Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотологический мониторинг и совершенствование мер борьбы с артритом-энцефалитом коз в РФ

УДК 619 616 98 578 636 22

На правах рукописи

Волкова Ирина Юсупджановна

Эпизоотологический мониторинг и совершенствование мер борьбы с артритом-энцефалитом коз в РФ

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ООЗ172284

Покров - 2008

003172284

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ)

Научные руководители*

доктор биологических наук,

профессор Стрижаков Александр Анатольевич

доктор ветеринарных наук Колбасов Денис Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник доктор ветеринарных наук, профессор

Селянинов Юрий Олегович

Мищенко Владимир Александрович

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им ЯР Коваленко (ГНУ ВИЭВ)

Защита диссертации состоится 10 июля 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу 601120, Владимирская обл, Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Тел/ факс (49243)62125

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Автореферат разослан 2 июня 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук В Я Савукова

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы

Артрит-энцефалит коз (АЭК) - болезнь, характеризующаяся длительным инкубационным периодом, продолжительным течением и персистенцией вируса. Артрит-энцефалит коз поражает козлят, ягнят и телят, вызывая гибель 100 % зараженных животных

Возбудителем артрита-энцефалита коз является вирус, относящийся к семейству ретровирусов, роду лентивирусов, куда входят также антигенно и генетически родственные вирусы висна-маеди овец, инфекционной анемии лошадей и иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) [Архипов НИ, 1987, John Е D, 1981]

Спектр восприимчивых к вирусу АЭК животных не ограничивается парнокопытными жвачными и в эпизоотологический процесс могут вовлекаться грызуны, собаки, кошки, приматы и т д [SciTecLibrary ru - 2003]

Американские ученые представили доказательства инфицирования вирусом АЭК людей Возбудитель АЭК передается со свежим козьим молоком, что объясняет его широкое распространение среди людей в странах с активным козоводством Мексика, Центральная Америка [SciTecLibrary ru - 2003]

По данным OIE АЭК встречается во многих странах мира и на всех континентах В недавних сообщениях отмечается о том, что болезнь возникает в тех странах, где до этого не регистрировалась

Наличие на территории РФ потенциально-восприимчивых животных в сочетании с социально-экономическими фоновыми показателями, указывает на высокую вероятность возникновения и распространения АЭК в России Кроме того, в козоводческих хозяйствах России обнаружены случаи заболевания коз, по клинической и патологоанатомической картине вызывающие подозрение на АЭК Эпизоотологический анализ показал, что такие животные завезены из неблагополучных по АЭК стран В тоже время, в РФ отсутствуют как средства диагностики болезни, так и меры борьбы с ней

В связи с вышеизложенным, проведение научных исследований по изучению эпизоотологии АЭК, разработке средств и методов диагностики, мер борьбы с болезнью является актуальным

1.2. Цель и задачи

Цель работы провести эпизоотологический мониторинг АЭК коз в РФ, разработать средства и методы диагностики болезни, а также комплекс мероприятий по ликвидации и профилактике АЭК

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Провести эпизоотологический анализ нозоареала АЭК в мире

2 Определить и ранжировать зоны риска возникновения АЭК на территории РФ Разработать пространственно-динамическую модель АЭК на территории РФ

3 Провести эпизоотологическое обследование парнокопытных жвачных для вьивления вируса АЭК в зонах высокого риска возникновения болезни

4 Разработать тест-систему на основе ПЦР для выявления генома вируса АЭК

5 Определить восприимчивость культур клеток, КРС и белых мышей к заражению вирусом АЭК

6 Разработать и апробировать на практике комплекс мер по профилактике и борьбе с АЭК в животноводческих хозяйствах

1.3. Основные положения, выдвигаемые на защиту

1 Результаты эпизоотологического анализа мирового нозоареала АЭК

2 Пространственно-динамическая модель АЭК на территории РФ

3 Тест-система на основе ПЦР для выявления генома вируса АЭК

4 Эпизоотологический мониторинг, клинические, патологоанатомические проявления АЭК в неблагополучных хозяйствах, у естественно и экспериментально зараженных животных,

5 Рекомендации по профилактике и ликвидации артрита-энцефалита коз 14. Научная новизна работы

1 В результате проведенных исследований впервые установлена циркуляция вируса АЭК на территории РФ в стадах коз молочного направления Изучены клиническое проявление и патологоанатомические изменения у естественно инфицированных АЭК коз

2 Определена чувствительность первичных и перевиваемых культур клеток и лабораторных животных (мышей) к вирусу АЭК

3 Определены и ранжированы зоны риска возникновения артрита-энцефалита коз на территории РФ Разработана пространственно-динамическая модель АЭК на территории РФ

4 Разработана тест-система на основе метода ПЦР для выявления генома вируса АЭК, определена ее диагностическая чувствительность и специфичность

5 Разработан проект «Правил по борьбе с артритом-энцефалитом коз»

1.5. Практическая значимость и реализация результатов исследования

Разработанные "Методические рекомендации по выявлению РНК вируса артрита-энцефалита коз методом полимеразной цепной реакции" утверждены РАСХН от 12 12 2007 и рекомендованы для использования при идентификации указанного возбудителя и его дифференциации от генетически родственных вирусов семейства Ретровирусов

Полученные в экспериментальных исследованиях данные мы использовали при разработке мер профилактики и ликвидации артрита-энцефалита коз Разработанные "Правила по борьбе с артритом-энцефалитом коз " рассмотрены ученым советом ВНИИВВиМ 14 10 2005 и представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ

Проведение мероприятий согласно предложенным "Правилам ", позволило в течение 2-х лет оздоровить от АЭК ранее неблагополучное козоводческое хозяйство Тверской области

1 6. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (г Ульяновск, 2006 г ) и представлены на заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (2005-2007 гг)

1.7. Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 статей научных работ, в том числе три статьи в журнале «Ветеринария»

1.8. Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно В выполнении работы по разделу «Разработка набора препаратов для выявления РНК вируса АЭК методом ПЦР» практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ Цыбанов С Ж, Жигалева О Н, Бурдинский В Г, а по разделу «Определение чувствительности культур клеток к заражению вирусом АЭК» -Юрков С Г, Филатов А В

1.9. Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 116 листах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (138 источников, в том числе 33

отечественных) Работа иллюстрирована 9 таблицами и 20 рисунками и дополнена приложениями 2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы

Вирусы: полевой изолят вируса АЭК, синовиальная жидкость телят, Липецкая область 2003 г, полевой изолят вируса АЭК, кровь коз, Тверская область, 2004-2006 гг, референс-штамм вируса АЭК (Европейский), США, кат № 75-G63

