Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз

УДК: 619:616.98:578:636.39

На правах рукописи

Сидельников Георгий Дмитриевич

Биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ел

Покров-2009

003465195

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук Денис Владимирович Колбасов

Официальные оппоненты: доктор ветеринарках наук,

профессор Владимир Александрович Мищенко

кандидат биологических наук Елена Алексеевна Балашова

Ведущая оргаютцшк: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ГНУ ВИЭВ).

Защита диссертации состоится 16 апреля 2009 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 006.003.С1 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел./факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан _» марта 2009 г.

Ученый сехргтарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.Я. Савукова

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы

Артрит-энцефалит коз (АЭК) представляет собой симптомокомплекс болезни, вызываемый неонкогенным ретровирусом из рода lcntuviridae, и характеризующийся длительным инкубационным периодом, хроническим течением, признаками поражения нервной системы, легких, суставов с прилежащими тканями и молочной железы.

К вирусу восприимчивы домашние козы и овцы. Экономический ущерб при этом складывается в основном из выбраковки из стад клинически больных животных и вирусоносителей, а также недополучения молока.

До 2003 года АЭК на территории РФ не регистрировали.

В связи с регулярным пополнением отечественного поголовья мелкого рогатого скота высокопродуктивными животными, импортируемыми из зарубежных стран, значительно возрос риск заноса в страну вируса АЭК.

Поскольку АЭК для нашей страны является экзотической болезнью, имеются лишь единичные работы по разработке молекулярно-генетических методов диагностики [Волкова И.Ю., 2008]. Данные по исследованию биологических свойств вируса АЭК, средствам и методам лабораторной диагностики, а также данные по эпизоотической ситуации в РФ отсутствуют.

В связи с вышеизложенным, существует необходимость в получении более точных данных биологических свойств вируса АЭК для разработки и совершенствования диагностики, эпизоотологического и лабораторного мониторинга болезни.

1.2. Цель исследований - определение основных биологических свойств вируса артрита-энцефалита коз.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Провести поиск и оценить возможности использования пермиссивных

культур клеток для изучения вируса артрита-энцефалита коз in vitro.

2. Выделить отечественный изолят вируса артрита-энцефалита коз и адаптировать его к чувствительной культуре клеток.

3. Изучить основные биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз in vitro и in vivo.

4. Получить специфический антиген вируса артрита-энцефалита коз для использования в реакции диффузионной преципитации.

1.3. Научная новизна исследований

1. Оптимизированы условия получения и культивирования клеток синовиальной мембраны козленка и показана возможность эффективного использования данной субкультуры клеток в качестве лабораторной модели для изучения вируса артрита-энцефалита коз.

2. Выделен изолят «Тверской» вируса артрита-энцефалита коз в культуре клеток синовиальной мембраны козленка.

3. Впервые дана сравнительная характеристика биологических свойств полевого изолята «Тверской» и штамма 75G-63 (США) вируса артрита-энцефалита коз в культуре клеток.

4. Показана возможность использования специфического антигена из изолята вируса артрита-энцефалита коз «Тверской» в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агарозном геле для выявления антител к вирусу АЭК в сыворотках крови коз.

1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследования.

Заключается в разработке «Методических рекомендаций по получению, культивированию клеток синовиальной мембраны козленка и применению данной культуры в качестве лабораторной модели для изучения вируса артрита-энцефалита коз», регламентирующих методы и условия получения, выращивания первичной и субкультуры клеток синовиальной мембраны козленка и использования ее для изоляции из патологического материала, накопления, определения инфекционной активности вируса

артрита-энцефалита коз и «Методических рекомендаций по постановке реакции диффузионной преципитации для выявления антител к антигенам вируса артрита-энцефалита коз в сыворотках крови коз при диагностике на артрит-энцефалит коз».

Получен изолят «Тверской» вируса АЭК от козы-вирусоносителя с использованием метода сокультивирования клеточных элементов в культуре клеток синовиальной мембраны козленка.

Методики могут использоваться для производства диагностических препаратов и проведения прижизненной ретроспективной диагностики АЭК.

Так, с использованием метода РДП проведено исследование 385 проб сывороток крови коз и выявлено 59 животных из хозяйств Московской, Владимирской и Тверской областей РФ, в сыворотке крови которых обнаружены антитела к вирусу АЭК, что свидетельствует о циркуляции вируса АЭК на территории РФ.

1.5. Основные положения, выдвигаемые на защиту

1. Биологические свойства и характеристика лабораторной клеточной системы (клеток синовиальной мембраны козлят) для изучения вируса артрита-энцефалита коз.

2. Изоляция полевого вируса артрита-энцефалита коз (изолят «Тверской») в культуре клеток синовиальной мембраны козленка и его биологические свойства.

3. Выявление антител к вирусу артрита-энцефалита коз в сыворотках крови клинически больных коз и коз-вирусоносителей с использованием специфического антигена изолята «Тверской» вируса артрита-энцефалита коз в реакции диффузионной преципитации.

1.6. Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновская ГСХА, 2008г.) и на заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (2006-2008гг.).

1.7. Публикации

Основные результаты диссертационной работы изложены в 7 работах, в том числе в журнале «Ветеринария», включенном в перечень ВАК Министерства образования науки РФ - 1 работа.

