Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологические свойства дитолония - нового миорелаксанта периферического действия

■ :,;Й I

МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ' """

УДК 615.22-036.12-056.3

Таганович Наталья Дмитриевна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДИТОЛОНИЯ - НОВОГО МИОРЕЛАКСАНТА ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

14.00.25 - фармакология

Автореферат

. диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Минск 2000

Работа выполнена в центральной научно-исследовательской лаборатории Минского государственного медицинского института

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор Захаревский A.C.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.

профессор Бушма М.И.

доктор медицинских наук, профессор Кузьмицкий Б.Б.

Оппонирующая организация: Гомельский государственный

медицинский институт

Защита состоится «__« «_« 2000 года в _ часов на заседании

совета [Д 03.18.08] по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Минском государственном медицинском институте [220116, г.Минск, пр.Дзержинского, 83, тел. 272 55 98]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского государственного медицинского института

Автореферат разослан «_«_2000 г.

/

В.А.Переверзев

Ученый секретарь совета по защи1с дйсссртатк! доктор медицинских наук, профессор

^>СС!ЖСКАЯ ГОСУЛ; ГСТВЕН11ЛЯ КИйЛИОТЕКЛ

--^ЧЭБЩАЯ1 ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Дальнейшее совершенствование современных методов общего обезболивания в значительной степени связано с созданием и внедрением в клиническую практику нозых мышечных релаксантов. В связи с широким спектром показаний трудно представить возможность создания одного миорелаксанта. отвечающего всем требованиям. Современной анестезиологии необходимо три вида миорелаксантов: 1) вызывающие быстро развивающуюся нервно-мышечную блокаду (в течение 1 мин), но с коротким периодом действия (5-10 мин), которые могли бы использоваться путем продолжительной инфузии; 2) вызывающие быстро развивающуюся нервно-мышечную блокаду со средней продолжительностью действия (20-30 мин); 3) для обширных хирургических вмешательств - препараты с длительным периодом действия (30-150 мин), лишенные влияния на сердечно-сосудистую систему [45,153]. Постсинаптические недеполяризующие мышечные релаксанты заняли прочное место в арсенале лекарственных средств, широко применяемых в анестезиологической практике [61,62,66,77,92,127]. Считают, что для клинического применения они представляют наибольший интерес, поскольку вызывают быстрый эффект, устраняемый антагонистами, не кумулируют и максимально лишены побочных свойств [17,106].

За последние 10-15 лет в клиническую практику было внедрено несколько недеполяризующих миорелаксантов с высокой активностью и избирательностью действия: векуроний, атракурий, пипекуроний (ардуан) и теркуроний. Однако все они оказались препаратами со средней продолжительностью действия [17,61,62,66,77,92,101, 151]. Поэтому создание более совершенного недеполяризующего миорелаксанта короткого действия остается актуальной задачей. Стремясь решить эту проблему, в Минском медицинском институте (кафедра фармакологии, лаборатория физиологии и экспериментальной патологии ЦНИЛ) были исследованы курареподобные свойства 44 соединений, представляющих собой новые бис-четвертичные аммониевые соли дикарбоновых кислот [6,7,8,9]. Все они были синтезированы на кафедре органической химии Белорусского государственного университета под руководством доктора химических наук, профессора Л.С. Станишевского.

Высокоактивным и перспективным для клинического применения признан бисбензолсульфонат К1,Ы1-дитолил-К1,М1-ди-(4-триметил-аммониобензил) амид адипиновой кислоты, названный дитолопием. Непременным условием при решении вопроса о возможности использования дитолония, как и любого другого лекарственного препарата, в клинической практике в качестве миорелаксирующего средства является выяснение фармакокинетических, фармакодинамических его параметров и оценка безвредности.

Связь работы с крупными программами. Данная работа выполнялась в рамках республиканской межотраслевой научно-технической программы Комитета по фармацевтической и микробиологической промышленности РБ 43-01 р «Создать новые эффективные лекарственные препараты» (срок выполнения - 1994г.-1995г.) и Республиканской программы концерна Белбиофарм 05.05. «Лекарственные средства» (срок выполнения 1997-2000 г.г.).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования - завершить экспериментальную разработку нового периферического миорелаксанта недеполяризующего типа действия - дитолония: исследовать фармакокинетические и некоторые фармакодинамические параметры, оценить безвредность и подготовить материалы для клинических испытаний. Задачи исследования:

1. Изучить возможность связывания дитолония белками плазмы крови и метаболического превращения в кровотоке;

2. Выяснить пути тканевого метаболизма дитолония и выведения из организма конечных продуктов биотрансформации;

3. Определить элементы зависимости «структура-действие» в ряду химических аналогов дитолония;

4. Оценить возможность комбинированного применения дитолония и дитилина с целью сокращения времени восстановления мышечной активности в послеоперационном периоде;

5. Получить дополнительные данные о подострой и специфической токсичности дитолония.