Сыворотки крови, сыворотки крови коз, полученные в процессе проведения серологического мониторинга АЭК из различных регионов России, сыворотки крови от интактных и зараженных вирусом АЭК коз, полученные в результате экспериментов

Животные* козы зааненской породы в возрасте 3-5 лет, массой до 50 кг, получены из фермерского хозяйства Тверской области, телята черно-пестрой породы в возрасте 5-6 месяцев, массой до 50 кг, выращенные в условиях чистого вивария ГНУ ВНИИВВиМ, мыши белые, нелинейные, массой 20-30 г, выращенные в условиях чистого вивария ГНУ ВНИИВВиМ, мышата-сосуны нелинейные, 1-2 дневные Животных выдерживали до начала эксперимента под наблюдением в течение 10-14 дней Кормление осуществляли в соответствии с рекомендуемыми рационами

Культуры клеток* Для выделения, культивирования и изучения культурально-биологических свойств вируса АЭК использовали в виде суспензии и двухсуточные перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки - CV-1, катал № 43 3, почки эмбриона африканской козы -ПЭАК, катал № 26, почки сайги - ПС, катал № 31, легкого эмбриона оленя -ЛЭО, катал № 30, легкого эмбриона лося - ЛЭЛ, катал № 27, легкого эмбриона ягненка - ЛЭЯ, перевиваемой линии клеток почки теленка - MDBK, катал № 13, почки африканской зеленой мартышки VERO, катал № 44, почки новорожденного сирийского хомячка - ВНК-21/13, катал № 39, сосудистого сплетения мозга овцы - ССМО, первичная культура клеток тестикул козлят -ТК

Культуры клеток получали в лаборатории "Культур клеток с музеем клеточных штаммов" ГНУ ВНИИВВиМ

Сыворотки: Для поддержания роста гибридных клеток и перевиваемых клеток животных использовали фетальную сыворотку КРС ("Sigma", США, Cat № F 2442)

Питательные среды и добавки* Среда для культивирования клеточных культур Игла-МЕМ

Методы

Культивирование вируса АЭК. Для получения культурального вируссодержащего материала использовали культуры клеток ЛЭО и ЛЭЯ, выращенные в 50 мл матрасах или чашках Кареля в среде Игла-МЕМ Заражение культур клеток проводили методом сокультивирования суспензии чистых клеток с лейкоцитами периферической крови (ЛПК), полученными от инфицированных АЭК животных

Получение форменных элементов крови. Для лизиса эритроцитов к одному объему крови добавляли 20 объемов дистиллированной воды, а затем вносили равный объем ФСБ в двукратной концентрации После центрифугирования в течение 15 мин при 1500-2000 g, осадок растворяли в 0,5 см3 воды и использовали в качестве материала для выделения нуклеиновых кислот

Постановка ПЦР Раствор кДНК (5 мкл) амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 0,4 мкМ каждого праймера, 0,1 мМ смеси dNTP, 50 mM TnsHCI pH 8,8, 50 мМ KCl, 2,0 мМ MgCl2, 1,0 ед Taq-полимерззы Затем на поверхность реакционной смеси наслаивали 25 мкл легкого минерального масла и помещали в термоциклер Амплификацию в термоциклере проводили по следующим программам, указанным в табл 1

Таблица 1 Режимы постановки ПЦР

Температура Время Количество циклов

АЭК ВМО

98 °С 98 "С 30 сек 1

95 °С 95 "С 2 сек 42

69 °С 58 "С 15 сек

72 °С 72 °С 60 сек 1

Анализ ПЦР продуктов. Для анализа фрагментов ДНК методом гель-электрофореза наносили по 5-10 мкл ПЦР продуктов в лунки на 2 % агарозный гель Электрофорез проводили, используя Трис-ацетатный буфер, содержащий бромистый этидий в концентрации 0,4-0,5 мкг/мл, в режиме 10-15 В/см в течение 30 минут Учет результатов электрофореза проводили по размеру ПЦР-продуктов с использованием маркера молекулярной массы ДНК (100 Ьр)

Экспериментальное заражение животных. Заражение проводили путем инокуляции культурального или нативного антигена внутримышечно,

интрацеребрально и внутрибргошинно Объем и кратность инокулируемой дозы варьировали в зависимости от вида животного и активности инокулята

Статистические методы исследования. Статистическая обработка результатов проведена с использованием персонального компьютера и пакета прикладных программ "Statgiaf' и "Statsf'

2 2. Результаты собственных исследований

2 2.1. Сравнительно-географический и исторический анализ распространения АЭК в мире

2211 Формирование исходных данных.

Сформирован перечень неблагополучных по АЭК территорий за период с 1984 по 2004 гг, включающий информацию по всем странам, существовавшим в этот период на карте мира Учитывались неблагополучные, а также свободные от АЭК страны Страны дифференцированы на группы с учетом природно-сельскохозяйственных особенностей, уровня развития овцеводства и козоводства и характера нозопрофиля, видов восприимчивых к болезни животных, частоты регистрации и широты распространения болезни, числа эпизоотических вспышек и случаев, числа заболевших, павших, вынужденно убитых, уничтоженных, обследованных, характер противоэпизоотических мероприятий, применявшихся в стране

2212 Пространственная динамика и структура нозоареала АЭК в мире

На основании анализа регистрации АЭК в мире получены данные о том, что наибольшее число вспышек с 1996 по 2004 год зарегистрировано в странах Европы и Северной Америки, далее по убыванию идут Азия, Африка, Австралия и Океания, Южная Америка Из 161 стран, задействованных в системе отчетности FAO по АЭК, циркуляция вируса зарегистрирована в 43-х

годы

Рис 1 Динамика распространения ареала артрита-энцефалита коз

Анализ динамики нозоареала АЭК неблагополучных стран свидетельствует о выраженной трансгрессии нозоареала Как свидетельствуют данные представленные на рис 1, динамика эпизоотической ситуации по АЭК характеризуется ростом напряженности в период с 1996 по 2004 гг

2 21.3 Математико-картографическое моделирование

действующего и потенциального нозоареалов АЭК в мире

Моделирование структуры нозоареала АЭК проводилось по следующим показателям индексу стационарности, индексу эпизоотичности и характеру проявления эпизоотического процесса.