1.8. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (158 источников, в том числе 18 отечественных). Работа иллюстрирована 10 таблицами и 21 рисунками и дополнена приложениями.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы

Вирусы: Референс-штамм вируса АЭК (75G-63), изолированный в 1980г. Крауфордом с соавторами от козла с клиническими признаками хронического артрита и любезно предоставленный Dr. Lynn Hermann (США). Лимфоциты и моноциты крови, содержащие провирусную ДНК ВАЭК отобранные от инфицированной вирусом АЭК козы, принадлежащей хозяйству Тверской области.

Животные: Козлята до 10-дневного возраста Зааненской породы; беспородные козлята (аборигенные), из частного хозяйства г. Покрова; инфицированные ВАЭК козы Зааненской породы в возрасте 3-9-летнего возраста, получены из козоводческой фермы Тверской области и

Московского зоопарка; козлята Зааненской породы, экспериментально зараженные штаммом 75G-63 вируса АЭК внутривенным и интраартикулярным путем.

Сыворотки крови: Сыворотки крови от клинически больных АЭК и ГТЦР- положительных животных; сыворотки крови от интактных коз; серопозитивная и серонегативная референс-сыворотки, любезно предоставленные Dr. Lynn Hermann (США); сыворотка, содержащая антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.

Культуры клеток: Для определения чувствительности, накопления, определения инфекционной активности, изоляции и изучения биологических свойств вируса АЭК использовали следующие культуры клеток: перевиваемую линию клеток легкого эмбриона ягненка - ЛЭЯ; перевиваемую линию клеток легкого эмбриона теленка - ЛЭТ; перевиваемую линию клеток почки ягненка - ПЯ; субкультуру клеток синовиальной мембраны козленка - СМК.

Перевиваемые культуры клеток ЛЭЯ, ПЯ, получали в лаборатории "Культур клеток с музеем клеточных штаммов" - ВНИИВВиМ; ЛЭТ -любезно предоставлена профессором, д.м.н. А.Д. Альштейном (институт «Биологии гена»); субкультура клеток синовиальной мембраны козленка получена на базе лаборатории Биофизики ВНИИВВиМ по методике, изложенной в разделе 2.2.

Питательные среды, сыворотки и добавки: DMEM с глютамином (производства ФГУП «Института полиомиелита» им.М.П. Чумакова); ИГЛА/MEM, производства ВНИИВВиМ; 0,5% ГЛА/Хенкса, производства ВНИИВВиМ; сыворотка крови плода КРС (Ну Clone, ПанЭко); сыворотка крови КРС.

Антигенные препараты: Специфический преципитирующий культуральный антиген вируса АЭК приготовлен из инфицированной культуры клеток СМК; контрольный (отрицательный) антиген приготовлен из интактной культуры клеток СМК.

2.2. Методы

Получение первичной и субкультуры клеток синовиальной мембраны козленка. При получении культуры СМК применяли методику выращивания тканевых эксплантатов [Crawford Т.В. et. al., 1980]. В качестве доноров использовали козлят до 10-дневного возраста.

Культивирование клеток СМК. Культивирование клеток осуществляли в матрасах и микропанелях в условиях стационарного монослоя. Пассирование проводили бесцентрифужным способом. Для диспергирования клеточного пласта использовали раствор 0,25% трипсина- 0,02% версена в соотношении 1:1, подогретого до 37°±0,5°С. Ростовые и цитоморфологические характеристики культуры оценивали на протяжении 19 последовательных субпассажей.

Криоконсервация. Клетки с концентрацией 2-2,5 млн.кл/см3 криоконсервировали в жидком азоте в среде с 30% фетальной сыворотки крови КРС и с добавлением 10% диметилсульфоксида.

Культивирование вируса АЭК. С целью изучения репродукции вируса АЭК в культуре клеток и получения вируссодержащего материала была использована культура клеток СМК. Клетки инфицировали путем контакта в течение 2-х часов при 37°±0,1°С вируссодержащей культуральной жидкости с монослоем. Затем добавляли поддерживающую среду с 2% фетальной сыворотки крови КРС. Контролем служила интакгная культура клеток. Культуры инкубировали в термостате при (36,5-37)°±0,1°С и (38,5-39)°±0,1°С до проявления максимально выраженного цитопатического эффекта (ЦПЭ) в опытных образцах при отсутствии изменений в контроле.

Изоляция полевого вируса АЭК в культуре клеток СМК. С целью изоляции вируса АЭК из крови инфицированного животного применяли метод сокультивирования лимфоцитов и моноцитов крови (JIMK) с клетками СМК. Фракцию JIMK получали путем центрифугирования крови в градиенте плотности фикола (1,077 г/см3). Суспензию среды DMEM с лимфоцитами и моноцитами добавляли к суспензии клеток СМК. Контролем служила неинфицированная культура СМК.

Экспериментальное воспроизведение инфекции. Заражение козлят (Зааненской породы 10-дневного возраста) штаммом вируса АЭК (75G-63) проводили с целью изучения клинического проявления болезни, персистенции вируса в организме подопытных животных. Вирусный материал (титр вируса 10бТЦЦ50/см3) инокулировали внутривенно - 1 см3 и интраартикулярно (в запястный сустав) - 0,25 см3 2-м козлятам.

Полимеразная цепная реакция. При проведении ПЦР-анализа, препараты нуклеиновых кислот, выделенные из исследуемых проб, гибридизировались с праймерами, комплементарными последовательностям gag-гена вируса АЭК, фланкирующими фрагмент размером 392 пар оснований и 178 пар оснований в гнездовом варианте ПЦР.

