Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Фармако-токсикологическая оценка тримиксана

На правах рукописи

ИШКАЕВА ДЖАМИЛЯ РАФАЭЛЕВНЛ

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ТРИМИКСАНА

16.00.04. - Ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань -2005

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская госуд арственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана »

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор

Гарипов Талгат Валирахманович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Тремасов Михаил Яковлевич

доктор ветеринарных наук, профессор

Софронов Владимир Георгиевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится « & 2005 года в « /а> часов на заседании

диссертационного совета Д-220.012.01. при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном инсппуге (420075, г. Казань, Научный городок-2, ВНИВИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, л

кандидат ветеринарных наук суЬь*******"^- В.И. Степанов

4Ш6

И9ЧЧИ9

3

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ветеринарной наукой и практикой достигнуты значительные успехи в лечении и ликвидации многих болезней животных. Тем не менее, болезни кожи микотической и саркоптоидозной этиологии имеет распространение среди всех видов животных (В.В. Дроздов, 1997; J1H. Скосырских, О.В. Полянская, 1999; JI.H. Гордиенко, ЕВ. Пильщик, 1999; М.А. Шустрова, ВЛ. Арестов, 1999 и др.)- Большинство лекарственных соединений по ряду причин не удовлетворяют современным требованиям (Т.Г. Аббасов, 1982; MA. Ананичков, 1990; JLP. Закие-ва, Р.Р. Закиев, 2001; Ю.А. Нахов, И.Ю. Кугепова, C.B. Ларионов и др., 2000; А.Н. Тйигасов, 1993; BJ1 Беспалов, ОА. Приступа, Н.М. Колычев и др., 2003; L.Garii, L. Larizza, 1988 и др.), поэтому поиск новых биолошчески-актавных веществ актуален.

Одним из перспективных направлений поиска новых средств для лечения саркоптоидозов и дерматомикозов животных является направленный синтез соединений, обладающих широким спектром действия (акарицидным, бактерицидным, фунгицидным). По литературным данным некоторые нитро- и галогенпроизводные бензофуроксанов и бензофуразаной проявляют высокую биологическую активность (Р.Г. Каримова, 2003; М.К. Шиндала, 2004 и др.). Изучение биологической активности и фармако-токсиколошческих свойств дигалогеннитробензофуроксанов позволило выявить наиболее активные и малотоксичные препараты для лечения дерматомикозов и саркоптоидозов, а также в дальнейшем рекомендовать их для ветеринарной практики. Анализ же зависимости биологической активности препарата от его химической структуры позволит в дальнейшем проводить целенаправленный синтез соединений, проявляющих необходимые свойства.

Цель и задачи исследований. Основной целью нашей работы было создание нового лекарственного средства для лечения кожных болезней животных паразитарной и микотической этиологии. Для достижения поставленной цели необходимо было решение следующих задач:

1. Исследовать акарицидную, антимикробную, ангимикотическую активность замещенных нитробензофуроксанов, выявить связь между их структурой и активностью, найти наиболее перспективное соединение.

2. Определить параметры токсичности, кумулятивные свойства 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана, 5,7-дихлор-6-шпробензофуроксана и 5,7-дихлор-4-нитробензофуроксана («Тримиксан»).

3. Изучить отдаленные последствия действия «Тримиксана» на организм животных.

4. Изучить действие «Тримиксана» на клинический статус, гематологический и биохимический состав крови лабораторных животных; определить характер гис-томорфологических изменений, возникающих в организме животных после его применения.

5. Установить лечебную эффективность «Тримиксана» при дерматомшеозах и саркоптоидозах животных, разработать ла ' и схемы его

применения.

Научная новизна. Впервые установлено, что ншробензофуроксаны - новая группа соединений, обладающая широким спектром биологического действия (акарицидным, ангимикотическим, антимикробным). Выявлена зависимость их биологической активности от структуры молекулы. Впервые определены параметры токсичности и клинические проявления токсикоза «Тримиксана». Доказано отсутствие отрицательного влияния «Тримиксана» на общее состояние, морфологический и биохимический состав крови, гистомррфологию тканей животных при длительном применении в рекомендуемых концентрациях и дозах, доказано отсутствие отдаленного последствия действия препарата на организм животных (мутагенность, эмбрио-токсичность, тератогенность). Разработаны лекарственные формы, дозы, схемы применения «Тримиксана» при дерматомикозах и саркоптоидозах животных. Впервые показан высокий терапевтический эффект «Тримиксана» в виде 0,1% спиртового раствора и 0,2% жидкой мази при болезнях кожи животных паразитарной и микоти-ческой этиологии.

Практическая ценность. Установлены закономерности проявления биологической активности производных нитробензофуроксана, что позволяет проводить направленный синтез химических соединений. Определен рад производных нитробензофуроксана, обладающих широким спектром биологической активности (акари-цидной, бактериостатической, фунгисгагаческой).

Рекомендован для внедрения в ветеринарную практику «Тримиксан» в виде 0,1% спиртового раствора и 0,2% жидкой мази, как высокоэффективное средство при псороптозе кроликов, отодектозе, дерматомикозах и гнойном отите плотоядных.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены и получили положительную оценку на: научно-практических конференциях КГАВМ (Казань, 2000, 2001), международной конференции ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященной 125-летию Н.А. Сошественского (КазаньД001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов РТ (Казань,2001), итоговой конференции Республиканского конкурса научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии имени Н.И. Лобачевского (Казань,2002), научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (СПб, 2002), международной научно-практической конференции «Новые энтеросор-бенты и фармакологически активные вещества и их применение в ветеринарии и животноводстве», посвященной 80-легаю Заслуженного деятеля науки РФ, д.в.н., проф. М.И. Рабиновича (Троицк, 2002), семинаре КБАУА в рамках программы пост дипломного образования ветеринарных специалистов (Казань, 2004).

Настоящая работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований ФГОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана (гос. регистрации № 0.1.98.0002094).

Основные положения диссертации, выносимые на защшу:

- замещенные ншробензофуроксаны обладают выраженными фуншстатиче-скими, бактериостаггическими и акарицидными свойствами;

- «Тримиксан» малотоксичен, умеренно кумулятивен при длительном применении;

- «Тримиксан», в рекомендуемой концентрации и кратности применения, не оказывает отрицательного действия на общее состояние, состав крови, морфологию тканей животных, не обладает мутагенным, эмбриотоксическим и тератогенным действием;

«Тримиксан» в виде 0,1% спиртового раствора обеспечивает высокий терапевтический эффект при псороптозе кроликов, отодектозе и гнойном отите собак и кошек;

- «Тримиксан» в виде 0,2% жидкой мази обеспечивает высокий терапевтический эффект при микроспории собак и кошек.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками, содержит 21 таблицу. Список литературы включает 238 источников.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены на кафедре физиологии и этиологии животных ФГОУ ВПО «Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана» в 1999-2005 гг.

Объектами исследований были II1 соединений производных бензофуроксана, которые были синтезированы Фаляховым И.Ф. и Юсуповой JI.M. на кафедре ХТОСА Kl ТУ им. С .М.Кирова с целью поиска новых биологически активных соединений*. Бензофуроксаны достаточно лабильные соединения. Они не устойчивы при действии щелочей, но устойчивы к кислотам.. Бензофуроксаны легко подвергаются нитрованию, образуя 4,6-динитробензофуроксан. При наличии шпрогруппы в бензольном кольце галоген- и дигалогенбензофуроксаны проявляют высокую реакционную способность в реакциях нуклеофильного замещения. Эти соединения ис-пытывались в виде растворов. В качестве растворителя использовали этиловый спирт, диметилсульфоксид (димексид, Р. 75.244.9), для приготовления суспензии в качестве эмульгатора - стеарокс-6 (ГОСТ 8980-75), для приготовления жидкой мази - ПЭО-400. Экспериментальная часть работы выполнена в лабораторных условиях на 24 белых беспородных мышах, 140 белых беспородных крысах, 56 кроликах, 17 собаках, 19 кошках.

Изучение акарицидной активности соединений проведено по общепринятой методике на клещах Psoroptes cuniculi. Наблюдение за клещами вели тотчас же после воздействия препаратов и через 10, 30 мин, 1, 2, 4, 24 часа Контрольных клещей подвергали воздействию 0,5% раствора стеарокса-б. Об акарицидной активности препаратов судили по показателю СК50, который высчитывали по формуле Кербе-раС. (1931).

Определение бактериостатической активности производных бензофуроксана проводили in vitro методом серийных разведений в жидкой питательной среде (Т.Н. Першин, 1971). В опыте была использована бактериальная культура Staphylococcus aureus. Бактериостатические свойства определяли визуально по отсутствию роста культуры в пробирках после суточной инкубации при температуре 37°С.

