсового десятидневного применения препарата в дозе 120 мг/кг массы тела, что соответствует 3 кг/т корма, было установлено, что тиаму-лин и его метаболиты более длительное время задерживаются в организме свиней, чем доксициклин. Наибольшие концентрации тиамулина и его метаболитов были обнаружены в печени на 7 день после отмены препарата, что согласуется с литературными данными (ЕМЕА/М11Ь/578/99,1999), согласно которым антибиотик в значительной степени подвергается метаболизму в печени. На 10 день только у одного животного из трех 8-альфа-гидроксимутилин обнаруживался в печени. В почках антибиотик определяли через 7 и 10 суток. В других исследованных органах и тканях метаболиты тиамулина не обнаруживали. На 15 день после последнего введения препарата ни в одной пробе метаболиты тиамулина не регистрировали.

Наиболее высокие уровни доксициклина отмечали на 5 день в почках (0,218 мкг/г), в печени и мышцах его концентрации были значительно ниже (0,079 и 0,05 мкг/г соответственно), в легких и жировой ткани доксициклин не регистрировали во все сроки исследования. Доксициклин не обнаруживался ни в одной пробе через 10 дней после последнего введения препарата.

На основании полученных результатов можно рекомендовать установить срок предубойной выдержки поросят после применения комплексного препарата 15 суток.

2.2.8. Терапевтическая эффективность комплексного препарата при желудочно-кишечных и респираторных инфекциях поросят.

В опытах по фармакокинетике нами была установлена ориентировочная терапевтическая доза препарата 120 мг/кг массы тела, позволяющая поддерживать концентрацию тиамулина и доксициклина в организме животных на терапевтическом уровне в течение всего периода лечения.

Окончательный выбор оптимальной дозы был проведен при испытании препарата в дозах 2, 2,5 и 3 кг/т корма, что соответствует 100, 110 и 120 мг/кг массы тела при дизентерии и энзоотической пневмонии свиней. В качестве препарата сравнения использовали наиболее эффективный препарат аналогичного назначения тилозин.

Таблица 4. Терапевтическая эффективность комплексного препарата

Показатель Дизентерия Энзоотическая пневмония

Доза (кг/т корма) 2 2,5 3 тилозин 2 2,5 3 тилозин

Количество животных, гол 250 261 275 254 177 179 180 180

Привесы, г 297,5 318 313 301 325,5 310,5 339,5 321

Курс лечения, дней 5 5 5 5 7 7 7 7

Выздоровело, гол 230 239 257 209 148 148 160 139

Пало, гол 7 10 8 13 5 5 1 7

Вынужденно убитых, голов 13 12 10 32 5 6 4 10

Продолжало болеть, голов - - - - 19 20 15 24

Эффективность,% 92 91,6 93,5 82,3 83,6 82,7 88,9 77,2

При применении комплексного антибактериального препарата поросятам, больным дизентерией, во всех испытанных дозах был получен хороший терапевтический эффект - более 91% (таблица 4). Наилучший результат был достигнут при введении препарата в дозе 3 кг/т корма - 93,8%. Среднесуточные привесы были выше в группах, получавших препарат в дозах 2,5 и 3 кг/т корма, также в этих группах был наименьший вынужденный убой. Комплексный препарат во всех испытанных дозах был на 7,4-9,6 % эффективнее тилозина.

При лечении энзоотической пневмонии максимальная терапевтическая эффективность (88,9%) была также получена при применении комплексного антибактериального препарата в максимальной дозе 3 кг/т корма (таблица 4). Кроме этого в этой группе по сравнению с другими испытанными дозами отмечали более высокие привесы, наименьшее количество павших (3%) и вынуждено убитых животных (2,2%). Терапевтическая эффективность препарата в до-

зах 2 и 2,5 кг/т корма была также достаточно высокой и на 5,5-6,4 % превосходила применение одного из наиболее эффективных препаратов при энзоотической пневмонии - тилозина. Достоверных различий (р>0,05) в сохранности поросят при использовании препарата в дозах 2 и 2,5 кг/т корма установлено не было.

