Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Фармако-токсикологическая оценка миорелаксанта адилинсульфама

003461233

На правах рукописи

V

ЛАРИНА ЮЛИЯ ВАДИМОВНА

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МИОРЕЛАКСАНТА АДИЛИНСУЛЬФАМА

16.00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г- Р

г ^

Казань -2009

003461233

Работа выполнена в отделе токсикологии ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» ФГУ «ФЦТРБ -ВНИВИ» (г. Казань)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Ю.А. Зимаков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Г.В. Конюхов

доктор медицинских наук, профессор P.C. Гараев

Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится « о » -J-iapfO о 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (420075, г. Казань, Научный городок-2, ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань)

Автореферат разослан «

4JL» ^ У &/J> 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук, В.И. Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Применение средств для временного обездвиживания животных - миорелаксантов является одной из актуальных проблем при работе с домашними и дикими животными при оказании им лечебной помощи, отлове, мечении или транспортировке (Стоув K.M., 1971; Чижов М.М., 1992; Jalanka H.H., 1992). Они же в больших дозах применяются в качестве средств массового бескровного убоя животных, заболевших или подозрительных на заболевание, в практике предупреждения и ликвидации эпизоотий, когда возбудителями являются особо опасные инфекции (ящур, сибирская язва и др.). Бескровный метод убоя незаменим в пушном звероводстве с целью получения полноценного конкурентно-способного качественного меха (Ильина Е.Д., 1990).

В нашей стране давно известно применение для обездвиживания продуктивных и других видов животных диталина, относящегося к деполяризующим миорелаксантам (Харкевич Д.А., 1989). В настоящее время применение диталина в практике животноводства затруднено, в связи со сложностью его приобретения и производства, поскольку для, этого необходимо импортировать исходный реагент - хлористый метил, Дитшгац имеет существенные побочные эффекты при использовании его для временного обездвиживания животных, а именно: малая широта миопаралитического действия - коэффициент безопасности; и, кроме того, в больших количествах препарат ограниченно растворяется в воде, что затрудняет его использование на крупных животных и при низких температурах.

В сообщениях о новых миорелаксантах - пирокурине и амидокурине, превосходящих по «широте миорелаксирующего действия» d-тубокурарин, дитилин и их аналоги (Харкевич Д.А., 1989; Чижов М.М., 1992), информация скудная и недостаточная для суждения об их перспективности и доступности.

Кетамин (кетапар, калипсол, ромпун) - широко применяется для

временного обездвиживания и внутримышечного наркоза животных ((.Га1апка Н.Н., 1991). Однако, выраженные побочные эффекты ограничивают его широкое применение в ветеринарии.

В ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» накоплен опыт применения временного обездвиживания и убоя животных при помощи деполяризующих миорелаксантов - дитилина и его структурного аналога адилина-супер. Новый миорелаксант этой же группы адилинсульфам был недавно синтезирован Р.Д.Гареевым и соавторами (2005г) в качестве более технологичного, дешевого и стабильного аналога дитилина и адилина-супер.

Цель исследования: фармако-токсикологическая оценка адилинсульфама и экспериментальное обоснование возможности применения его в ветеринарии для временного, предубойного обездвиживания и бескровного убоя животных.

Задачи исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- определить параметры острой токсичности и специфической миорелаксирующей активности адилинсульфама для разных видов животных;

- оценить безопасность применения адилинсульфама, включая токсичность при поступлении внутрь и отдаленные последствия (эмбриотоксичностъ, тератогенность, постнатальное развитие и др.) на лабораторных животных по принятым критериям;

- изучить стабильность препарата при хранении, его фармакодинамику и фармакокинетику в организме животных;

на основании результатов исследования разработать токсикологические и технологические критерии для проекта технических условий и инструкции по применению адилинсульфама в ветеринарии.

Научная новизна. Впервые на лабораторных, домашних и некоторых видах продуктивных животных изучены токсичность и специфическая

эффективность адилинсульфама для временного, предубойного обездвиживания и бескровного убоя животных. Разработан метод тонкослойной хроматографии для определения препарата в органах и тканях животных, с помощью которого изучена фармакокинетика адилинсульфама в организме животных и установлена высокая скорость его метаболизма. Впервые выявлены 4 антидота, предотвращающие гибель животных, после введения им летальных доз.

Практическая ценность. На основании результатов исследования для ветеринарной практики предлагается новый миорелаксант адилинсульфам.

Полученные экспериментальные данные использованы при составлении проектов нормативных документов: лабораторного регламента, ТУ и Инструкции по применению препарата, которые будут представлены для госрегистрации адилинсульфама.

Основные положения, выносимые на защиту:

фармакологическая и токсикологическая характеристика адилинсульфама в качестве лекарственного средства ветеринарной медицины;

- обоснование возможности применения адилинсульфама для обездвиживания и бескровной эвтаназии животных;

- обоснование безвредности и технологии применения адилинсульфама в ветеринарии.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВЙ» по итогам НИР за 2005-2008 гг.; на международной научной конференции «Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка)) - Казань, 2006 г; на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» - Казань, 2007 г.; на I Съезде ветеринарных фармакологов России, г. Воронеж, 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, в т.ч. 2 - в изданиях, включенных в перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов и результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа содержит 26 таблиц и 2 рисунка. Список использованной литературы включает 204 источника, в том числе 69 зарубежных авторов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследований

Работа проводилась в 2005-2008 гг. в отделе токсикологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Эксперименты проведены на лабораторных животных: 36 белых мышах, 1323 белых крысах, 35 кроликах, 15 кошках, 12 собаках, 4 овцах и 16 норках. Животные для опытов подбирались по принципу аналогов с учетом пола, породы, возраста и живой массы тела.

