Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Этиологическая структура эшерихиоза пушных зверей и кроликов

Отечественное клеточное пушное звероводство в настоящее время испытывает большие экономические затруднения практически на всех технологических этапах воспроизводства, выращивания и сбыта шкурковой продукции. Высокая себестоимость шкурковой продукции значительно сократила потребительский спрос на меховые изделия.

За 10 прошедших лет поголовье норок сократилось более чем на 70%, лис на 43%. Поголовье песца сегодня находится на уровне 1990-1993 гг. Это произошло в результате хозяйственно-экономической перестройки всех отраслей звероводства.

Проблема увеличения производства пушного сырья в значительной степени связана с сохранностью поголовья и, в первую очередь, молодняка, на который приходятся наибольшие потери от инфекционных заболеваний. Так отход щенков в первые три дня жизни в 1,5-5 и более раз превышает общий отход животных в течение всего производственного года [25].

Одной из основных причин, вызывающих заболевание и гибель молодняка пушных зверей и кроликов, является эшерихиоз (колибактериоз). Однако, в связи с принадлежностью возбудителя к группе условно патогенных микроорганизмов, отсутствием достаточно полных данных о биологических особенностях возбудителя и этиологической структуре колибактериоза пушных зверей и кроликов, а также острым течением заболевания, эшерихиоз нередко не диагностируется даже при значительном распространении [46].

В настоящее время хорошо известно, что эшерихиоз - преимущественно остро протекающая инфекционная болезнь молодняка и взрослых. У молодняка пушных зверей она характеризуется, в основном, сепсисом с явлениями диареи, поражениями центральной нервной системы и органов дыхания. У взрослых проявляется в энтеритной и энтеротоксемической формах, а также абортами, циститами, маститами, отитами, менингоэнцефалитами и др. У кроликов характерны септицемия и расстройства функции пищеварительного тракта [16, 57].

Изучением колибактериоза пушных зверей занимались многие отечественные и зарубежные исследователи: В.А. Аликаев, A.M. Борисов, И.А. Бузинов, А.Д. Буров, A.B. Грабовский, С.А. Джульфаев, A.B. Жаров, В.Г. Зароза, Я.Е. Коляков, С.Я. Любашенко, К.Г. Малышев, А.Г. Малявин, Д.П. Мангаров, З.Н. Меньшикова, П.А. Мхаргрдзели, В.К. Новиков, Т.М. Омельченко, A.M. Петров, Ю.В. Сафаров, B.C. Слугин, С.М. Сулейманов, Е.Т. Цветкова, Ю.В. Чюнаев, В.П. Шишков, В.А. Шубин, И.Г. Щербаков, A.I. Baba, E.F. Logan, I. Masek, Т. Naglic, B.C. Nayk, G.R. Pearson, J.R. Thomlinson, B.G. Wray и др. [32, 46]. 7

Основными направлениями в борьбе с колибактериозом являются химио- и антибиотикотерапия, а также специфическая профилактика. Однако, возникновение резистентных форм энтеропатогенных эшерихий к лекарственным веществам, а также острое течение болезни, заметно снижают лечебную эффективность антибактериальных препаратов [58].

В связи с этим, возникает необходимость изыскания надежных средств специфической профилактики и терапии колибактериоза пушных зверей и кроликов, для решения которой требуется комплексный подход к изучению широкого спектра биологических свойств возбудителя и этиологической структуры заболевания.

Цель исследования.

Изучить этиологическую структуру эшерихиоза пушных зверей и кроликов в различных регионах РФ и отобрать высокоиммуногенные штаммы эшерихий, обладающие комплексом факторов патогенности, включающим продукцию гемолизинов, адгезинов, энтеротоксинов, для создания эффективных биопрепаратов.

Задачи исследования.

1. Изучить распространенность эшерихий - возбудителей эшерихиоза пушных зверей и кроликов в различных регионах РФ, морфологические, культуральные, ферментативные и гемолитические свойства выделенных изолятов.

2. Определить антигенную структуру и наличие адгезинов у изолятов Е. coli.

3. Исследовать токсигенные свойства изолятов эшерихий.

4. Изучить на лабораторных животных вирулентные и иммуногенные свойства изолятов.

5. Изучить чувствительность изолятов к антибиотикам.

6. Отобрать высокоиммуногенные штаммы Е. coli.

Научная новизна.