♦Выражаю благодарность за оказанную консультацию и помощь профессору д.х.н. Фаляхову И.Ф. и профессору д.х.н. Юсуповой Л.М.

Антимикотическое действие производных бензофуроксана

определяли по отношению к Aspergillus niger BKMF-1119 по стандартной методике, принятой Всемирной организацией здравоохранения (Г.Н. Першин, 1971), а к Trichophiton rubrum, Trichophiton gypseum и Microsporum lanosum методом серийных разведений (В.А. Антипов, 1972). Все исследования на тест-объектах проведены в трехкратных повторностях.

Острую токсичность препарата изучали на белых беспородных крысах живой массой 120-150 г, белых беспородных мышах живой массой 18-20 г. Соединение вводили однократно в различных дозах в виде 5% водной суспензии внутрижелудочно и в виде 20% раствора в ДМСО накожно. Контрольным животным вводили раствор эмульгатора в дистиллированной воде и растворитель. Расчеты параметров острой токсичности проводили по методу Миллера и Тейнтера (1944).

Кумулятивные свойства изучали по методу «субхронической токсичности» (Limm R.K., Rink K.G., Glass H.G. Soage-Echague E.,1961). Животным ежедневно вводили препарат в дозе 1/10 LD50 в желудок и на кожу в возрастающих дозах. Контрольным животным вводили 2% раствор эмульгатора или растворителя. Расчет коэффициента кумуляции производили по формуле, предложенной Ю.С. Каганом и В.В.Станкевичем (1970).

Определение раздражающих свойств препарата на кожу и слизистые оболочки проводили согласно методическим указаниям (1985).

Изучение аллергенного действия «Тримиксана» проводили на кроликах методом эпикутанных аппликаций (Методические указания, 1985).

Мутагенное действие определялось на примере His+ реверсий у ауксо-трофного по гистидину штамма ВА13 Salmonella thyphimurium, имеющего мутацию в гене his G46 (А.М. Фонштейн и др., 1986).

Эмбриолетальное и теретогенное действия препарата изучали согласно методическим указаниям (1986) на белых беспородных крысах.

По окончании токсикологических исследований осуществляли умерщвление животных и проводили паталогоанатомическое вскрытие. Патологический материал фиксировали в 10% формалине. Срезы получали с парафиновых блоков. Для изучения общей гистоморфологической картины окраску срезов проводили гематоксилин-эозином.

Влияние «Тримиксана» на морфологический и биохимический состав крови проводили по общепринятым методикам.

Лечебные свойства соединения изучали в условиях in vivo путем местной обработки ушной раковины и пораженных участков кожи животных лекарственными формами, содержащими разную концентрацию действующего вещества.

Клинические испытания препарата проводили в условиях лечебно-консультативного центра ФГОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана г. Казани и в РГУ «Волжская ветеринарная станция по борьбе с болезнями животных» г. Волжска республики Марий-Эл на клинически больных животных.

Статистическую обработку цифрового материала осуществляли на компьютере с использованием табличного процессора Microsoft Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Биологическая активность в ряду замещенных нитробензофуроксана

3.1.1. Акаришишая активность

Изучение акарицидной активности замещенных нитробензофуроксана проводили на 1200 клещах Рзогор1ез сишсиН. Установлено, что в акарицидной активности четко прослеживается связь структура-активность. Нитробензофу-роксаны (нитроБФО), замещенные бензольными фрагментами с различными заместителями, более активны, чем исходное вещество 5,7-дихлор-4,6-динитроБФО, взятое для их синтеза. Анализ полиядерных структур - бис-ариламинопроизводных показал, что акарицидная активность зависит от природы заместителя в ариламинном ядре. Следует отметить, что наибольшему к увеличению акарицидной активности способствуют такие группы как хлор -

' это 5,7-дихлор-4-нитроБФО + 5,7-дихлор-6-нитроБФО (СК5о-0,0044%), 5,7-

дихлор-4,6-динитроБФО + 5,7-дихлор-6-нитроБФО+-5,7-дихлор-4-нитроБФО (СК5о-0,00044%), 4-(3-хлорфениламино)-6-бром-5,7-дигапроБФО (СК50-0,0067%); окси - 2-амино-пирим4аино-молекулярный комплекс с 5-окси-7-хлор-4,6-динитроБФО (СК5о-0,0075%), карбокси-5,7-динитро-4,6-бис-(4-карбоксифениламино)-БФО (СК5о-0,0029%). Понижение акарицидной активности примерно на порядок происходит при замене бензольного кольца на пиридиновое - это 4,6-динитро-5,7-бис-(4-хлорпиридинамино)-БФО (СК50-0,0332%) и 4,6-динитро-5,7-бис-(4-бромпиридинамино)-БФО (СК50-0,0276%). Среди изученных соединений самой высокой акарицидной активностью обладает 5,7-дихлор-4,6-динитроБФО + 5,7-дихлор-6-нитроБФСИ-5,7-дихлор-4-нитроБФО (СК5(Г0,00044%).

3.1.2. Бактериостатическая активность

Бактериостатическую активность замещенных нитробензофуроксана изучали на патогенной культуре Зг.аигеив штамм 209-Р. Контролем служили раствор ДМСО в питательной среде и питательная среда без препарата. Показателем бактериостатической активности служила минимальная бактериостатиче-^ екая концентрация (МБСК,%). Исследования показали, что активность возрас-

тает на порядок и более при замещении атомов галогена в 5,7-дихлор-4,6-динитроБФО ароматическими и гетероциклическими аминами - это следующие I соединения: 4,6-динитро-5,7-бис-(4-хлорпиридинамино)-БФО (МБСК-

0,0056%), 4,6-динитро-5,7-бис-(4-бромпиридинамино)-БФО (МБСК-0,0067%), 5,7-динитро-4,6-бис-(4-карбоксифениламино)-БФО (МБСК-0,00312%), причем также отмечается зависимость активности от природы заместителя в ароматическом или гетероциклическом ядре. Анализ зависимости бактериостатической активности полиядерных структур от природы заместителя в ариламинной группировке показал, что для усиления бактериостатической активности немаловажным оказалось наличие в бензольном кольце заместителя таких групп как окси - это соединение 2-амино-пиримидино-молекулярный комплекс с 5-окси-7-хлор-4,6-динитроБФО (МБСК-0,025%), карбокси - 5,7-дишпро-4,6-бис-(4-карбоксифениламино)-БФО (МБСК-0,003%). Предположительно, что увеличе-

ние биологической активности может быть связано с образованием водородных связей, характерных для донорных групп. Это предположение подтверждается тем, что в случае замены атома водорода в карбоксильной группе пара-аминобензойн'ой кислоты на этильную группу активность соединения понижается примерно в 15 раз (М.К. Шиндала, 2004).

3.1.3. Фунгистатическая активность

Из соединений, проявляющих антимикотическую активность, наибольший интерес представляют соединения, подавляющие рост гриба Aspergillus niger, наиболее устойчивого среди плесневых грибов. Чувствительность к препаратам определяли по их минимальной фунгистатической концентрации (МФСК, %). Исследования позволили выявить яркую зависимость фунгистатической активности бензофуроксановых соединений от строения. Установлено, что фунгистатическая активность возрастает в тех соединениях, где присутствуют такие заместители как атомы галогена в сочетании с нитрогруппой, причем наибольший эффект наблюдается при наличии в структуре атомов хлора. Это следующие соединения: 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан+5,7-дихлор-6-нитробензофуроксан (МФСК-0,0007%), 5,7-дихлор-4-нитроБФО+5,7-дихлор-6-нитроБФО (МФСК-0,0013%), 5,7-дихлор-4,6-динитроБФО+5,7-дихлор-6-нитроБФО+5,7-дихлор-4-нитроБФО (МФСК-0,0011%), 4-(3-хлорфениламино)-6-бром-5,7-динитроБФО (МФСК-0,005%), 4,6-динитро-5,7-бис-(4-хлорпиридинамино)-БФО (МФСК-0,0005%). Также установлено влияние нитрогрупп на фунгистатическую активность и показано, что с увеличением количества нитрогрупп в структуре фунгистатическая активность понижается -соединения 5,7-динитро-4,6-бис-(4-нитрофениламино)-БФО (МФСК-0,1%), 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)-БФО(МФСК-0,05%).

Роль атомов галогена в проявлении фунгистатической активности очевидна и этот факт доказывается тем, что активность 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана уменьшается при замене галогена на ариламинное' ядро, свободное от заместителей - соединение 4,6-динитро-5,7-бис-(фениламино)-БФО (МФСК-0,5%). Установлено, что введение в ариламинное ядро атомов хлора вызывает появление фунгистатической активности - соединения 4-(3-хлорфениламино)-6-бром-5,7-динитроБФО (МФСК-0,005%), 4,6-динйтро-5,7-бис-(4-хлорпиридинамино)-БФО (МФСК-0,0005%). Введение нитро- и карбок-си- групп способствует снижению активности по сравнению с активностью исходного 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана - 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино>БФО (МФСК-0,05%), 5,7-динитро-4,6-бис-(4-

карбоксифениламино)-БФО (МФСК-0,1%). Существенное влияние оказывает положение нитро группы относительно центра замещения. Так, нитрогруппа в орто- и пара положении снижает активность примерно в 100 раз, тогда как при замещении в мета - положение только в 10 раз (М.К. Шиндала, 2004). Зависимость фунгистатической активности синтезированных соединений от структурных особенностей наглядно прослеживается на примере соединения 4,6-динитро-5,7-бис-(4-хлорпиридинамино>БФО (МФСК-0,0005%), в котором в качестве заместителя атома галогена в 5,7-дихлор-4,6-динитроБФО выступает гетероциклический амин - 5-хлор-2-аминопиридин. Замена атома хлора на бром в гетероциклическом амине вызывает потерю фунгистатической актив-

ности - 4,6-динитро-5,7-бис-(4-бромпиридинамино)-БФО. Из литературы известно, что наибольшей активностью обладают соединения, содержащие атомы галогена, следовательно, в исследуемых соединениях высокая фунгистатиче-ская активность не противоречит общей закономерности, выявленной для нит-робензофуроксанов.

Соединение 5,7-дихлор-4,6-динитроБФО+6-нитро-5,7-дихлорБФО+ 5,7-дихлор-4-нитроБФО («Тримиксан») дополнительно бьшо исследовано на фун-гистатическую активность в отношении патогенных грибов, это Microsporum lanosum (МФСК-0,0156%), Trychophiton gipseum (МФСК-0,0078%) и Trychopbi-ton rubrum (МФСК-0,004%). Анализ проведенных исследований показывает, что «Тримиксан» проявляет широкий спектр биологического действия, а по акарицидной активности ему нет равных в исследуемом ряду соединений.

3.2. Определение параметров острой токсичности «Тримиксана»

Нами изучена токсичность «Тримиксана» на двух видах животных (белых крысах и мышах) при внутрижелудочном пути введении, а также при накожном пути введения на белых крысах. Исследуемое вещество в виде 5% водной суспензии вводили однократно крысам и мышам в желудок при помощи зонда. Контрольная группа получала 2% раствор стеарокса (эмульгатора).

Однократное внутрижелудочное введение исследуемого «Тримиксана» в дозе 500 мг/кг белым крысам не вызывало изменений в поведений и'общем состоянии животных. Эту дозу мы определили как максимально переносимую (МПД). В последующие десять дней наблюдения животные оставались живыми, были подвижны, хорошо поедали корм. После введения препарата в дозе 600 мг/кг, животные проявляли беспокойство, пытались зарыться в подстилку, через 50-60 мин затихали и вели пассивный образ жизни. Спустя 24 часа общее состояние опытных животных не отличалось от контрольных. Введение препарата в дозах 800 мг/кг, 900 мг/кг вызывало общее угнетение животных, а перед гибелью - судороги. Через 2-24 часа часть крыс погибала. В дозе 1000 мг/кг токсическое действие проявлялось через 30-60 мин: угнетение двигательной активности, отказ от еды, судороги. Гибель всей группы наблюдалась через 24-48 часов. При вскрытии только что погибших крыс наблюдали венозный застой в органах, тканях, кровонаполненые сосуды брюшных органов, отек легких, ас-фиксическое сердце, вздутие желудочно-кишечного тракта. Это позволило прийти к выводу, что гибель животных наступала от остановки дыхания. На основании выживаемости животных в группах после введения исследуемого препарата была рассчитана среднесмертельная доза (ЛД50) по методу Миллера и Тейнтера (1944), которая составила 723 мг/кг.

Однократное внутрижелудочное введение «Тримиксана» белым мышам в дозе 300 мг/кг не вызывало видимой интоксикации, поведение животных в данной подгруппе не отличалось от контрольной. В дозах 400-800 мг/кг отмечалось общее угнетение животных. Мыши забивались в подстилку, шерстный покров был взъерошен. Они потирали лапами мордочки, встряхивали головой, выгибали спину. Возможно, эти клинические признаки отравления вызваны

раздражением рецепторов слизистой желудка. Гибель животных наступала через 24-36 часов после введения препарата. При паталогоанатомическом исследовании погибших животных было отмечено асфиксическое сердце, гиперемия и отек легких, полнокровие слизистых оболочек желудка, тонкого отдела кишечника, печени, почек. На основании выживаемости животных в группах после введения исследуемого препарата была рассчитана среднесмертельная доза (ЛДзо) по методу Миллера и Тейнтера, которая составила 448 мг/кг. Установленные в результате исследований параметры острой токсичности при введении в желудок для белых мышей и крыс приведены в таблице 1. Вариабельность смертельных Доз определяли отношением показателей ЛД^ к ЛД]6 и в опыте с мышами этот показатель равен 2,8; а в опыте с крысами - 1,7.

Таблица 1

Параметры острой токсичности «Тримиксана»- при введении в желудок

Вид животных Дозы, мг/кг

ЛД,6 ЛДзо ДЦи

Белые мыши „зю 448,0±60,8 675

Белые крысы 549 723,0±62,0 921

л ' 1

Согласно ГОСТ 12.1.007-76 (1999), «Тримиксан» относится к веществам III класса токсичности.

Острую токсичность «Тримиксана» при накожном применении (количественная оценка ко^ногрезорбтивного действия) изучали на 24 беспородных белых крысах обоего пола со средней живой массой 150-180г по методу Миллера и Тейнтера (М Л. Беленький, 1963).

Белым крысам шести опытных групп на предварительно (за сутки до опыта) выстриженные участки кожи на спийе наносили однократно 20% раствор «Тримиксана» в ДМСО в дозах 300 мг/кг, 500 мг/кг, 700 мг/кг, 900 мг/кг, 1100 мг/кг, 1300 мг/кг. Животным контрольных групп в тех же количествах наносили ДМСО.

«Тримиксан» в виде 20%-го раствора (300 мг/кг) оказывал незначительное раздражающее действие на кожу животных, которое исчезало в течение 5-6 часов. В течение 10 суток с момента нанесения препарата крысы оставались живы, по поведению ничуть не отличались от контрольных. Применение «Тримиксана» в более высоких дозах вызывало беспокойство животных. Крысы активно двигались по клетке, зарывались в подстилку, пытались слизывать нанесенный препарат. Через 5-10 часов наступали вялость животных, затем клони-ческие судороги, непроизвольное мочеиспускание. Гибель животных наступала через 24-48 часов после нанесения препарата. При паталогоанатомическом вскрытии павших животных визуально отмечали кровенаполненность и тупые края печени, селезенка кровенаполнена и увеличена. На месте нанесения препарата отмечалась отечность, гиперемия кожи и подкожной клетчатки, местами отмечали кровоизлияния.

По числу павших и выживших животных были рассчитаны параметры кожно-резорбтивного действия «Тримиксана» по методу Миллера и Тейнтера

(1944), результаты которых приведены в таблице 2. Вариабельность смертельных доз определяли отношением показателей ЛД*» к ЛД)6, показатель при накожном применении составил 2,85.

Таблица 2

Параметры острой токсичности «Тримиксана» при накожном применении

Вид животных Дозы, мг/кг

лд16 Л&о ДЦм

Белые крысы 400 655,0± 123 1140

Критерием всасывания вещества через кожу является кожно-оральный коэффициент, который вычисляли как отношение ЛДя^йри накожном применении к ЛДзд при введении в желудок (Методическйе указкййя| 1985). Для «Тримиксана» этот показатель составил 1,6.

Таким образом «Тримиксан» в виде 20% раствора в ДМСО хорошо проникает через кожу и вызывает ту же клиническую картину отравления, что и при внутрижелудочном введении. Согласно классификации пестицидов по параметрам кожно-резорбтивной токсичности «Тримиксан» можно отнести к препаратам со слабовыраженной токсичностью (ЛДзо> 1 ОООмг/кг) (В.И.Мартыненко и др., 1997).

3.3. Определение кумулятивных свойств «Тримиксана»

Выявление эффекта кумуляции при внутрижелудочном введении и при накожном применении проводили по методу "субхронической токсичности" на 24 беспородных крысах обоего пола со средней живой массой 120-170 г.

При внутрижелудочном введении исследуемое вещество в виде 5% водной суспензии задавали крысам при помощи зонда в течение тридцати дней; первоначальная ежедневная доза была 72,3 мг/кг, что составляет 1/10 часть от однократной ЛДзо при внутреннем введении. Контрольным животным вводили такое же количество 2% водного раствора стеарокса. Затем каждые последующие 4 суток дозу препарата увеличивали в 1,5 раза.

После введения исследуемого вещества крысы проявляли беспокойство, пытались зарыться в подстилку. Признаки токсического отравления стали проявляться на седьмые сутки после первоначального введения препарата, когда вводимая доза была 108,85 мг/кг, а суммарная доза - 615,75 мг/кг. В последующие дни крысы были угнетены, шерсть взъерошена, присутствовало снижение аппетита. Первая крыса пала через 9 дней с начала опыта, получив суммарную дозу 724,6 мг/кг, последняя 1фыса пала на 29 день, получив суммарную дозу 9995,7 мг/кг. При вскрытии павших крыс было отмечено вздутие желудочно-кишечного тракта, асфиксическое сердце, печень темного цвета, увеличена, отек легких. Установлено, что коэффициент кумуляции при пероральном введении равен 5,2.

При накожном применении «Тримиксан» в виде 20% раствора в ДМСО наносили крысам (на ранее выстриженный участок кожи на спине) в течение 16

дней; первоначальная ежедневная доза была 65,5 мг/кг. После нанесения препарата крысы пытались достать обработанный участок на спине, бегали по клетке, затем забивались в угол. Кожный покров был мокрым от частого облизывания. Первые признаки отравления появились на 3-4 сутки с начала опыта. Животные отказывались от корма, были угнетены. В местах нанесения препарата появились уплотнение ткани и гиперемия. На 5 сутки погибли 2 крысы, получив суммарную дозу 360,25 мг/кг, последняя пала на 16 сутки, получив суммарную дозу 1907,9 мг/кг. Все погибшие крысы подвергались паталого-анатомическому вскрытию. У них отмечалось гиперемия кожного покрова, печень увеличена, с тупыми краями, темного цвета, селезенка увеличена, крове-наполнена, сердечная мышца с отдельными кровоизлияниями, правый желудочек кровенаполнен. Таким образом, установлено, что коэффициент кумуляции «Тримиксана» при накожном применении равен 1,28.

Анализ результатов опытов по изучению кумулятивного свойства «Тримиксана» при разных путях применения с использованием разных растворителей и разных лекарственных форм показал, что применение ДМСО как растворителя значительно повышает всасываемость препарата в организм.

3.4. Определение раздражающего действия «Тримиксана» на кожу и слизистые

Раздражающее действие «Тримиксана» изучали на 17 белых крысах обоего пола живой массой 140-160 г и 20 кроликах живой массой 2,5-3 кг. Нами изучено действие 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25% и 0,1% суспензии препарата на стеароксе-6, растворов в ДМСО (такие же концентрации) и 0,5%, 0,25%, 0,1% растворов «Тримиксана» в 70% этиловом спирте. Приготовленный препарат наносили однократно на ранее выстриженный участок кожи размером 2x2 см (у крыс) и 4x5 см (у кроликов) объемом 1 мл и 2 мл соответственно. На параллельный участок кожи, который являлся контролем, наносили такой же объем эмульгатора или растворителя. Наблюдение за животными вели в течение первых 6 часов после аппликации, затем 1 раз в день в течение 10 суток.

«Тримиксан» оказывал сильное раздражающее действие на кожу кроликов в виде 10% раствора в ДМСО. В течение первых 6 часов после нанесения препарата, отмечали у животных выраженную гиперемию, эритему, в более поздние сроки - отек, расчесы, выпадение волос, образование корочки. Последствия раздражающего действия препарата проходили через 18-20 дней. На кожу крыс данная форма препарата оказывала менее выраженное действие. Отмечали лишь незначительную инфильтрацию, отечность кожи при наличии эритемы.

Препарат в концентрациях 5%, 2% также оказывал раздражающее действие, выраженность которого была сильнее у кроликов, чем у крыс. «Тримиксан» в указанных концентрациях вызывал заметную гиперемию кожи, которая проходила через 24-30 часов без существенных последствий. Замечено, что ДМСО всегда повышает раздражающее действие препарата на кожу.

Суспензия на стеароксе-6 и раствор в ДМСО, содержащие 1%, 0,5%. 0,25% и 0,1% «Тримиксана» не вызывали видимой реакции кожи. Спиртовые растворы в изученных концентрациях не оказывали раздражающего действия

на коясу белых крыс и кроликов, хотя вызывали незначительную гиперемию участка кожи, что объясняется, по-видимому, раздражающим действием этилового спирта.

Действие «Тримиксана» на слизистые оболочки глаз определяли путем однократного нанесения 2 капель 0,5%, 0,2% и 0,1% суспензии на конъюнктиву глаза кроликов. В опыте было использовано 6 кроликов обоего пола весом 2,54 кг. При нанесении суспензии препарата оттягивали внутренний угол конъ-юнктивального мешка, затем в течение 1 мин прижимали слезно-носовой канал. Животным опытных групп на конъюнктиву правого глаза закапывали по две капли суспензии исследуемого препарата, а левого - водопроводной воды комнатной температуры (18-20°С). Кроликам контрольной группы на конъюнктиву правого глаза закапывали по две капли раствора стеарокса, а левого - водопроводной воды комнатной температуры (18-20°С). Состояние животных оценивали через 5, 30, 60 мин после нанесения препарата и ежедневно в течение 10 Дней, при этом обращали внимание на состояние оболочки глаза, слезоточивость, отечность, гиперемию.

Установлено, что 0,5% суспензия «Тримиксана» вызывает слезотечение, которое прекращается через 1.5-2 часа и незначительную гиперемию капилляров конъюнктивы, сохраняющуюся 3-4 часа, которая проходила через 2 суток. Суспензии с меньшим содержанием препарата (0,2% и 0,1%) вызывали незначительное слезотечение, которое прекращалось через 20-30 мин с начала опыта. У животных контрольной группы на правом глазе (место нанесения стеарокса) наблюдали незначительную гиперемию и слезотечение, которое Прекращалось через 30 минут.

Таким образом, установлено, что 0,5%, 0,25%, 0,1% растворы всех изученных форм препарата не оказывают раздражающего действия на кожу животных. Лечебные концентрации препарата - 0,2% И 0,1% суспензии не оказывают отрицательного воздействия на слизистые оболочки животных.

3.5. Определение аллергенных свойств «Тримиксана»

Аллергенные свойства препарата изучали на 12 кроликах массой 1,5-2 кг. На первом этапе опыта оценивали первично-раздражающее действие препарата путем однократных накожных аппликаций различных его разведений с целью определения концентрации, которая не вызывает реакцию кожи животных. Такой концентрацией является 1 % раствор препарата в ДМСО. На втором этапе животных сенсибилизировали путем многократных аппликаций препарата в 1% концентрации на один и тот же участок кожи. Для этого предварительно (за сутки до опыта) выстригали волосы на участке спины размером 2x3 см. Аппликации делали в направлении от шеи к хвосту. На поверхность кожи наносили 1 % раствор «Тримиксана» в ДМСО объемом 0,1 мл, выдерживали 4 часа и смывали дистиллированной водой. На 10-й день нанесения препарата у кроликов наблюдалась слабая гиперемия кожи, и нанесение раствора было прекращено. Через 21 день после последней аппликации на свежевыстриженный участок кожи на спине наносили разрешающую дозу - 1 мл в той же концентрации. Учет реакции проводили через 24

часа. Признаков аллергической реакции экспериментальных животных не выявили. Таким образом, «Тримиксан» не обладает аллергизирую-щим действием.

3.6. Изучение отдаленных последствий действия «Тримиксана»

Мутагенное действие «Тримиксана» изучали согласно методике (A.M. Фонштейн и др., 1986). Метод основан на индукции испытываемых ветеринарными препаратами или их метаболитами обратных мутаций от ауксотрофности к прототрофности Индикаторных штаммов сальмонелл по гистидину, а именно минимальную концентрацию, цри которой подавляется рост бактерий. Для «Тримиксана» эта концентрация составила 70 мкг/мл. •

На следующем этапе проводили полуколичёственное определение генных мутаций с внесением растворов препарата в слой полужидкого агара с метабо- |

лической активацией in vitro и визуальном учете числа колоний ревертантов в 1

опытных и контрольных чашках Петри. В качестве позитивного контроля использовали 0,1 мл раствора нитрозометилмочевины (100 мкг/мл). Учет результатов проводили через 48 часов инкубации, подсчитывая число колоний ревертантов. Ошыт проводили в трехкратной повторности.

> Анализ резуйьтатов позволяет сделать вывод, что в исследуемом диапазоне концентраций препарат подавлял появление мутантов в опыте, и только при концентрации 0,015 мкг/мл число мутантов в опыте сравнялось с таковым в контроле. Это говорит о том, что «Тримиксан» не проявляет на данной мутационной модели мутагенных свойств.

Эмбриотоксические свойства препарата включают в себя эмбриолеталь-ное и тератогенное действия его на организм животного.

Животные были разделены на две группы. Опытным животным первой группы исследуемый препарат задавали внутрижелудочно в виде 1% суспензии (растворитель - стеарокс) в дозе 40 мг/кг (терапевтическая доза). Животные второй группы получали препарат накожно в виде 1% раствора в ДМСО, также в дозе 40 мг/кг. За подопытными животными вели ежедневные наблюдения в процессе получения препарата и в течение 30 суток после последнего введения ,

препарата (третья группа). Контрольным животным вводили дистиллирован- '«

ную воду, накожно - физиологический раствор. Исследования по воздействию растворителя ДМСО на организм животных были проведены Р.Г. Каримовой \

(2003). Выявлено, что в дозе 32 мг/кг ДМСО не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия.

В опыте при внутрижелудочном введении использовали 18 самок, массой тела 200-220 г. Животных разделили на 3 группы, по 6 крыс в каждой. Каждую группу разделили на 2 подгруппы, по 3 — в контрольной и 3 — в опытной. Эм-бриотоксическое действие устанавливали после эвтаназии самок крыс первых 2-х групп на 15-й и на 20-й день беременности, с подсчетом в матке живых и мертвых плодов, а в яичнике желтых тел. Плоды и плаценты взвешивали, осматривали их на наличие кровоизлияний, аномалий. Определяли размеры плодов. Третью группу оставляли до родов.

Исследования показали, что введение «Тримиксана» первой'группе внутрижелудочно в виде 1% суспензии в дозе 40 мг/кг беременным животным в течение 15 суток один раз в сутки не оказывало отрицательного воздействия на их клиническое состояние и эмбриогенез. Некоторыё различия в средней массе и длине плодов, а также в весе плаценты и количестве желтых тел в яичнике среди опытных и контрольных: групп были не достоверны. Эти исследования показали, что препарат «Тримиксан» в виде 1% суспензии при внутрижелудоч-ном введении не оказывал отрицательного воздействия на развитие плодов белых крыс. Введение препарата беременным животным в течение 20 суток (один раз в сутки) не оказывало отрицательного воздействия на их клиническое состояние и эмбриогенез. Все различия показателей размеров плодов также были» не достоверны, в процессе опыта не было отмечено отрицательного воздействия препарата на развитие плодов.

Анализ проведенных исследований показал,"что многократное внутриже-лудочное введение «Тримвдссана» в виде 1%'суспензйи в дозе 40 мг/кг не оказывает отрицательного воздействия на клиническое состояние беременных белых крыс. Показатели размеров плодов (вее, длина) в опытных и контрольных -группах на 15 и 20 дни внутриутробного развития и после рождения, существенно не отличались. При осмотре половых органов'видимых отличий не обнаружено. После родов кормление и уход за потомством самками белых крыс в опытной и контрольной группах был одинаковым. Потомство всех групп развивалось без видимых изменений, и сохранность приплода к 20 дню постна-тального периода была 100%.

Животным второй группы «Тримиксан» наносили накожно в виде 1% раствора (растворитель - ДМСО) также в дозе 40 мг/кг. В опыте использовали 18 самок, живой массой 210-230 г. Животных разделили на 3 группы, по 6 крыс в каждой. Каждую группу разделили на 2 подгруппы — контрольную и опытную, по 3 особи в каждой. Начиная с первого дня беременности, ежедневно в течение 20 дней подряд, наносили 1% раствор «Тримиксайа» в ДМСО накожно, равномерно по участку в дозе 40 мг/кг. Контрольным животным на выстриженный участок наносили 0,85% раствор Натрия хлорида. В течение всего эксперимента вели наблюдение за клиническим состоянием подопытных животных. Эмбриотоксическое действие определяли после эвтаназии также на 15-й день беременности и на 20-й день, третью группу оставили до родов. В опытной группе общее количество плодов незначительно отличалось от контрольной группы, некоторое различие в показателях размеров плодов белых крыс (вес, длина) опытных и контрольных групп были не достоверны.' Эти исследования показали, что «Тримиксан» при накожном применении не оказывает отрицательного воздействия в начальный период развития плодов белых крыс.

Анализ полученных результатов позволяет констатировал, что исследуемый препарат в дозе 40 мг/кг при накожном применении не оказывает токсического действия на внутриутробное развитие плодов. У остальных белых крыс на 21-22 дни беременности наступали роды. Установлено, что «Тримиксан» в виде 1% раствора в ДМСО при накожном применении в дозе 40 мг/кг не оказывает отрицательного воздействия на клиническое состояние белых крыс.

Потомство обеих групп отличий в развитии не имели. К 20 дню постнатального развития сохранность приплода была 100%-ой.

Обобщенный анализ проведенных исследований позволяет констатировать, что «Тримиксан» при наружном и внутреннем поступлении в организм животных в терапевтической дозе 40 мг/кг в виде 1% концентрации не проявляет выраженного эмбриотоксического и тератогенного действия.

3.7. Изучение влияния «Тримиксана» на морфологический и биохимический состав крови

Исследования были проведены на 12 клинически здоровых кроликах весом 2.5-4 кг, подобранных по принципу аналогов. Раствор препарата в ДМСО наносили на ранее выстриженный участок кожи 4x5 см в межлопаточной части в 1% концентрации (концентрация не вызывающая реакции кожи животных) в дозах 40 мг/кг (терапевтическая доза) и 80 мг/кг. Способ введения препарата соответствовал способу, рекомендованному для клинического применения. Контрольным животным наносили ДМСО и воду. До начала опыта у животных брали кровь на исследования, затем препарат наносили 30 дней подряд один раз в сутки. Забор крови проводили при помощи стерильной иглы из краевой ушной вены утром до кормления на 5,12,15,20,30 дни в период проведения опыта.

Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что «Тримиксан» в дозе 40 мг/кг и 80 мг/кг при длительном накожном применении не вызывает достоверных изменений как биохимических (общий белок и сахар), так и морфологических показателей крови кроликов. Незначительные колебания отмечались как в контрольных, так и в опытных группах.

3.8. Патоморфологические изменения в органах и тканях белых крыс при накожном применении «Тримиксана»

Изучение патоморфологических изменений в органах и тканях белых крыс при накожном применении «Тримиксана» проводили на 15 белых крысах обоего пола живой массой 180-200 г. Животные были разделены на две группы - опытную и контрольную. Крысы контрольной группы получали дистиллированную воду. Крысы опытной группы были разделены на четыре подгруппы.

Животным первой подгруппы исследуемый препарат наносили на ранее выстриженный на спине участок (2x2 см) накожно в виде 1%-ого раствора (растворитель - ДМСО) в дозе - 40 мг/кг, ежедневно, в течение 14 дней. Суммарная доза, полученная каждой крысой в данной подгруппе, составила 560 мг/кг. У крыс этой опытной подгруппы при гистологическом исследовании кожи в эпидермисе выявили многослойный плоский ороговевающий эпителий, волосяные фолликулы и корень волоса по микроструктуре были подобны таковым у контрольных животных. Сосочковый и сетчатый слои дермы, подкожная соединительная ткань гистологически соответствовали нормативным показателям. Печень имела сглаженный рисунок балочного строения в дольках с признаками дискомплексации гепатоцитов, выраженными более отчетливо центролобулярно. Центральные вены имели расширенные просветы. Синусоидные капилляры переполнены кровью, отмечали слад-

жирование эритроцитов с образованием «монетных столбиков». В почках в корковом веществе отмечаются переполненные кровью капилляры гломерул с расширением просветов капсулы нефронов, сосуды микроциркуляторного русла в интерсгиции переполнены кровью, эпителий собирательных трубок большей частью десквамировался. В мозговом веществе выявили некротические изменения эпителия тонких канальцев петли нефронов, дистонию сосудов интерстиция, очаш микрокровоизлияний.

Животным второй подгруппы исследуемый препарат наносили накожно в виде 0,2%-ого раствора (растворитель - ДМСО) в дозе - 40 мг/кг, ежедневно, в течение 14 дней. Суммарная доза, полученная каждой крысой в данной подгруппе, составила 560 мг/кг. При гистоисследовании патологического материала животных этой подгруппы видимых изменений в органах и тканях белых крыс не установлено.