Новый миорелаксант адилинсульфам - бис-п-толуолсульфонат бис-2-тримегиламмониоэтилового эфира янтарной кислоты впервые синтезирован в ФГУ «ФЩРБ-ВНИВИ» Р.Д.Гареевым и соавторами.

Изучение фармако-токсикологических свойств адшгансульфама включало определение острой, хронической токсичности, раздражающего, аллергизирующего, эмбриотоксического и тератогенного действий.

Острую токсичность определяли экспресс-методом В.Б. Прозоровского и соавт. (1978); пробит-анализом (Муканов P.A., 2005); по методу Кербера (Беленький М.Л., 1963). Для овец использовали метод «одной точки» Ван дер Вэрдена (Саноцкий И.В., 1970; Каплин В.Г., 2006).

Токсичность адилинсульфама для норок определяли в зверосовхозе «Кощаковский» Пестречинского района Республики Татарстан во время производственных испытаний в период убоя пушных зверей клеточного содержания. Хроническую токсичность препарата с количественной оценкой кумулятивного эффекта вычисляли по формуле Кагана Ю. С. и Станкевича В.В. (1964).

Оценку местно раздражающего действия проводили в однократных опытах на кроликах, согласно «Методическими указаниями по изучению раздражающих свойств и обоснованию ПДК избирательного действия раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны», утвержденными Минздравом в 1980 году.

Аллергизирующее действие препарата изучали в соответствии с Методическими указаниями МУ 1.1.578-96 «Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы» (М., 1997).

Эмбриотоксическое и тератогенное действие оценивали в соответствии с методическими указаниями по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию (1986).

При оценке стабильности и, соответственно, зависимости эффективности адилинсульфама от сроков хранения использован биологический метод. Группе крыс (5-10 гол) в контрольные сроки исследования вводили внутримышечно летальную дозу - ЛДюо, определенную ранее - сразу после синтеза препарата; По процентному соотношению выживших и погибших животных судили об остаточной активности испытанных образцов препарата, синтезированных 1, 2 и 3 года назад. Полученные данные сравнивали с показателями приборной оценки -

по ЯМР-спектрам тех же препаратов адилинсульфама, регистрируемых в те же сроки.

Оценку иммобилизирующего эффекта адилинсульфама проводили по основным критериям, принятым для миорелаксантов (Харкевич Д.А., 1989). После введения препарата, в т.ч. на фоне действия его потенциальных антагонистов, за опытными животными велось наблюдение с регистрацией во времени поведенческих реакций, наступления миорелаксации - характерные симптомы, учитывая при этом, как показатель степени миорелаксации - время наступления симптома склонения головы, бокового положения и его длительность, и затем, фиксируя признаки токсикоза, одышку и в случае гибели - динамику остановки дыхания и сердечной деятельности.

Скрининг потенциальных антагонистов адилинсульфама проведен в ряду холинотропных соединений: холиномиметиков (ацетилхолин, ареколин, пилокарпин), антихолинэстеразных средств (аминостигмин, оксазил); холинолитиков (атропин, скополамин), реактиваторов холинэстераз (дипироксим), транквилизаторов (феназепам, мебикар), аналептиков (сульфокамфокаин, пирацетам), витаминов (тиамин) и др.

При определении безвредности адилинсульфама, в т.ч. как потенциального средства для предубойного обездвиживания продуктивных животных в производстве мяса, использовали методы биологической оценки мяса и мясопродуктов сельскохозяйственных животных - биопробы со скармливанием крысятам-отьемышам фарша мяса, содержащего разные количества препарата. Кроме того, для оценки мяса, полученного таким способом, использовали принятые, в соответствии с ГОСТом методы ветеринарно-санитарной экспертизы.

Для первичной оценки мутагенной активности был использован метод хромосомных аберраций (Методические указания, 1986 г).

О посгшатальном развитии потомства крысят судили по динамике массы тела и принятым показателям физиологического развитая: времени

отлипания ушей, открытия глаз, обрастания шерстью, опускания яичек и, соответственно, открытая влагалища у самок, а также по некоторым поведенческим реакциям крысят и молодняка, в т.ч. по тесту «отрытого поля» (Бутаев Б.М., 1964) и ориентировочной реакции по методу Буасье (Boissier J.R., 1980). Животных взвешивали 1 раз в неделю, начиная с первого дня жизни и заканчивая 2,5-месячным сроком. Показатели общего развития и поведенческие реакции крысят и молодняка крыс рассматривались в качестве одних из основных показателей безвредности самого препарата, в том числе при оценке мяса, полученного от животных, убитых с помощью адилинсульфама.

Изменение гематологических показателей как критерий безвредности препарата определяли общепринятыми методами (Нименова Ю.М., 1967; Кудрявцев A.A., 1969; Бажибина Е.Б., 2005). Для оценки содержания общего белка в сыворотке крови и использовали рефрактометрический метод, биохимических белковых фракций - нефелометрический метод (Симонян Т.А., Антонов Б.И., 1991; Кондрахин И.П., 2004). Определение активности ацетилхолинэстеразы крови проводили по методу Хестрина С. (1964).