Изучена этиологическая структура эшерихиоза пушных зверей и кроликов, которая представлена эшерихиями 28 серогрупп.

При этом от лисиц выделены эшерихии 20 серогрупп, от песцов - 24-х, от норок - 13-ти, от соболей - 8-ми, от хорьков - 3-х, от кроликов - 15-ти. Эшерихии трех серогрупп (033, 0149, 0157), выделенные от пушных зверей, и девяти (01, 09, 033, 035, 0101, 0119, 0127, 0139, 0157) от кроликов, ранее не устанавливались как возбудители эшерихиоза у этих видов животных.

Адгезивные антигены А20 и F41 у Е. coli, выделенные от пушных зверей, и К88, 987Р и К99 у эшерихий от кроликов, не описаны в литературе.

От песца выделен изолят Е. coli серогруппы 026, продуцирующий веротоксин VT1; сведения о котором также отсутствуют в доступной нам литературе.

Практическая значимость.

Отобранные высокоиммуногенные штаммы эшерихий, данные об этиологической структуре эшерихиоза пушных зверей и кроликов и спектр чувствительности возбудителя к антибиотикам, могут служить научным обоснованием и практической основой для разработки средств специфической профилактики и терапии эшерихиоза этих видов животных. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на:

- межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки». Воронеж, 12-13 мая 2005 года;

- межлабораторном совещании сотрудников ФГУ ВГНКИ 15 декабря 2005 года.

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 3 научные статьи. Положения, выносимые на защиту:

- распространенность эшерихиоза пушных зверей и кроликов,

- особенности биологических свойств возбудителя,

- антигенная структура и наличие адгезинов у изолятов эшерихий,

- токсигенные, вирулентные и иммуногенные свойства изолятов,

- чувствительностьт изолятов Е. coli к антибиотикам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. ЭШЕРИХИОЗ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ И КРОЛИКОВ

1.14. Заключение

Таким образом, представленный анализ доступной нам научной литературы, свидетельствует об особенностях биологических свойств эшерихий, обусловленных сложностью антигенной структуры возбудителя и широким комплексом факторов патогенности.

Эшерихиоз пушных зверей и кроликов является одной из проблем звероводческой и кролиководческой отраслей, наносящий ощутимый экономический ущерб.

Проводимые для борьбы с эшерихиозом мероприятия часто малоэффективны из-за быстро развивающейся резистентности бактерий к лекарственным препаратам и отсутствия высокоиммуногенных средств специфической профилактики и терапии.

Для создания высокоиммуногенных препаратов (вакцин и сывороток), которые обеспечивали бы защиту восприимчивого поголовья против эшерихиоза, необходимо четкое знание этиологической структуры и патогенеза заболевания, а также факторов патогенности эшерихий.

Наличие и степень выраженности вирулентности у эшерихий определяют форму проявления и тяжесть течения болезни, а также иммуногенную активность самого возбудителя, что необходимо учитывать при отборе производственных штаммов для изготовления биопрепаратов.

Для получения высокоиммуногенного препарата против эшерихиоза пушных зверей и кроликов, вакцину необходимо формировать из штаммов, проверенных по иммуногенности и обеспечивающих перекрестную защиту против гомологичных и гетерологичных серогрупп эшерихий с учетом факторов, ответственных за вирулентность.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2002-2005 гг. в отделе бактериных лекарственных средств ФГУ «ВГНКИ», НЭЛ ОПХ «Манихино», в ветлабораториях звероводческих хозяйств «Салтыковский», «Пушкинский» Московской области, «Майский» Кабардино-Балкарской республики.

В работе использовали полевые изоляты эшерихий, диагностические сыворотки, питательные среды, реактивы, лабораторную посуду и оборудование, лабораторных животных, а также бактериологические, серологические, иммунологические и другие методы исследований, необходимые для выделения из патологического материала изолятов бактерий и изучения их свойств.

2.1. МАТЕРИАЛЫ

В работе использовали 220 изолятов Escherichia coli, выделенных от пушных зверей и кроликов в 3 хозяйствах Московской области и одного -Кабардино-Балкарской республики Российской Федерации. Изоляты хранили в полужидком 0,3% мясопептонном агаре и в лиофилизированном состоянии в холодильнике при температуре 2-4 °С.