Получение антигенов. Культуральный антиген, приготовленный с использованием культуры клеток СМК, получали путем концентрирования осветленной вируссодержащей культуральной жидкости и обработки инфицированного вирусом АЭК клеточного детрита раствором детергента. Полученные антигены использовали в РДП.

Постановка РДП. РДП проводили по методу, описанному А.Ф. Валиховым (для выявления антител к вирусу лейкоза КРС). Раствор агарозы (0,7%) готовили в 0,05М трис-HCl буфере с 8% хлористого натрия с (рН 7,27,4). Расплавленный гель разливали по 15 мл в чашки Петри, диаметром 10 см. После застывания геля с помощью штампа выбивали лунки, которые располагались в форме шестиугольника с центральной лункой. Диаметр лунок составлял 8 мм, а расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Реакцию учитывали в крестах (от + до ++++) через 48 и 72 часа.

2.3. Результаты собственных исследований

2.3.1. Оценка ростовых свойств, переживания клеток, способности субкультивирования клеток синовиальной мембраны козленка. После убоя животных отбирали фрагменты синовиальной мембраны из запястных

суставов, которые в последующем измельчали до получения кусочков ткани, не превышающих 2 мм в диаметре. После 3-х кратной отмывки питательной средой БМЕМ с антибиотиками тканевые фрагменты переносили в культуральные матрасы с добавлением среды ЭМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки крови КРС. Матрасы инкубировали в атмосфере с повышенным до 5% содержанием С02 при 37°С в течение 5 суток. На 4—5-е сутки культивирования клеток СМК наблюдали интенсивный рост клеток по периметру прикрепившихся тканевых фрагментов. Отмечали пролиферацию клеток по краю эксплантата и миграцию адгезированных клеток по периферии участка роста.

На 10-12 сутки культивирования вырастали обширные колонии клеток, которые сливаясь между собой образовывали конфлюэнтный монослой. Клетки формировали ярко выраженные разнонаправленные потоки и тяжи, характерные для культур фибробластоподобного типа (рис.1).

(нативный препарат х150)

В процессе культивирования клеток СМК отмечали зависимость скорости формирования монослоя от используемой питательной среды (табл.1).

Таблица 1

Сроки формирования конфлюэптного монослоя при использовании различных питательных сред (при посевной концентрации 150-200тыс.

кл/см3)

п=3

Вид питательной среды Сроки формирования монослоя (сут.)

ИГЛА/МЕМ 5-7

0,5%ГЛА/Хенкса 5-7

БМЕМ с двойным количеством глютамина 2-3

Культуры клеток, полученные от беспородных козлят, обладали несколько лучшими ростовыми характеристиками, чем культуры, полученные из синовиальной мембраны козленка Зааненской породы. После пересева культуры от беспородных животных, конфлюэнтный монослой формировался уже на 2-3 сутки, а клетки от породистых животных формировали монослой только на 4-5 сутки.

Срок переживания монослоя культур клеток при 37°С в условиях повышенного до 5% содержания С02 и поддерживающей (с 2% фетальной сыворотки плода КРС) среды составлял 20 суток (срок наблюдения) без каких-либо дегенеративных изменений клеточного пласта. Эти показатели сохранялись до 10-11 уровня субкультивирования. В последующем эти сроки сокращались до 5-6 суток.

В процессе культивирования было отмечено, что использование кондиционированной среды в количестве от 10 до 30% существенно улучшает ростовые характеристики полученной культуры клеток СМК, что позволило увеличить коэффициент пересева.

На первых двух-трех пассажах коэффициент пересева составлял 1:2, но в последующем, с 3-го по 8-й пассажи, может быть увеличен до 1:3-1:4 (табл. 2).

Таблица 2

Динамика изменения ростовых свойств в зависимости от пассажного уровня субкулътивирования СМК

п=3

№ пассажного уровня Коэффициент пересева Сроки формирования монослоя (сут.)

1-й - 10-12

2-й 1:2 2-3

с 3-го по 8-й 1 :3 - 1:4 2-3

9-й 1 :2 4-5

10-й 1: 1,5-1 :2 6-7

11-й 1 :1,5-1 : 1 5-6

с 12-го по 19-й 1 :2 - 1:2,5 3-4

Несмотря на то, что полученные клетки после 9-10-го пассажа сохраняли достаточно высокий потенциал к размножению и продолжали шггенсивно делиться, возможность для их масштабного культивирования несколько ограничена. Наиболее продуктивным в развитии клеток СМК в условиях in vitro, на наш взгляд, является период с 3-го по 8-й пассажные уровни. В этих «культуральных рамках» достигается наивысший для данной культуры клеток коэффициент пересева - 1:4, при минимальных сроках формирования конфлюэнтного монослоя - 2-3 суток, что гарантированно создает благоприятные условия для относительно быстрого наращивания необходимого количества клеточной массы.

Процент жизнеспособности клеток в суспензии после размораживания определяли с помощью теста витального окрашивания трипановым синим, который составлял 87%.

2.3.2. Изоляция вируса артрита-энцефалита коз. Целью наших исследований было выделение возбудителя АЭК из крови коз-вирусоносителей, заразившихся естественным путем, используя ряд культур клеток.