В результате исследований были определены и ранжированы по напряженности предпосылок зоны риска обнаружения АЭК

Зона I (очень высокого риска обнаружения АЭК) Включает в себя территории Центральной и Южной Америки, Африки, Азии, Австралии и Европы Животноводство носит натуральный характер Специфические значения индекса стационарности - 0,8-1,0, эпизоотичности - свыше 0,6

Зона II (высокого риска обнаружения АЭК) Занимает территорию субэкваториального и тропического пояса с ландшафтными зонами переменно влажных лесов, саванн, редколесья и кустарников Стационарность АЭК в зоне -0,8-1, эпизоотичность болезни достигает 0,6 и более

Зона III (риск обнаружения АЭК выше среднего и высокий риск эпизоотичности болезни) Включает районы мира, расположенные в субтропическом климатическом поясе, характерны ландшафтные зоны влажных вечнозеленых, лесов, жестколистных лесов и кустарников средиземноморского типа, степей, саванн, прерий и полупустынь Значения индекса стационарности -0,6-0,8, эпизоотичности -0,55-0,66

Зона IV (средний риск обнаружения АЭК при диагностических исследованиях, средний риск эпизоотичности болезни) Включает районы мира, расположенные в субтропиках Индексы стационарности для зоны 0,4-0,6, эпизоотичности - 0,2-0,4

Зона V (ниже среднего риск обнаружения АЭК, ниже среднего риск эпизоотичности) Расчетные значения индекса стационарности могут составить от 0,2 до 0,4, эпизоотичности - менее 0,2

Зона VI (низкий риск обнаружения АЭК, низкий риск эпизоотичности) Индекс стационарности - менее 0,2

Зона VII (очень низкий риск обнаружения АЭК и эпизоотичности болезни) Включает зоны тундры и лесотундры арктического пояса.

2.2.2. Определение и ранжирование зон риска возникновения АЭК в различных географических и климатических зонах РФ

При установлении потенциального нозоареала АЭК на территории РФ методом эпизоотологического моделирования по степени риска выделено 4 зоны из семи определенных по результатам эпизоотологического районирования мирового ареала этой болезни.

Рис.2 Потенциальный нозоареал АЭК в РФ

Зона IV. Для РФ - зона риска наиболее высокой стационарности и эпизоотичности болезни (индекс стационарности 0,4-0,6, эпизоотичности - 0,20,4). Зона риска охватывает Северо-Кавказский экономический район, субтропическую зону Краснодарского края и Дагестан, Центральный Федеральный округ.

Зона V. Наиболее высока вероятность возникновения вспышек в районах пастбищного скотоводства Северного Кавказа, Поволжья и Уральского района в пределах степной, лесостепной и полупустынных зон.

Зона VI. Характеризуется преобладанием степных и горно-степных ландшафтов и таежно-лесных ландшафтов Западно-Сибирского и Дальневосточного округов.

Зона VII. Включает ландшафты тундры и лесотундры арктического пояса, где риск обнаружения АЭК исключительно низок.

2.2.3. Разработка тест-системы для выявления РНК вируса артрита-энцефалита коз методом полимеразной цепной реакции

2.2.3.1. Выбор метода выделения нуклеиновых кислот

В ходе работы проверили сравнительную эффективность и пригодность нескольких методов выделения ДНК ретровирусов: нуклеосорбции, лизирования с помощью буфера с ГТЦ, фенольно-детергентную экстракцию с использованием протеиназы К. В качестве источника ДНК использовались лейкоциты, выделенные из крови козы, инфицированной возбудителем АЭК. Для выделения использовали 100 мм3 материала. Результаты ПЦР представлены на рис. 2.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР полученных на матрицах проб РНК, выделенных

разными способами

1.4.7 - исходный материал;

2.5.8 - разведение в 3 раза;

3.6.9 - разведение в 9 раз;

1 - 3 - пробы, выделенные методом нуклеосорбции; 4 - 6 - пробы, выделенные с лизирующим буфером ГТЦ; 7 - 9 - пробы, выделенные с использованием протеиназы К. М - маркер молекулярной массы ДНК, 100-1000 п.о.

Как видно из представленной электрофореграммы, наилучший результат получен при выделение нуклеиновых кислот при помощи сорбции на силикагель (треки №1-3).

2 2 32 Подбор праймеров

Поиск и подбор специфических праймеров был проделан на основе опубликованных в GenBank нуклеотидных последовательностей генома различных типов и изолятов вируса АЭК

Праймеры подбирались на LTR-область генома, тк данная область генома возбудителя АЭК имеет наименьшую идентичность с эндогенным геномом возбудителя АЭК закодированными в геноме коз

Праймеры подбирали с помощью программы Oligo, на предварительно выравненных, с помощью компьютерной программы BioEdit 6 О, последовательностях геномов изолятов возбудителя АЭК

Для исключения теоретической возможности гибридизации рассчитанных праймеров с геномами других организмов, они были проверены при помощи программы BLASTn (http //www nebí nlm nih gov/BLAST/), показавшей наличие комплементарное™ рассчитанных праймеров с геномами только возбудителя АЭК

2 2 33 Оптимизация условий постановки ПЦР

Для оптимизации ПЦР оптимальную температуру отжига праймеров подбирали в районе 60-69 "С (рис 3) Результаты исследований показали, что максимальное накопление ПЦР-ампликона происходит при температуре отжига 69 °С (трек №4, рис 3), при снижении температуры ниже 69 °С снижается накопление специфического продукта (треки №2, 3), а при 60 °С четкая полоса на электрофорезе не образуется (трек №1) Таким образом, в дальнейших исследованиях при постановке ПЦР использовали температуру отжига праймеров - 69"С

При дальнейших исследованиях для определения оптимальной концентрации в реакционном буфере ионов Mg2+ и значения показателя концентрации ионов водорода (pH) использована система из 16 буферов, содержащих разное количество ионов Mg2+ и имеющих различные показатели pH В табл 2 указана нумерация буферов для соответствующих значений показателя концентрации водородных ионов и концентрации Mg2+

Результаты проведения реакции ПЦР с буферами для одношаговой оптимизации представлены на рис 4

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР полученные при оптимизации температуры

отжига праймеров М - маркер молекулярного веса ДНК, 100-1000 п о.;

1 - температура отжига 60 °С;

2 - температура отжига 63 °С;

3 - температура отжига 66 °С;

4 - температура отжига 69 °С.