Испытания на пирогенность проводили на здоровых кроликах самцах, не альбиносах, в соответствии с принятой методикой, приведенной в Государственная фармакопее XI, 1989).

Ветеринарно-санитарную оценку качества мяса проводили с учетом общепринятых требований ГОСТов (Колоболотский Г.В., 1974; Макаров В.А., Фролов В.П., Шуклин Н.Ф., 1991; Шур И.В., 1959). Биологическую оценку мяса проводили на подопытных животных при помощи постановки биопробы на крысятых-отъемышах, как было описано выше.

Определение количества адилинсульфама и его метаболитов проводили следующим образом: растворяли 0,5 грамма адилинсульфама в 1 мл дистиллированной воды. Далее отбирали 10 мкл раствора, наносили на хроматографическую бумажную пластину марки «М», опускали в систему

растворителей для элюирования (однозамещенный фосфат калия) и хроматографировали восходящим способом. Во всех опытах соблюдались стандартные условия хроматографирования (температура, границы старта и финиша) для обеспечения достоверных результатов. После завершения процесса (об этом судили по достижении элюентом линий финиша на пластине) извлекали пластинку, сушили на открытом воздухе, на столе вытяжного шкафа, затем обрабатывали из пульверелизатора реактивом Драгендорфа. При воздействии этого реактива адшшнсульфам проявлялся в виде оранжевого пятна с индексом хроматографической подвижности ИХ 0,42, а один из продуктов его гидролиза - холин, обнаруживался в виде фиолетового пятна с М- 0,45.

Для изучения влияния препарата Адюшн-супер на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы использовали электроэнцефалографический (Кожевников В. А., 1963; Тремасов М.Я., 1982) и электрокардиографический методы (Гуляев П.И., 1948; Казакова В.М.,1959; Дехтярь ГЛ., 1966; Жуленко В.Н., 1970). Животных (кроликов) фиксировали на операционном столе в специальном станке. Запись ЭЭГ и ЭКГ регистрировали при помощи одноканального энцефалографа ИСН-2 и электрокардиографа ЭК-1Т-03М. Датчики (игольчатые электроды) устанавливали согласно инструкций к приборам. Для записи ЭЭГ использовали сагитальное, лобно-затылочное расположение электродов, а для ЭКГ - второе стандартное отведение.

Частоту сердечных сокращений вычисляли по формуле:

ЧСС=60 сек/11-11

Систолический показатель обозначает, какая доля систолы приходится на 1 сердечный цикл, находится в процентах и его вычисляли по формуле:

сл-о-т/я-н

и

Экспериментально полученный материал обрабатывали с применением критерия достоверности "t" Стьюдента (Меркурьева Е.К., 1970) и на персональном компьютере с использованием пакета программ Micrsoft Excel.

3 Результаты собственных исследований

Оценка острой токсичности адилинсульфама. Определены границы его смертельных и безопасных доз и концентраций, оптимальных для проявления специфичной для миорелаксантов активности. При парентеральном введении ЛД50 у разных видов животных составили (мг/кг): мыши - 8,9±0,5; крысы - 3,5±0,3; кошки - 3,6±0,4; собаки - 0,72±0,06; норки -0,8±0,1; кролики - 3,1±0,3; овцы - 0,6±0,1. Указанные показатели находились в диапазоне: от 10 до 0,7 мг/кг, и, следовательно, по ГОСТ 12.1.007-76, препарат соответствует II классу опасности -«высокоопасные». Это отвечает прямому назначению его как средства для предубойного обездвиживания и эвтаназии животных и характеризует адилинсульфам как высокоэффективный препарат.

При определении на крысах токсичности адилинсульфама при введении его внутрь, внутрижелудочно, ЛД50 препарата составила 380±45 мг/кг, - III класс опасности - «умеренно опасные». По сравнению с его ЛД50 при введении в мышцу - 3,5±0,3 мг/кг, разница почти в 100 раз.

Хроническая токсичность. При 5-кратном внутримышечном введении адилинсульфама крысам оптимальной миорелаксирующей дозы - 3,25 мг/кг с постепенным увеличением дозы в каждой последующей группе животных на 7%., с интервалом 1 сут выявлены признаки развития толерантности. Коэффициент кумуляции препарата по формуле Кагана Ю.С. и Станкевича В.В. (1964) составил 6,6. Следовательно, он не проявляет функциональной кумуляции.

Особенности миорелаксирующего действия. По результатам испытаний адилинсульфама глубина миорелаксирующего эффекта у крыс

при дозе - 3,5 мг/кг боковое положение наступает на 8-10 мин, и удерживается ~20 мин с полным последующим восстановлением двигательной способности и нормализацией состояния. У кроликов клинические симптомы миорелаксации после введения препарата в общем сходны с теми, что и у крыс, однако боковое положение они принимают раньше - через 2 мин, хотя удерживают его также в течение 20 минут.

У кошек относительное постоянство в длительности наступления бокового положения - около 20 мин от времени введения препарата наблюдается в значительном диапазоне доз - 0,9 до 2,5 мг/кг, с пребыванием в боковом положении 20+25 мин. После введения им адилинсульфама в диапазоне миорелаксирующих субапноэтических доз - 0,2-Ю,5 мг/кг средняя продолжительность бокового положения по сравнению с кошками была больше- 45 минут. Овцы занимают промежуточное положение между ними.