Для достижения этой цели нами были испытаны перевиваемые линии клеток ЛЭЯ, ЛЭТ и ПЯ (как наиболее технологичные и доступные) и субкультура клеток СМК. Основными принципами, которыми мы руководствовались при выборе систем для культивирования - это данные о клеточном тропизме вируса и видовая принадлежность культуры клеток.

Для заражения применяли метод сокультивирования вышеуказанных культур клеток с лимфоцитами и моноцитами крови, содержащими провирусную ДНК вируса АЭК.

Выделение возбудителя АЭК в нашей стране до настоящего времени не проводилось. Учитывая специфику патогена, необходимо отметить, что вирусовыделение в данном случае весьма затруднительно проводить по схемам, принятым для возбудителей остро протекающих болезней.

Ввиду крайне низкого содержания вируса в пораженных органах и тканях, приходиться прибегать к различным приемам, сводящимся к концентрированию клеточных элементов патологического материала и сохранению живыми инфицированных клеток с тем, чтобы в последующем перенести их в условия in vitro для культивирования и сокультивирования с чувствительными культурами клеток.

Смешанные культуры культивировали в течение 3-х последовательных пассажей без добавления незараженных клеток при пересевах. Длительность каждого пассажа составляла 7-10 суток.

Таблица 3

Результаты определения репродукции вируса АЭК в культурах клеток

п=3

Метод заражения Количество пассажей Результаты ПЦР-анализа

ЛЭЯ ЛЭТ ПЯ СМК

сокультивирование (2x106 кл/см3 на 7,5-8 млн. клеток испытуемой культуры клеток) 1-й + + + +

- 2-й - - - +

- 3-й - - - +

Примечание: сокультивирование клеточных элементов проводили только на 1-м пассаже с последующим пассированием культур клеток.

При совместном культивировании лимфоцитов и моноцитов крови инфицированного животного с клетками синовиальной мембраны козленка (получены от козлят Зааненской породы) в первых 2-х пассажах цитопатические изменения отсутствовали. Лишь на 3-м пассаже смешанной клеточной культуры на 5-6 сутки отмечено проявление ЦПЭ, характеризующегося образованием многоядерных «клеток». При дальнейшем культивировании число симпластов увеличивалось, а число формирующих их ядер доходило до 20-30.

Для сравнительной оценки чувствительности клеток СМК к вирусу АЭК использовали штамм 750-63.

После инфицирования культуры клеток синовиальной мембраны козленка штаммом вируса АЭК 75С-63 1-го пассажа, ЦПЭ начали регистрировать уже на 4-5 сутки. Наблюдали образование мелких симпластов, число которых увеличивалось в монослое по мере развития инфекции. Ядра разрушенных клеток располагались в виде округло-овальных розеток или имеющих неправильные очертания скоплений (рис.2).

Рис. 2. Монослой инфицированной культуры СМК на 4-е сутки после заражения. Мультинуклеарная «клетка» в центре фото (нативный препарат х380).

На 7-8 сутки после инфицирования в культуре клеток отмечали формирование синцития. Немногочисленные оставшиеся клетки имели

вытянутую форму, крупное, хорошо заметное ядро и отростки, соединяющиеся наподобие мостиков с соседними клеточными структурами. На фоне этих процессов постепенно прогрессировало отделение клеток от субстрата. В конечном итоге большая часть монослоя разрушалась на 8-9 сутки. При этом интактная культура оставалась без изменений.

2.3.3. Чувствительность культуры клеток синовиальной мембраны козлят к вирусу артрита-энцефалита коз (штамм 7561-63, нзолят «Тверской»).

Уровень инфекционной активности штамма 750-63 ВАЭК составил Ю5,5 ТЩЫсм3, изолята «Тверской» Ю5'0 ТЩЬо/см3 в культуре клеток СМК от беспородных животных. При титровании штамма 750-63 в культуре клеток СМК от козлят Зааненской породы титр составил Ю6,0 ТЦЦ5о/см3 (табл. 4).

Таблица 4

Уровни инфекционной активности штамма 750-63 и изолята «Тверской» вируса АЭК в клетках СМК

п=3

Происхождение клеток СМК Штамм 750-63 Изолят «Тверской»

Козлята Зааненской (Швейцарской) породы Ю6'0 ТЦД50/см3 -

Беспородные (аборигенные) козлята - г.Покров 105'5ТЦД5о/см3 105'°ТЦЦ5О/СМ3

Примечания: (-) не исследовали.

Полученная культура клеток СМК сохраняла чувствительность к вирусу до 12-го уровня субкультивирования (срок наблюдения).

Следует отметить различия в проявлении ЦПЭ при размножении изолята «Тверской» и штамма 750-63 вируса АЭК в культурах клеток СМК, полученных от разных пород коз (табл. 5).

Таблица 5

Форма проявления ЦПЭ штамма 75С- 63 и изолята «Тверской» вируса АЭК в культуре клеток синовиальной мембраны козленка, полученных от доноров различного породного происхождения

п=3

Вирус артрита-энцефалита коз Происхождение КК СМК Форма проявления ЦПЭ

Штамм 750-63 Козлята Зааненской породы Симпластообразование и цитолизис

Беспородные козлята (г.Покров)

Изолят «Тверской» Козлята Зааненской породы Симпластообразование и цитолизис

Беспородные козлята (г.Покров) Цитолизис

Было установлено, что степень интенсивности проявления ЦПЭ, а также уровень инфекционной активности ВАЭК зависит от температуры инкубации зараженных культур.