Методы проведенного исследования. Для решения поставленных задач были привлечены следующие методы: спектральные и флюоресцентные: препаративные (выделение микросомальной фракции из ткани печени, альбумина - из плазмы крови, метаболитов дитолония - из мочи); аналитические (определение гидроксилируюшей активно-

сти микросомальной системы окисления, интенсивности окислительного дезметилирования, концентрации цитохрома Р-450, активности NADFH-цитохром Р-450 редуктазы, ацетатсолинэстеразы); фармако-логичекие (симптом склонения головы у кроликов, блокада проводимости импульсов в нервно-мышечных синапсах в ответ на электрическое раздражение, определение острой и подострой токсичности); клинико-биохимические (соотношение белков, концентрация глюкозы, холестерола, мочевины, активности ACT, АЛТ, щелочной фосфа-тазы в плазме крови); морфологические (макро- и световая микроскопия); иммунологические (эпи- и внутрикожное тестирование, реакции специфического лейкоцитолиза, специфической агглютинации, специфической микропреципитации, спонтанной лейкергии).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Все данные исследований, приведенные в настоящей работе, были получены впервые и не имеют аналогов, поскольку у новосинтезиро-ванного соединения исследовались такие характеристики, которые ранее не были определены.

В частности, установлено, что дитолоний после внутривенного введения в кровотоке взаимодействует с белками плазмы и связывается с ними. Это связывание достигает максимального уровня через 20 мин поете введения препарата и сохраняется в течение 1 часа. Показано, что в крови дитолоний не подвергается метаболическим превращениям под действием типичного участника этого процесса - ацетилхолинэстеразы. В клетках же важнейшим звеном метаболизма дитоло-ния являются процессы дезметилирования аммониевого центра и окисления бензильной группы посредством монооксигеназной системы окисления. Причем, именно эти процессы приводят к снижению миорелаксирующей активности препарата, в то время как пероксида-за, протеазы не оказывают влияния на эффективность его фармакологического эффекта. Вместе с тем, удалось выяснить, что в проявлении дитолонием миорелаксирующего действия значительную роль играет наличие при третичном атоме азота п-толилового радикала, а между третичным и четвертичным атомами азота - фенильной группировки. Установлено, что конечные продукты метаболизма дитолония. п-диметиламинобензойная, п-метиламинобензойная кислота и п-аминобензойная кислоты,- выводятся с мочой.

Были получены дополнительные аргументы в пользу перспективности использования дитолония в клинической практике. Так, при необходимости, в конце мышечной релаксации, вызванной дитолонием, можно использовать деполяризующий миорелаксант - дитилин, с целью продления эффекта миорелаксации и последующего сокращения выхода из блокады. Получены экспериментальные доказательства относительной безвредности дитолония для организма. Практическая значимость полученных результатов состоит в том, что они существенно дополняют сведения, необходимые для обоснования возможности клинических испытаний дитолония в качестве миорелаксирующего средства.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ

НА ЗАЩИТУ

1. Дитолоний - антидеполяризующий миорелаксант короткого действия связывается с белками плазмы крови, в частности, с альбумином.

2. Метаболизм дитолония в организме осуществляется посредством дезметилирования аммониевого центра и окисления бензильной группы внутриклеточной монооксигеназной системой окисления. Образующиеся конечные продукты: п-диметиламинобензойная, п-метиламинобензойная кислота и п-аминобензойная кислоты,- не обладают специфической активностью и выводятся из организма почками.

3. Время восстановления мышечной активности после блокады, вызванной дитолонием, сокращается при заключительном введении деполяризующего миорелаксанта - дитилина.

4. Специфическое миорелаксирующее действие дитолония зависит от наличия в его молекуле при третичном атоме азота п-толилового радикала, а также — фенильной группировки между третичным и четвертичным атомами азота.

5. Дитолоний лишен аллергенной активности и малотоксичен при повторных введениях.

Личный вклад соискателя. Изложенные в диссертации результаты получены соискателем лично и совместно с другими исследователями. Соискателем самостоятельно разработаны модели экспериментов, осуществлялось их выполнение, проведена обработка результатов и их анализ.

Синтез предполагаемых метаболитов дитолония и выделение конечных продуктов проведены совместно с профессором кафедры орга-

нической химии БГУ JI.C. Станишевским. Спектрально-флюоресцентные исследования проведены с участием научного сотрудника Института физики HAH РБ Е.И. Каролик. Выделение микросомаль-ной фракции из ткани печени, определение активности микросо-мальных ферментов проведены совместно с доцентом кафедры биохимии БГУ В.П. Курченко. Морфологические исследования проведены совместно с профессором кафедры гистологии МГМИ A.A. Ар-тишевским. Определение подострой токсичности и аллергенной активности дитолония проведено совместно с научным сотрудником лаборатории токсикологии НИИ санитарии и гигиены МЗ РБ В.В. Шевляковым и научным сотрудником ЦНИЛ МГМИ Л.А. Меленто-вич.

Научный руководитель, помимо постановки целей и задач исследования, оказывал консультативную помощь в разработке моделей, обсуждении и трактовке полученных результатов.