Клинические признаки у норок были сходны с теми, что наблюдались у собак с той разницей, что миорелаксирующая доза 0,8 мг/кг проявлялась в динамике, начинаясь с покачивания головы, и затем через 10 мин принятием бокового положения и миорелаксацией на фоне легких редуцированных судорог.

Следует отметить у адилинсульфама значительную растянутость диапазона субапноэтических миорелаксирующих доз у кошек и собак. По-видимому, это связано с разнообразием пород и различия в массе у отдельных особей этих видов животных.

Миорелаксация, вызываемая у животных адилинсульфамом по сравнению с дитилином и Адилином-супер на уровне -ЛДюо (в эквимолекулярных отношениях, т.е., с учетом коэффициентов разницы молекулярного веса препаратов), имеет более короткую фазу миорелаксации. Соотношение средней длительности фазы миорелаксации - от момента введения летальной дозы до остановки дыхания , в опытах на крысах для указанных препаратов составляет, соответственно 1:1,1:1,25.

Оценка гематологических показателей у крыс в числе стандартных методов оценки безвредности адилинсульфама: к 3-му часу после его однократной внутримышечной инъекции в дозе 1 ЛД50: снижение количества гемоглобина, общего белка и у- глобулинов с одновременным повышением а-глобулинов. К 7 часу имела место тенденция к нормализации показателей, и к 24 часам - полное возвращение их к исходным. Указанные изменения - расценены как обратимый процесс адаптации, связанный с состоянием иммобилизации у животных и, возможно, с функциональной гипоксией.

Изучение отдаленных последствий (эмбриотоксичность и тератогенность). Фарш мяса использовался одновременно для двух исследований: на беременных самках белых крыс - тестирование на эмбриотоксичность, и кроме того, параллельно - была проведена «биопроба» на крысятах-отъемышах, - скармливание им мяса, содержащего адекватное предубойному обездвиживанию остаточное количество адилинсульфама.

Согласно изученным показателям, какие-либо значимые признаки эмбриотоксичности адилинсульфама, отсутствовали в группе самок крыс, которые получали в течение всего срока беременности мясо овцы, убитой с применением этого миорелаксанта.

При проведении биопробы крысятам опытной группы ежедневно в течение 30 дней скармливали фарш мяса овцы из расчета 5 г на 100 г массы. Контрольная группа крысят-отъемышей массой 50 г получала чистый фарш, полученный от животного, убитого без применения адилинсульфама, в том же количестве. В процессе опыта была проведена оценка их роста и развития. Далее крысята были убиты под легким эфирным наркозом, затем вскрыты и после патологоанатомического осмотра внутренних органов у них были определены весовые коэффициенты их органов.

Визуальный осмотр кожного покрова и органов после вскрытия крысят как и гистологическая картина органов опытной и контрольной групп практически не отличались одна от другой.

Согласно полученным данным, достоверных различий в динамике масс крысят и молодняка крыс в контрольной и опытной группах не отмечалось.

2-я биологическая проба для оценки функционального состояния ЦНС проведена на молодняке крыс массой -100 г. После убоя кролика адилинсульфамом приготовленный фарш скармливали го расчета 5 г/100 г массы молодняку крыс и через 30 мин и 1 час наблюдали за изменением их состояния с определением их поведенческих реакций: «ориентировочной реакции» и поведения в «открытом поле», и затем брали кровь для определения , гематологических показателей. Согласно полученным данным различия в сравниваемых группах не выходили за рамки физиологических показателей и при статистической оценке отличались несущественно.

Изучение мутагенной активности было проведено на крысах самцах разделенных на 2 группы - контрольную (интактную) и опытную, которая в течение 20 дней получала корм, содержащий адилинсульфам в максимально переносимой дозе - из расчета - 300 мг/кг. При оценке частоты хромосомных нарушений в пластинах у опытных и контрольных животных было найдено, что разница в обеих группах была статистически недостоверна (Р>0,05), и это свидетельствует об отсутствии мутагенных свойств у адилинсульфама.

Иммобилизация беременных животных. В соответствии с общепринятой практикой применения миорелаксантов, беременность является противопоказанием их применения для временной иммобилизации животных. Однако бывают случаи, когда их иммобилизация необходима по жизненным показаниям.

Опыты проведены на 30 крысах. Беременным крысам 3-го триместра вводили внутримышечно адилинсульфам, постепенно снижая дозу препарата в логарифмической шкале от 3,6 мг/кг до 0,8 мг/кг, с целью достичь того уровня, когда не будут проявляться заметные признаки миорелаксации. У выживших крыс на следующие сутки производили вскрытие под легким эфирным наркозом и определяли состояние плодов. Крысят, полученных от беременных самок, наблюдали по принятым критериям физиологического развития: рост - динамика массы тела, открытие глаз, покрытие шерстью, отлипание ушей, опускание яичек у самцов и раскрытие влагалища у самок. По достижении массы тела 80-100г у крысят оценивали психофизиологические показатели активности ЦНС: ориентировочную («норковую») реакцию по методу Буасье и поведение в «открытом поле», включающее «заглядывание в норки», «перемещение по квадратам» и «вставание». Результаты опытов показали, что ЛД50 миорелаксанта у беременных самок в предродовом периоде составила 1,27±016 мг/кг, т.е. токсичность препарата увеличилась в ~3 раза.