Полученные экспериментальные данные показали, что при температуре (36,5-37)°С мультинуклеарные (поликариоциты) «клетки» практически не формировались или вообще могли отсутствовать. При этих температурных условиях инфицированные клетки погибали и отделялись от стекла не формируя многоядерных симпластов.

При температуре инкубации (38,5-39)°С, напротив, отмечался интенсивный процесс симпластообразования по всему монослою.

Определение уровня инфекционной активности внеклеточного вируса в питательной среде, отобранной на момент начала процесса образования симпластов, показало, что титр вируса был выше на 1 в среде, отобранной из культурального матраса, инкубированного при температуре (38,5-

39)±0,1°С и составил Ю4'0ТЦЦ5о/см3 и 103-°ТЦЦ5о/см3 при (36,5-37)±0,1°С (табл.6).

Таблица 6

Зависимость характера проявления ЦПЭ и уровня инфекционной

активности вируса АЭК от температурного фактора

п=3

Температура инкубации, °С Характер цитопатических изменений в культуре клеток СМК Уровень инфекционной активности внеклеточного вируса в питательной среде из зараженных ВАЭК культуральных матрасах, ТЦЦ50/см3

(36,5—37)±0,1 Единичные симпласты, преобладает отделение погибших клеток от субстрата без образования многоядерных клеток 103'°

(38,5-39)±0,1 Интенсивный процесс симпластообразования 104'и

Результаты этого наблюдения могут быть полезны не только при культивировании вируса АЭК для создания условий максимальной выраженности ЦПЭ, но и при первичной изоляции полевого вируса из патологического материала, когда цитопатические изменения в первых пассажах в культуре клеток отсутствуют или слабо выражены и могут остаться незамеченными при классическом культивировании при 37°С.

Таким образом, в результате изучения чувствительности культур клеток к ВАЭК установлено, что лабораторной моделью, оптимальной для работы с данным агентом, является субкультура СМК, как наиболее чувствительная.

2.3.4. Определение чувствительности козлят к вирусу АЭК.

Воспроизвести клинически выраженное заболевание у козлят нам не удалось (срок наблюдения 12 месяцев). Однако, проведение ПЦР-анализа выявило наличие провирусной ДНК вируса АЭК в пробах крови, отобранных через

месяц после заражения. Последующие исследования образцов крови методом ПЦР подтверждали статус инфицированности животных. Также установлено, что вирус после инокуляции подопытным животным вызывал продукцию антител через 1,5 месяца после заражения. Титр антител в РДП составил 1:2.

2.3.5. Реакция диффузионной преципитации в агарозном геле с использованием специфического антигена вируса АЭК для выявления антител к данному вирусу в сыворотках крови коз

В настоящее время происходит стремительное нарастание количества ввозимого в страну мелкого рогатого скота. В этой связи специалисты ветеринарных лабораторий испытывают затруднения при проведении диагностических мероприятий по медленным инфекциям по причине недостатка средств диагностики, особенно серологической.

Поэтому нашей целью явилась оценка возможности выявления антител к вирусу АЭК в пробах сывороток крови с применением реакции диффузионной преципитации в агарозном геле.

2.3.5.1. Получение антигенного препарата. Штамм 750-63 и изолят «Тверской» вируса АЭК были размножены в субкультуре клеток СМК. Специфический антиген вируса АЭК получали по следующей схеме:

Культуральная вируссодержащая жидкость 3-х кратный цикл замораживания-оттаивания Центрифугирование при 2000 об./мин. в течение 15-20 мин.

Надосадок Клеточный детрит

Концентрирование

Обработка р-ром детергента

Нормальный (контрольный) антиген готовили аналогично из неинфицированной культуры клеток СМК.

Таблица 7

Результат использования антигена в РДП

п=3

Метод получения антигена для РДП Результат использования антигена в РДП

Обработка инфицированного клеточного детрита 1% р-ром тритона Х100 Отрицательный

Концентрирование инфицированной культуральной жидкости в: 20 (х) 30 (х) Отсутствие или слабая визуализация линий преципитации

50 (х) 100 (х) Ярко выраженные линии преципитации

Анализ продуктов электрофореза подтвердил присутствие белков в приготовленном концентрированном препарате антигена, имеющих диагностическое значение: поверхностного гликопротеина с молекулярной массой 135000 дальтон и внутреннего белка с массой 28000 дальтон.

2.3.6. Выявление преципитирующих антител к вирусу АЭК в сыворотках крови коз. Для оценки уровня серопозитивности животных метод апробировали на практике при проведении серологического мониторинга.

Результаты выборочного исследования проб сывороток крови и молозива из козоводческих ферм представлены в табл. 8. Как видно из данных таблицы, РДП уступает по чувствительности методу ПЦР - 15% и 21% соответственно. Несмотря на это, РДП позволяла выявлять серопозитивных животных (особенно молодняк), в крови которых не обнаруживали фрагменты генома вируса АЭК.

Таблица 8

Результаты обнаружения специфических к вирусу АЭК антител в сыворотках крови коз в РДП и вирусного генома в ПЦР

Хозяйство Порода обследуемых животных Всего проб РДР ПЦР

полож. отриц. полож. отриц.