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации были изложены на Международном симпозиуме «Экспериментальная фармакология - клинике», Винница-Киев, 1992г., Втором съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков «Моле-кулярно-клеточные основы функционирования биосистем», Минск, 1996г., научной сессии Белорусского института усовершенствования врачей, Минск, 1997г., 15-ом Европейском симпозиуме по метаболизму лекарств, Йена (ФРГ), 1996г.

Опубликованность результатов. Основные положения изложены в 8 работах: 5 статей в журналах и сборниках, 3 тезисов докладов на международных и республиканских съездах и симпозиумах. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения (4 главы), заключения и списка литературы, включающего 173 источника. Работа изложена на 109 страницах, содержит 17 рисунков, 24 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объектом исследования являлось соединение - бисбензолсульфонат N1, N1 -дитолил- N1, N1 -ди-(4-триметиламмониобензил)амид адипиновой кислоты, получившее название «дитолоний».

н,с—

)—Н2С— К—1С—(СЕ4)— С—Ы— НгС—

Ы1 аьгсжо,"

Шз

(|Нз

СНз

СНз

СНз

Рис.1. Структура дитолония

Предметом исследования было определение фармакокинетических его параметров (транспорт в крови, метаболизм в организме и выведение), фармакодинамических характеристик, связанных с выяснением роли отдельных структурных компонентов дитолония в проявлении миорелаксирующего действия, возможности комбинированного использования дитолония и дитилина, подострой токсичности и аллергенной активности.

Оценка связывания миорелаксанта белками плазмы крови производилась с помощью флюоресцентного метода. Исследовалось влияние дитолония на собственную флюоресценцию белков плазмы крови кроликов и зондовую флюоресценцию. В качестве флюоресцентного зонда использовался АНС (1-анилинонафталин-8-сульфонат). Для сравнения в ряде опытов оценивали связывающую способность белков плазмы крови при введении в организм экспериментальных животных дитилина, (З-тубокурарина, предполагаемых метаболитов дитолония.

Механизм взаимодействия дитолония с белками плазмы крови определяли с использованием метода инфракрасной спектроскопии. Для выяснения путей метаболизма дитолония и выведения его из организма были привлечены следующие методы: определение активности ацетилхолинэстеразы плазмы крови кроликов - по скорости гидролиза ацетилтиохолина; определение гидроксилирующей активности микросомальной системы окисления из печени кроликов и способности её катализировать окислительное дезметилирование - по реакции гидроксилирования анилина и дезметилирования диметила-нилина соответственно. В качестве индуктора микросомальной гидроксилирующей системы использовали фенобарбитал натрия, который вводили кроликам внутрибрюшинно в течение 5 суток. Дополнительно в микросомальной фракции оценивали концентрацию цито-хрома Р-450 и активность ИАОРН-цитохром Р-450 редуктазы - спек-трофотометрически.

Выведение дитолония почками и определение его метаболитов в моче исследованы в опыте на собаке. Из собранной мочи экстрагировали органическую фазу, которую разделяли градиентной хроматографией на колонке, заполненной кремниевой кислотой (10-20 мк). Идентификацию выделенных продуктов осуществляли тонкослойной хроматографией в присутствии свидетелей.

Оценку миорелаксирующей активности дитолония и других анализируемых соединений проводили в опытах на кроликах по тесту «симптом склонения головы» и на кошках - по проводимости в нервно-мышечных синапсах, посредством регистрации сокращений икроножной мышцы, вызываемых электрическим раздражением седалищного нерва. Анализируемые соединения вводили в краевую вену уха кролика в виде 0,01% водных растворов со скоростью 0,1 мл за 15 с. Кошкам соединения вводили в виде 0,05% водных растворов в бедре-ную вену со скоростью 0,1 мл за 30 с до развития полной нервно-мышечной блокады. Определяли время развития и длительность полной блокады, а также время восстановления нервно-мышечной проводимости до 25%, 50%, 75% и 95%-100% к исходному уровню. В качестве вспомогательного теста для оценки миорелаксирующей активности использовали показатели острой токсичности соединений для белых мышей, поскольку гибель животных происходит от гипоксии, развивающейся вследствие паралича дыхательной мускулатуры. Для этого метаболиты вводили в хвостовую вену в виде 0,0025% водного раствора. Определяли летальную дозу, вызывающую гибель 50% животных (ЛД50)

Токсичность дитолония при многократном введении (подострая токсичность) оценивалась на белых крысах, которым на протяжении двух недель, через день, вводили препарат внутривенно в миорелак-сирующих дозах (0,22 мг/кг и 0,33 мг/кг), не вызывающих полного выключения дыхательных мышц. Период наблюдения за животными после прекращения введения дитолония составлял 30 суток. После умерщвления животных декапитацией определяли весовые коэффициенты внутренних органов, клеточный состав и общие показатели крови, биохимические показатели сыворотки крови (соотношение белков, уровень холестерола, глюкозы, мочевины, активность щелочной фосфатазы, аспартат- и аланинаминотрансферазы (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Оценка аллергенной активности дитолония проводилась на моделях воспроизведения гиперчувствительности замедленного и немедленного типов: провокационного эпикутанного теста у морских свинок, а