Испытания стабильности адилинсульфама. В соответствии с программой исследования были проведены испытания стабильности 3 образцов (проб) препарата разного срока хранения от 9 мес до 3-х лет. Для оценки был использован: биологический метод. Тест состоял в определении соответствия ЛДюо в 4 группах по 5 крыс при внутримышечном введении в возрастающих дозах: 3,5; 4; 4,5 и 5,0 мг/кг. Этот тест, согласно проекту ТУ на препарат, является одним из показателей его подлинности.

При оценке эффективности препаратов биологическим методом на крысах было установлено, что у 2- и 3-х летних образцов препаратов она сохранилась на уровне 80%, а образец 9 мес срока от синтеза сохранил -100% активности.

Стерильность. В соответствии с Государственной фармакопеей XI и согласно рекомендованным в ней методам препарат был испытан на

стерильность - на питательных средах: Сабуро и гликолевой; на пирогеннность - с термометрией кроликов; на наличие раздражающих и аллергенных свойств - на кроликах. Согласно результатам испытаний адилинсульфам удовлетворяет предъявленным требованиям на стерильность, пирогенность, и отсутствие раздражающих и аллергенных свойств.

Разработка ТСХ метода определения адилинсульфама в растворах, органах и тканях животных была проведена с целью изучения фармакокинетики миорелаксанта как потенциального средства предубойного обездвиживания, в т.ч. при производстве мяса и в звероводстве. В качестве индикатора для проявления был использован реактив Драгендорфа. Всего проведено более 60 хроматографических анализов на бумаге и пластинах и более 20 опытов на крысах и кроликах, которым вводили препарат внутримышечно в разных дозах, в соответствии с предлагаемой технологией его практического применения.

В результате апробации разных модификаций анализа . удалось достигнуть чувствительности метода до 0,6 мкг/г ткани (0,006 мкг в объеме 10 мкл при нанесении на пластину) при использовании треххлористой кислоты в качестве экстрагента.

Фармакокинетика. С использованием ТСХ-метода удалось определить препарат в крови крыс после введения им летальной дозы препарата. Судя по результатам индикации, сделано заключение, что препарат, попадая в кровь, мышцы и другие органы разрушается с очень высокой скоростью. Установлено, что раствор адилинсульфама, как и экстракт мочи, содержащий в виде экстрагента трихлоруксусную кислоту, хорошо хранится, и препарат практически может проявить себя на пластине даже через 4 суток хранения после приготовления экстракта.

С целью определения скорости деградации адилинсульфама в месте инъекции были проведены опыты по обнаружению миорелаксанта в мясе животных с помощью разработанной нами методики. Препарат инъецировали

кролику в несколько разных точек его задней конечности в суммарной дозе -20 мг и 600 мг. Сразу после гибели, у животных отделяли конечность, мышцы из области инъекций гомогенизировали и экстрагировали миорелаксант 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. В результате в первом случае хроматографически адшшнсульфам не был определен, а во втором - удалось обнаружить препарат в образцах этого мяса в убывающей степени в следующие интервалы: сразу после вкола, через 15, 30 мин, 1,3 час, а на следующие сутки - в виде слабо окрашенного пятна. По ранее составленной шкале концентраций остаточные количества препарата соответствовали - 0,6 мкг во вколе, т.е. препарат определялся на уровне «следов». Из этого и предыдущих опытов нами был сделан вывод, что препарат после инъекции быстро разрушается в мышечной ткани в течение суток даже при самой высокой, реально возможной в практике концентрации. Проведенное исследование является основанием считать, что мясо, полученное от животных, убитых при помощи адилинсульфама, по показателям токсичности является безвредным для употребления уже через сутки.

Антагонисты. Для деполяризующих миорелаксантов до сих пор не найдены антагонисты. Поэтому в опытах на белых крысах и кроликах нами проведен скрининг более 15 соединений, потенциальных антагонистов адилинсульфама. В результате исследования антагонизм в отношении адилинсульфама проявили несколько соединений, в т.ч.: пирацетам, ацетилхолин, феназепам и сульфокамфокаин. Наиболее эффективными оказались пирацетам и ацетилхолин в дозах, соответственно: 20 и 4 мг/кг.

При разработке оптимальной лекарственной формы адилинсульфама в опытах на крысах было найдено, что при введении препарата животным в виде растворов, содержащих хлорид натрия в количестве 2-4%, скорость наступления его эффекта увеличивается и необходимый эффект достигается при введении его меньших доз.. Это

позволяет экономить расход препарата и ускорить наступление его действия. При использовании этилового спирта в качестве растворителя для получения 10-20%-ных спиртовых растворов адилинсульфама, уже спустя 30 мин после приготовления наблюдается резкое снижение его активности. Этим адилинсульфам отличается от адилина-супер. Полученные данные были учтены при разработке лабораторного регламента, проектов ТУ и Инструкции по применению препарата.

Оценка функционального состояния сердца и центральной нервной системы. При использовании адилинсульфама у животных в дозах на уровне ЛДюо, проведен анализ ЭКГ и ЭЭГ кролика, после введения ему препарата адилинсульфама в дозе 4 мг/кг и антидота в дозе 20 мг/кг, который включает в себя пирацетам. Было отмечено учащение сердцебиения, которое в опыте происходило на фоне учащения дыхания, одышки. Затем интервалы P-Q и QRS увеличились, что связано с замедлением прохождения возбуждения по проводниковой системе. Имевшее место снижение интервала ST и учащение сердечных сокращений и оцениваются как нарушение метаболизма и вероятных дистрофических изменений в миокарде, которые ведут к ослаблению его сократительной способности (Уразаев H.A., 1963). По данным ЭКГ после введения антидота через 20 мин состояние животного нормализуется, на электрокардиограмме вольтаж всех зубцов также приходит в норму.