Ленинградская область Зааненская порода 305 0 305 35 270

Тверская область Зааненская и англо-нубийская 58 41 17 31 27

Московский зоопарк Зааненская порода 6 5 1 6 0

Частное хозяйство (г.Покров) Аборигенные козы 9 9 0 3 6

Виварий института Зааненская порода 7 5 2 7 0

ВСЕГО 385 59 325 82 303

Сопоставление данных прижизненной диагностики АЭК методом ПЦР и РДП позволяет сделать вывод о том, что эти методы не являются взаимоисключающими. Применение каждого из них в отдельности не позволяет достоверно оценить уровень инфицированное™ поголовья и лишь комплексный подход в их применении решает данную задачу.

При исследовании проб сывороток из перечисленных хозяйств была обнаружена взаимосвязь между наличием у обследуемых животных клинических признаков и выявляемостью антител. В пользу данного утверждения имеются следующие данные:

- Поголовье хозяйства Ленинградской области, импортированное из Германии, на момент проведения диагностических исследований являлось клинически здоровым и состояло из нетелей и нескольких козлов-производителей. Все обследуемые животные являлись серонегативными.

- В противоположность этому среди обследуемого поголовья из Тверской области у нескольких особей были отмечены признаки истощения, поражения дыхательной системы (кашель, слизистые истечения из носа) и задних конечностей (хромота, отекание конечностей). Производилось

выборочное исследование проб основных производителей, маточного поголовья и ремонтного молодняка. Кроме того, исследовали пробы свежесобранного молозива, в которых выявляли антитела.

- При обследовании козематок из Московского зоопарка было выяснено, что родившиеся от них козлята имели признаки нарушения функции центральной нервной системы, проявлявшиеся парезами и параличами. У нескольких маток отмечали признаки хронического истощения при обильном кормлении. В молозиве от этих животных также выявляли антитела.

По результатам проведенных исследований можно сделать предположение, что появление антител к вирусу у животных влечет за собой манифестацию болезни различной степени, проявляющуюся хроническим течением (истощение), либо яркими клиническими признаками (поражение суставов, ЦНС; интерстициальная пневмония).

Сопоставление результатов РДП и ПЦР-метода позволяет сделать вывод о том, что ПЦР является более чувствительным методом, позволяющим выявлять инфицированных животных до сероконверсии. Однако РДП выступает как ценный индикаторный диагностический инструмент, позволяющий определять уровень серопозитивности поголовья, что является важным показателем степени инцидентности и клинической манифестации АЭК. В пользу данного аргумента свидетельствуют данные, что присутствие у животного антител к вирусу знаменует о прогрессировании заболевания, когда из стадии инфекции происходит постепенный переход к клинически выраженной болезни. Таким образом, проведение мероприятий по диагностике АЭК должно предусматривать комплексное применение этих взаимодополняющих методов.

3. Выводы

1. Культура клеток синовиальной мембраны козленка может служить лабораторной системой для выделения вируса артрита-энцефалита коз.

2. Культура клеток СМК пригодна для масштабного культивирования с 3-го по 8-й пассажные уровни.

3. Перевиваемые культуры клеток ЛЭЯ, ЛЭТ и ПЯ не чувствительны к возбудителю артрита-энцефалита коз.

4. Культура клеток СМК, полученная от коз культурных пород более чувствительна к ВАЭК, чем от аборигенных.

5. Характер ЦПЭ и уровень инфекционной активности различен при заражении культуры клеток СМК штаммом 750-63 и изолятом «Тверской» ВАЭК.

6. Повышение температуры инкубации вируса АЭК в культуре клеток СМК до (38,5-39)±0,1°С увеличивает интенсивность проявления ЦПЭ и уровень инфекционной активности вируса АЭК на

7. Полученный специфический антиген из отечественного изолята ВАЭК «Тверской» является пригодным при использовании в РДП для выявления антител к вирусу в сыворотках крови клинически больных коз и коз-вирусоносителей.

8. С помощью метода РДП установлена циркуляция ВАЭК среди поголовья коз на территории Владимирской, Тверской и Московской областей.

4. Практические предложения

Для проведения лабораторной диагностики АЭК нами разработаны следующие документы: «Методические рекомендации по получению, культивированию клеток синовиальной мембраны козленка и применению данной культуры в качестве лабораторной модели для изучения вируса артрита-энцефалита коз», которые регламентируют методы и условия получения, выращивания первичной и субкультуры клеток синовиальной

мембраны козленка и использования ее при изоляции из патологического материала, накоплении, определении инфекционной активности вируса артрита-энцефалита коз;

«Методические рекомендации по постановке реакции диффузионной преципитации для выявления антител к антигенам вируса артрита-энцефалита коз в сыворотках крови коз при диагностике на артрит-энцефалит коз».

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Волкова, И.Ю. Эпизоотологические аспекты артрита-энцефалита коз / И.Ю. Волкова, A.A. Стрижаков, Г.Д. Сидельников // Молодежь и наука XXI века: материалы Международной научно-практической конференции / УГСХА. - Ульяновск, 2006. - С. 339 - 344.

2. Эпизоотологический мониторинг артрита-энцефалита коз в России / А.Ю. Чичикин, A.A. Стрижаков, И.Ю. Волкова, Г.Д. Сидельников, С.Ж. Цыбанов, A.A. Коломыцев // Роль аграрной науки в развитии с/х производства крайнего севера: материалы Международной научно-практической конференции / Бурятский СХИ. - Улан-Удэ, 2006. - С. 24 - 28.