также внутрикожной разрешающей пробой с последующим учетом эритематозной реакции (Алексеева О.Г., Петкевич А.И.Д972). Обнаружение возможных специфических сдвигов в клеточном и гуморальном иммунном ответе организма на введение дитолония проводили по реакции специфического лейкоцитолиза - PCJIJI (компле-ментзависимая цитотоксичность) [Деува JI.A., Бару Р.В., 1978], реакции специфической агглютинации - PCAJI [Вегенер 3.,1987], реакции специфической микропреципитации - РСМП [Деува JI.A. и др., 1976]. Иммуномодулирующее (аутоиммунное) действие дитолония оценивали по реакции спонтанной лейкергии - PCJI [Мац А.Н., 1964]. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента. Для этого использовали пакет компьютерных программ Microsoft Excel.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие дитолония с белками плазмы крови Спектр флюоресценции белков в плазме крови кроликов имел максимум при ЗЗОнм. После введения животным дитолония A^c. флюоресценции белков плазмы, измеряемая сразу после забора крови, не изменялась, но заметно снижалась интенсивность флюоресценции, максимально через 20 мин после введения препарата. Добавление дитолония к раствору альбумина (предварительно выделялся гель-хроматографией из плазмы крови кролика) приводило к изменению спектральных характеристик флюоресценции белка вплоть до концентрационного тушения флюоресценции при A,viaKC= 412нм. При введении кроликам дитилина, d-тубокурарина, дитолония интенсивность зондовой флюоресценции АНС в плазме крови существенно снижалась во времени, но только для дитолония, введенного в дозе, равной или больше ЭД. Минимальное значение зарегистрировано через 20 мин после введения препарата (рис.2).

В инфракрасном спектре альбумина из плазмы крови кролика после введения дитолония произошло изменение интенсивности высокочастотной полосы 2965 см'1, области частот 1450-1750 см"1, что свидетельствовало о конформационной перестройке белка. Полученные данные свидетельствуют о том, что дитолоний связывается с белками плазмы. Связывание обусловлено присоединением миорелаксанта вблизи радикала триптофана. В результате изменяется гидрофобная часть белковой молекулы и степень упорядоченности структуры белка.

□дитилин

В ТУБОКУРАРИН

о,1т-

адитолоний (ЭД-150) ЕДИТОЛОНИЙ (ЭД-50)

0,05

о

-0,05

■0,1-

-0,15

-0,2

*

*

-0,25т-1-1-1-1-1-:-1-1-1-1-11 5 10 20 40 60

Рис.2. Динамика флюоресценции АНС в белках плазмы крови до и после введения исследуемых препаратов

По оси ординат - интенсивность флюоресценции, 1оп - 1„сх / 1Иох, (измерялась при X возбуждения - 370 нм, X регистрации - 490 нм). По оси абсцис -время (мин) после введения препарата; * - статистически достоверные результаты (Р<0,05).

Пути метаболизма дитолония и его выведения из организма Выяснение возможности участия холинэстеразы крови в метаболизме дитолония проводилось по оценке влияния миорелаксанта на активность фермента, а также способности дитолония сохранять после инкубации с плазмой крови миорелаксирующий эффект. Исследование показало, что ингибирование холинэстеразной реакции в плазме крови кроликов достигалось лишь при концентрациях дитолония 5 10"4 -а инкубация дитолония с цельной кровью, сывороткой или плазмой крови кроликов в течение 45 мин и последующим обратным введением инкубационной смеси в организм экспериментальных животных не сопровождалась изменением миорелаксирующей активности препарата (табл. 1).

654574525

Таблица 1.

Мнорелаксирующая активность раствора днтолония после инкубация с цельной кровью и её компонентами

Днтолопнй Доза, вызывающая симптом

склонения головы у кроликов

(мг/кг)

Водный раствор 0,061

Цельная кровь * 0,057

Плазма крови * 0,055

Сыворотка крови 0,058

Примечание. 0,01% раствор дитолония смешивали с цельной кровью, плазмой или сывороткой крови и инкубировали 45 мин при температуре 37°С, после чего вводили в организм того же животного, от которого забиралась кровь.

Исходя из особенностей химического строения дитолония, наиболее вероятными ферментными системами для его внутриклеточного катаболизма были определены пероксидаза, протеазы и микросомаль-ная оксигеназная система. Опыты in vitro, в ходе которых дитолоний подвергался окислению пероксидазой хрена, обработке протеолити-ческими ферментами (трипсином, химотрипсином или папаином) не сопровождались снижением его миорелаксирующей активности. Дитолоний при контакте с микросомами печени кролика в присутствии NADPH подвергался дезметилированию с образованием формальдегида. Процесс имел оптимум рН 7,2 и зависел от концентрации NADPH и микросомального белка. Была определена скорость дезметилирования дитолония. Она составила 1,5 10"8Ммин/мг. Продукты дезметилирования дитолония были обнаружены в моче собаки после внутривенного введения ей дитолония в остром опыте. Всего за 4 ч эксперимента было введено 28,8 мг/кг дитолония. За это время объем мочи, собранной путем катетеризации мочеточников, составил 780 мл. Из этого объема в результате проведенной процедуры было выделено 42 мг п-диметиламинометилбензоата, 24 мг п-метиламинометилбензоата и 14 мг п-аминометилбензоата. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что распад дитолония в организме происходит, главным образом, за счет внутриклеточного дезметилирования аммониевого центра и окисления бен-зильной группы. Конечные метаболиты имеют следующее строение:

сн,

^-^Д^-аь н£-нкН^}-с--о-сн

п-НК-диметиламиноме- п-а.минометилбензойная п-М- метиламинометил-тилбешойная кислота кислота бензойная кислота

Миорвлаксчрующая активность возможных метаболитов дито-лония. Вышеназванные и некоторые другие предполагаемые метаболиты дитолония были синтезированы и тестированы на предмет наличия у них миорелаксирующего действия. В дозах, в 10 и более раз превышающих эффективную дозу дитолония, они не вызывали расслабления мышц у кроликов. Результаты определения острой токсичности на мышах подтвердили, что указанные соединения в исследуемых дозах не оказывают парализующее влияние на дыхательную мускулатуру.

Некоторые элементы зависимости между химическим строением и фармакологическим действием в ряду амидов дикарбоновых кислот-

структурных аналогов дитолония В зависимости от химического строения все исследуемые соединения были объединены в пять отдельных групп (табл.2):

Таблица 2.

Миорелакснрующая активность исследовапных соединений в опытах на кроликах я кошках

Исследуемые соединения - производные кислот Кролики (ССГ) Кошки (икроножная мышца)

Доза мг/кг Блок (мин) Блок (мин) Восстановление дыхания (мин)

I. Янтарная 0,10±0,01 6,6±0,2 14 16

II. Адипиновая (дитолоний) 0,07±0,03 4,0±0,5 10 11

Ш.Пробковая 0,16±0,016 11,8±0,3 23 21

Г/.Себациновая 0,15±0,012 23,0±0,7 26 27

У.Терефталевая 0,08±0,004 22,0±0,5 13 15

* - исследуемые соединения вводились в одинаковых дозах (0,15 мг/кг)

Как видно из табл. 2, все сопоставляемые соединения в опытах на кроликах обладали миорелаксирующей активностью, которая существенно ниже у производных пробковой и себациновой кислот. Это подтвердили и результаты опытов на кошках.

Роль химических радикалов при третичном атоме азота молекулы ди-толония (см. рис.1) оценивали сопоставлением активности соединений, производных адипиновой кислоты. Установлено, что миорелак-сирующая активность соединений, содержащих метильный (соед. 415), циклогексильный (соед. 417) радикалы намного ниже, а вызываемая ими нервно-мышечная блокада значительно продолжительнее, чем у соединений, включающих п-толиловый (соед. 278) или п-метоксифенильньш (соед. 418) радикалы.

Аналогичным образом определена роль химических радикалов при четвертичных атомах азота (катионные головки) в молекуле миоре-лаксанта. Полученные данные свидетельствуют о том, что миорелак-сирующая активность соединений возрастает (доза соединения, вызывающая блокаду, уменьшается, а длительность блока увеличивается) при замене метальных групп на этильные. Наличие же двух метальных групп и бензильного радикала у четвертичного атома азота существенно не сказывается на специфической активности. Схожие результаты были получены при исследовании соединений -производных терефталевой кислоты. Кроме того, на примере этих химических соединений была оценена роль групп, расположенных между третичными и четвертичными атомами азота. Установлено, что замена фенильной части молекулы на этильную снижает миоре-лаксирующую активность.

Взаимодействие дитолония с деполяризующим миорелаксантом - ди-

тилином

Выяснение этого вопроса для миорелаксантов с разным механизмом действия представляет как теоретический, так и практический интерес. После повторного введения дитолония в одинаковых дозах период восстановления мышечной активности приблизительно равен длительности блокады, вызванной однократным введением миорелаксан-та. В острых опытах на наркотизированных уретаном кошках с электрической регистрацией нервно-мышечной проводимости в икроножной мышце, исследовали миорелаксирующую активность дитилина (0,3мг/кг), вводимого на заключительном этапе миорелаксации, обеспечиваемой дитолонием. Результаты показали, что и при такой последовательности введение дитилина сопровождается развитием

нервно-мышечной блокады, клинические характеристики которой остаются на уровне, присущем дитилину (выход из блокады составлял 7,8±1,3 мин). Можно предположить, что испытанная в эксперименте схема применения миорелаксантов с разными механизмами действия и клиническими характеристиками может способствовать повышению качества проводимой миорелаксации.