Феномен первичного угасания биоэлектрической активности мозга на 14-15 мин после введения летальной дозы адилинсульфама при наличии сердечных сокращений указывает на то, что сам факт гибели животного происходит в «бессознательном» состоянии.

Ветсанэкспертиза. В нашем исследовании послеубойная оценка тушек животных позволила определить хорошее качество мяса по требованиям Правил ветеринарно-санитарной экспертизы и соответствующих ГОСТов, а постановка биологической пробы являлась дополнительным

вспомогательным тестом выявления наличия какого-либо возможного скрытого токсического действия препарата на организм и установления начальных сроков после введения адилинсульфама готовности (безопасности) мяса к употреблению.

Следовательно, новый миорелаксант адилинсульфам может быть предложен не только как средство для временной иммобилизации животных - или бескровного их убоя, но также и для предубойного обездвиживания животных при производстве мяса.

4 ВЫВОДЫ

1. Адилинсульфам по фармакологическому действию: клиническим проявлениям, отношению с холинотропными веществами (обратимыми ингибиторами холинэстераз, холинолитиками и др.) является высоко активным деполяризующим миорелаксантом; при внутримышечном его введении ЛД50 у разных видов животных составляют (мг/кг): мыши - 8,9±0,5; крысы - 3,5±0,3; кошки - 3,б±0,4; собаки - 0,72±0,06; норки - 0,8±0,1; кролики - 3,1±0,3; овцы - 0,6±0,1 и, следовательно, препарат соответствует II классу опасности веществ - «высокоопасные».

2. Соотношение летальных доз при моделировании на крысах «технологического» (парентерального) и алиментарного (перорального) способа поступления адилинсульфама в организм составляет ~ 1:100.

3. При 20-дневном скармливании беременным крысам мяса кроликов, убитых с помощью адилинсульфама (2ЛДюо - 8 мг/кг), эмбриотоксический, тератогенный эффекты и отрицательное влияние на выживаемость, ростовые и физиологические показатели крысят и молодняка крыс не установлены.

4. При 30-дневном скармливании крысятам и молодняку крыс мяса овцы и кроликов, убитых с помощью адилинсульфама, либо контаминированного препаратом корма (ОД ДМТ - 38 мг/кг), токсическое действие препарата по ростовым, физиологическим, гематологическим

показателям, функциональным тестам ЦНС и весовым коэффициентам внутренних органов не обнаружено.

5. В опытах на самках крыс показано, что при введении животным адилинсульфама в третьем триместре беременности почти вдвое (по ЛД50 ) повышается чувствительность к препарату, но при этом миорелаксант не оказывает вредного влияния на детенышей и молодняк, полученных от выживших самок.

6. Разработан метод тонко-слойно хроматографического определения адилинсульфама в растворах и биосубстратах с экстракцией препарата треххлоруксусной кислотой и проявлением реактивом Драгендорфа, Ш- -0,42, с чувствительностью - 0,6 мкг в 10 мкл экстракта. Установлено, что препарат при парентеральном и пероральном поступлении в организм животных быстро разрушается. При хранении субстанции (порошка) адилинсульфама в стеклянной таре в течение 3-х лет его остаточная активность составляет не менее 80%.

7. В результате скрининга потенциальных антагонистов адилинсульфама на крысах и кроликах выявлены 4 соединения, существенно снижающие действие препарата: пирацетам, ацетилхолин, сульфокамфокаин и феназепам. При лечебно-профилактическом введении их на фоне смертельной дозы адилинсульфама предотвращается гибель животных и снижается риск его применения для временного обездвиживания.

8. По показателям токсичности и специфической для миорелаксантов активности адилинсульфам не уступает аналогам: дитилину и адалину, проявляя более короткую фазу миорелаксации и превосходя дитилин по растворимости >4 раз, а адалин по срокам хранения субстанции - в 3 раза.

5 Практические предложения

1. Основные фармако-токсикологические показатели по оценке свойств нового миорелаксанта адилинсульфама, по разработке его лекарственной формы и метод тонкослойной хроматографии его определения включить в лабораторный регламент и ТУ на производство препарата.

2. Результаты диссертационной работы включить в комплект - документов для госрегистрации адилинсульфама как лекарственного средства

ветеринарной медицины для обездвиживания и бескровного убоя животных.