3. Опыт оздоровления хозяйства, неблагополучного по артриту-энцефалиту коз / Г.Д. Сидельников, Д.В. Колбасов, А.Ю. Чичикин, И.Ю. Волкова, A.B. Ржавин // Ветеринария. -№12.- 2007. - С. 25-27.

4. Получение и характеристика первичной культуры клеток синовиальной мембраны козлят, как модель для культивирования лентивирусов мелких жвачных / Г.Д. Сидельников, O.JI. Колбасова, Д.В Колбасов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Международной научно-практической конференции / ВНИТИБП. - Щелково, 2007. -С. 153- 157.

5. Идентификация возбудителя артрита-энцефалита коз методом ПЦР I О.Н. Жигалева, В.М. Бурдинский, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов, Г.Д. Сидельников // Молекулярная диагностика - 2007: сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - М., 2007. - Т.2. - С. 92 - 95.

6. Сидельников, Г.Д. Культура клеток синовиальной мембраны козленка, как модель для культивирования вируса артрита-энцефалита коз / Г.Д. Сидельников, О.Л. Колбасова, Д.В. Колбасов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы Международной научно-практической конференции / УГСХА. - Ульяновск, 2008. - Т. 4. - С. 68 - 71.

7. Артрит-энцефалит коз в России: эпизоотологический анализ инцидента / А.Ю. Чичикин И.Ю, Волкова, С.Ж. Цыбанов, О.Н. Жигалева, С.Г. Юрков, Г.Д. Сидельников, A.B. Филатов, A.A. Сгрижаков // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров -2008. - Т. 1,-С. 87.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.

Актуальность темы.

Артрит-энцефалит коз (АЭК) - медленно протекающая вирусная болезнь, сопровождающаяся развитием энцефаломиелитов (преимущественно у молодняка), хронических пролиферативных синовитов, периартритов, прогрессирующих интерстициальных пневмоний и интралобулярных маститов.

К вирусу восприимчивы домашние козы и овцы [39]. Экономический ущерб при этом складывается в основном из выбраковки из стад клинически больных животных и вирусоносителей, а также недополучении молока.

Единственное эффективное средство борьбы — убой всех животных в неблагополучных и подозреваемых в неблагополучии хозяйствах, поскольку специфические меры профилактики не разработаны. Кроме того, появление этой болезни ведет к ограничениям при экспорте и импорте племенного поголовья.

Во многих зарубежных странах с промышленно развитым козоводством налажен строгий контроль за данными болезнями. Разработаны и внедрены в ветеринарную практику программы по их искоренению и недопущению распространения. Основными инструментами для осуществления этих программ являются проведение диагностических, карантинных и ветеринарно-санитарных мероприятий [121].

Персистенция ВАЭК сопровождается появлением антител у клинически больных и инфицированных животных [97]. Поэтому особую важность приобретает обнаружение и своевременное устранение из стада серопозитивных животных. Наиболее простым в исполнении и, одновременно, высокочувствительным методом, позволяющим выявлять антитела к вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК), является реакция диффузионной преципитации в агарозном геле. Во многих странах данный метод используется в качестве рутинного метода диагностики, позволяющнго достоверно определить уровень инфицированности поголовья [28; 30].

В последнее время при диагностике АЭК возникло ряд проблем, связанных с генетической и антигенной изменчивостью. Данное обстоятельство предполагает, что географическое распространение различных штаммов может оказывать влияние на результаты диагностических исследований. Таким образом, необходимо постоянно совершенствовать диагностические тесты и при этом брать за основу новые изоляты и штаммы вируса [39].

В настоящее время в РФ возрастает интерес к отрасли козоводства. Это диктуется все более возрастающей потребностью населения в диетических продуктах питания, особенно молоке, а также продуктах его переработки.

В связи с этим происходит регулярное пополнение отечественного поголовья высокопродуктивными животными, импортируемыми из зарубежных стран. На этом фоне моногократно возрастает риск заноса в страну и распространения болезней, присущих данному виду животных, в том числе и медленных инфекций, таких как: лентивирозы мелких жвачных (артрит—энцефалит коз, висна-маеди овец), аденоматоз легких овец.

АЭК для нашей страны является экзотической и неизученной болезнью. Имеются лишь единичные работы по разработке молекулярно-генетических методов диагностики [144]. Данные по исследованию биологических свойств вируса, средствам и методам лабораторной диагностики, а также эпизоотической ситуации в РФ отсутствуют.

В связи с вышеизложенным, существует необходимость в проведении фундаментальных вирусологических исследований по данной проблеме, без которых невозможно выполнение точной диагностики болезни и разработка мер профилактики и борьбы. I

Цель и задачи исследований

Цель наших исследований заключалась в определении основных биологических свойств вируса артрита-энцефалита коз.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести поиск и оценить возможности использования пермиссивных культур клеток для изучения вируса артрита—энцефалита коз in vitro.

2. Выделить отечественный изолят вируса артрита-энцефалита коз и адаптировать его к чувствительной культуре клеток.

3. Изучить основные биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз in vitro и in vivo.

4. Получить специфический антиген вируса артрита-энцефалита коз для использования в реакции диффузионной преципитации (РДП).

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту

1. Биологические свойства и характеристика лабораторной клеточной системы (клеток синовиальной мембраны козлят) для изучения вируса АЭК.