Подострая токсичность и аллергизуюшая активность дитолония Длительное введение препарата (7-кратное, в течение 14 суток) крысам в дозах, составляющих 50% и 75% от ЛД50, после исчезновения симптомов кратковременной миорелаксации, не сказывалось на поведении животных, не тормозило их рост, не влияло на функциональные показатели деятельности сердца (на основании результатов ЭКГ, ЧСС). Колебания количества лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, гематокрита и лейкоцитарной формулы в крови, относительной массы сердца, легких, селезенки, печени, почек, надпочечников не отличались от таковых у контрольной группы животных. Результаты макро- и микроскопического исследования внутренних органов также заметно не отличались от нормы. В период наблюдения не претерпели заметных изменений и показатели (см. Материалы и методы) метаболизма в сыворотке крови.

К дитолонию не было установлено кожной гиперчувствительности, так как абсолютные (мм) и относительные (балл) величины ТОУ (теста опухания уха) в опыте и контроле не имели статистически значимых различий (табл. 3). Не отличались от контроля и показатели эри-тематозной реакции, толщины кожной складки как через 30 мин (гиперчувствительность немедленного типа - ГНТ), так и через 24ч (гиперчувствительность замедленного типа - ГЗТ) после проведения внутрикожной разрешающей пробы. Следовательно, препарат не проявляет способность вызывать аллергические реакции I и IV типа. Уровень лейкоцитолиза в ответ на гаптенную стимуляцию (табл. 4) у трех животных опытной группы превышал физиологическую норму (10%). Однако у двух из 9 контрольных животных также выявлялись запредельные сдвиги, а среднегрупповой показатель РСЛЛ в контроле даже несколько превышал таковой в опыте. РСАЛ как по количеству животных с положительным результатом (интенсивностью в 1 балл), так и по средним уровням в контроле и опыте была одинаковой.

Таблица 3.

Результаты провокационного эиикутанного (ТОУ) и внутрикож-ного тестирования (ГЗТ, ГНТ)

Показатели Группы сравнения

Контроль (п=9) Опыт (п=10)

ТОУ (мм) 0,89 ±0,33 0,9 ± 0,29

ТОУ (баллы) 0 0

ГНТ: по эритеме (через 30 мин), балл 1,22 ±0,16 1,3 ±0,16

ГЗТ: через 24 ч

Толщина кожной складки (мм) 20,7 ±4,82 21,83 ±3,0

Эритематозная реакция (мм) 6,44 ± 0,4 6,2 ± 0,38

Таблица 4.

Результаты проведения тестов на проявление дитолонием аллергенного и иммуномодулирующего действия

Показатели Статистиче- Группы сравнения

ские величины Контроль (п=9) Опыт (п=10)

РСЛЛ (реакция Н* 2/9 3/10

специфическо- X±Sx 6,55 ±3,51 6,16 ±2,9

го лейкоцито-

лиза), %

PCAJI (реакция н* 1/9 1/10

специфической агглютинации), X±Sx 0,11 ±0,12 0,1 ±0,1

оалл

РСМП, log2 н* 1/9 1/10

титров антигап- X±Sx 0,22 ± 0,24 0,3 ± 0,32

тенных антител

PCJ1 (реакция X±Sx 16,5 ±2,4 15,0 ±-2,2

спонтанной

лейкергии), %

Примечание: Н* - в числителе - количество животных с положительным результатом, в знаменателе - всего животных в группе

Полученные результаты свидетельствуют о том, что дитолоний не стимулирует образование агглютинирующих и комплементсвязы-вающих антител. То есть индукция этим препаратом аллергической реакции цитотоксического типа маловероятна. При проведении реакции специфической микропреципитации (РСМП) только в сыворотке крови одного животного в каждой из сравниваемых групп отмечалось увеличение нефелометрической плотности (с титром 1:4 - 1:8). Средний уровень антигаптенных пре-ципитирующих антител не отличался в опыте и контроле (табл. 4). Это указывает на низкую вероятность развития иммунокомплексного типа аллергических реакций на дитолоний.

Таким образом, иммуномодулирующий эффект дитолония, судя по уровню РАЛ и других определяемых клеточных реакций, не установлен.

Совокупность полученных данных позволяет охарактеризовать дитолоний как препарат антидеполяризующего типа действия с коротким периодом нервно-мышечной блокады. Будучи введен в организм, он подвергается в печени биотрансформации под действием оксигеназ-ной ферментативной системы. Процессы дезметилирования и окисления бензильных колец дезактивируют миорелаксант. Конечные метаболиты выводятся из организма с мочой. Хотя не исключены и другие пути выведения. При использовании препарата, он хорошо сочетается с дитилином, если последний вводится для завершения миорелакса-ции после применения дитолония. Дитолоний нетоксичен и лишен аллергенной активности. Эти сведения дополняют характеристику препарата и подтверждают целесообразность проведения его клинических испытаний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Установлено, что дитолоний (Ы1,Н1-дитолил^1,М'-ди-(4-триметил-аммониобензол) амид адипиновой кислоты) при внутривенном введении взаимодействует с белками плазмы крови, главным образом, с альбумином. При этом изменяется пространственная структурная организация микроокружения в гидрофобной части молекул белков. Связывание с белками плазмы достигает максимума через 20 мин и сохраняется в течение 1 часа после введения миоре-лаксанта [2,5].