6 Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ларина, Ю.В. Оценка опасности временной иммобилизации беременных животных деполяризующими миорелаксантами / Ю.В.Ларина, Ю.А.Зимаков,

B.И.Макаева // Материалы Международной научной конференции «Токсикозы животных и актуальные проблемы молодняка». - Казань, 2006. -

C. 108-111

2. Ларина, Ю.В. Контроль безопасности миорелаксанта БР-2 при предубойном обездвиживании им животных / Ю.В.Ларина, Ю.А.Зимаков, В.И.Макаева, Е.Е.Борисова // Материалы Международной научной конференции «Токсикозы животных и актуальные проблемы молодняка». -Казань, 2006.-С. 111-116

3. Ларина, Ю.В. Степени риска применения деполяризующих миорелаксантов для обездвиживания беременных самок животных / Ю.ВЛарина, Ю.А.Зимаков // Материалы Первого съезда ветеринарных фармакологов России. - Воронеж, 2007. - С. 395-399

4. Ларина, Ю.В. Разработка метода определения в крови и органах животных препарата БР-2 / Ю.В.Ларина // Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии». - Казань, 2007. - С. 55

5. Ларина, Ю.В. Гуманные аспекты фармакологической эвтаназии миорелаксантами деполяризующего типа / Ю.В.Ларина // Научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Достижения молодых ученых - в производство», посвященная 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдуллина, 25-26 июня 2008г. - Казань. - С. 65-67

6. Ларина, Ю.В. Изыскание антидотов деполяризующего миорелаксанта / Ю.В.Ларина // Ветеринарный врач. - Казань, 2008. - №3. - С. 10-12

7. Ларина, Ю.В. Применение деполяризующих миорелаксантов для временного обездвиживания диких и зоопарковых животных / С.А.Царев, Ю.А.Зимаков, Ю.В.Ларина, А.В.Малев //Ветеринарный врач . - Казань, 2008. - №5. - С. 4-7

Подписано в печать 20.01.2009г. Заказ № 6 Гарнитура "Times New Roman". Печать офсетная. Бумага офсетная. Объем 1,0 п.л.

Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ФГУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» (г.Казань)

Адрес 420075, г. Казань, Научный городок-2

Актуальность темы. Применение средств для временного обездвиживания животных - миорелаксантов является одной из актуальных проблем при работе с "дШШи1Шми и'дикимиживотнБШи при оказании им-лечебной помощи, отлове, мечении или транспортировке (Стоув K.M., 1971; Чижов М.М., 1992; Jalanka H.H., 1992). Они же в больших дозах применяются в качестве средств массового бескровного убоя животных, заболевших или подозрительных на заболевание, в практике предупреждения и ликвидаций эпизоотий, когда возбудителями являются особо опасные инфекции (ящур, сибирская язва и др.). Бескровный метод убоя незаменим в пушном звероводстве с целью получения полноценного качественного меха (Ильина Е.Д., 1990). Кроме того, до сих пор остается неизученной проблема возможности использования в пищу мяса продуктивных сельскохозяйственных и охотничьих животных, которые были убиты или случайно погибли с использованием деполяризующих миорелаксантов (Макаров В. А., 1991).

В нашей стране давно известно применение для обездвиживания животных полученного в 1958 г дитилина, относящегося к деполяризующим миорелаксантам (Харкевич Д. А., 1989). Препараты данной группы первоначально вызывают активизацию Н-холинорецепторов, в результате которой возникает стойкая деполяризация постсинаптической мембраны, после чего наступает расслабление скелетных мышц.

В настоящее время применение дитилина в практике животноводства затруднено, в связи со сложностью его приобретения и производства, поскольку для этого необходимо импортировать исходный реагент — хлористый метил. Он имеет некоторые побочные эффекты при использовании его для временного обездвиживания животных, а именно: малая широта миопаралитического действия — коэффициент безопасности; и, кроме того, в больших количествах препарат ограниченно растворяется в воде, что затрудняет его использование на крупных животных и при низких температурах (Сергеев П.В., 1993; Царев С.А., 2002).

В последние годы появлялись публикации о новых миорелаксантах — пирокурине и амидокурине, которые имеют значительно большую «широту миорелаксирующего действия» по сравнению с известными и применявшимися ранее и теперь d-тубокурарином, дитилином и их аналогами (Харкевич Д.А., 1989; Чижов М.М., 1992). Однако пока информация о них скудная и недостаточная для суждения об их перспективности и доступности.

Также в ветеринарной практике получил широкое распространение ксилазин, который по механизму действия относится к агонистам альфа2-адренорецепторов и, по некоторым данным (Sagner G., Haas G., 1999), вызывает у животных сноподобное состояние, т.е. как бы позволяющее их пробудить. Однако, именно длительное пробуждение, как и отсутствие антагонистов, нередко указывается в качестве недостатков рецептур на основе как ксилазина, так и его более поздних аналогов из числа альфаг-адренорецепторных агонистов - детомидина и медетомидина (Jalanka H.H., 1991).

Приведенные литературные данные указывают на необходимость совершенствования средств ветеринарной медицины, предназначенных для временного и предубойного обездвиживания животных. Факторы эффективности, надежности, экономичности, доступности в практике их использования в настоящее время приобретают решающее значение.

В связи с этим поиск новых эффективных и безопасных препаратов является актуальной задачей теоретической и практической ветеринарной медицины.

В ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» накоплен опыт временного обездвиживания и убоя животных при помощи деполяризующих миорелаксантов - дитилина и его структурного аналога адилина.

Новый миорелаксант этой же группы адилинсульфам был синтезирован Р.Д.Гареевым и соавторами в качестве более технологичного, дешевого и стабильного аналога дитилина и адилина.

Цель исследования: ~~ фармако-токсикологическая--оценкаадилинсульфама и экспериментальное обоснование возможности применения его в ветеринарии в качестве потенциального лекарственного средства ветеринарной медицины для временного, предубойного обездвиживания и бескровного убоя животных.