Таблица 2

Буферная система для одношаговой оптимизации ПЦР

мё2+ рН ................-........................ 10 мМ 20 мМ 30 мМ 40 мМ

8,0 1 5 9 13

8,4 2 6 10 14

8,8 3 7 11 15

9,2 4 8 12 16

Как видно из электрофореграммы (рис. 4) при низком значении рН 8,0 (треки №1-4) и 8,4 (треки №5-8) накопление ампликона проходит не при всех значениях концентрации ионов При более высоком значении рН 8,8 (треки №9-12) и 9,2 (треки №13-16) накопление ампликона приходит при всех испытанных значениях концентрации ионов Лучшее накопление

ампликона получено при рН 8,8 и концентрации М§С12 30 мМ, т.е. с буфером №11.

n=3

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 4. ПЦР с использованием буферной системы для одношаговой оптимизации ПЦР

М-маркер 100- 1000 п.о.;

1 -16 - результаты ПЦР с буферной системой, указанной в табл.2

2.2.3.4. Определение специфичности и чувствительности метода ПЦР

Специфичность ПЦР проверяли с использованием панели контрольных образцов, включающей пробы крови от коз, больных АЭК, овец, больных аденоматозом, интактных коз и овец, культур клеток, контаминированных вирусами лейкоза КРС, висна и маэди, чистых культур клеток (всего 19 проб). Предложенный набор препаратов для выявления РНК вируса артрита-энцефалита коз методом ПЦР обеспечивает специфическую амплификацию фрагмента генома вируса артрита-энцефалита коз при использовании праймеров, комплементарных участку gag-гена. Установлено, что метод ПЦР позволяет специфически выявлять данный возбудитель в пробах крови и легких животных. Амплификации родственных РНК-содержащих вирусов (аденоматоз овец, висна-маеди овец, лейкоз КРС), РНК полученных из перевиваемой культуры клеток ПО, ПК и от интактных овец не выявлено (рис. 5).

М пко 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 пко

Рис. 5 Гель-электрофорез продуктов ПЦР с использованием набора препаратов для выявления генома вируса артрита-энцефалита коз

М - маркер; ПКО - положительный контрольный образец;

1- кровь интактных коз; 2- ПКК ПК; 3, 4, 10 11 - пробы крови, от больных АЭК коз; 5, 6, 9, 12- пробы крови животных, больных АО; 7- ПКК ПЭО-ЛС, контамин.вирусом лейкоза КРС; 8- кровь интактных овец; 13- ПКК ПЯ, висна К-796; 15- почка интактной овцы; 16- ПКК ПО; 17- легкое интактной овцы; 18- ПКК ПЯ, маеди М-88; 19- легкое животного, больного АО

2.2.4. Эпизоотологический мониторинг АЭК на территории РФ

2.2.4.1. Изучение распространения и особенностей развития эпизоотологического процесса при АЭК в хозяйстве Тверской области

В марте 2003 г. в одном из козоводческих хозяйств Тверской области зарегистрировано заболевание коз, характеризующееся поражением суставов, маститами, снижением надоев. На основании результатов проведенных исследований нами установлен предварительный диагноз - артрит-энцефалит

Первые признаки болезни отмечены в 1992 г. у коз, завезённых из госплемзавода "Никоновское" Московской области. Клиническое обследование поголовья коз, проведенное в 2003 г., выявило наличие животных с поражениями суставов конечностей. У заболевших животных наблюдали развитие хронических артритов, чаще карпальных суставов, хромоту, маститы, агалактию. Различные схемы симптоматической терапии ожидаемого эффекта не принесли. Болезнь характеризовалась хроническим течением, длительной латентной стадией. Периодически у животных наблюдались приступы сухого кашля. Коз выбраковывали в начальной стадии развития парезов конечностей и кахексии. Случаев выздоровления не зафиксировано. Клинические случаи заболевания других видов животных не зарегистрированы.

Исследования проб крови животных (коз, овец, КРС) методом ПЦР, показали, что выделенные из крови коз препараты ДНК реагируют с праймерами, специфическими к вирусу АЭК, что подтвердило предварительный диагноз У 2-х заболевших АЭК коз из 10 обследованных по клиническим показаниям обнаружен участок генома, специфичный для АЭК Также по результатам ПЦР установлено заражение КРС (телка в возрасте 1,5 лет), которая с раннего возраста содержалась в станке, где до нее находился больной козел-производитель Исследование крови второй коровы, содержащейся в другом станке, дало отрицательный результат Обследование в ПЦР овец, совместно содержащихся, дало отрицательный результат Данные по количеству обследованных животных представлены в табл 3 Согласно результатам ПЦР зараженность коз составила 10 % от общего поголовья

Таблица 3

Результаты исследования проб крови животных в ПЦР

Исследовано животных Срок проведения исследования, год

2003 2005 2006 2007

Всего 10 125 25 32

Положительных 3 9 1 1

Последние случаи клинического проявления болезни (артритов) у коз в данном хозяйстве регистрировали в мае 2005 г в ходе проведения повторного эпизоотологического обследования С целью проведения молекулярно-диагностических исследований отобрали 104 пробы крови от коз, 20 проб от овец и 1 пробу от КРС Согласно результатам ПЦР, зараженность коз в стаде составляла 8,6 % от общего поголовья дойного стада, причем большинство положительно реагирующих животных обнаружено в группе доращивания Зараженность потомства козла-производителя составила 17,6 % от общего числа зараженных животных Исследование проб от овец и КРС дало отрицательные результаты

В ходе проведения очередного эпизоотологического обследования в июне 2006 г, отбирали пробы крови от приплода, полученного в 2005-2006 гг от положительно реагирующих родителей Результаты ПЦР показали наличие 1-ой положительно реагирующей годовалой козочки из 25-ти обследованных животных

Повторное исследование крови у козы (матери) и полученной от нее козочки, проведенное в январе 2007 г, подтвердило в ПЦР полученные ранее результаты (позитивность козочки и негативность козы) В это же время

отбирали пробы крови повторно у ремонтного молодняка (19 проб), у необследованных козлов-производителей, у козематок (6 проб) и у трех козликов По результатам ПЦР эти животные являются свободными от вируса АЭК

В процессе отслеживания перемещения животных внутри стада, изучения гениологического древа козлов-производителей и коз маточного поголовья, являющихся больными или вирусоносителями (по результатам ПЦР), нами сделаны следующие выводы

- источником инфекции АЭК в хозяйстве явились козы, завезенные из госплемзавода «Никоновское»,

- основным в данном случае явился вертикальный путь передачи вируса АЭК - со спермой козла-производителя,

- инфицированность потомства козла-производителя достигала 17,6 %, общая инфицированность стада составила 8,6 %,

- при изучении гениологии положительно-реагирующей козочки выяснилось, что она получена от положительно реагирующего козла-производителя и отрицательно реагирующей козы,

- факты обнаружения циркуляции вируса АЭК в Тверской области свидетельствуют о распространении этой болезни в России

2 2 4.2 Изучение распространения и особенностей развития эпизоотического процесса при АЭК в хозяйстве Липецкой области