Диагностические сыворотки. Для определения серогрупповой принадлежности изолятов Escherichia coli использовали набор агглютинирующих О-коли сывороток, выпускаемый Армавирской биофабрикой, включающий 31 серогрупповую и 4 поливалентные сыворотки, набор из 6 моноспецифических анти-коли сывороток германского производства. Адгезивные свойства выявляли при помощи набора агглютинирующих эшерихиозных антиадгезивных коли-сывороток К88, К99, 987Р, А20 и F41 фирмы «Диавак»; наличие веротоксинов - сыворотками фирмы «Oxoid».

Питательные среды: мясопептонный бульон (МПБ), бульон Хоттингера, мясопептонный агар (МПА), мясопептонный агар с содержанием 5% дефибринированной крови барана, мясопептонный агар - 0,3%, агар Эндо, среды Гисса с добавлением углеводов и многоатомных спиртов (глюкозы, лактозы, сахарозы, маннита, дульцита, сорбита, инозита, рафинозы, рамнозы, арабинозы, адонита, мальтозы, ксилозы с индикатором Андреде), обезжиренное молоко, мясопептонный желатин (МПЖ), среда Клиглер для определения сероводорода, среда Симмонса, полоски фильтровальной бумаги для определения индола, пропитанные раствором парадиметил-аминобензольдегида в ортофосфорной кислоте и этиловом спирте, диски фирмы «ШтесНа», пропитанные 1%-ным раствором тетраметил-парафинилдиамина дигидрохлорида для определения оксидазы, полусинтетическая среда Минка, среда Кларка, МПБ с 0,2% содержанием нитрата калия, среда Китта-Тароцци; среда Сабуро, и др.

Реактивы: вода дистиллированная, физиологический раствор, формалин, фуксин основной, генциан виолет, раствор Люголя, 3% перекись водорода, масло иммерсионное и другие.

Антибиотики: азитромицин, ампициллин, гентамицин, доксициклин, имипенем, канамицин, кларитромицин, клиндамицин, левомицетин, линкомицин, налидиксовая кислота, неомицин, норфлоксацин, оксациллин, олеандомицин, офлоксацин, пефлоксацин, рифампицин, сизомицин, тобрамицин, фузидин, фурагин, фурадонин, цефазолин, цефалексин, цефотаксим, цефтриаксон, цефоперазон, ципрофлоксацин, энрофлоксацин, эритромицин.

Лабораторная посуда: пробирки стеклянные ГОСТ 10515-75, стекла предметные ГОСТ 9284-75, флаконы от 0,1 до 0,5 литра, колбы 0,5 и 1,0 литровые, цилиндры мерные, пипетки мерные стеклянные от 0,1 до 25,0 см3 ГОСТ 20292-74, пипетки пастеровские, чашки Петри стеклянные диаметром 90 мм ТУ 64-2-19-79, ампулы стеклянные по 3,0 и 6,0 см3.

Лабораторное оборудование: микроскоп «JENAMED» (ZEISS); центрифуги «Вестап J2-21», J5-65, Т-24; холодильники «ЗИЛ» и «Стинол»; термостаты «Брува-8» и «И-10»; агглютиноскоп; лупа бинокулярная МБС-9; шприцы 1,0 и 2,0 см3; иглы инъекционные; стерилизаторы; автоклавы; пинцеты анатомические и хирургические; скальпели; ножницы; зажимы; нож вскрывочный; биксы; весы электрические и торсионные; оптические стандарты мутности с концентрацией 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 млрд. микробных клеток в 1 см3, изготовленные ГКИ им. Тарасевича.

Животные: белые мыши беспородные массой 16-18 граммов - 8700 голов.

2.2. МЕТОДЫ

В целях изучения распространённости эшерихиоза на зверофермах и крольчатниках вскрывали трупы пушных зверей и кроликов, отбирали материал для лабораторного бактериологического исследования. Исследования проводили согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденным Департаментом ветеринарии Российской Федерации в 2000 году [29].

Кровь из сердца, костный мозг, печень, почки, легкие, содержимое желудочно-кишечного тракта высевали в чашки Петри со средой Эндо и МПА. Через 18-20 часов инкубирования в термостате учитывали результаты посевов. Из каждой чашки отбирали колонии, помещая их в отдельные пробирки с МПБ.

После культивирования в термостате до появления четко выраженного роста бактерий, из бульонных культур готовили мазки и окрашивали по Граму. Если при микроскопии мазков обнаруживали мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами, не образующие спор, расположенные одиночно или попарно, культуру микроорганизма пересевали на среды Гисса, скошеный МПА, среду Минка и кровяной агар.