2. Доказано, что метаболизм дитолония осуществляется посредством дезметилирования аммониевого центра и окисления бензильной

группы внутриклеточной монооксигеназной системой. Перокси-дазное окисление, протеолитические ферменты, ацетилхолинэсте-раза крови не участвуют в метаболизме дитолония [6,7].

3. Показано, что конечными метаболитами дитолония являются п-диметиламинобензоат, п-метиламинобензоат и п-аминобензоат. Они не обладают миорелаксирующим действием и выводятся из организма с мочой.

4. Установлено определяющее значение в развитии миорелаксирую-щего эффекта дитолония наличия в его структуре при третичном атоме азота п-толилового радикала, а также - фенильной группировки между третичным и четвертичным атомами азота. Отсутствие одной метильной группы у четвертичного азота и длина центральной углеродной части в молекуле дитолония существенно не сказываются на специфической активности миорелаксанта [4].

5. Показано, что комбинированное последовательное применение дитолония с дитилином не оказывает существенного влияния на мио-релаксирующие свойства, присущие каждому из этих препаратов. Введение дитилина в конце мышечной релаксации, вызванной ди-толонием, можно рекомендовать для сокращения времени восстановления нервно-мышечной проводимости [1].

6. По экспериментальным показателям, определяющим подострую токсичность и аллергенность, доказано, что дитолоний относится к малотоксичным соединениям [3,4].

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хиониди Э.А., Миклевич A.B., Таганович Н.Д. Взаимодействие дитолония с прозерином и пимадином //Експериментальна фармакология- клшад : тез. докл.- Вшниця-Кшв,- 1992.-C.91-92.

2. Каролик Е.В., Иванов A.A., Жбанко Р.Г., Захаревский A.C., Ме-лентович Л.А., Хиониди Э.А., Таганович Н.Д. Исследование влияния периферического миорелаксанта на транспортную функцию альбумина плазмы крови с помощью флюоресцентного анализа: Сб.науч.ст. / Альбумин сыворотки крови в клинической медицине,- 1994,- Москва, Ириус,- С.116-119.

3. Хиониди Э.А., Таганович Н.Д. Миорелаксирующая акчиьнос1ь

дитолония при повторных введениях : Сб.науч.тр. /Актуальные проблемы биологии и медицины.- Минск, 1996.- т.З.- С.534-536.

4. Мелентович JI.A., Захаревский A.C., Хиониди Э.А., Буянова А.Н.,

Павлов О.Б., Таганович Н.Д. Изучение миорелаксирующей активно-

и

сти в ряду бисчетвертичных аммониевых солей амидов дикарбоновых кислот: Сб. науч. тр. /Актуальные проблемы медико-биологической науки,-Минск, 1997,-С.195-198.

5. Таганович Н.Д. Взаимодействие миорелаксанта короткого действия - дитолония с белками крови //Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем : Тез.докл. второго съезда Белорусского общ-ва фотобнологов и биофизиков,- Минск, 1996 - С. 180.

6. Таганович Н.Д., Сенчук В.В., Курченко В.П. Механизмы биотрансформации миорелаксанта краткосрочного действия дитолония // Вестник Белорусского государственного университета, Сер.2,- 1997,-№ 1,-С. 19-23.'

7. Taganovich N.D., Senchuk V.V., Kurchenko V.P, Peculiarities of the genotoxic effects of a short-term muscle relaxant - ditolonium // Experimental and toxicologic pathology.- 1996.- V.48, N 5,- P.394.

8. Таганович Н.Д. Мышечные релаксанты - современное состояние проблемы //Медицинские новости,- 2000,- Х° 2,- с. 16-22.

РЭЗЮМЭ

Таганов1ч Наталля Дзмпрыеуна

ФАРМАКАЛАПЧНЬЫ УЛАСЦ1ВАСЦ1ДЫТАЛОНШ - НО-ВАГА М1ЯРЭЛАКСАНТА ПЕРЫФЕРЫЧНАГА ДЗЕЯННЯ Ключавыя словы; мшрэлаксант, транспарт, метабашзм, вывядзен-не, структура, актыунасць, такачнасць.

Абъект даследавання: злучэнне - бюбензолсульфанат М^Ы'-ды-талид- К1,Н1-дь[-(4-трыметыламон1абензш)ам1д адышнавай ислаты, атрымаушае назву «дыталонш».

Прадмет даследавання: вызначэнне фармакаюнетычных (транспарт у крыв1, метабал!зм у аргашзме, вывядзенне) i фармакадына-р.пчных параметрау дыталон1я (вызначэнне роли асобных структурных кампанентау у праяуленш мiяpэлaкcipyючara дзеяння, магчы-масщ камбшаванага выкарыстання дыталошя $ дытылша), яго па-дострай I аллергеннай актыунасщ.