В мае 2003 г в Липецкой области в хозяйстве по откорму КРС произошла вспышка болезни телят неясной этиологии с симптомами артрита По результатам проведенного нами эпизоотологического обследования данного хозяйства установлен предварительный диагноз - АЭК Проведенные впоследствии лабораторно-диагностические исследования патологического материала, полученного от больных телят, исключили ряд других инфекций и подтвердили диагноз на АЭК

Данные эпизоотологического анализа свидетельствовали, что первые симптомы болезни у телят появились спустя 1,5 месяца после завоза их в хозяйство и постановки на откорм - в мае 2003 г В июне заболело 43 животных, в июле - более 100, а в августе заболеваемость составила 70 % от общего поголовья Гибель телят наступала от кахексии

При вскрытии телят отмечено сухость кожи, отсутствие подкожных жировых отложений, мышечная дистрофия Суставы конечностей заметно увеличены, суставные сумки наполнены синовиальной жидкостью

Симптоматическое лечение больных телят не принесло положительных результатов Прогрессирующие темпы развития болезни на фоне неэффективности принимаемых мер привели к выбраковке телят Для предотвращения дальнейшего распространения инфекции ужесточили требования к проведению полной дезинфекции и дератизации помещений, ветеринарных мероприятий, соблюдению принципа «пусто-занято» Данный комплекс противоэпизоотических мероприятий позволил взять ситуацию под контроль и остановить дальнейшее распространение болезни

Характер эпизоотического процесса и его показатели, а также результаты диагностических исследований указывали на наличие нетипичной для крупного рогатого скота инфекционной болезни При постановке ПЦР препараты ДНК, выделенные из проб крови и органов больных телят, взаимодействовали с праймерами, комплементарными §а§-гену вируса АЭК

2 2.43 Пути передачи вируса АЭК в хозяйствах

Изучение путей передачи вируса АЭК мы осуществляли на примере козоводческого фермерского хозяйства Тверской области При проведении корреляционного анализа зараженности животных с их гениологической линией, движением внутри стада и содержанием, установлены предполагаемые пути заноса и распространения возбудителя АЭК в данном хозяйстве

Согласно результатам эпизоотологического обследования, проведенного в мае 2003 г, вирус в хозяйство занесен с козой Алисой К-49, поступившей в 1996 г из Госплемзавода "Никоновское" М О Дальнейшее распространение вируса внутри стада происходило по наследственной линии козла-производителя Рэма, слученного с козой-вирусоносителем Алисой К-49 (рис 6)

Таким образом, в наблюдаемом случае, нами установлено несколько путей перезаражения животных и распространения возбудителя

- половой путь передачи - при случке от зараженной козы к козлу, со спермой зараженного производителя - козам маточного поголовья,

- вертикальный путь передачи - от зараженных маток потомству в процессе прохождения козленка через родовые пути, облизывания его маткой и потребления им молозива и молока,

- трансовариальный - от зараженного козла - потомству, не заражая мать,

контактный путь передачи - при совместном вирусоносителей со здоровыми козлятами под одной крышей

содержании

Рис 6 Схема передачи вируса АЭК по линии козы Алисы К-49

2 2.5 Изучение восприимчивости культур клеток, лабораторных и сельскохозяйственных животных к вирусу АЭК.

2 2 51. Определение восприимчивости белых мышей к вирусу АЭК

В ходе разработки лабораторной модели для накопления антигена ВАЭК мы изучили восприимчивость к заражению и уровень накопления вирусного антигена у мышей Для этого инокулировали синовиальную жидкость больных АЭК животных в разведении 1 10 взрослым белым мышам внутрибрюшинно и 1-2- дневным мышатам-сосунам интрацеребрально Установлена персистенция возбудителя АЭК на протяжении 3-х пассажей (срок наблюдения) Кроме того, отмечено наличие вируса в мозге и легких взрослых мышей на 45-е сутки после внутрибрюшинного заражения В плодах этих мышей вирусная РНК не обнаружена

2.2.5.2. Определение чувствительности культур клеток к заражению вирусом АЭК

В результате проведенных исследований установлено, что культуры клеток MDBK, VERO, ВНК, ГТЭАК, ПС, ССМО являются нечувствительными к вирусу АЭК Размножение вируса установлено в культуре клеток CV-1, ЛЭО, ЛЭЛ, ЛЭЯ (табл 4) При заражении перевиваемой культуры клеток CV-1 на 3-5-е сутки проявляется цитопатический эффект, в виде локальных очагов (фокусов) Однако на уровне 3-4 пассажа активность вируса резко падает, исключая возможность дальнейшего размножения и накопления вирусного антигена.

Сокультивирование ЛПК от пораженной АЭК козы и клеток культуры ЛЭО, позволило получить хронически инфицированную вирусом АЭК культуру клеток ЛЭО На основании проведенных исследований создан криобанк этих клеток в жидком азоте в объеме, обеспечивающем долгосрочные вирусологические исследования с возбудителем АЭК

Таким образом, в результате изучения чувствительности культур клеток к вирусу АЭК установлено, что тест-системой, оптимальной для работы с вирусом АЭК, является перевиваемая культура клеток ЛЭО, как наиболее чувствительная и стабильная

Таблица 4

Результаты определения чувствительности лабораторных систем и моделей к вирусу АЭК по результатам ПЦР

Исследуемая модель Метод заражения Кол-во пассаж Сроки после заражения Результат ПЦР

Культура кл CV-1 Инокуляция 3 3-5 сутки +

Культура кл ПЭАК Инокуляция 5 3-7 сутки -

Культура кл МДВК Инокуляция 5 3-7 сутки -

Культура кл ЛЭО Сокультивирование 7 10-14 сутки +

Культура кл ЛЭЛ Сокультивирование 3 7-8 сутки +

Культура кл ЛЭЯ Сокультивирование 4 7-8 сутки +

Культура кл ССМО Инокуляция, сокультивирование 5 5-7 сутки -

Культура кл ВНК Инокуляция 3 3 сутки -

Культура кл VERO Инокуляция 3 3 сутки -

Культура кл ПС Инокуляция 5 3-7 сутки -

Культура кл ТК Сокультивирование 5 10-14 сутки -

2 2 53 Определение восприимчивости КРС скота к вирусу АЭК

Восприимчивость крупного рогатого скота к заражению вирусом АЭК подтверждена нами на основании следующего

- обнаружение положительно реагирующей в ПЦР телки в фермерском хозяйстве Тверской области в 2003 г,

- регистрация в 2003 г вспышки болезни телят неясной этиологии с симптомами артрита в Липецкой области в хозяйстве по откорму КРС,