У выделенных культур изучали морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные, гемолитические, токсигенные, и иммуногенные свойства, антигенную структуру, вирулентность и чувствительность к антибиотикам.

В работе использовали недиссоциированные изоляты в стойкой Б-форме. Диссоциацию выявляли пробой кипячения по Бернгоффу. Для этого, выращенные на скошенном агаре в течение 24 часов изоляты эшерихий смывали физиологическим раствором, доводили концентрацию микробных клеток до 500 млн./см по оптическому стандарту мутности и прогревали при 100 °С в течение часа. Пробу кипячения учитывали сразу и через 24 часа выдержки при температуре 4-6 °С. Наличие в пробирке осадка, хлопьев, комочков свидетельствовало о самоагглютинации (диссоциации) культуры -положительная реакция.

Ферментативные свойства исследовали на средах Гисса с углеводами и многоатомными спиртами; протеолитические - посевом на МПЖ и обезжиренное молоко. За изменениями сред Гисса в процессе роста бактерий наблюдали в течение 10 дней, учитывая результаты на 1, 3, 5, 7, 10 сутки.

Образование культурами сероводорода определяли по появлению черной окраски среды Клиглер; индола - по изменению цвета индикаторных бумажек.

Для изучения способности изолятов редуцировать нитраты в нитриты их высевали на МПБ, содержащим 0,2% нитрата калия. Через 48 часов инкубирования при 37 °С к культурам добавляли водный 1% раствор крахмала и 10% раствор соляной кислоты в соотношении 1:1. Появление тёмно-синего окрашивания свидетельствовало о редукции нитратов.

Способность усвоения цитратно-аммонийных солей выявляли посевом культур на среду Симмонса. О положительном результате судили по появлению роста культуры и синего окрашивания среды, при отсутствии указанного свойства рост культуры не наблюдался и цвет среды не изменялся.

При определении образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) использовали среду Кларка. Через 48 часов инкубирования при 37 °С к культурам добавляли 5% спиртовой раствор а-нафтола и 40% раствор гидроксида калия. При положительном результате культуральная жидкость окрашивалась в красный цвет.

Наличие уреазы изучали посевами изолятов в среду с мочевиной (по Кристенсену), с последующим инкубированием в течение 48 часов. При расщеплении мочевины среда приобретала малиновый цвет, при отсутствии расщепления - желтый.

Подвижность исследовали при просмотре в препарате раздавленной капли и посеве культур уколом в 0,3% МПА.

Гемолитические свойства изолятов определяли посевами культур на МПА с 5% дефибринированной крови барана. Наличие гемолиза учитывали через 24 часа культивирования при температуре 37 °С.

Для определения серогрупповой принадлежности использовали изоляты, находящиеся в Б-форме, дающие отрицательную реакцию Бернгоффа, имеющие характерные для эшерихий морфологические, культуральные, ферментативные свойства.

Культуры выращивали на скошенном МПА при температуре 37 °С в течение 18-20 часов, смывали физиологическим раствором. Взвесь бактерий прогревали при температуре 100 °С в течение одного часа на водяной бане для разрушения поверхностных термолабильных антигенов. Изоляты, образующие на агаре непрозрачные колонии слизистой тягучей консистенции, автоклавировали при температуре 120 °С в течение двух часов для разрушения поверхностного А-антигена.

Полученную взвесь бактерий центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об./мин, надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в физиологическом растворе до концентрации 4,0 млрд./см3 микробных клеток согласно стандарта мутности и использовали в качестве антигена для постановки реакции агглютинации на стекле.

Серогрупповую принадлежность выявляли с помощью 41 агглютинирующих О-коли сывороток, среди которых:

- 35 сывороток, изготовленные Армавирской биофабрикой, серогрупп:

1 - 01, 02, 04, 08, 078, 0111,0115, 0126;

2 - 09, 015, 018, 020, 026, 0119;

3 - 033, 035, 041, 086, 0101, 0103, 0117, 0137;

4 - 055, 0127, 0138, 0139, 0141, 0142, 0147, 0149; в том числе, четыре комплексные поливалентные, и одна сыворотка к серовару 0157, не входящая в состав комплексных;

6 сывороток производства Германии (Берлинский институт иммунопрепаратов), серогрупп: 044:К74, 055:К59, 078:К80, 0114:К90, 0119:К69, 0152:К.