Мэта працы: скончыць эксперыментальную распрацоуку новага перыферычнага мiяpэлaкcaнтa - дыталошя: даследаваць фармака-кшетычныя и некаторыя фармакадынам1чныя параметры, ацанщь бясшкоднасць 1 падрыхтаваць матэрыялы для клшчных выпраба-ванняу.

Метады даследаванняу: фармакалапчныя, бш^чныя, б1ях1.\пч-ныя, гематалапчныя, патамарфалапчныя, ¡муналапчныя, статы-стычныя.

Атцыманыя выткт 1' шшзна: установлена, што дыталонш у крыв1 звязваецца з бялкам1 плазмы. Паказана важнасць для праяулення прэпаратам М1ярэлакаруючага дзеяння наяунасщ у саставе малеку-лы п-талшавага радыкала [ феншавай групоукк Даказана, што най-важнейшым звяном метабашзма з'яуляюцца працэсы дэзметы-л1равання амошевага центру 1 аюслення бензильнай групы пры да-памозе унутрыклетачнай монаакагеназнай Ыстэмы аюслення. Установлены канечныя метабал1ты, як1я выводзявда з аргашзма з чой. Даказана мэтазгоднасць сучаснага выкарыстання дытылша I дыталошя. Прэпарат нетакслчны пры шматразовым увядзенш, ён не праяуляе аллергеннай, аугамуннай актыунасщ. Вобласць выкарыстання: фармакалош, юншчная фармакалопя, анэстэз1ялопя.

РЕЗЮМЕ

Таганович Наталья Дмитриевна

«ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДИТОЛОНИЯ - НОВОГО МИОРЕЛАКСАНТА ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ» Ключевые слова: миорелаксант, транспорт, метаболизм, выведение, структура, активность, токсичность.

Объект исследования: соединение - бисбензолсульфонат Ы1, Ы1 -ди-толил- -ди-(4-триметиламмониобензил)амид адипиновой

кислоты, получившее название «дитолоний». Предмет исследования: определение фармакокинетических (транспорт в крови, метаболизм в организме и выведение) и некоторых фармакодинам1гческих параметров дитолония (выяснение роли отдельных структурных компонентов в проявлении миорелак-сирующего действия, возможности комбинированного использования дитолония и дитилина), его подострой токсичности и аллергенной активности.

Цель работы: завершить экспериментальную разработку нового периферического миорелаксанта - дитолония: исследовать фарма-кокинетические и некоторые фармакодинамические параметры, оценить безвредность и подготовить материалы для клинических испытаний.

Метод исследования: фармакологические, биофизические, биохимические, гематологические, патоморфологические, иммунологические, статистические.

Полученные результаты и их новизна: Установлено, что дитолоний, в кровотоке связывается с белками плазмы. Показана важность для проявления препаратом миорелаксирующего действия наличия в составе молекулы п-толилового радикала и фенильной группировки. Доказано, что важнейшим звеном метаболизма дитолония являются процессы дезметилирования аммониевого центра и окисления бензильной группы посредством внутриклеточной моноокси-геназной системы окисления. Установлены конечные метаболиты, которые выводятся из организма с мочой. Доказана целесообразность совместного использования дитилина и дитолония. Установлено, что препарат нетоксичен при многократном введении, он не проявляет аллергенной и аутоиммунной активности. Область применения: фармакология, клиническая фармакология, анестезиология

SUMMARY

Tahanovich Natalja Dmitrievna

PHARMACOLOGICAL PROPERTIES OF THE NEW NONDEPOLARIZING NEUROMUSCULAR BLOCKING DRUG - DI-

TOLONIUM

Key Words: myorelaxant, transfer, metabolism, excretion, structure, activity, toxicity.

Object of Studies: the substance - bisbenzolsulfonate N'N'-ditolil-N1N1-di(4-threemethylammoniumbenzoate)amid adipinate, also called "ditolonium".

Subject of Studies: the determination of some parmacokinetic (protein binding in blood, metabolism and elimination by organs) and pharmacodynamic properties of ditolonium (the role of its molecular components in myorelaxant activity, the possibility of combined use of ditolonium and succynilcholine), the evaluation of its chronical and allergic toxicity. Study Goal: to complete the experimental elaboration of the new peripheric myorelaxant - ditolonium: to investigate its pharmacokinetic and some pharmacodynamic parameters, to evaluate its harmlessness and prepare materials for its clinical testing.

Study Methods: pharmacological, biophysical, biochemical, hematological, pathological, immunological, statistical. The Obtained Results and their Novelty: ditolonium in blood binds to plasma proteins, p-tolil and and phenyl group in ditolonium structure were shown to contribute to the neuromuscular blocking activity of the compound. The most important step in the metabolism of ditolonium is the process of demethylating ammonium centre and oxidating benzil group by the intracellular system of microsomal oxidation. Final metabolites of ditolonium were established. All of them, at least in part, are excreted in urine. The expediency of combined use of ditolonium and succinylcholine was proved, because it makes shorter the recovery from neuromuscular block. No toxic effects were manifested after repeated infusions of ditolonium. The compound has neither allergic nor autoimmune activity.

Area of Application: pharmacology, clinical pharmacology, anesthesiology.