- экспериментальное воспроизведение болезни на телятах 1,5-2-х месячного возраста Заражение бычков проводили путем инокуляции синовиальной жидкости, полученной от клинически больных животных (телята, Липецкая область) внутримышечно, внутривенно и симультанно Развитие виремии отмечено у бычка, зараженного внутримышечно, которая регистрировалась ПЦР на протяжении не менее 45 суток При других методах инокуляции инфицированной синовиальной жидкости животным виремию не наблюдали

2.2.6 Изучение клинических особенностей течения и патоморфологических изменений при АЭК у естественно инфицированных коз

Нами изучены клинические особенности течения и патоморфологические изменения при АЭК у 3-х естественно инфицированных коз доставленных в ГНУ ВНИИВВиМ из неблагополучного хозяйства в сентябре 2005 г

При поступлении у больных животных отмечали хромоту непостоянного типа, опухание окружающих карпальные суставы мягких тканей и их уплотнение, болезненность при надавливании, тугоподвижность У одной из коз наблюдали парез передних конечностей У самок отмечали агалактию У всех животных регистрировали снижение аппетита, а в конце опыта - истощение, взъерошенность и сухость шерсти Периодически у них наблюдали сухой непродолжительный кашель и серозные истечения из носовых полостей

При вскрытии коз выявили следующие патологоанатомические изменения Отмечена гиперемия и точечные кровоизлияния на твердой мозговой оболочке Заметны дегенеративные изменения, такие как фиброз и минерализация синовиальных оболочек, обширная кальцификация мягких тканей, окружающих сустав Суставная жидкость содержала повышенное количество мононуклеарных клеток и имела низкую вязкость

Легкие увеличены за счет гиперплазии соединительной ткани Легочная ткань диффузно уплотнена и по консистенции напоминает губчатую резину Над

поверхностью легкого выступают участки более светлой окраски, чем сама легочная ткань Заметны спайки легочной и кастальной плевры

Селезенка незначительно увеличена в размере, кровенаполнена, пульпа выступает над поверхностью разреза Сердечная мышца истончена

Общая картина патологоанатомических изменений соответствовала состоянию крайней степени кахексии

2.2.7. Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации АЭК в хозяйствах РФ и апробация их на практике

Мероприятия по профилактике и ликвидации АЭК ранее в Российской Федерации регламентированы не были Необходимость разработки соответствующих инструкций обусловлена, рядом причин, важнейшими из которых являются

1 В настоящий момент в мире происходит обострение эпизоотической ситуации по АЭК

2 Существование, согласно разработанной нами модели, зон высокого риска возникновения АЭК на территории РФ

3 Обнаружение болезни и выделение вируса в РФ

Основное внимание при разработке мер борьбы с АЭК обращено на проведение серологического и молекулярно-биологического мониторинга болезни на территориях, которые определены нами как зоны высокого риска возникновения болезни Основные действия ветеринарной службы должны быть направлены на недопущение распространения болезни из стационарно неблагополучных территорий на благополучные по АЭК регионы страны и оздоровление неблагополучных хозяйств

На основании анализа эффективности используемых нами мер борьбы с АЭК и с учетом данных зарубежных исследователей, нами разработана и применяется в настоящий момент система ветеринарно-санитарных мероприятий, которая легла в основу "Правил по борьбе с артритом-энцефалитом коз" Полное содержание "Правил " приведено в приложении

Разработанные нами "Правила " прошли успешную апробацию на практике в хозяйстве Тверской области, где показали свою высокую эффективность при оздоровлении козоводческих хозяйств, неблагополучных по АЭК в течение 2-х лет

ВЫВОДЫ

1 Современный нозоареал вируса АЭК включает в себя 29 стран четырех континентов, среди них Бразилия, Венгрия, Испания, Латвия, Мексика,

Тунис, Великобритания, США Согласно разработанной нами пространственно-динамической модели пространственный тренд АЭК характеризуется нарастанием числа неблагополучных стран в мире в период с 1996 по 2004 гг

2 Эпизоотологическое моделирование АЭК показывает, что зоны высокого риска возникновения АЭК в РФ включают Центральный, Южный, Приволжский, Северо-Кавказский, Уральский федеральные округа, а также субъекты Сибирского и Дальневосточного округов, прилегающие к южной границе страны

3 ПЦР позволяет обнаруживать геном вируса АЭК в пробах культурального материала и крови инфицированных животных на ранних стадиях заболевания (начиная с 45 суток) и дифференцировать его от других близкородственных ретровирусов (висна-маеди, аденоматоз) Данная реакция пригодна для проведения эпизоотологического мониторинга АЭК и использования при осуществлении мер борьбы с АЭК в неблагополучных хозяйствах

4 Установлена циркуляция вируса АЭК среди поголовья коз и КРС на территории Липецкой и Тверской областей Российской Федерации, входящих в определенные нами зоны высокого риска возникновения болезни

5 Установлена персистенция вируса АЭК в течение не менее 60-ти суток в организме экспериментально зараженных мышей, что свидетельствует о возможности циркуляции его среди грызунов в природе, где они могут служить резервуаром инфекции

6 Наиболее пригодной для накопления вируса АЭК является перевиваемая культура клеток легкого эмбриона оленя, как наиболее чувствительная и стабильная в условиях длительного культивирования (не менее 7 суток)

7 Крупный рогатый скот восприимчив к заражению вирусом АЭК, болезнь протекает с характерными клиническими и патологоанатомическими признаками и вирусоносительством

8 Проведение противоэпизоотических мероприятий в соответствии с разработанными нами "Правилами по борьбе с артритом-энцефалитом коз" позволяют ликвидировать АЭК в неблагополучных по данной болезни хозяйствах в течение двух лет

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1 В результате проведенных исследований территория РФ

ранжирована по степени риска возникновения АЭК

2 Разработанные «Методические указания по выявлению РНК вируса АЭК методом полимеразной цепной реакции», утвержденные отделением ветеринарной медицины РАСХН от 12 12 2007 г, рекомендованы для использования при обнаружении указанного возбудителя и его дифференциации от генетически родственных вирусов семейства Ретровирусов

3 Разработаны и предложены для практического применения ветеринарной службой РФ «Правила по борьбе с артритом-энцефалитом коз», рассмотренные и одобренные ученым советом ВНИИВВиМ от 14 10 2005 г и представленные на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Заболевание телят, ассоциированное с вирусом артрита-энцефалита коз / А А Стрижаков, С Ж Цыбанов, А Ю Чичикин, С Г Юрков, О Н Жигалева, И Ю Волкова, В Г Бурдинский, С П Живодеров // Ветеринария -№8 - 2005 - С 21-23

2 Новый патогенный для крупного рогатого скота ретровирус - вирус артрита-энцефалита коз / А А Стрижаков, А Ю Чичикин, И Ю Волкова, С Ж Цыбанов, В Г Бурдинский // Научные основы профилактики и лечения болезней животных материалы Международной научно-практической конференции -Уральский НИВИ - Екатеринбург, 2005 - С 334-339