Животным третьей подгруппы исследуемый препарат наносили накожно в виде 20%-ого раствора (растворитель - ДМСО) ежедневно, в течение пяти дней. Суммарная доза, полученная каждой крысой в данной подгруппе, составила 360 мг/кг. При гистоисследовании кожи соединительная ткань сосочкового слоя и поверхностной зоны сетчатого подвержена глыбчатому распаду и инфильтрирована большим количством лимфоидно- гистиоцитарных клеток, фибробластов и фиброцитов. В печени венозные сосуды умеренно налиты кровью. Периваскулярная соединительная ткань некоторых сосудов инфильтрирована лимфоидно-гистиоцитарными клетками. Во всех зонах большинства печеночных долек обнаруживаются отдельные гепатоциты или группы гепатоцитов, сильно увеличенные в объеме, с грубозернистой цитоплазмой, лишенные ядра, встречаются гепатоциты с ядрами в состоянии пикноза. В почке венозные сосуды и капилляры полнокровны, встречаются нефроны, в которых эпителиальные клетки проксимальных извитых канальцев подвержены зернистой дистрофии. В мозговом веществе почки выявляли расширение просветов тонких канальцев петли нефронов, набухания выстилающих их эпителиальных клеток с кариолизисом ядер, наличие микрокровоизлияний.

Животным четвертой подгруппы исследуемый препарат наносили накожно в виде 20%-ого раствора (растворитель - ДМСО) ежедневно, в течение десяти дней. Суммарная доза, полученная каждой крысой в данной подгруппе, составила 950 мг/кг. При гистологическом исследовании кожи выявлено, что базальные, призматические и шиповатые клетки производящего слоя эпидермиса уменьшены в объеме, имеют уплотненную цитоплазму и пикнотичное ядро, роговой слой утолщен. В печени центральные вены и синусоиды слабо налиты кровью. Рисунок балочного строения печеночных долек сглажен. Цитоплазма большинства центролобулярных гепатоцитов вакуолизирована. В почке местами встречались отдельные нефроны, в которых эпителиальные клетки проксимальных извитых канальцев находились в состоянии умеренно выраженной зернистой дистрофии, эпителиоциты указанных канальцев подвергались набуханию, цитоплазма их становилась зернистой, разреженной. Значительное количество эпителиоцитов не содержало ядер. В просвете этих канальцев находилась зернистая эозинофильная масса с примесью спущенных клеток.

( Таким образом, «Тримиксан» в малых концентрациях (0,2%) в дозе 560 мг/кг безвреден, а в дозах превышающих лечебные в 4 раза и в концентрациях превышающих лечебные в 100 раз, вызывает необратимые изменения в органах и тканях белых крыс.

3.9. Разработка лекарственных форм и изучение лечебной эффективности «Тримиксана» при саркоптоидозах и дерматомикозах

В связи с тем, что «Тримиксан» практически не растворим в воде, возникла необходимость подобрать подходящие растворители для создания удобных для применения лекарственных форм. Лучшим растворителем для «Тримиксана» является диметилсульфоксид. Также при приготовлении лекарственных форм мы использовали в качестве растворителя 96% этиловый спирт, а затем доводили до нужного объема и 70% концентрации дистиллированной водой.

Суспензии. При разработке суспензий в качестве поверхностно-активных веществ нами использовался стеарокс-6. Для приготовления суспензии навеску исследуемого вещества растирали в ступке с эмульгатором в различных соотношениях и по каплям при постоянном растирании добавляли дистиллированную воду. Полученную суспензию помещали в химические стаканы и оставляли при комнатной температуре на 24 часа, 5,10 суток, после чего взбалтывали и проверяли на однородность. Суспензию готовили в соотношении 1: 0,5 (1 часть препарата и 0,5 части эмульгатора - стеарокса-6). Установлено, что после 24 часового хранения однородность суспензии нарушается и при взбалтывании не восстанавливается. Следует отметить, что водные суспензии препарата удобны для массового применения, но они не стабильны и не могут храниться долгое время.

Жидкая мазь. Для местного применения на ограниченных участках кожи требовалась разработка других лекарственных форм. Поэтому мы взяли в качестве растворителя ДМСО, а в качестве основы ПЭО-400, также в раствор добавлялась дистиллированная вода. Навеску препарата растворяли в ДМСО, затем добавляли ПЭО-400 и уже водой доводили до нужного объема. «Тримиксан» в форме жидкой мази обладает стабильностью, не выпадает в осадок, может храниться длительное время (до трех лет), пригоден только для наружного применения. Кроме того, нами были разработаны капли для лечения отодектоза плотоядных. Навеску действующего вещества растворяли в 96% этиловом спирте (90 мл) и добавляли затем воды (26 мл), получаем 0,1% раствор «Тримиксана» в 70% этиловом спирте. Таким образом, на клинические испытания были предложены суспензия (жидкая мазь) на ПЭО-400 и ушные капли в 70% этиловом спирте.

Изучение лечебной эффективности «Тримиксана» при ушной форме чесотки проведено на 12 кроликах с разной степенью поражённости. В некоторых случаях псороптоз сопровождался гнойным отитом. В соскобах, взятых из ушной раковины кроликов, обнаруживались подвижные клещи Рзогс^еБ си-шсиН. Лечебная эффективность «Тримиксана» против псороптоза кроликов изучена в пяти группах опытов:

В первой группе опыта на трех кроликах применяли ОД % жидкую мазь «Тримиксана» (препарат, ДМСО, ПЭО, вода). Обрабатывали больных животных ватным тампоном 7 дней один раз в сутки.

Во второй группе опыта на трех кролика^ использовали 0,2 % жидкую мазь (препарат, ДМСО, ПЭО, вода), которую наносили один раз в сутки в течение 7 дней.

В третьей группе - 0,2 % спиртовой раствор, в четвертой - 0,1 % спиртовой раствор. В пятой группе - 0,05 % спиртовой раствор. Препарат наносили пипеткой в каждое ухо от трех до пяти капель, в зависимости от тяжести заболевания, в течение 5-7 дней однократно. Изучаемый препарат применяли на участки поражения без предварительной подготовки.

Установлено, что в первой (0,1% жидкая мазь) и во второй группе (0,2% жидкая мазь) наблюдалось полное выздоровление животных через семь дней. После нанесения препарата уже на второй день было отмечено отслоение пораженного эпидермиса и продуктов жизнедеятельности клещей. Препарат в данных концентрациях не вызывал раздражения кожи. В третьей и четвертой группе уже после двукратного нанесения препарата клещи в соскобах не обнаруживались. Полное выздоровление) кроликов наступало на 5-6 день, в случаях осложнения течения псороптоза гнойным отитом - на 7-8 день. В пятой группе полного выздоровления животных не наблюдалось даже после повторного курса лечения.

Таким образом, «Тримиксан» в форме 0,1 % спиртового раствора и 0,1% - 0,2 % жидкой мази обладает хорошим лечебным действием при псороптозе кроликов. Обработка ущной раковины один раз в сутки в течение 5-7 дней обеспечивает полное выздоровление животных. Через 20 дней в соскобах, взятых у вылеченных животных, клещи не обнаружены. Однако следует отметить, что лекарственная форма жидкой мази не очень удобна для обработки ушной раковины, поэтому в дальнейшем для лечения псороптоза и отодектоза плотоядных мы рекомендовали 0,1% спиртовые ушные капли.

Собакам 0,1% спиртовой раствор «Тримиксана» наносили на внутреннюю поверхность ушных раковин с последующим растиранием их основания, в количестве 1-5 капель, в зависимости от тяжести заболевания, один раз в сутки в течение 5-7 дней. Отторжение корочек начиналось на 2-3 сутки от начала лечения. Препарат при соблюдении кратности и дозировки не раздражал кожу, не вызывал побочных эффектов. Выздоровление животных наступало в среднем на 7-9 сутки.

Клинически больным кошкам 0,1% спиртовой раствор «Тримиксана» наносили на внутреннюю поверхность ушных раковин с последующим небольшим растиранием их основания, в количестве 1-3 капель, в зависимости от тяжести заболевания, один раз в сутки, в течение 5-7 дней,, после предварительной чистки поверхности ушной раковины 3% раствором перекиси водорода. На 6-7 сутки лечения кожный зуд на месте поражения полностью- прекращался, также не наблюдалось выделение гнойного экссудата, у животных появлялся аппетит. Препарат не раздражал кожу и не вызывал местных и общих отеков. Выздоровление животных наступало, в среднем, на 9-10 сутки с начала лечения. --

Анализируя полученные результаты лечения больных животных с ото-дектозами и гнойными отитами, можно сделать вывод, что 0,1% спиртовой раствор «Тримиксана» при 5-7 кратном применении один раз в сутки обеспечивает полное выздоровление от отодектоза и отодектоза, осложненного гнойным отитом, не вызывая при этом местных и общих побочных действий.

Диагноз на микроспорию ставили на основании клинических признаков болезни, по результатам лабораторных исследований соскобов, взятых с пораженных участков. «Тримиксан» применяли в виде 0,2% - ной жидкой мази один раз в сутки в течение 5-7 дней. Лечению было подвергнуто 7 кошек и 9 собак. После первого применения животные меньше беспокоятся, охотнее принимают корм, повторное применение ускоряет отторжение корочек и появление под ними волос. Появление роста волос на пораженных местах наступает в среднем через 8-10 дней, полное выздоровление животных через две недели. «Тримиксан» не раздражал кожу и не вызывал побочных местных и общих действий. Таким образом, установлено, что «Тримиксан» в виде 0,2% жидкой мази при 5-7 кратном применении один раз в сутки является эффективным средством для лечения микроспории собак и кошек.

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые созданы соединения из класса нитробензофуроксанов, обладающие широким спектром биологического действия, что дает возможность использовать их как лечебные средства при поражениях кожи животных микотической и паразитарной этиологии.

2. Замещенные нитробензофуроксаны обладают выраженными акарицидны-ми, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами. Наиболее активным соединением является 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан+5,7-дихлор-6-нитробензофуроксан + 5,7-дихлор-4-шпробензофуроксан («Тримиксан»).

3. «Тримиксан» относится к соединениям III класса токсичности (ГОСТ 12.1.007-76). Его ЛД50 для белых крыс при однократном внутрижелудоч-ном введении составляет 723,0±62,0 мг/кг, для мышей - 448,0±60,8 мг/кг. В зависимости от применяемого растворителя острая токсичность меняется. Так при накожном применении в виде 20% раствора в ДМСО ЛД50 на 68,0 мг/кг ниже (655,0±12 3 мг/кг), чем при внутреннем введении. Коэффициент кумуляции при внутрижелудочном введении в виде 5% суспензии- 5,2, при накожном нанесении 20% раствора в ДМСО - 1,28.

4. «Тримиксан» при накожном применении в концентрациях до 1% не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки, не обладает аллергенным действием.

5. «Тримиксан» не обладает мутагенным действием (тест Эймса), эмбриоток-сическим и тератогенным действиями.

6. При накожном применении в течение 30 дней «Тримиксан» в дозе 40 мг/кг не оказывает отрицательного влияния на биохимический и морфологиче-

с кий состав крови кроликов, не вызывает морфологических изменений в органах белых крыс.

7. Разработаны лекарственные формы «Тримиксана», удобные для наружного применения. Наиболее активными являются 0,1% спиртовые капли на 70% этиловом спирте и 0,2% жидкая мазь на ПЭО-400.

8. Установлена лечебная эффективность «Тримиксана» при псороптозе и отодектозе плотоядных. Препарат в виде 0,1% спиртового раствора при нанесении на ушную раковину один раз в сутки в течение 5-7 дней является эффективным средством для лечения псороптоза кроликов, отодектоза и гнойного отита кошек и собак.

9. «Трймиксан» в виде 0,2%-ной, жидкой мази является эффективным средством для лечения микроспории собак и кошек. Курс лечения заключается в однократном ежедневном применении в течение 5-7 дней в зависимости от тяжести поражения.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Направленный синтез соединений в ряду нитробензофуроксанов позволяет создать новые высокоэффективные соединения для борьбы с болезнями кожи животных.

2. При создании лекарственных форм трудноводорастворимых соединений, предназначенных для наружного применения, с успехом можно использовать как основу ПЭО-400, ДМСО и спирт этиловый (96%).

3. Для лечения болезней кожи животных паразитарной и микотической этиологии предложено новое средство - «Тримиксан», которое рекомендовано использовать наружно в виде 0,1% и 0,2% концентрации.

4. Разработано и утверждено в установленном порядке «Временное наставление по применению препарата «Тримиксан» при акарозах и дерматомикозах плотоядных животных (в порядке широкого производственного испытания в 2004-2005 гг.)».

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ

1. Ишкаева Д.Р., Гарипов Т.В., Юсупова Л.М., Салахова A.C. Акарицид-ная активность производных бензофуроксана. // Незаразные болезни животных: Материалы науч. конф., посвящ. 70-летию образования зооинженерного факультета. - Казань, 2000. — С. 273.

2. Ишкаева Д.Р., Гарипов Т.В., Юсупова Л.М. Действие 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана+6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксана+5,7-дихлор-4-нитробензофуроксана на возбудителей Psoroptes cuniculi. // Материалы конф. ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященной 125-летию H.A. Сошественского. -Казань,2001. -С.50-51.

3. Ишкаева Д.Р. Кумулятивные свойства тройной смеси производных бензофуроксана. // Материалы IV научн.- практ. конф. молодых ученых и специалистов РТ. - Казань, 2001. - С. 74.

4. Ишкаева Д.Р. Острая токсичность смеси производных бензофуроксана. // Материалы IV научн.- практ. конф. молодых ученых и специалистов РТ. - Казань, 2001. - С. 75.

5. Ишкаева Д.Р. Мутагенное действие 5,7-дихлор-4,6-динитробензо-фуроксана+6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксана+5,7-дихлор-4-нитро-бензофуроксана. // Материалы итоговой конференции республиканского конкурса на соискание премии им. Н.И. Лобачевского. - Казань, 2002-С. 170.

6. Ишкаева Д.Р., Юсупова Л.М. Биологическая активность производных бензофуроксана. // Новые фармакологические средства в ветеринарии: Материалы научн.-практ. конф. - СПб.: СПбГАВМ, 2002, - С. 57.

7. Юсупова Л.М., Гарипов Т.В., Ишкаева Д.Р., Шиндала М.К. Ветфурок-сан - новое средство для лечения саркоптоидозов и дерматомикозов животных. // Ветеринарный врач. - 2002. - №2. - С. 77-79.

8. Ишкаева Д.Р. Действие нитробензофуроксана на организм теплокровных животных и его противопаразитарные свойства. // Новые энтеро-сорбенты и фармакологически активные вещества и их применение в ветеринарии и животноводстве: Материалы межд. научн.-практ. конф., посвященной 80-летию Заслуженного деятеля науки РФ, д.в.н., профессора М.И. Рабиновича. - Троицк, 2002. - С. 38.

9. Ишкаева Д.Р., Зарипов И.З. Лечебное действие препарата «Тримик-сан» при гнойном отите и отодектозе у собак и кошек. //Ветеринарная медицина домашних животных. Сборник статей, выпуск 1. - Казань, 2004.-С.50.

10. Пат. 2255935 РФ, МПК7 С 07 Д 271/12, А 01 N 43/832. / 5,7-дизамещенный 4,6- динитро бензофуроксан общей формулы С^ОбЯ, обладающийакарицидной и бактерицидной активностью. Заявка 2003119046 от 24.06.03. / Юсупова Л.М., Фаляхов И.Ф., Спатлова Л.В., Гарипов Т.В., Шиндала М., Ишкаева Д.Р.

Подписано к печати Л V. fe. Формат 60x84/16

Заказ Тираж/00 экз. Усл.-печ.л. ¿>

Бумага офсетная Печать RISO

Центр информационных технологий КГАВМ 420074, Казань, Сибирский тракт, 35.

i

I

I

!

f

№20 203

РНБ Русский фонд

2006-4 18926

i

Актуальность темы. Наукой и практикой в ветеринарии достигнуты значительные успехи в лечении и ликвидации многих болезней животных. Тем не менее, болезни кожи микотической и саркоптоидозной этиологии имеют распространение среди всех видов животных [54, 161, 132, 45]. Ежегодно лечебной и профилактической обработке против стригущего лишая подвергаются свыше 50% общего поголовья крупного рогатого скота, против псороптоза - 13%, овец - 18%. Многие регионы Российской Федерации считаются неблагополучными по псороптозу овец и крупного рогатого скота, а также по саркоптозу свиней [8,13].

Большинство лекарственных соединений, рекомендуемых для лечения болезней кожи животных, по ряду причин не удовлетворяют требованиям ветеринарной науки и практики. Производные фосфор- и хлорорганических соединений (хлорофос, циодрин, акродекс и др.) обладают высокой токсичностью, кумулятивны, эмбриотоксичны, длительно сохраняются в пищевых цепях [96, 59, 97, 1, 2, 6]. Нистатин, леворин, амфотерицин и др. часто вызывают аллергические реакции и другие побочные эффекты [142, 94, 131]. Препараты йода и салициловой кислоты, гризеофульвин и другие малоэффективны [100, 218,182, 21, 156,136, 35, 40], а гризеофульвин обладает канцерогенным, эмбриотоксическим и тератогенным действием [188]. Менее безопасными и эффективными для лечения трихофитии и микроспории считаются сера и ее препараты, в том числе сероорганические соединения нефтехимического синтеза сульфоны и сульфоксиды [153, 154].

Из приведенного следует, что поиск перспективных лечебно-профилактических средств для лечения паразитарных и инфекционных болезней кожи животных актуален и требует усилий химиков и ветеринарных специалистов.

Одним из перспективных направлений поиска новых средств для лечения саркоптоидозов и дерматомикозов животных является направленный синтез соединений, обладающих широким спектром действия (акарицидным, бактерицидным, фунгицидным). По литературным данным некоторые нитро- и гало-генпроизводные бензофуроксанов и бензофуразанов проявляют высокую биологическую активность [38,70,120,121,157,159].

Изучение биологической активности и фармако-токсикологических свойств дигалогеннитробензофуроксанов позволило выявить наиболее активные и малотоксичные препараты для лечения дерматомикозов и саркоптоидозов, а также в дальнейшем рекомендовать их для ветеринарной практики. Анализ же зависимости биологической активности препарата от его химической структуры позволит в дальнейшем проводить целенаправленный синтез соединений, проявляющих необходимую биологическую активность.

Цель и задачи исследований. Основной целью нашей работы было создание нового лекарственного средства для лечения кожных болезней животных паразитарной и микогической этиологии. Для достижения поставленной цели необходимо было решение следующих задач:

1. Исследовать акарицидную, антимикробную, антимикотическую активность замещенных нитробензофуроксанов, выявить связь между их структурой и активностью, найти наиболее перспективное соединение.

2. Определить параметры токсичности, кумулятивные свойства 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана, 5,7-дихлор-6-нитробензофуроксана и 5,7-дихлор-4-нитробензофуроксана («Тримиксан»).

3. Изучить отдаленные последствия действия «Тримиксана» на организм животных.

4. Изучить действие «Тримиксана» на клинический статус, гематологический и биохимический состав крови лабораторных животных; определить характер гис-томорфологических изменений, возникающих в организме животных после его применения.

5. Установить лечебную эффективность «Тримиксана» при дерматомико-зах и саркоптоидозах животных, разработать лекарственные формы, дозы и схемы его применения.

Научная новизна. Впервые установлено, что нитробензофуроксаны -новая группа соединений, обладающая широким спектром биологического действия (акарицидным, антимикотическим, антимикробным). Выявлена зависимость их биологической активности от структуры молекулы. Впервые определены параметры токсичности и клинические проявления токсикоза «Тримиксана». Доказано отсутствие отрицательного влияния «Тримиксана» на общее состояние, морфологический и биохимический состав крови, гис-томорфологию тканей животных при длительном применении в рекомендуемых концентрациях и дозах, доказано отсутствие отдаленного последствия действия препарата на организм животных (мутагенность, эмбриотоксич-ность, тератогенность). Разработаны лекарственные формы, дозы, схемы применения «Тримиксана» при дерматомикозах и саркоптоидозах животных. Впервые показан высокий терапевтический эффект «Тримиксана» в виде 0,1% спиртового раствора и 0,2% жидкой мази при болезнях кожи животных паразитарной и микотической этиологии.

Практическая ценность. Установлены закономерности проявления биологической активности производных нитробензофуроксана, что позволяет проводить направленный синтез химических соединений. Определен ряд производных нитробензофуроксана, обладающих широким спектром биологической активности (акарицидной, бактериостатической, фунгистатиче-ской).

Рекомендован для внедрения в ветеринарную практику «Тримиксан» в виде 0,1% спиртового раствора и 0,2% жидко." мази, как высокоэффективное средство при псороптозе кроликов, отодектозе, дерматомикозах: и гнойном отите плотоядных.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены и получили положительную оценку на: международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета (Казань, 2000), научно- производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехники (Казань, 2001), международной конференции ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященной 125-летию Н.А. Сошественского (Казань,2001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов РТ (Казань,2001), итоговой конференции Республиканского конкурса научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии имени НИ. Лобачевского (Казань,2002), семинаре RSAVA в рамках программы постдипломного образования ветеринарных специалистов (Казань, 2004).

Настоящая работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований Казанской государственной академии ветеринарной медицины (гос. регистрации № 0.1.98.0002094)

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- замещенные нитробензофуроксаны обладают выраженными фунгистати-ческими, бакгериостатическими и акарицидными свойствами; -5,7-дихлор-4,6-динитробензоф}фоксана+5,7-дихлор-6-нитробензофуроксана и 5,7-дихлор-4-нитробензофуроксана («Тримиксан») малотоксичен, умеренно кумулятивен при длительном применении;

- «Тримиксан» в рекомендуемой концентрации и кратности применения не оказывает отрицательного действия на общее состояние, состав крови, морфологию тканей, не обладает мутагенным, эмбриотоксическим действием;

- «Тримиксан» в виде 0,1% спиртового раствора обеспечивает высокий терапевтический эффект при псороптозе кроликов, отодекгозе и гнойном отите собак и кошек;

- «Тримиксан» в виде 0,2% жидкой мази обеспечивает высокий терапевтический эффект при микроспории собак и к^ск.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками, содержит 21 таблицу. Список литературы включает 238 источников.

IV. ВЫВОДЫ

Впервые созданы соединения из класса нитробензофуроксанов, обладающие широким спектром биологического действия, что дает возможность использовать их как лечебные средства при поражениях кожи животных микотической и паразитарной этиологии.

Замещенные нитробензофуроксаны обладают выраженными акарицид-ными, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами. Наиболее активным соединением является 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан+5,7-дихлор-6-нитробензофуроксан + 5,7-дихлор-4-нитробензофуроксан («Тримиксан»).

Тримиксан» относится к соединениям 1П класса токсичности (ГОСТ 12.1.007-76). Его ЛД50 для белых крыс при однократном внутрижелу-дочном введении составляет 723,0±62,0 мг/кг, для мышей - 448,0±60,8 мг/кг. В зависимости от применяемого растворителя острая токсичность меняется. Так при накожном применении в виде 20% раствора в ДМСО ЛД50 на 68,0 мг/кг ниже (655,0±123,0 мг/кг), чем при внутреннем введении. Коэффициент кумуляции при внутрижелудочном введении в виде 5% суспензии- 5.2, при накожном нанесении 20% раствора в ДМСО — 1,28.

Тримиксан» при накожном применении в концентрациях до 1% не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки, не обладает аллергенным действием.

Тримиксан» не обладает мутагенным действием (тест Эймса), эмбрио-токсическим и тератогенным действиями.

При накожном применении в течение 30 дней «Тримиксан» в дозе 40 мг/кг не оказывает отрицательного влияния на биохимический и морфологический состав крови кроликов, не вызывает морфологических изменений в органах белых крыс.

Разработаны лекарственные формы «Тримиксана», удобные для наружного применения. Наиболее активными являются 0,1% спиртовые капли на 70% этиловом спирте и 0,2% жидкая мазь на ПЭО-400.

Установлена лечебная эффективность «Тримиксана» при псороптозе и отодектозе плотоядных. Препарат в виде 0,1% спиртового раствора при нанесении на ушную раковину один раз в сутки в течение 5-7 дней является эффективным средством для лечения псороптоза кроликов, отодек-тоза и гнойного отита кошек и собак.

Тримиксан» в виде 0,2%-ной, жидкой мази является эффективным средством для лечения микроспории собак и кошек. Курс лечения заключается в однократном ежедневном применении в течение 5-7 дней в зависимости от тяжести поражения.

V. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Направленный синтез соединений в ряду нитробензофуроксанов позволяет создать новые высокоэффективные соединения для борьбы с болезнями кожи животных.

2. При создании лекарственных форм трудноводорастворимых соединений, предназначенных для наружного применения, с успехом можно использовать как основу ПЭО-400, ДМСО и спирт этиловый (96%).

3. Для лечения болезней кожи животных паразитарной и микотической этиологии предложено новое средство — «Тримиксан», которое рекомендовано использовать наружно в виде 0,1% и 0,2% концентрации.

4. Разработано и утверждено в установленном порядке «Временное наставление по применению препарата «Тримиксан» при акарозах и дерматомико-зах плотоядных животных (в порядке широкого производственного испытания в 2004-2005 гг.)».