2. Изоляция полевого вируса АЭК (изолят «Тверской») в культуре клеток синовиальной мембраны козленка (СМК) и его биологические свойства.

3. Выявление антител к вирусу АЭК в сыворотках крови клинически больных коз и коз-вирусоносителей с использованием специфического антигена изолята «Тверской» ВАЭК в РДП.

Научная новизна исследований

1. Оптимизированы условия получения и культивирования клеток синовиальной мембраны козленка и показана возможность эффективного использования данной субкультуры клеток в качестве лабораторной модели для изучения ВАЭК.

2. Выделен изолят «Тверской» вируса артрита-энцефалита коз в культуре клеток синовиальной мембраны козленка.

3. Впервые дана сравнительная характеристика биологических свойств полевого изолята «Тверской» и штамма 75G-63 (США) ВАЭК в КК.

4. Показана возможность использования специфического антигена из изолята ВАЭК «Тверской» в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агарозном геле для выявления антител к вирусу АЭК в сыворотках крови коз.

Практическая значимость и реализация результатов исследования

Заключается в разработке «Методических рекомендаций по получению, культивированию клеток синовиальной мембраны козленка и применению данной культуры в качестве лабораторной модели для изучения вируса артрита-энцефалита коз», регламентирующих методы и условия получения, выращивания первичной и субкультуры клеток синовиальной мембраны козленка и использования ее для изоляции из патологического материала, накопления, определения инфекционной активности вируса артрита-энцефалита коз и «Методических рекомендаций по постановке реакции диффузионной преципитации для выявления антител к антигенам вируса артрита—энцефалита коз в сыворотках крови коз при диагностике на артрит—энцефалит коз».

Получен изолят «Тверской» вируса АЭК от козы-вирусоносителя с использованием метода сокультивирования клеточных элементов в культуре клеток синовиальной мембраны козленка.

Методики могут использоваться для производства диагностических препаратов и проведения прижизненной ретроспективной диагностики АЭК.

Так, с использованием метода РДП проведено исследование 385 проб сывороток крови коз и выявлено 59 животных из хозяйств Московской, Владимирской и Тверской областей РФ, в сыворотке крови которых обнаружены антитела к вирусу АЭК, что свидетельствует о циркуляции вируса АЭК на территории РФ.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновская ГСХА, 2008г.) и на заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (2006-2008гг.).

Публикация результатов

Основные результаты диссертационной работы изложены в 7 работах, в том числе в журнале «Ветеринария», включенном в перечень ВАК Министерства образования науки РФ - 1 работа.

Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования и анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ.

Благодарности

Выполнение настоящей работы и качественный анализ её результатов были бы невозможны без непосредственного участия ряда сотрудников ВНИИВВиМ. Отдельные этапы экспериментальных работ выполнены совместно с сотрудниками лаборатории «Биофизика» (зав.лаб. С.Ж. Цыбанов; О.Л. Колбасова; О.Н. Жигалева), лаборатории «Эпизоотология» (А.Ю. Чичикин; И.Ю. Волкова). Практическую и консультативную помощь оказывали: Н.С. Неверовская, С.Г. Юрков, А.В. Филатов, С.П. Живодеров, Е.Г. Анохина, Б.В. Новиков, И.М. Калабеков, В.М. Бурдинский, а также заведующий кафедрой биологии, вирусологии и генной инженерии Московского государственного университета прикладной биотехнологии д.б.н., профессор А.Ф. Валихов, за что автор выражает глубокую признательность.

2. Обзор литературы

5. Выводы

1. Культура клеток синовиальной мембраны козленка может служить лабораторной системой для выделения вируса артрита-энцефалита коз.

2. Культура клеток СМК пригодна для масштабного культивирования с 3-го по 8-й пассажные уровни.

3. Перевиваемые культуры клеток ЛЭЯ, ЛЭТ и ПЯ не чувствительны к возбудителю артрита-энцефалита коз.

4. Культура клеток СМК, полученная от коз культурных пород более чувствительна к ВАЭК, чем от аборигенных.

5. Характер ЦПЭ и уровень инфекционной активности различен при заражении культуры клеток СМК штаммом 75G-63 и изолятом «Тверской» ВАЭК.

6. Повышение температуры инкубации вируса АЭК в культуре клеток СМК до (38,5—39)±0,1°С увеличивает интенсивность проявления ЦПЭ и уровень инфекционной активности вируса АЭК на llg.

7. Полученный специфический антиген из отечественного изолята ВАЭК «Тверской» является пригодным при использовании в РДП для выявления антител к вирусу в сыворотках крови клинически больных коз и коз-вирусоносителей.

8. С помощью метода РДП установлена циркуляция вируса АЭК среди поголовья коз на территории Владимирской, Тверской и Московской областей.

6. Практические предложения

Для проведения лабораторной диагностики АЭК нами разработаны следующие документы: «Методические рекомендации по получению, культивированию клеток синовиальной мембраны козленка и применению данной культуры в качестве лабораторной модели для изучения вируса артрита—энцефалита коз», которые регламентируют методы и условия получения, выращивания первичной и субкультуры клеток синовиальной мембраны козленка и использования ее при изоляции из патологического материала, накоплении, определении инфекционной активности вируса артрита— энцефалита коз;

Методические рекомендации по постановке реакции диффузионной преципитации для выявления антител к антигенам вируса артритаэнцефалита коз в сыворотках крови коз при диагностике на артрит-энцефалит коз».