Задачи исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- определить параметры острой токсичности и специфической миорелаксирующей активности адилинсульфама для разных видов животных;

- оценить безопасность применения адилинсульфама, включая токсичность при поступлении внутрь и отдаленные последствия (эмбриотоксичность, тератогенность, постнатальное развитие и др.) на лабораторных животных по принятым критериям;

- изучить стабильность препарата при хранении, его фармакодинамику и фармакокинетику в организме животных;

- на основании результатов исследований разработать проект нормативной документации и инструкцию по применению адилинсульфама в ветеринарии.

Научная новизна. Впервые на лабораторных, домашних и некоторых видах продуктивных животных изучены токсичность и специфическая эффективность и безопасность применения адилинсульфама для временного, предубойного обездвиживания и бескровного убоя животных. Разработан метод тонкослойной хроматографии для определения препарата в органах и тканях животных, с помощью которого изучена фармакокинетика адилинсульфама в организме животных и установлена высокая скорость его метаболизма. При скрининге потенциальных антидотов и корректоров впервые выявлены 4 соединения - антагонисты, предотвращающие гибель животных после введения им летальных доз адилинсульфама.

Практическая ценность. На основании результатов исследований предлагается для вётеринарнойПпрактикй~~новое"" л екарственное~средство — -адилинсульфам для бескровного убоя и обездвиживания животных.

Полученные экспериментальные данные использованы при составлении проектов нормативных документов: лабораторного регламента, ТУ и Инструкции по применению препарата, которые будут представлены для госрегистрации адилинсульфама

Основные положения, выносимые на защиту: фармакологическая и токсикологическая характеристика адилинсульфама в качестве лекарственного средства ветеринарной медицины; применение адилинсульфама для временного, предубойного обездвиживания и бескровной эвтаназии животных;

- обоснование безвредности и технологии применения адилинсульфама в ветеринарии.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2005-2008 гг.; на международной научной конференции «Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка», Казань - 2006 г; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии», Казань - 2007 г., «Первом Съезде ветеринарных фармакологов России», Воронеж - 2007 г., научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Достижения молодых ученых - в производство», Казань - 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 работы в рецензируемом журнале «Ветеринарный врач».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы,

6 ВЫВОДЫ

1. Адилинсульфам по фармакологическому действию: клиническим проявлениям, отношению с холинотропными веществами (обратимыми ингибиторами холинэстераз, холинолитиками и др.) является высоко активным деполяризующим миорелаксантом. При внутримышечном его введении ЛД50 у разных видов животных составляют (мг/кг): мыши -8,9±0,5; крысы - 3,5±0,3; кошки - 3,6±0,4; собаки - 0,72±0,06; норки -0,8±0,1; кролики - 3,1±0,3; овцы -0,7, и, следовательно, препарат соответствует II классу опасности веществ - «высокоопасные».

2. Соотношение летальных доз при моделировании на крысах «технологического» (парентерального) и алиментарного (перорального) способа поступления адилинсульфама в организм составляет ~ 1:100.

3. При 20-дневном скармливании беременным крысам мяса овцы, убитой с помощью адилинсульфама (3«ЛД100» - 3 мг/кг), эмбриотоксический, тератогенный эффекты и отрицательное влияние на выживаемость, ростовые и физиологические показатели крысят и молодняка крыс не установлены.

4. При скармливании крысятам и молодняку крыс мяса овцы и кроликов, убитых с помощью адилинсульфама, токсическое действие препарата на животных по ростовым, физиологическим, гематологическим показателям, функциональным тестам ЦНС и весовым коэффициентам внутренних органов не обнаружено.

5. В опытах на самках крыс показано, что при введении им адилинсульфама в третьем триместре беременности вдвое (по ЛД50) повышается токсичность препарата, но при этом миорелаксант не оказывает вредного влияния на детенышей и молодняк, полученные от выживших самок.

6. Разработан метод тонко-слойно-хроматографического определения адилинсульфама в растворах и биосубстратах с экстракцией препарата трихлоруксусной кислотой и проявлением реактивом Драгендорфа, ЯГ - 0,42, с чувствительностью - 0,6 мкг в 10 мкл экстракта. Установлено, что препарат при парентеральном и пероральном поступлении в организм животных быстро разрушается, а при хранении субстанции (порошка) адилинсульфама в стеклянной таре он стабилен - в течение 3-х лет его остаточная активность составляет не менее 80%.

7. В результате скрининга потенциальных антагонистов адилинсульфама на крысах и кроликах выявлены 4 соединения, существенно снижающие действие препарата: пирацетам, ацетилхолин, сульфокамфокаин и феназепам. При лечебно-профилактическом введении их на фоне смертельной дозы адилинсульфама предотвращается гибель животных, и снижается риск его применения для временного обездвиживания.

8. По показателям токсичности и специфической для миорелаксантов активности адилинсульфам не уступает аналогам: дитилину и адилину, проявляя более короткую фазу миорелаксации и превосходя дитилин по растворимости >4 раз, а адилин по срокам хранения субстанции - в 3 раза.

Практические предложения

1. Основные фармако-токсикологические показатели по оценке свойств нового миорелаксанта адилинсульфама, по разработке его лекарственной формы и метод тонкослойной хроматографии его определения включить в лабораторный регламент и ТУ на производство препарата.

2. Результаты диссертационной работы включить в комплект документов для госрегистрации адилинсульфама как лекарственного средства ветеринарной медицины для обездвиживания и бескровного убоя животных.