В другом опыте эффективность применения лекарственного средства на основе тиамулина и доксициклина при дизентерии свиней в дозе 2 кг/т корма (100 мг/кг массы тела) составила 92,85% и была выше препарата сравнения -метронидазола (84,3%).

Комплексный антибактериальный препарат в дозе 2,5 кг/т корма показал более высокую эффективность (100%) при использовании с лечебно-профилактической целью при энзоотической пневмонии свиней в сравнении с другим комплексным антибактериальным препаратом спелинк-44 на основе линкомицина и спектиномицина (97,3%).

Таким образом, результаты изучения терапевтической эффективности в производственных условиях дают основание рекомендовать разработанный нами комплексный антибактериальный препарат на основе доксициклина и тиамулина для лечения респираторных и желудочно-кишечных заболеваний свиней бактериальной этиологии в дозе 2-3 кг/т корма, что соответствует 100-120 мг/кг массы тела, при пероральном введении в смеси с кормом в течение 5-10 суток.

Результаты проведенных нами исследований по разработке лекарственной формы, методов контроля качества, изучению антибактериальных, фарма-ко-токсикологических свойств и терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина были использованы при разработке нормативной документации на лекарственное средство и инструкции по его применению в ветеринарии.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина в форме порошка для лечения желудочно-кишечных и респираторных заболеваний бактериальной этиологии у свиней, терапевтическая эффективность которого подтверждена результатами производственных испытаний.

2. Доксициклин и тиамулин, входящие в состав комплексного препарата, обладают взаимоусиливающим эффектом в отношении стафилококков, который проявляется снижением минимальной подавляющей концентрации доксициклина в 2-10 раз, а тиамулина - в 2-5 раз.

3. Комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина отвечает стандартным требованиям, предъявляемым Государственной и Европейской фармакопеями к порошкообразным лекарственным формам, и стабилен в течение 3 лет при температуре 25±3 °С, а также при кратковременном воздействии высокой температуры (80±2 °С).

4. Комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12.1,007-76 относится к 4 классу опасности - веществам малоопасным. ЛД50 для белых мышей и крыс при пероральном введении превышает 7000 мг/кг массы тела (максимально вводимая доза).

5. Тридцатидневное введение препарата крысам в дозах 1400 мг/кг и 700 мг/кг приводит к обратимым изменениям гематологических и биохимических показателей, а в трехкратной терапевтической дозе (350 мг/кг) не вызывает функциональных изменений в организме животных. По параметрам субхронической токсичности дозу 1400 мг/кг следует считать токсической, дозу 700 мг/кг - пороговой, а дозу 350 мг/кг - недействующей.

6. Тридцатидневное применение комплексного антибактериального препарата свиньям в терапевтической дозе (120 мг/кг) не оказало токсического действия на основные жизнеобеспечивающие системы организма. Применение препарата в дозах, в 2 и 4 раза превышающих терапевтическую, приводило к временным нарушениям функций печени и почек, проявляющихся увеличением уровней аспартат - и аланинаминотрансфераз, а также мочевины в крови.

7. Фармакокинетика комплексного антибактериального препарата характеризуется высокими значениями максимальных концентраций антибиотиков (Стах дц=1>92; Стах тм=1,02 мкг/мл), которые достигаются в течение 2-3 часов после однократного перорального введения препарата; длительным периодом полувыведения (около 8 часов), высоким уровнем объема распределения доксициклина и тиамулина; большой площадью под фармакокинетической кривой, что свидетельствует не только о постепенном всасывании и длительном нахождении антибактериальных веществ в организме животных, но и об их проникновении внутрь клетки.

8. Введение комплексного антибактериального препарата в дозе 120 мг/кг ежедневно в смеси с кормом в течение 10 дней, обеспечивало в сыворотке крови терапевтические концентрации доксициклина (0,45-0,85 мкг/мл) и тиамули-

на (0,3-0,6 мкг/мл), которые в течение всего курса применения превышали МПК для основных бактериальных возбудителей респираторных и желудочно-кишечных инфекций свиней.

9. Убой животных на мясо можно разрешить через 15 суток после последнего введения препарата в дозе 120 мг/кг массы тела (3 кг/т корма), т.к. остаточные количества доксициклина и тиамулина (при пределе детектирования методов 0,01 мкг/г) в паренхиматозных органах и мышечной ткани в этот период не обнаруживаются.

10. Комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина в дозах 100-120 мг/кг массы тела (2-3 кг/т корма) при применении в течение 5-10 дней обладает 93-94% эффективностью при лечении дизентерии и 82-100% эффективностью при лечении энзоотической пневмонии свиней.

1. Разработан и предложен для ветеринарной практики новый комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина для лечения желудочно-кишечных и респираторных заболеваний свиней бактериальной этиологии.

2. Результаты исследований нашли отражение в разработанной нормативной документации, переданной в Россельхознадзор для регистрации лекарственного средства в Российской Федерации:

- стандарт организации «Тиациклин»;

- инструкции по применению Тиациклина в ветеринарии.

3. На лекарственное средство, содержащее в качестве действующих веществ доксициклин и тиамулин, получен патент РФ на изобретение №2287989 «Препарат для профилактики и лечения заболеваний животных и птиц, вызванных микоплазмами или серпулинами в ассоциации с бактериями».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. П.С.Лобова, Б.В.Виолин. Изучение фармакокинетики тиамулина и доксициклина в организме поросят после однократного перорального введения. // Аграрная наука. - 2008. - № 6. - С. 28-30.

2. П.С.Лобова, ББ.Виолин, Т.С.Новик, С.ИЛукина, Е.И.Ковешникова Изучение острой и субхронической токсичности лекарственной формы на основе тиамулина и доксициклина в опытах на лабораторных животных. // Аграрная наука. - 2008. - №10. - С. 33-35.

3. П.С.Лобова, Б.В.Виолин, В.Н.Скворцов. Терапевтическая эффективность антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина при дизентерии и энзоотической пневмонии свиней. // Аграрная наука,- 2008. - №

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

11.-С. 31-32.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" ОГР № 1067746281514 от 15.02.2006г. Москва, Талалихина, 33

Подписано к печати 05.11.2008г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,37. Тираж 100. Заказ 256.

WWW.FRANTERA.RU

Актуальность проблемы.

Респираторные и желудочно-кишечные заболевания свиней бактериальной этиологии наносят значительный экономический ущерб и являются серьезной проблемой ветеринарной практики. Наиболее часто инфекционные заболевания протекают в смешанной форме, что осложняет течение болезни и выбор эффективного лекарственного средства (16; 38; 43; 143).

Для лечения таких ассоциированных инфекций часто недостаточно использование монопрепаратов, т.к. практически не существует антибиотиков, активных против всего спектра микроорганизмов. Поэтому целесообразно применять комбинированные лекарственные средства, обладающие максимально широким спектром действия и активных в отношении как первичного этиологического фактора, например, брахиспир или микоплазм, так и в отношении вторичной бактериальной инфекции, например, эшерихий, стрептококков, стафилококков, гемофилюсов.

Количество антибиотиков, применяемых в свиноводстве, постоянно растет, но из-за широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов не удается полностью ликвидировать инфекционную патологию. Применение научно-обоснованных комбинаций антибактериальных веществ является важным направлением современной химиотерапии бактериальных инфекций, позволяющим не только преодолеть проблему антибиотикорезистентности, но и значительно расширить спектр антимикробного действия. Исходя из анализа данных отечественных и зарубежных исследователей, нам представлялось актуальным разработать удобный в применении и безопасный комплексный антибактериальный препарат, использование которого позволит повысить эффективность лечения широкого спектра смешанных форм инфекционных заболеваний свиней, в том числе энзоотической пневмонии и дизентерии.