3 Разработка метода ПЦР для идентификации вируса висна-маэди в пробах органов больных животных /ОН Жигалева, В Г Бурдинский, С Ж Цыбанов, А А Стрижаков, И Ю Волкова, А Ю Чичикин // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов материалы Международной научно-практической конференции - Щелково, 2005- С 211216

4 Волкова, И Ю Артрит-энцефалит коз (обзор литературы) / И Ю Волкова // Сибирская язва и другие опасные инфекционные болезни животных материалы Международной научно-практической конференции - ГНУ ВНИИВВиМ - Покров, 2005 - С 62-67

5 Чичикин, А Ю Артрит-энцефалит коз в мире и России / А Ю Чичикин, А А Стрижаков, И Ю Волкова // Сибирская язва и другие опасные инфекционные болезни животных материалы Международной научно-практической конференции - ГНУ ВНИИВВиМ - Покров, 2005 - С 217-221

6 Волкова, И Ю Эпизоотологические аспекты артрита-энцефалита коз / И Ю Волкова, А А Стрижаков, Г Д Сидельников // Молодежь и наука XXI века Материалы Международной научно-практической конференции - УГСХА - Ульяновск, 2006 - С 339-344

7 Эпизоотологический мониторинг артрита-энцефалита коз в России / Чичикин А Ю , Стрижаков А А , Волкова И Ю , Сидельников Г Д , Цыбанов С Ж, Коломыцев А А // Роль аграрной науки в развитии с/х производства крайнего севера материалы Международной научно-практической конференции - Бурятский СХИ - Улан-Уде, 2006 - С 24-28

8 Клиническая и патоморфологическая диагностика артрита-энцефалита коз / И Ю Волкова, А Ю Чичикин, А А Стрижаков, С Ж Цыбанов // Ветеринария -№1 - 2007 - С 23-25

9 Опыт оздоровления хозяйства, неблагополучного по артриту-энцефалиту коз / Г Д Сидельников, Д В Колбасов, А Ю Чичикин, И Ю Волкова, А В Ржавин//Ветеринария-№12 - 2007 - С 25-27

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г Покров Владимирской обл тираж 75 экз

Актуальность темы. Артрит-энцефалит коз (АЭК) - болезнь, характеризующаяся длительным инкубационным периодом, продолжительным течением и персистенцпей вируса. Артрит-энцефалит коз поражает коз, вызывая гибель 100% зараженных животных.Возбудителем артрита-энцефалита коз является вирус, относящийся к семейству ретровирусов, роду лентивпрусов, куда входят также антигенно и генетически родственные вирусы висиа-маеди овец, инфекционной анемии лошадей и иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2)[1; 10; 28; 91].Болезнь поражает козлят, ягнят и телят. Предположительно, спектр восприимчивых к вирусу АЭК животных не ограничивается парнокопытными жвачными и в эпизоотологический процесс могут вовлекаться грызуны, собаки, кошки, приматы и т.д. [14; 40; 45].АЭК является медленной инфекцией животных - традиционно сложившееся наименование группы инфекционных болезней, которая представляет собой серьёзную проблему для животноводства в связи с их скрытым течением, летальным исходом, отсутствием средств лечения и профилактики [5]. В основном - это болезни, поражающие только один орган или систему тканей и один вид животных или родственные виды, принадлежащие к одному семейству или отряду [15]. К группе медленных инфекций животных относятся как болезни, вызываемые прионами -губкообразная энцефалопатия КРС, скрепи, так и вирусами - алеутская болезнь норок, инфекционная анемия лошадей, артрит-энцефалит коз и другие болезни [54].Для медленных инфекций характерно отсутствие сезонности и периодичности эпизоотии, географической приуроченности. В то же время чётко прослеживается энзоотичность болезней [10]. б Дувас Анджелин и Эресман Гленн из Университета Южной Калифорнии, используя ПЦР-анализ, представили доказательства инфицирования вирусом АЭК людей. Возбудитель АЭК передается со свежим (не подвергавшимся пастеризации) козьим молоком, что объясняет его широкое распространение среди людей в странах с активным козоводством: Мексика, Центральная Америка. Контакт человека с вирусом АЭК может стимулировать иммунный ответ на него, обуславливающий перекрестную реакцию с ВИЧ-1 в лабораторно-диагностических методах [14].В Российской Федерации по последним данным 23 млн. голов мелкого рогатого скота (овцы, козы). В последнее время интерес к козоводству связан с возрастающей потребностью населения в диетических продуктах питания, к которым относится козье молоко.Наметилась тенденция к формированию системы фермерских козоводческих хозяйств, пополняющих отечественный генофонд животных по каналам Международной Ассоциации Козоводов.По данным Всемирной организации здоровья животных OIE АЭК встречается во многих странах мира и на всех континентах (Австралия, Дания, Германия, Франция, Канада, Кения, Норвегия, Великобритания, Новая Зеландия, США и др.). В недавних сообщениях отмечается, что болезнь обнаруживают в тех странах, где до этого ее не регистрировали.Так, в сообщении OIE от 20 апреля 2005 года говорится о возникновении инфекции в Боснии и Герцеговине [45].Учитывая эпизоотологические особенности АЭК, можно предположить вероятность гораздо более широкого распространения этой болезни в зарубежных странах, чем это отражается данными МЭБ. Наличие на территории РФ потенциально-восприимчивых животных в сочетании с социально-экономическими фоновыми показателями, указывает на высокую вероятность возникновения и распространения АЭК в России. Кроме того, в козоводческих хозяйствах России обнаружены случаи заболевания коз, по клиническим и патологоанатомическим признакам напоминающие симптомы АЭК, описанные в научной литературе. Эпизоотологический анализ показал, что такие животные завезены из неблагополучных по АЭК стран. В тоже время, в РФ отсутствуют как средства диагностики болезни, так и меры борьбы с ней.В связи с вышеизложенным, проведение научных исследований по изучению эпизоотологии АЭК, разработке средств и методов диагностики, мер борьбы с болезнью является актуальным.Цель и задачи исследований Цель работы: провести эпизоотологический мониторинг артрита-энцефалита коз в Российской Федерации, разработать средства и методы диагностики болезни, а также комплекс мероприятий по ликвидации и профилактике АЭК. Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи: 1. Провести эпизоотологический анализ нозоареала АЭК в мире.2. Определить и ранжировать зоны риска возникновения АЭК на территории РФ. Разработать пространственно-динамическую модель АЭК на территории РФ.