Реакцию агглютинации ставили с групповыми поливалентными сыворотками, для чего на чистое обезжиренное стекло наносили каплю сыворотки и равную по объему каплю антигена и тщательно перемешивали. Реакцию оценивали в крестах по четырех бальной системе в зависимости от времени завершения реакции, размеров частиц агглютината и степени просветления жидкости. Результаты учитывали в течение 3 минут.

Каждый антиген, агглютинирующийся одной из поливалентных сывороток на стекле, исследовали в РА с разведенными 1:10 моновалентными сыворотками, входящими в ее состав, и с сывороткой к серогруппе 0157, находящейся в наборе отдельно. Разведение сыворотки приводило к уменьшению количества перекрестных реакций с гетерологичными серогруппами эшерихий. Все антигены, реагирующие на стекле более чем на два креста, в дальнейшем использовали для постановки развернутой пробирочной реакции агглютинации.

Для постановки пробирочной РА сыворотку разводили стерильным физиологическим раствором от 1:25, 1:50, 1:100 и так далее до титра, указанного на этикетке. В каждой пробирке оставляли по 0,5 см3 разведенной сыворотки и добавляли к ней равный объем антигена, разведенного л физиологическим раствором до концентрации 500,0 млн./см микробных клеток. Одновременно ставили контроль:

- антиген с физиологическим раствором (для исключения самоагглютинации);

- сыворотку в разведении 1:25 без антигена (для исключения флокулляции).

Пробирки выдерживали в термостате при 37 °С в течение суток, а затем еще 4 часа при комнатной температуре. Реакцию учитывали с помощью агглютиноскопа и оценивали в крестах по четырехбальной системе: (четыре креста) - полная агглютинация, жидкость прозрачная, на дне пробирки осадок в виде зонтика. При встряхивании зонтик легко разбивается на хлопья, комочки и крупинки; (три креста) - почти полная агглютинация, слегка опалесцирующая жидкость, менее выраженный зонтик. При разбивании зонтика образуются мелкие хлопья и комочки; (два креста) - агглютинация не полная, жидкость не прозрачная, зонтик слабо выражен; (один крест) - агглютинация незначительная, жидкость не прозрачная, зонтик отсутствует; отрицательная реакция) - равномерная взвесь бактериального антигена, полное отсутствие осадка. Микробы могут оседать на дно пробирки в виде точки, но при встряхивании разбиваются в равномерную взвесь.

Серогруппу считали установленной, если исследуемая культура вступала в реакцию агглютинации с одной из сывороток в наибольшем титре, который должен быть не ниже половины рабочего титра сыворотки.

Адгезивные антигены изолятов эшерихий выявляли в реакции агглютинации с набором агглютинирующих эшерихиозных антиадгезивных коли-сывороток НПФ «Диавак», включающим поливалентную и пять моновалентных сывороток: К88, К99, 987Р, А20, F41.

Для этого культуры высевали в чашки Петри с МПА для выявления антигенов К88, 987Р и А20 и в чашки Петри со средой Минка - для обнаружения антигенов К99 и F41. Посевы выращивали в течение 20-24 ч при температуре 37-38 °С.

Выросшие культуры исследовали в реакции агглютинации на стекле с антиадгезивными сыворотками. Реакцию ставили в начале с комплексной сывороткой и в случае положительной оценки исследовали культуры, выращенные на МПА и среде Минка. Каплю сыворотки наносили на стекло, бактериологической петлей брали испытуемую культуру и тщательно растирали с сывороткой. Реакцию учитывали в течение одной минуты при легком покачивании стекла при температуре 18-28 °С. Контролем служила испытуемая культура, смешанная с каплей физиологического раствора (pH 7,27,4). Положительная реакция - характеризовалась склеиванием микробных клеток в зерна или хлопья различной величины и полным или частичным просветлением сыворотки при отсутствии агглютинации в контроле.

Качественную характеристику токсигенности культур Е. coli определяли по эдематозному тесту Вартаняна Ю.П на мышах.

Для этого оценки токсигенности изолятов эшерихий по эдематозному тесту, их культивировали на среде Мунделя при температуре 37 °С в течение 18-24 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугировали в течение 30 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость вводили 3 мышам в область плантарной поверхности лапы в дозе 0,1 см3. В качестве контроля использовали чистую среду Мунделя, вводя параллельно в другую лапу в той же дозе. Через 24 часа мышей умертвляли, отрезали лапки выше плюсневого сустава, и проводили их взвешивание, определяя разность веса лапок мышей в опыте и контроле. Устанавливали достоверность разницы веса лапок.

Для установления достоверности разницы веса лапок применяли следующую методику. Вычисляли сумму разности веса лапок (Zd) и сумму квадратов разности веса лапок (Ed ). ad=Sd2 - (Xd)2/n. (1)

После получения ad вычисляли среднее квадратическое отклонение (ad): ad = Vad/n-1. (2)

Среднюю арифметическую (Md) разности веса лапок высчитывали для каждого изолята:

Md = Id/n. (3)

На основании этих данных вычисляли статистическую ошибку md: md = od/Vn-l. (4)

Далее определяли критерий достоверности разности: td = Md/md. (5)

По величине td судили о достоверности, основываясь на связи этой величины с уровнем вероятности (Р), по таблице Стьюдента [49].

Вирулентность выделенных культур эшерихий определяли на белых мышах массой 16-18 грамм, используя по двадцать пять животных на каждый изолят. Культуры выращивали на МПА при температуре 37 °С в течение 18-20 часов, смывали физиологическим раствором и устанавливали концентрацию в 1 см3: 4,0 млрд., 800,0 млн., 160,0 млн., 32,0 млн., 6,4 млн. микробных клеток. Белых мышей заражали внутрибрюшинно, вводя каждой по 0,5 см взвеси бактерий, используя по 5 мышей на дозу. Учет результатов проводили в течение пяти дней. Всех павших мышей вскрывали для исключения гибели от возможного повреждения внутренних органов во время инъекции.

В случае гибели всех мышей, опыт переставляли, применяя меньшие заражающие дозы. Использовали также 25 мышей, по 5 голов на дозу, вводя однократно по 3,2 млн., 1,6 млн., 800,0 тыс., 400,0 тыс., 200,0 тыс. микробных клеток в объеме 0,5 см3.

ЫЭ5о рассчитывали по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьёва [2]:

181Л}5о=№-8 (Е1л-0,5), (6) где Б - максимальная из испытанных доз бактерий; 5 - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей; 1л - отношение числа животных, павших от данной дозы, к общему количеству животных; £1л - сумма значений 1л.

Чувствительность изолятов к антибиотикам выявляли методом диффузии в агар с использованием бумажных дисков, пропитанных различными антибиотиками.

Способность изолятов эшерихий продуцировать веротоксины (УТ1, УТ2) определяли в реакции диффузной преципитации, используя для этой цели диагностикум УТЕС-ЯРЬА фирмы «Охо1с1». (Великобритания).

С целью определения иммуногенности культур готовили моновакцины из вирулентных изолятов Е. соИ, которыми иммунизировали белых мышей в различных дозах.

Степень напряжённости иммунитета у животных оценивали по величине ГО5о - количеству микробных клеток, способных обеспечить защиту 50% иммунизированных белых мышей, при последующем внутрибрюшинном заражении гомологичными и гетерологичными изолятами в дозе 5 1Л)5о.

Величину Ш50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьёва [2]:

Ь8ГО50= №-5(1X1-0,5), (7) где Э - максимальная из испытанных доз бактерий; 5 - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей; Ы - отношение числа животных, выживших при иммунизации данной дозой, к общему количеству животных; ХЫ - сумма значений.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение эпизоотической обстановки в звероводческих и кролиководческих хозяйствах проводили путем бактериологических исследований для выделения энтеропатогенных эшерихий из патологического материала, полученного от свежих трупов пушных зверей и кроликов с клиническими признаками, свойственными эшерихиозу. Изоляты эшерихий выделяли из крови сердца, легких, печени, почек, костного мозга и содержимого желудочно-кишечного тракта.

3.1. Распространенность эшерихий у пушных зверей и кроликов

Из трех зверохозяйств и одного кролиководческого хозяйства в 2003 и 2004 годах были исследованы 526 трупов пушных зверей, павших в возрасте 1-20 дней, в том числе лисиц - 226, песцов - 126, норок - 77, соболей - 68, хорей - 29, и 103 трупа кроликов, павших в возрасте 1-30 дней. Культуры, выделенные от пушных зверей и кроликов представлены в табл.6.