В настоящее время наибольшей активностью в отношении основных возбудителей респираторных и желудочно-кишечных инфекций обладают антибиотики из группы макролидов, особенно производные плевромутилина (16; 48; 59; 810; 109; 130). Поэтому в качестве одного из компонентов препарата нами был выбран антибиотик из этой группы - тиамулин, который обладает высокой активностью в отношении микоплазм, брахиспир, гемофшпосов, пасте-релл, бордетелл, стафилококков, стрептококков и др., однако не действует на энтеробактерии, которые часто осложняют течение заболевания.

Антибиотики тетрациклинового ряда активны в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, но слабоактивны в отношении внутриклеточных возбудителей, таких как микоплазмы (56; 69; 101; 170; 172).

Доксициклин, являясь представителем группы тетрациклинов, по сравнению с другими антибиотиками этого ряда обладает более высокой биодоступностью при пероральном введении (более 90%) и способностью за счет своих липофильных свойств лучше проникать в микробную клетку (56).

Основываясь на результатах собственных исследований in vitro и анализа литературных данных, нами был предложен комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина для лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней свиней бактериальной этиологии.

Цели и задачи исследования.

Разработать на основе тиамулина и доксициклина новый комплексный антибактериальный препарат для лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций свиней бактериальной этиологии.

Для этого было необходимо:

- изучить антибактериальную активность доксициклина и тиамулина, обосновать состав и разработать лекарственную форму комплексного антибактериального препарата на основе этих двух антибиотиков;

- разработать требования к качеству препарата и методы его контроля;

- изучить стабильность препарата в процессе хранения;

- определить параметры острой токсичности препарата в опытах на лабораторных животных;

- изучить субхроническую токсичность препарата в опытах на лабораторных животных и поросятах;

- изучить фармакокинетику тиамулина и доксициклина в организме поросят после применения препарата;

- установить сроки выведения остаточных количеств тиамулина и доксициклина из организма поросят после курсового применения препарата;

- определить оптимальную терапевтическую дозу и изучить терапевтическую эффективность комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина в производственных условиях и разработать схему его применения для лечения бактериальных инфекций свиней.

Научная новизна.

Теоретически и экспериментально обоснован состав антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина, установлено взаимоусили-вающее действие комбинации антибиотиков на стафилококки; определены фармако-токсикологические свойства, доказывающие возможность безопасного использования лекарственного средства в терапевтических дозах; обоснованы сроки возможного использования в пищу человека мяса и субпродуктов после применения комплексного препарата; подобрана оптимальная схема применения комплексного антибактериального препарата и проведена оценка эффективности лечения бактериальных инфекций свиней.

Практическая значимость работы.

Разработан и предложен для ветеринарной практики новый комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина для лечения бактериальных инфекций желудочно-кишечного и респираторного тракта свиней.

Разработаны методы контроля качества комплексного антибактериального препарата и установлен срок его годности.

Определены сроки возможного использования в пищу человеку мяса и субпродуктов свиней после применения комплексного антибактериального препарата.

Разработана схема применения комплексного антибактериального препарата при лечении бактериальных инфекций свиней.

Разработана нормативная документация и инструкция по применению комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксицик-лина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- научное обоснование состава комплексного антибактериального препарата.

- качественные и количественные методы контроля комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.

- результаты изучения стабильности комплексного антибактериального препарата при хранении.

- результаты изучения острой и субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата в опытах на лабораторных животных и свиньях.

- результаты изучения фармакокинетики тиамулина и доксициклина и определения сроков выведения остаточных количеств антибиотиков из организма поросят после применения препарата.

- результаты определения терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата при лечении дизентерии и энзоотической пневмонии свиней.

- практические предложения по применению комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 научные работы.