3. Провести эпизоотологическое обследование парнокопытных жвачных для выявления вируса АЭК в зонах высокого риска возникновения болезни.4. Разработать тест-систему на основе ПЦР для выявления генома вируса АЭК.

5. Определить восприимчивость культур клеток, КРС и белых мышей к заражению вирусом АЭК.

6. Разработать и апробировать на практике комплекс мер по профилактике и борьбе с АЭК в животноводческих хозяйствах.Научная новизна работы: 1. В результате проведенных исследований впервые установлена циркуляция вируса АЭК на территории РФ в стадах коз молочного направления. Изучены клиническое проявление и патологоанатомические изменения у естественно инфицированных АЭК коз.2. Определена чувствительность первичных и перевиваемых культур клеток и лабораторных животных (мышей) к вирусу АЭК.

3. Определены и ранжированы зоны риска возникновения артритаэнцефалита коз на территории РФ. Разработана пространственно-динамическая модель АЭК на территории РФ.

4. Разработана тест-система на основе метода ПНР для выявления генома вируса АЭК, определена ее диагностическая чувствительность и специфичность.5. Разработан проект «Правил по борьбе с артритом-энцефалитом коз».Личный вклад соискателя Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделу «Разработка набора препаратов для выявления РНК вируса АЭК методом ПЦР» практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Цыбанов Ж., Жигалева О.Н., Бурдинский В.Г., а по разделу «Определение чувствительности культур клеток к заражению вирусом АЭК» - Юрков Г., Филатов А.В. Практическая значимость и реализация результатов исследования Разработанные "Методические рекомендации по выявлению РНК вируса артрита-энцефалита коз методом полимеразной цепной реакции", утверждены РАСХН от 12 декабря 2007 г. и рекомендованы для использования при идентификации указанного возбудителя и его дифференциации от генетически родственных вирусов семейства Ретровирусов.Полученные в экспериментальных исследованиях данные использовались при разработке мер профилактики и ликвидации артрита-энцефалита коз. Разработанные "Правила по борьбе с артритом-энцефалитом коз" рассмотрены учёным советом ВНИИВВиМ 14 октября 2005 года и представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ. Проведение мероприятий согласно предложенным "Ветеринарным правилам" позволило в течение 2-х лет оздоровить от АЭК ранее неблагополучное козоводческое хозяйство Тверской области.Выделен и идентифицирован на перевиваемой культуре клеток и лабораторных животных вирус АЭК. Апробация работы Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (г. Ульяновск, 2006 г.) и представлены на заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (2005-2007гг.).Публикация результатов Результаты основных этапов диссертационной работы опубликованы в 9 статьях в материалах Международных научно-практических конференций ВНИИВВиМ (г. Покров), УГСХА (г. Ульяновск), Уральского НИВИ (г. Екатеринбург), Бурятского СХИ (г. Улан-Уде); 3 статьи опубликованы в журнале «Ветеринария».Основные положения, выдвигаемые на защиту 1. Результаты эпизоотологического анализа мирового нозоареала АЭК.

2. Пространственно-динамическая модель АЭК на территории РФ.

3. Тест-система на основе ПЦР для выявления генома вируса АЭК.

4. Эпизоотологический мониторинг, клинические, патологоанатомические проявления АЭК в неблагополучных хозяйствах, у естественно и экспериментально зараженных животных; 5. Рекомендации по профилактике и ликвидации артрита-энцефалита коз.Благодарности Выполнение настоящей работы, качественный анализ её результатов были бы невозможны без непосредственного участия ряда сотрудников ВНИИВВиМ. Отдельные этапы экспериментальных работ выполнены совместно с коллективом лаборатории "Эпизоотологии", а также сотрудниками лабораторий "Биофизики", "Культур клеток с музеем клеточных штаммов": А.Ю. Чичикиным, О.Н. Бурдинской, Ж. Цыбановым, О.Н. Жигалевой, Г. Юрковым, за что автор выражает глубокую признательность.

4. ВЫВОДЫ

1. Современный нозоареал вируса АЭК включает в себя 29 стран четырёх континентов, среди них Бразилия, Венгрия, Испания, Латвия, Мексика, Тунис, Великобритания, США. Согласно разработанной нами пространственно-динамической модели пространственный тренд АЭК характеризуется нарастанием числа неблагополучных стран в мире в период с 1996 по 2004 гг.

2. Эпизоотологическое моделирование АЭК показывает, что зоны высокого риска возникновения АЭК в РФ включают: Центральный, Южный, Приволжский, Северо-Кавказский, Уральский федеральные округа, а также субъекты Сибирского и Дальневосточного округов, прилегающие к южной границе страны.

3. ПЦР позволяет обнаруживать геном вируса АЭК в пробах культурального материала и крови инфицированных животных на ранних стадиях заболевания (начиная с 45 суток после заражения) и дифференцировать его от других близкородственных ретровирусов (висна-маеди, аденоматоз). Данная реакция пригодпа для проведения эпизоотологического мониторинга АЭК в неблагополучных хозяйствах.

4. Установлена циркуляция вируса АЭК среди поголовья коз и КРС на территории Липецкой и Тверской областей Российской Федерации, входящих в определённые нами зоны высокого риска возникновения болезни.

5. Установлена персистенция вируса АЭК в течение не менее 60-ти суток в организме экспериментально зараженных мышей, что свидетельствует о возможности циркуляции его среди грызунов в природе, где они могут служить резервуаром инфекции.

6. Наиболее пригодной для накопления вируса АЭК является перевиваемая культура клеток легкого эмбриона оленя, как наиболее чувствительная и стабильная в условиях длительного культивирования (не менее 7 суток).

7. Крупный рогатый скот восприимчив к заражению вирусом АЭК, болезнь протекает с характерными клиническими и патологоанатомическими признаками и вирусоносительством.

8. Проведение противоэпизоотических мероприятий в соответствии с разработанными нами "Ветеринарными правилами по профилактике и ликвидации АЭК" позволяют ликвидировать АЭК в неблагополучных по данной болезни хозяйствах в течение двух лет.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате проведенных исследований территория РФ ранжирована по степени риска возникновения АЭК.

2. Разработанные «Методические указания по выявлению РНК вируса АЭК методом полимеразной цепной реакции», утвержденные отделением ветеринарной медицины РАСХН от 12.12.2007 г., рекомендованы для использования при обнаружении указанного возбудителя и его дифференциации от генетически родственных вирусов семейства Ретровирусов.

3. Разработаны и предложены для практического применения ветеринарной службой РФ «Правила по борьбе с артритом-энцефалитом коз », рассмотренные и одобренные ученым советом ВНИИВВиМ от 14.10.2005 г. и представленные на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ.