Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотологические особенности анаплазмоза крупного рогатого скота и совершенствование методов его диагностики, профилактики и лечения

На правах рукописи

ББИСЕМБАБВ КАНАТЖАН КАИРГЕЛЬДИНОВИЧ

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНАПЛАЗМОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СОВЕРШЕНСТВОАНИЕ МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК-2005

Работа выполнена в институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет», ФГУ Омском НИИ природ-но-очаговых инфекций Роспотребнадзора.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Красиков Александр Пантелеевич

доктор медицинских наук, профессор Рудаков Николай Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Сидоров Геннадий Николаевич

Защита состоится 28 октября 2005 г. в 14— часов на заседании диссертационного совета Д 220.050.03 при ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» в институте ветеринарной медицины ОмГАУ по адресу: 644122, г. Омск-122, ул. Октябрьская, 92, тел. 24-15-35; факс (3812) 23-04-67.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ.

Автореферат разослан 28 сентября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного со

доктор ветеринарных наук Бажин Михаил Аристоклевич

Ведущее учреждение:

ГУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО

РАСХН

доцент

Н.П. Жабин

20 Q&-4

TlGA^

¿//^22 О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Анаплазмоз регистрируется во многих странах мира, в частности странах Балтии, Средней Азии, Латинской Америки, а также во многих регионах России, На территории Западной Сибири анаплазмоз крупного рогатого скота ранее официально не регистрировался. По данным сотрудников ИВМ ОмГАУ (В.А. Стрельчик и др., 2000), за последние 15 лет в ряде хозяйств Омской, Новосибирской и Тюменской областях отмечались периодические вспышки заболевания крупного рогатого скота с клиническими признаками анаплазмоза, в мазках крови от больных животных обнаруживали поражение эритроцитов анаплазмами.

Длительное время считалось, что эрлихии вызывают болезни только у животных и не представляют опасности для человека. В настоящее время доказано развитие у человека заболеваний, вызываемых возбудителями: эрлихио-за Сеннетсу (Neorickettsia sennetsu), моноцитарного эрлихиоза (Ehrlichia chaffeensis) и гранулоцитарного эрлихиоза (Anaplasma phagocytophila).

В последнее время благодаря широкому внедрению методов генетического анализа пересмотрена филогенетическая позиция представителей рода Ehrlichia. Вследствие этого Е. phagocytophila этиологический агент гранулоцитарного эрлихиоза человека (ГЭЧ) была реклассифицирована и помещена в соседний род Anaplasma семейства Anaplasmataceae (J.S. Dumler et al., 2001), в связи с генетическим родством с возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота Anaplasma marginale.

По данным отечественной и зарубежной литературы, возбудители анаплазмозов животных имеют близкое генетическое родство с возбудителями анаплазмозов и эрлихиозов человека и относятся к одному и тому же семейству Anaplasmatacea. Возбудители анаплазмозов у людей и животных генетически не идентифицированы в России, не доказано генетическое родство и отличие между ними, однако считается что один из них - А. phagocytophila является возбудителем гранулоцитарного анаплазмоза как у животных, так и у человека.

Исходя из этого, можно предположить, что одними и теми же или очень близкими анаплазмозами болеют люди и животные. А значит, больные люди и животные могут представлять эпидемическую и эпизоотическую опасность.

В связи с этим весьма актуальным является: выяснить эпизоотическую ситуацию по анаплазмозу (гранулоцитарному эрлихиозу) крупного рогатого скота в Омской области, определить таксономическое положение возбудителя, эпизоотологическую и эпидемиологическую опасность данной болезни и роль членистоногих переносчиков инфекции, для разработки профилактики и эффективных мер борьбы с ней.

Цель и задачи исследований: выявить эпизоотологические особенности анаплазмоза крупного рогатого скота, свойства возбудителя, основных переносчиков. усовершенствовать диагностику, а также определить эффек-

IPOC. НАЦИОНАЛЬНАЯ { БИБЛИОТЕКА {

■ 3 ¿"таг!

тивность некоторых химиотерапевтических средств для борьбы с данной инфекцией в условиях хозяйств Омской области. Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Выяснить эпизоотическую ситуацию по анаплазмозу крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области и установить возможность его проявления в ассоциативной форме.

2. Изучить основные биологические свойства возбудителя.

3. Определить роль клешей в передаче возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота.

4. Установить клинико-морфологические изменения у животных спонтанно и экспериментально инфицированных A.sp.Omsk.

5. Получить антиген и анаплазмозную диагностическую сыворотку, определить в РНИФ их специфичность, активность и возможность применения для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота.

6. Разработать схемы профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота и дать им экономическое обоснование.

Научная новизна работы. Впервые: установлено широкое распространение анаплазмоза крупного рогатого скота и ассоциативные формы его проявления в хозяйствах Омской области. На территории Западной Сибири от больных животных выделен первый в России штамм анаплазм A.sp.Omsk, который по нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16s р-РНК отличается от А. centrale и А. marginale. Изготовлены и лиофи-лизированы опытные образцы антигена из шт. A.sp Omsk и гомологичная кроличья анаплазмозная сыворотка для РНИФ. Разработан культуральный метод диагностики анаплазмоза с использованием клеток Vero. Для изучения возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота применён метод использования клещевой экспериментальной модели, который позволяет установить сроки персистирования анаплазм в клещах и выявлять трансова-риальный и трансфазовый пути передачи возбудителя. Разработаны, экспериментально и экономически обоснованы эффективные схемы лечения и профилактики анаплазмоза крупного рогатого скота.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации дополняют концепцию о паразито-хозяинных отношениях, внося г вклад в развитие науки паразитоценологии об ассоциативных инфекционных процессах. Метод экспериментального моделирования естественного цикла метаморфоза иксодовых клещей позволяет изучать взаимоотношения возбудителей и переносчиков, наблюдать инфекционный процесс и локализацию возбуди геля в органах и тканях, изучать гетерогенные популяции возбудителей на уровне вертикальной передачи. Разработанные способы получения анаплазмозных антигенов и сывороток для РНИФ позволят внедрить данный экспресс-mel од диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота в условиях промышленного животноводства Омской области и в других регионах РФ. Применение в общем комплексе: диа! ностики, рациональных схем профилактики и лечения позволит контролировать

эпизоотическую ситуацию и проводить эффективные мероприятия по борьбе с анаплазмозом крупного рогатого скота.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на: ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ (Омск, 2003-2005); 1П и IV межрегиональных научно-практических конференциях: «Современные проблемы ветеринарной медицины» и «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Омск, 2004-2005, СО РАСХН ВНИИБТЖ).

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований вошли в методические рекомендации «Экспериментальное моделирование естественного цикла метаморфоза иксодовых клещей» и «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота», которые рассмот-ренны и одобренны на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 25.05.2005, протокол № 8 и на заседании Центра научного обеспечения АПК при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 26.05.2005, протокол № 4. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней и микробиологии, вирусологии и иммунологии Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ, Института повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ. а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса. Депонирован штамм анаплазм «0мск/2004» во Всероссийском музее риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под инвентарным №138 от 19.09.2005. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эпизоотологииеские особенности анаплазмоза крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области.

2. Основные биологические свойства возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота.

3. Экспериментальное изучение роли иксодовых клещей в передаче возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота.

4. Клиннко-морфологические изменения у животных спонтанно и экспериментально инфицированных А.Бр.Отзк.

5. Способы получения антигена и сыворотки и изучение их специфичности и активности в РНИФ для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота.

6. Схемы профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, приложения. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 25 рисунками. Список литературы включает 177 источников, из них 71 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Тема диссертационной работы самостоятельным разделом входит в комплексную государственную программу «Профилактика, диагностика и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» (номер государственной регистрации 01.2.001100602). Работа проводилась в период с 2002 по 2005 годы в лаборатории микст-инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней, лаборатории электронной микроскопии кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ФГ'ОУ ВПО ОмГАУ, лаборатории зоонозных инфекций ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора, а также в хозяйствах Омской области.

Объектом исследований являлся клинически здоровый и с выраженными клиническими признаками анаплазмоза крупный рогатый скот различных возрастов.

Использовали эпизоотологические, клинические, патологоанатомические и лабораторные методы диагностики инфекционных болезней.

Прижизненно от животных исследовали пробы крови, молока, молозива, цервико-вагинальиой слизи, бронхиальной жидкости, полученную методом бронхоальвеолярного лаважа, мазки крови. Кровь для серологических исследований брали из ярёмной, а для гематологических-из краевой ушной вен. Посмертно от животных исследовали пробы патологического материала от вынужденно убитых и павших животных: печень, почки, селезенка, легкие, сердечная мышца, лимфоузлы. Всего исследовано 170 голов крупного рогатого скота в возрасте 1,5-3,5 лет и 55 телят 4-6 мес. возраста из разных хозяйств Омской области.

В опытах использовали белых мышей (6 и 30-45 дн. возраста), кроликов (5-6 мес. возраста), а также лабораторные линии клещей D. reticulatus (во втором поколении) и D. silvarum (в четвёртом поколении).

В качестве материала для заражения иксодовых клешей применяли 10%-ную суспензию из селезёнки больной анаплазмозом коровы в острой форме. Голодных половозрелых клещей (самец и самка) заражали интрацело-мально с помощью микроинъектора путём прокалывания мембраны у основания четвёртой коксы клеща, в дозе 0,2 - 0,3 мкл. Всего заражено 140 голодных половозрелых особей по 70 экземпляров на каждый вид клешей. Для изучения восприимчивости клещей D. reticulatus и D. silvarum к возбудителю анаплазмоза крупного рогатого скота (A. sp. Omsk), их исследовали через 14 дней, а для определения сохраняемости в теле беспозвоночных, при итрацеломальном заражении - через 60 дней. Исследования проводили путём тотального приготовления мазков-отпечатков от 60 особей. Для этого членистоногих гомогенезировали в пластиковых пробирках для микропроб и использовали 1% суспензию клещей в 0,2 мл. 0,01 М ФСБР,

рН 1,7-1,А. До исследования суспензии её хранили в течение суток при +4°С, при более длительных сроках, при -20°С.

Изучение морфологических и тинкториальных свойств выделенных микроорганизмов осуществляли при окраске мазков-препаратов по Романов-скому-Гимза. Интенсивность паразитемии оценивали определением количества анаплазм в 100 полях зрения микроскопа.

Заражение культур клеток Vero проводили приготовленной суспензией из селезёнки больной анаплазмозом коровы. Культуру клеток Vero выращивали в стеклянных флаконах в концентрации 150 тыс. на 1 мл. В качестве питательной среды использовали Игла MEM с двойным набором аминокислот, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и антибиотиков (пенициллин в дозе 1млн. ЕД и стрептомицин в дозе 500тыс. ЕД на 1 мл.). На следующие сутки после образования монослоя проводили замену среды роста на среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки). В подготовленные флаконы вносили 0,5 мл суспензии из селезёнки. Затем флаконы с заражёнными клетками Vero центрифугировали при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 1 часа, после центрифугирования среду поддержки меняли на новую. Флаконы помещали при анаэробных условиях и 36°С на 8 суток. После завершения инкубации все флаконы промораживали при -20 С в течение 30 мин, а затем оттаивали при +18°С. После оттаивания, клеточную взвесь центрифугировали при 3000g в течение 15 мин и для дальнейшей работы отбирали супернатант. Для накопления антигенной биомассы, анаплазмы восьмикратно пассировали. Культуру клеток с анаплазмами после каждого пассажа просматривали при помощи световой и люминесцентной микроскопии.

Патогенные свойства выделенных культур изучали при постановке биологической пробы на белых мышах, которым внутрибрюшинно вводили по 1 мл на голову культуры A. sp. Omsk выращенной на культуре клеток Vero. Наблюдение проводили в течение 30 суток. По мере гибели лабораторных животных готовили мазки-отпечатки, которые окрашивали по Романов-скому-Гимза. По окончанию опыта (30 дн.) всех животных также подвергали исследованию.

Для изучения субмикроскопического строения анаплазмозных клеток, взвеси исследуемых культур фиксировали в смеси глутарового и парафор-мальдегидного растворов. После промывки фосфатным буфером и дополнительной фиксации в 1% растворе четырёх окиси осмия обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и ацетоне. Приготовленный материал заключали в аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме УМТП-4. После контрастирования срезы исследовали под электронным микроскопом ЭМ-125.

Применяли стандартные и дополнительные, разработанные в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней мето-

ды серологической диагностики - прямой и непрямой иммунофлуоресцен-ции (РПИФ и РНИФ) для прижизненного выявления антигенов и антител (А.П. Красиков, Н.В. Лобанова, 2004).

Видоспецифические сыворотки к полевому штамму анаплазм получали путём гипериммунизации кроликов по схеме D. Schimmel в модификации Красикова А.П. и Новиковой H.H. (2002). Для постановки РНИФ использовали ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ, изготовленный НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Двухраундовую ПЦР проводили с применением родоспецифических праймеров с последующим секвенированием положительных образцов ДНК.

Расчёт экономической эффективности ветеринарных мероприятий при анаплазмозе крупного рогатого скота проводили по «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утверждённой МСХ и продовольствия РФ, Департаментом Ветеринарии, Московской государственной академией ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (1997).

Статистическую обработку материалов проводили по общепринятым методикам (А. М. Мерков, Л.Е. Поляков, 1974).

Часть исследований была проведена совместно с сотрудниками Новосибирского института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН им. М. Лаврентьева (Pap В.А., Морозова О.В.), ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора (И.Е. Самойленко, В.В. Якименко, Г.П. Юртова), а также с сотрудниками ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ: лабораторий электронной микроскопии (Т.А. Беспалова), резистентности молодняка (В.И. Зайнчковский, B.C. Сороковой), кафедр ветеринарной хирургии (В.И. Сам-чук), внутренних незаразных болезней, фармакологии и токсикологии (C.B. Савицкий), аспирантами (Н.П. Бронникова) и ОмГМА (Л.В. Кумпан), которым выражаем глубокую благодарность.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эпизоотологические особенности анаплазмоза крупного рогатого скота в Омской области

Работа по выяснению распространения, сезонности проявления, степени восприимчивости разных возрастных групп крупного рогатого скота и основных путей распространения анаплазмоза, а также вопроса о возможности ассоциативных форм течения анаплазмоза, проведена на 150 головах крупного рогатого скота, спонтанно инфицированных возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота. Для этого, выборочно исследовано 120 коров 3-7 лет, 30 телят 4-6 мес. возраста, принадлежащих хозяйствам Омской области (по 10 голов из каждого хозяйства). При этом в СПК "Русспол" - анаплазмы не обнаружены. В

С ПК "Такмык" анаплазмы обнаружены - у 20%, в СПК "Красный Яр» - у 50%, в ЗАО "Курнасово" - у 90%, в СПК "Большевик" - 70% (коров и телят), в ЗАО "Колос" - у 30% коров и у 60% телят. В АОЗТ "Новороссийское" - у 60% коров и 30% телят. В СПК "Дружба" - у 30%, в СПК "Семё-новка" - у 40%. В СПК "Кольпогино" - у 50%, в СПК "Тевриз" - у 20%, в ОПХ "Боевое" - у 60% животных из числа исследованных.

При эпизоотологическом обследовании хозяйств Омской области регистрировалось острое и подострое течение анаплазмоза крупного рогатого скота, главным образом в июне - сентябре, когда на животных паразитирует большое количество иксодовых клещей.

При проведении комплексных исследований установлено, что в ЗАО "Курнасово" из 90% реагирующих на анаплазмоз коров 30% приходилось на ассоциативную форму его проявления с лептоспирозом и сальмонелле-зом. В СПК "Красный Яр" моноинфекция зарегистрирована у 50% животных, в СПК "Такмык" - у 10% и у 10% - в ассоциативной форме с хлами-диозом, лептоспирозом, сальмонеллезом. В СПК "Большевик" из 70% коров и телят инфицированных анаплазмами 10% приходилось на долю животных инфицированных в ассоциации с хламидиями, лептоспирами, листер иями, сальмонеллами, вирусами ИРТ и ГТГ-3. В ЗАО "Колос" у 20% взрослого скота анаплазмоз, регистрировали как моноинфекцию, а у 10% в ассоциации с сальмонеллёзом, у 50% телят в ассоциативной форме с хла-мидиозом, лептоспирозом, диплококкозом, сальмонеллёзом и ПГ -3 и у 10% телят, как моноинфекцию. В СПК "Новороссийский" из числа исследованных животных у 30% взрослого скота инфекционный процесс проявлялся в виде моно - и ассоциативной инфекции с хламидиозом, лептоспирозом, сальмонелёзом, листериозом, а у молодняка в той же ассоциации за исключением замены возбудителей сальмонеллеза на ИРТ. В ОПХ "Боевое" из числа исследованных животных у 30% коров инфекционный процесс проявлялся в виде моно - и ассоциативной инфекции с сальмонеллезом, ИРТ.

При этом у взрослого скота число сочленов ассоциации достигало до трёх, а у молодняка - до пяти. Всё это указывает на то, что анаплазмоз крупного рогатого скота может протекать как моноинфекция и принимать ассоциативную форму течения, вызывая клиническое проявление болезни в более тяжёлой форме.

Основные биологические свойства возбудителя анаплазмоза, выделенного из биологического материала от крупного рогатого скота

Изучение тинкториальных и морфологических свойств анаплазм. В

окрашенных по Романовскому - Гимза мазках из периферической крови от больного крупного рогатого скота анаплазмы обнаруживали в виде одного, двух, реже трёх в одном эритроците розовато-фиолетовых точкоподобных включений округлой, овальной формы. Расположение в эритроците - преимущественно периферическое, иногда эксцентричное.

Изучение культуральных и субмикроскопических свойств анаплазм.

В качестве биологической модели для культивирования и изучения анаплазм, нами была использована культура клеток Vero. Заражение и культивирование анаплазм проводили согласно описанной методике. На вторые -третьи сутки после выращивания отмечали дегенеративные изменения клеток. Показано, что с каждым пассажем происходит накопление количества анаплазм в культуре клеток Vero с 30 м.т. в 100 п./з. в первые сутки, до 90 м.т. на 7 сутки, с незначительным уменьшением на 8 сутки. Анализ результатов электронно-микроскопических исследований показал, что структура клеток Vero нарушена, а цитоплазма содержит большое количество анаплазмозных «морул» различной величины и формы. Цито-плазматическая мембрана клеток истончена и местами разорвана. A.sp.Omsk поражает не только цитоплазму клеток, но и проникает в ядро клетки, разрушая ядерную оболочку. Установлено, что анаплазмы окружены плотной непроницаемой морулой (двухслойная цитоплазматическая мембрана), внутри которой находятся «инициальные тельца», каждое из которых окружены тонкой наружной и внутренней мембранами. Такие скопления паразитов назвали колониями (В.М. Петешев, 1969) или микроколониями (Л.П. Дьяконов, A.A. Авакян, 1970). Мелкие микроколонии состояли из одной - двух особей, а более крупные из нескольких. При наличие двух паразитов колонии имели вытянутую форму, трёх - треугольную, четырёх - четырёхугольную, свыше четырёх - округлую.

Анаплазмы размножаются простым делением и почкованием, формируя колонии из 2 - 8 особей (М.Ш. Акбаев, 1998). Анализ результатов электронно-микроскопических исследований показал, что анаплазмы формируют поперечные трубчатые структуры и перетяжки, что указывает на деление анаплазмозных клеток. Ультраструктура анаплазмозных клеток представлена протопластически-ми пучками в периплазмотическом пространстве, скоплениями рибосом (тёмные свободные пространства), тонкими нитями ДНК (светлое свободное пространство), трубчатыми и везикулярными образованиями.

Генетические особенности возбудителя анаплазмоза. При проведении двухраундовой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймерах среди образцов ДНК из селезёнок клинически больных анаплазмозом коров (СПК «Такмык» Большереченский район) и телят (ЗАО «Колос» Павлоградского района) анаплазмы были обнаружены во всех образцах, которые по нуклео-тидной последовательности фрагмента гена 16s рРНК отличались от ДНК Anaplasma marginale и Anaplasma centrale.

Экспериментальное изучение роли клешей в передаче возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота

Через 14 суток после заражения, число инфицированных особей возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота (A. sp. Omsk), составило -

53,3±9,1% у клещей Б. ге^сЫайк и 43,3±9,0% у клещей О. зЛуагшп. Через 60 суток, она составила - 63,3±8,8% у клещей О. гейсикйш и 56,6±9,0% у клещей В. эПуагит.

Для дальнейшей работы, нами было отобрано три экспериментально заражённые линии клещей (две - О. гейсикШБ и одну - О. эПуагит), самки которых дали хорошую яйцекладку, с наилучшим выходом личинок.

Образцы личинок и нимф от этих экспериментальных линий исследовали как в голодном состоянии, так и после напитывания. При этом в голодном состоянии количество исследованных экземпляров у клещей Б. гейсикШБ составляло 100 личинок и 50 нимф, после напитывания - не менее 50 личинок и 50 нимф. У клещей О. эПуагат количество исследованных экземпляров в голодном состоянии составляло 100 личинок и 50 нимф, после напитывания - 50 личинок и 50 нимф (табл. 1).

Таблица 1. Эффективность трансовариальнон и трансфазовой переда-

чи анаплазм (А. зр. Ошяк) в экспериментальных линиях клещей

Личинки Нимфы

Экспери мента льная линия клещей Кол-во жизне до кровососания после до кровососания после

способных личинок в кладке кол-во иссл экз. уров. ТОП в % кол-во иссл. экз. уров. ТОП в% кол-во иссл экз. уров. ТФП в % кол-во иссл. экз. уров. ТФП в%

Б. ге-ЦсиМв 1897 100 24,0 ±4,3 70 37,1 ±5,8 50 30,0 ±6,5 50 58,0 ±7,0

Э. ге-йсикШэ 1458 100 18,0 ±3,8 50 36,0 ±6,8 50 42,0 ±7,0 50 50,0 ±7,1

В. эПуагит 367 100 20,0 ±4,0 50 62,0 ±6,9 50 36,0 ±6,8 50 40,0 ±7,0

Примечание: ТОГМрансовариальная передача, ТФП-трансфазовая передача.

У клещей О. гейсикШэ выход личинок составил от 1458 до 1897 экземпляров, а у клещей О. вПуагит - 367. При этом инфицированность анаплаз-мами после кровососания личинками клешей О. геНсиЬШэ, была -36,6+6,3%, а уровень инфицированности до кровососания сосунков составлял 21,0±4,1% Уровень инфицированности анаплазмами в нимфальной стадии развития клешей Б. геНсикигс, после кровососания сосунков голодными формами, был - 54,0±7,1%, а до кровососания - 36,0±6,8. Инфицированность анаплазмами в личиночной стадии развития клещей О. я^уагит, в напитавшемся состоянии была - 62,0±6,9%, а в голодных формах развития личинок - 20,0±0,4%. Уровень инфицированности анаплазмами нимф клещей О. вЛуагит после кровососания сосунков составил -40,0+7,0%, а в голодном состоянии - 36,0±6,8%.

В мазках-отпечатках из селезёнок мышей-сосунков, на которых кормились личинки и нимфы клещей О. геПси1ай1я и О. БНуагиш, из 15 исследо-

ванных - 14 положительных проб, в которых были обнаружены анаплаз-мозные включения, причём как в эритроцитах, так и в лейкоцитах.

Клинико-морфологические изменения у животных спонтанно и экспериментально инфицированных A.sp.Omsk

У больных коров и телят, наблюдали следующие клинические признаки: угнетение, повышение температуры тела до 40,5°С, расстройство сердечной деятельности, анемичность (иногда со слабо выраженной желтушно-стью) слизистых оболочек, исхудание животных. При тяжёлом течении болезни наступало общая слабость, отказ от корма, атония желудочно-кишечного тракта, усиленная жажда, учащённое дыхание - до 65 движений в минуту, отёки век, подгрудка, слизистое истечение из ноздрей.

При морфологическом исследовании установлено наличие анаплазм в эритроцитах у 60% телят и у 90% коров, глубокое нарушение костномозгового кровообращения, которое проявляется анизо-пойкилоцитозом, включениями типа ретикулярной сетчатости и анемией. Также отмечены реологические нарушения крови, проявляющиеся образованием "монетных" столбиков в результате потери заряда эритроцитами. Дистрофические и литические процессы в лимфоцитах и нейтрофилах, характеризовались ворсинчатостью ядер и набуханием внутриклеточных структур. В каждом мазке от больных животных регистрировали клетки (лимфоциты и моноциты) с признаками недостаточной зрелости. Изменения лейкоцитарного профиля проявлялись нейтрофилией и эозинофилией у больных телят и коров.

В опыт по заражению возбудителем анаплазмоза были взяты два кролика весом 2-2,5 кг. Обоих кроликов спленэктомировали и через двое суток после операции заразили культурой A.sp.Omsk выращенной на культуре клеток Vero. Заражение проводили внутривенно по 1 мл на голову.

На основании результатов исследования проб крови установлено, что интенсивность паразитарной реакции уже на 2 сутки после заражения кроликов возрастает до 12 - 18% инфицированных клеток с последующим увеличением до 30 - 40%, на 12 - 27 сутки. При этом инфекционный процесс протекает остро, с проявлением клинических признаков: вялость, угнетение, отсутствие аппетита, повышение температуры тела на 0,4°С (39,9°С), внутриушные наложения, исхудание и гибелью животных на 14 сутки.

При проведении опытов по заражению белых мышей культурой A.sp.Omsk были использованы 3 группы клинически здоровых особей в возрасте 1,5 месяцев, весом 12-14 гр. (по 5 голов в каждой группе). Заражение проводили внутрибрюшинно по 1 мл на голову.

Результагы опытов показали, что через 10 суток после заражения в эритроцитах белых мышей были обнаружены единичные анаплазмы. Ещё через 20 суток произошла гибель одной особи, в крови которой находились анаплазмы. Повторное заражение мышей, одной группы кровью, а другой суспензией из селезёнки от первично инфицированных культурой A. sp. Omsk

особей, показало, что в первой группе через 10 суток у лабораторных животных наблюдались клинические признаки: взъерошенность, угнетение, воспаление конъюнктивы, анемия, а паразитемия составляла 8 - 10% инфицированных клеток. Во второй группе, через пять суток после проявления клинических признаков болезни произошла гибель четырёх особей. При этом в мазках крови и отпечатках из паренхиматозных органов у них были обнаружены анаплазмы, но паразитемия не превышала 10% инфицированных клеток.

Получение кроличьих гипериммунных ананлазмозных сывороток

Для гипериммунизации использовали 8 суточную культуру полевого штамма A. sp. Omsk, полученную на культуре клеток Vero. Для выделения ана-плазм из клеток использовали способ попеременного замораживания (при -20°С - 30 мин) и размораживания при комнатной температуре. После оттаивания клеточную взвесь центрифугировали при 3000g в течение 15 мин. Для дальнейшей работы использовали супернатант, который центрифугировали при 6000g в течение часа. Полученный осадок трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводили до концентрации 1,7x109 микробных тел в 1 мл по ОСМ ПИСК им. JI.A. Тарасе-вича. Гипериммунизацию проводили, используя трёх кроликов, породы шиншилла весом 2,5-3 кг.

Титры антител учитывали на 7, 14, 22 и 30 сутки после введения A. sp. Omsk в РНИФ, антиген для которой готовили из этого же штамма и использовали после инактивации в водяной бане при 70°С в течение 30 мин в концентрации 1 млрд. м.т.

Полученная гипериммунная кроличья сыворотка в разведении 1:5 давала перекрестную реакцию с микоплазмами, бруцеллами, хламидиями и вирусами ИРТ, а в последующих разведениях была строго специфична к ана-плазмам и обладала достаточно высокой активностью в РНИФ. При этом наиболее высокий уровень антител регистрировали на 22 - 30 сутки после начала гипериммунизации, который колебался в пределах от 160 до 320. Анаплазмозный антиген также обладал высокой специфичностью.

Экспериментальное изучение возможности применения РНИФ для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота

Для выявления антител в сыворотки крови больного и подозреваемого в заражении возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота, использовали антиген, полученный на культуре клеток Vero.

Для обнаружения антигена у экспериментально инфицированных A.sp.Omsk клещевых линий D. reticularis и D. silvarum (имаго - первого поколения, личинки и нимфы - второго поколения), использовали полученную нами кроличью сыворотку. При этом от каждой экспериментальной линии исследовали по 10 экземпляров имагинальных форм и по 20 экземпляров преимагинальных форм клещей. Образцы имаго, личинок и

нимф от этих экспериментальных линий исследовались в голодном состоянии. У имагинальных форм исследовали гемолимфу. Преимагинальные формы исследовали путём тотального приготовления мазков отпечатков. При наличии антигена отмечали интенсивное специфическое свечение.

Исследования экспериментально зараженных клещей О. гейсЫаШБ и Р. яПуагит, на обнаружение возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции с сывороткой в разведении 1:10, показали, что у 40,0± 15,2% взрослых особей (имаго) клещей О. гейсЫаШв первого поколения (Р-1) (из числа исследованных) выявляли антиген возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота. В личинках и нимфах второго поколения (Р-2) этих же клещей в 42,5±15,6% и 40.0±15,2% случаях соответственно. В клещах Б. БПуагшп (имаго), антиген возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота, был обнаружен в 40,0±15,2% случаях (табл. 2).

При исследовании сыворотки крови у 20 голов крупного рогатого скота, в 100% случаев установлено совпадение положительных результатов световой и люминесцентной микроскопии, что указывает на высокую чувствительность РНИФ. При этом придельное значение титра антител, при котором отмечалось яркое интенсивное свечение в исследованных пробах сыворотки крови инфицированных животных, было 1:30, что свидетельствует о достаточной для антигена не бактериальной природы такого уровня активности в РНИФ.

Таблица 2. Определение антигенов возбудителя анаплазмоза в клеще___вом материале с помощью РНИФ____

Имаго Р-1 Личинки Р-2 Нимфы Р-2

голодные формы

Эксперимен- кол-во уровень ин- кол-во уровень кол- уровень

тальные ли- ИССЛ. фици-рован- ИССЛ. инфици- во инфици-

нии клещей экз. НОСТИ, экз. рован- ИССЛ. рован-

в % ное™, экз. ное™,

в% в %

В.гейсикШв 10 30,0±14,5 20 40,0± 10,9 20 45,0x11,1

О.гейойаШз 10 50,0±15,8 20 45,0±11,1 20 35,0*10,7

В.зПуагит 10 40,0±15,2 - - - -

Примечание: Р-1. - клещи первог о поколения; К-2. - клещи второго поколения: «•-». -

не исследовали.

Схемы профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота и их экономическое обоснование

Опыты по сравнительному изучению терапевтической эффективности комплексных препаратов проводили в 3 базовых хозяйствах: ЗАО «Колос», СПК «Большевик» и СПК «Новороссийский» на спонтанно инфицированном крупном рогатом скоте (табл. 3).

В 1 -й группе I опыта до применения тетрациклина-ПВП в мазках крови обнаруживали 8% анаплазм в 100 п./з. микроскопа, после лечения - 0,6%. У животных 2-й группы с паразитемией 5,2%, через 4-5 суток после лечения тетраэритросульфином-ПЭГ, паразитемия снизилась до 0,4%. В 3-й группе животных, леченных силоветом, паразитемия снизилась с 6,8% до 1% инфицированных клеток. У животных 4-й группы до применения спирта с риванолом в мазках крови обнаруживали 4,6% инфицированных клеток, через 10-20 дней после лечения анаплазм ы в мазках крови не были обнаружены. Перед лечением азидином с нилвермом (схема 5), у подопытных животных паразитемия составляла - 6%, через 10-20 дней после введения препарата в мазках крови опытных животных анаплазмы не были обнаружены.

Таблица 3. Схемы опытов по изучению лечебно-профилактических свойств некоторых препаратов при анаплазмозе крупного рогатого скота

№ группы и схемы Кол-во гол. Схемы лечения нетелей и коров 1,5-3,5 лет (опыт 1) и телят 6 мес. возраста (опыт 2).

Опыт I. ЗАО «Колос»

1 5 Тетрациклин-ПВП 0,1мл/кг внутримышечно 1 раз в день с интервалом в 24ч. в течение 3 дней

2 5 Тетраэритросульфин-ПЭГ 1мл/10кг внутримышечно с интервалом в 24ч. 1 раз в день в течение 3 дней.

3 5 Силовет 0,1 мл/кг подкожно 1 раз в день с интервалом в 24ч. в течение 3 дней.

4 5 Спирт+риванол 180мл/гол внутривенно однократно.

5 5 Азидин+нилверм 15мл/гол подкожно, трёхкратно с интервалом 10 дней.

6 10 Контрольная группа не леченых животных

Опыт И. СПК «Большевик»

7 5 Левотетрасульфин - ПЭГ 1мл/10кг внутримышечно, двукратно с интервалом 4 дня.

8 5 Тилоциклин - ПЭГ 2мл/10кг внутримышечно, пятикратно, ежедневно по 1 разу.

9 I 10 Контрольная группа не леченых животных

Опыт III. СПК «Новороссийский»

10 И 5 Левоэритроциклин - ПЭГ 1мл/10кг внутримышечно, трёхкратно с интервалом 5 дней.

5 Тилоциклин - ПЭГ 2мл/10кг внутримышечно, пятикратно, ежедневно по 1 разу.

12 10 Контрольная туп па не леченых животных

В 7-й группе II опыта с терапевтической целью испытали левотетра-сульфин - ПЭГ на 6 месячных телятах, а в 8-й группе тилоциклин - ПЭГ на 1лубокостельных коровах. У животных 7-й группы до проведения лечения, в мазках крови обнаруживали 13% инфицированных клеток, через 20 дней после лечения в крови больных животных анаплазмы отсутствовали. У животных 8-й группы с паразитемией 10,2% инфицированных клеток, после лечения, паразитемия снизилась до 0,8% инфицированных клеток.

В III опыте с лечебной целью испытали комплексные препараты: лево-эритроциклин - ПЭГ на глубокостельных коровах (схема 10) и тилоциклин - ПЭГ на 6 месячных телятах (схема 11). В 10-й группе до лечения в мазках крови обнаруживали 11,2% инфицированных клеток, а после лечения -

0.6.. В 11-й группе животных, количество анаплазм в эритроцитах после санации снизилось с 9,8% до 0,8% инфицированных клеток.

Отсутствие клинических признаков, анаплазм или снижение паразитемии до единичных анаплазм в крови больных животных после лечения, указывает на эффективность данных схем лечения. Тогда как в контрольных группах во всех опытах через 20 дней, число анаплазм в эритроцитах увеличилось до 12,43=0,9 - 14±0,9%, у животных поднялась температура тела до 40 - 41°С, отмечалась выраженная анемия, угнетение, отказ от корма. Больные животные были подвергнуты лечению.

Применение 5 и 7 схем лечения в ЗАО «Колос», позволило предотвратить экономический ущерб за 2004 г. на сумму 591378,3 руб., получить экономический эффект на сумму 571854,9 руб. и экономический эффект на один рубль затрат - 29,29 руб.

ВЫВОДЫ

1. Установлено широкое распространение анаплазмоза и анаплазмо-носительства в 92% исследованных хозяйств всех природно-климатических зон Омской области. При инфицированности коров и телят от 20 до 90%. Выражена сезонность проявления болезни с апреля по октябрь с максимумом инфицированное™ животных в летний период, что обусловлено паразитированием на них большого количества иксодо-вых клещей.

2. Выявлено, что при обострении инфекции у анаплазмоносителей, болезнь у крупного рогатого скота протекает в виде моноинфекции в 10 - 60% случаев и в 10 - 50% случаев принимает ассоциативную форму течения. Ассоциативная форма вызывает клиническое проявление болезни в более тяжёлой форме. При этом у взрослого скота число сочленов ассоциации достигало до трёх, а у молодняка - до пяти, в различных сочетаниях с хламидиозом, лептоспирозом, а у молодняка ещё и с диплококкозом, ИРТ, ПГ-3, листериозом и особенно часто с сальмонеллёзом.

3. От больных анаплазмозом животных выделен возбудитель, который по биологическим свойствам принадлежит к роду анаплазм. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16s р-РНК, выявил нуклеотидную замену в ДНК, которая отличает A.sp.Omsk от А. centrale и А. marginale, циркулирующих в зарубежных странах.

4. В экспериментальных условиях доказана восприимчивость клещей D. reticulatus и D. silvarum к Anaplasma sp. Omsk при интрацеломальном заражении и сохраняемость возбудителя в них до двух месяцев. При этом установлена возможность не только трансовариальной, но и трансфазовой передачи в пределах одной генерации (сроки наблюдения). Наличие же анаплазм в селезёнке крупного рогатого скота указывает на трансмиссивный путь передачи возбудителя данными клещами, а повышение числа инфицированных нимф из потомства инфицированных самок - на медиа-торный путь передачи.

5. Возбудитель Anaplasma sp. Omsk, не только вызывает клиническое проявление болезни и гибель белых мышей, но и сохраняется в их организме в течение последующих двух пассажей. При этом в крови подопытных животных анаплазмы не увеличивают свою паразитемию выше 8 - 10%. Вместе с тем усиливается их патогенность, что обуславливает заболевание мышей.

6. Установлено, что у спленэктомированных кроликов инфекционный процесс протекает остро (с проявлением выраженных клинических признаков анаплазмоза), а интенсивность паразитарной реакции, возрастает до 30 - 40% заражённых клеток уже на 12 - 27 сутки после заражения.

7. Полученная диагностическая анаплазмозная сыворотка обладает специфичностью к гомологичному антигену штамма Anaplasma sp. Omsk в разведении 1/10 и выше. Применение её и анаплазмозного антигена в РНИФ позволит проводить индикацию возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота в биоматериале, определять его антигенные свойства и идентифицировать возбудитель для определения его роли в патологии и патогенезе болезни, а также выявлять антитела в сыворотке крови больных и анаплазмоносителей.

8. Применение 1, 2, 3, 8, 10, И схем лечения на спонтанно инфицированном крупном рогатом скоте оказывает бактериостатическое действие на анаплазмы. В то время как 4, 5, 7 схемы лечения оказывают бактерицидное действие, на что указывает отсутствие в крови опытных животных возбудителя анаплазмоза. Вместе с тем, по экономическим и технологическим параметрам преимущество имеют 5 и 7 схемы с применением ази-дина с нилвермом и левотетрасульфина-ПЭГ. Применение данных схем лечения в базовом хозяйстве позволило получить экономический эффект на сумму 571854,9 руб.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического применения разработаны методические рекомендации: «Схемы профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота», «Экспериментальное моделирование естественного цикла метаморфоза иксодовых клещей» утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол №4 от 26.05.2005 г. Материалы диссертации могут быть использованы:

• в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по микробиологии, эпизоотологии;

• в научно-исследовательских институтах и учреждениях ветеринарной медицины при решении вопросов диагностики, профилактики и лечения анаплазмоза крупного рогатого скота и изучения биологического взаимоотношения возбудителей трансмиссивных инфекций с их переносчиками.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Красиков А.П. Морфология крови при анаплазмозе крупного рогатого скота и ассоциативные формы его проявления / А.П. Красиков, В.И. Зайнчковский, B.C. Сороковой, К.К. Бейсембаев // Роль ветеринарного образования в подготовке специалистов агропромышленного комплекса: сб. науч. тр. - Омск: ИВМ ОмГАУ, 2003. - С. 153-157.

2. Красиков А.П. Анаплазмоз крупного рогатого скота и ассоциативные формы его проявления / А.П. Красиков, К.К. Бейсембаев, Ю.М. Гичев, Н.П. Бронникова // Проблемы ветеринарного образования и научных исследований в агропромышленном комплексе: сб. науч. тр. - Омск: ИВМ ОмГАУ, 2004.-С. 177-182.

3 Бейсембаев К.К Экспериментальный анаплазмоз белых мышей / К.К. Бейсембаев, Н.В. Рудаков // Эпизоотология, патология и ветеринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных: сб. науч. тр. СО РАСХН ВНИИБТЖ. - Омск, 2004. - С. 6-9.

4. Бейсембаев К.К. Изыскание средств терапии и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота / К.К Бейсембаев, А.П. Красиков, Н.П Бронникова, C.B. Савицкий // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сб. науч. тр. СО РАСХН ВНИИБТЖ. - Омск, 2005. - С. 42-46.

5. Бейсембаев К.К. Спленэктомия - как возможный способ увеличения па-разитеыии возбудителя анаплазмоза в крови кроликов / К.К. Бейсембаев, А.П. Красиков, В.И. Самчук // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сб. науч. тр. СО РАСХН ВНИИБТЖ. - Омск. 2005. - С. 46-50.

БЕЙСЕМБАЕВ КАНАТЖАН КАИРГЕЛЬДИНОВИЧ

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНАПЛАЗМОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СОВЕРШЕНСТВОАНИЕ МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Подписано в печать 19.09.2005 Формат 60 х 84 1/16. Гарнитура Times New Roman Печ. л. 1,2. Печать оперативная. Тираж 100 экз.

Институт ветеринарной медицины ОмГАУ

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО "Вариант-Омск" 644099 г. Омск, ул. Коммунистическая. 45. Тел: 25-14-34, 33-71-41

1178 92

РНБ Русский фонд

2006-4 17616

1.2. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Анаплазмоз регистрируется во многих странах мира, в частности странах Балтии, Средней Азии, Латинской Америки, а также во многих регионах России. На территории Западной Сибири анаплазмоз крупного рогатого скота ранее официально не регистрировался. По данным сотрудников нашего института (В.А. Стрельчик и др., 2000), за последние 15 лет в ряде хозяйств Омской, Новосибирской и Тюменской областях отмечались периодические вспышки заболевания крупного рогатого скота с клиническими признаками анаплазмоза, в мазках крови от больных животных обнаруживали поражение эритроцитов анаплазмами.

Анаплазмоз наносит, большой экономический ущерб животноводству, который складывается из снижения мясомолочной продуктивности, качества и количества продуктов животного происхождения, ущерба от недополучения молодняка и гибели животных.

Так, в августе 1987г., в совхозе "Западный" Называевского района за короткий промежуток времени пало 40 коров. В ноябре 1995г. в АО "Колос" Пав-лоградского района, началось массовое заболевание бычков в возрасте 10-12 месяцев. При этом смертность за декабрь и первую половину января составила 57 на 100 животных. В этом же хозяйстве, в ноябре 1998г. начался массовый падёж телят в возрасте 4-6 месяцев с синдроматикой поражения лёгких. При клиническом осмотре отмечено угнетение, анемия, желтушность слизистой оболочки и кожи молочного зеркала, мышечная дрожь, гипотония и атония преджелудков, повышение температуры тела до 40-42,5°С. На коже коров обнаружены десятки напившихся самок клещей Dermacentor sp. (В.А. Стрельчик и др., 2000).

Длительное время считалось, что эрлихии вызывают болезни только у животных и не представляют опасности для человека. В настоящее время доказано развитие у человека заболеваний, вызываемых возбудителями: эрлихиоза

Сеннетсу (Neorickettsia sennetsu), моноцитарного эрлихиоза (Ehrlichia chaffeensis) и гранулоцитарного эрлихиоза (Anaplasma phagocytophila).

Гранулоцитарный эрлихиоз человека — это трансмиссивное зоонозное, остролихорадочное заболевание, передающееся при присасывание клещей и часто приводящее к летальному исходу. Клинические признаки болезни: синдром интоксикации, поражения органов и гематологические нарушения, зависящие от вида возбудителя. На территории Алтайского края на фоне роста заболеваемости населения клещевым риккетсиозом (КР) часть случаев серонега-тивного КР была верифицирована с использованием реакции непрямой имму-нофлюоресценции (РНИФ) как гранулоцитарный эрлихиоз (Н.В. Рудаков и др. 2001). В Дальневосточном регионе серологически установлена заболеваемость людей гранулоцитарным эрлихиозом с некоторыми клиническими отличиями от описанного в Америке ГЭЧ (Ю.Н. Сидельников и др., 2002). На территории Азиатской части России в клещах Ixodes persulcatus генотипированы Е. muris и A. phagocytophila, в клещах Haemophesalis concinna в Приморском крае - A. bo-vis (С.Н. Шпынов и др., 2002, 2004). Возбудители анаплазмоза у животных на указанных территориях не генотипированы.

В последнее время благодаря широкому внедрению методов генетического анализа пересмотрена филогенетическая позиция представителей рода Ehrlichia. Вследствие этого Е. phagocytophila - этиологический агент гранулоцитарного эрлихиоза человека (ГЭЧ) была реклассифицирована и помещена в соседний род Anaplasma семейства Anaplasmataceae (J.S. Dumler et al., 2001), в связи с генетическим родством с возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота - Anaplasma marginale.

Anaplasma marginale относится к роду Anaplasma семейства Anaplasmata-сеа порядка Rickettsiales. Локализуются в эритроцитах, иногда находят в лейкоцитах и тромбоцитах. При исследовании мазков крови, окрашенных по Романовскому - Гимзе, обнаруживают круглые включения величиной 0,2-1,2 мкм почти тёмного цвета. Располагаются в эритроцитах (преимущественно на периферии, иногда ближе к центру). В одном эритроците может быть от 1 до 4 возбудителей. Пораженность эритроцитов составляет 3 - 40% , иногда до 80% (А.И. Ятусевич, Н.Н. Андросик, 2001).

По данным отечественной и зарубежной литературы, возбудители анаплазмозов животных имеют близкое генетическое родство с возбудителями анаплазмозов и эрлихиозов человека и относятся к одному и тому же семейству Anaplasmatacea. Возбудителями анаплазмозов у людей и животных генетически не идентифицированы в России, не доказано генетическое родство и отличие между ними, однако считается что один из них - A. phagocytophila является возбудителем гранулоцитарного анаплазмоза как у животных, так и у человека.

Исходя из этого, можно предположить, что одними и теми же или очень близкими анаплазмозами болеют люди и животные. А значит, больные люди и животные могут представлять эпидемическую и эпизоотическую опасность.

В связи с этим весьма актуальным является: выяснить эпизоотическую ситуацию по анаплазмозу (гранулоцитарному эрлихиозу) крупного рогатого скота в Омской области, определить таксономическое положение возбудителя, эпизоотологическую и эпидемиологическую опасность данной болезни и роль членистоногих переносчиков в передачи инфекции, для разработки профилактики и эффективных мер борьбы с ней.

Цель и задачи исследований: выявить эпизоотологические особенности анаплазмоза крупного рогатого скота, свойства возбудителя, основных переносчиков, усовершенствовать диагностику, а также определить эффективность некоторых химиотерапевтических средств для борьбы с данной инфекцией в условиях хозяйств Омской области.

Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Выяснить эпизоотическую ситуацию по анаплазмозу крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области и установить возможность его проявления в ассоциативной форме.

2. Изучить основные биологические свойства возбудителя.

3. Определить роль клещей в передаче возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота.

4. Установить клинико-морфологические изменения у животных спонтанно и экспериментально инфицированных A.sp.Omsk.

5. Получить антиген и анаплазмозную диагностическую сыворотку, определить в РНИФ их специфичность, активность и возможность применения для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота.

6. Разработать схемы профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота и дать им экономическое обоснование.

Научная новизна работы.

Впервые: установлена широкая распространённость анаплазмоза крупного рогатого скота и ассоциативные формы его проявления в хозяйствах Омской области. На территории Западной Сибири от больных животных выделен первый в России штамм анаплазм A.sp.Omsk, который по нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16s р-РНК отличается от A. centrale и A. marginale. Изготовлены и лиофилизированы опытные образцы антигена из шт. A.sp.Omsk и гомологичная кроличья анаплаз-мозная сыворотка для производственного испытания в РНИФ. Разработан куль-туральный метод диагностики анаплазмоза с использованием клеток Vero. Для изучения возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота применён метод использования клещевой экспериментальной модели, который позволяет установить сроки персистирования анаплазм в клещах и выявлять трансовариаль-ный и трансфазовый пути передачи возбудителя. Разработаны, экспериментально и экономически обоснованы эффективные схемы лечения и профилактики анаплазмоза крупного рогатого скота.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации дополняют концепцию о паразито-хозяинных отношениях, вносят вклад в развитие науки паразитоце-нологии об ассоциативных инфекционных процессах. Метод экспериментального моделирования естественного цикла метаморфоза клещей позволяет изучать взаимоотношения возбудителей и переносчиков, наблюдать инфекционный процесс и локализацию возбудителя в органах и тканях, изучать гетерогенные популяции возбудителей на уровне вертикальной передачи. Разработанные способы получения анаплазмозных антигенов и сывороток для РНИФ позволят внедрить данный экспресс-метод диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота в условиях промышленного животноводства Омской области и в других регионах РФ. На основании результатов проведённых исследований разработаны методические рекомендации «Экспериментальное моделирование естественного цикла метаморфоза иксодовых клещей» и «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота». Применение экспериментального моделирования естественного цикла метаморфоза клещей позволит изучить взаимоотношения клешей-переносчиков с возбудителями трансмиссивных инфекций и разрабатывать мероприятия по борьбе с ними. Применение приведённых схем лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота позволит контролировать эпизоотическую ситуацию по данной инфекции и своевременно проводить лечебно - профилактические мероприятия.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ 2003-2005гг. (Омск): «Роль ветеринарного образования в подготовке специалистов агропромышленного комплекса» (Омск, 2003), «Результаты научных исследований в ветеринарии и зоотехнии в агропромышленном комплексе» (Омск, 2004), «Проблемы ветеринарного образования и научных исследований в агропромышленном комплексе» (Омск, 2005), на Межрегиональных научно-практических конференциях: «Эпизоотология, патология и ветеринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных» (Омск, 2004, СО РАСХН - ВНИИБТЖ), «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Омск, 2005, СО РАСХН- ВНИИБТЖ), на региональной студенческой конференции «Достижения и перспективы студенческой науки» (Новосибирск, 2005, Региональное отделение Сибирского Федерального округа Международной Ассоциации «Агрообразо-вание» и ФГОУ ВПО Новосибирский государственный аграрный университет).

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований вошли в методические рекомендации «Экспериментальное моделирование естественного цикла метаморфоза иксодовых клещей» и «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 25.05.2005 года, протокол №8 и на заседании Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 26.05.2005, протокол №4. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней и микробиологии, вирусологии и иммунологии Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ, Института повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ, а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса. Депонирован штамм анаплазм «0мск/2004» во Всероссийском музее рик-кетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под инвентарным №138 от 19.09.2005.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эпизоотологические особенности анаплазмоза крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области.

2. Основные биологические свойства возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота.""^

3. Экспериментальное изучение роли иксодовых клещей в передаче возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота.

4. Клинико-морфологические изменения у животных спонтанно и экспериментально инфицированных A. sp .Omsk.

5. Способы получения антигена и сыворотки и изучение их специфичности и активности в РНИФ для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота.

6. Схемы профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и две методические рекомендации «Экспериментальное моделирование естественного цикла метаморфоза иксодовых клещей» и «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота».

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 25 рисунками. Список литературы включает 177 источников, из них 71 зарубежных авторов.

5. ВЫВОДЫ

1. Установлено широкое распространение анаплазмоза и анаплазмоноси-тельства в 92% исследованных хозяйств всех природно-климатических зон Омской области. При инфицированности коров и телят от 20 до 90%. Выражена сезонность проявления болезни с апреля по октябрь с максимумом инфицированности животных в летний период, что обусловлено паразитирова-нием на них большого количества иксодовых клещей.

2. Выявлено, что при обострении инфекции у анаплазмоносителей, болезнь у крупного рогатого скота протекает в виде моноинфекции в 10 — 60% случаев и в 10 - 50% случаев принимает ассоциативную форму течения. Ассоциативная форма вызывает клиническое проявление болезни в более тяжёлой форме. При этом у взрослого скота число сочленов ассоциации достигало до трёх, а у молодняка - до пяти, в различных сочетаниях с хламидиозом, лептоспирозом, а у молодняка ещё и с диплококкозом, ИРТ, ПГ-3, листериозом и особенно часто с сальмонеллёзом.

3. От больных анаплазмозом животных выделен возбудитель, который по биологическим свойствам принадлежит к роду анаплазм. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16s р-РНК, выявил нуклеотидную замену в ДНК, которая отличает A.sp.Omsk от A. central ей А. marginale, циркулирующих в зарубежных странах.

4. В экспериментальных условиях доказана восприимчивость клещей D. reticulatus и D. silvarum к Anaplasma sp. Omsk при интрацеломальном заражении и сохраняемость возбудителя в них до двух месяцев. При этом установлена возможность не только трансовариальной, но и трансфазовой передачи в пределах одной генерации (сроки наблюдения). Наличие же анаплазм в селезёнке крупного рогатого скота указывает на трансмиссивный путь передачи возбудителя данными клещами, а повышение числа инфицированных нимф из потомства инфицированных самок — на медиаторный путь передачи.

5. Возбудитель Anaplasma sp. Omsk, не только вызывает клиническое проявление болезни и гибель белых мышей, но и сохраняется в их организме в течение последующих двух пассажей. При этом в крови подопытных животных анаплазмы не увеличивают свою паразитемию выше 8 - 10%. Вместе с тем усиливается их патогенность, что обуславливает заболевание мышей.

6. Установлено, что у спленэктомированных кроликов инфекционный процесс протекает остро (с проявлением выраженных клинических признаков анаплазмоза), а интенсивность паразитарной реакции, возрастает до 30 - 40% заражённых клеток уже на 12 — 27 сутки после заражения.

7. Полученная диагностическая анаплазмозная сыворотка обладает специфичностью к гомологичному антигену штамма Anaplasma sp. Omsk в разведении 1/10 и выше. Применение её и анаплазмозного антигена в РНИФ позволит проводить индикацию возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота в биоматериале, определять его антигенные свойства и идентифицировать возбудитель для определения его роли в патологии и патогенезе болезни, а также выявлять антитела в сыворотке крови больных и анаплазмоносителей.

8. Применение 1, 2, 3, 8, 10, 11 схем лечения на спонтанно инфицированном крупном рогатом скоте оказывает бактериостатическое действие на анаплазмы. В то время как 4, 5, 7 схемы лечения оказывают бактерицидное действие, на что указывает отсутствие в крови опытных животных возбудителя анаплазмоза. Вместе с тем, по экономическим и технологическим параметрам преимущество имеют 5 и 7 схемы с применением азидина с нилвермом и ле-вотетрасульфина-ПЭГ. Применение данных схем лечения в базовом хозяйстве позволило получить экономический эффект на сумму 571854,9 руб.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического применения разработаны методические рекомендации: «Схемы профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота», «Экспериментальное моделирование естественного цикла метаморфоза иксодовых клещей» утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол №4 от 26.05.2005 г.

Материалы диссертации могут быть использованы:

• в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по микробиологии, эпизоотологии;

• в научно-исследовательских институтах и учреждениях ветеринарной медицины при решении вопросов диагностики, профилактики и лечения анаплазмоза крупного рогатого скота и изучения биологического взаимоотношения возбудителей трансмиссивных инфекций с их переносчиками.

2.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анаплазмоз крупного рогатого скота — трансмиссивная природно-очаговая болезнь многих видов сельскохозяйственных и диких парнокопытных животных (Bovidae, Cervidae, Camelidae, Caprinae, Antilope), протекающая остро или хронически, характеризующаяся лихорадкой не постоянного типа, резко выраженной анемией, желтушностью, расстройством пищеварения и истощением (А.А. Сидорчук и А.А. Глушков, 2005).

Анаплазмоз регистрируется во многих странах мира, в частности странах Балтии, Средней Азии, Латинской Америки, а также во многих регионах России. На территории Западной Сибири анаплазмоз крупного рогатого скота ранее официально не регистрировался. Вместе с тем, в последние 15 лет в ряде хозяйств Омской, Новосибирской и Тюменской областях периодически отмечались вспышки заболевания крупного рогатого скота с клиническими признаками анаплазмоза, во всех случаях в мазках крови от больных животных обнаруживались поражение эритроцитов анаплазмами. Так, в Омской области анаплазмоз, зарегистрирован в Называевском, Павлоградском, Горьковском, Знаменском, Муромцевском и Тарском районах, т. е. его ареал охватывал южную и северную лесостепь, а также подтаёжную зону. Вспышки наблюдались чаще в конце лета - начале осени и зимой, при этом, в каждом случае отмечались различия в клинико-морфологическом проявлении болезни, в возрасте заболевших животных и летальности (В.А. Стрельчик и др., 2000).

Е.И. Теплова и др. (1983), наблюдали клиническое проявление анаплазмоза в ряде хозяйств Новосибирской, Свердловской области и Алтайского края преимущественно в острой форме, в хозяйствах Амурской, Кемеровской области, Красноярского, Ставропольского края - в виде анаплазмоносительства. Особенно тяжело болели нетели и первотёлки черно-пёстрой породы. Коровы и нетели болели в последние месяцы стельности или в первые дни после отёла. Преимущественно заболевание анаплазмозом крупного рогатого скота приходилось на август-октябрь. Начало его совпадало с массовым лётом и нападением слепней. Кроме того, на больных животных обнаруживались в небольшом количестве клещи Dermacentor reticulates.

Как отмечают П.М. Мордасов и П.А. Битюков (1968), анаплазмоз снижает надои молока в среднем по стаду на 27,3%, а в период заболевания у некоторых животных происходят аборты, особенно во второй половине стельности.

У быков заболевание может вызвать стерильность. По данным этих же исследователей, в Белоруссии из 1562 животных пало от анаплазмоза 12 и вынужденно убито 291 животное.

Возбудители семейства Anaplasmataceae — обязательные внутриклеточные бактерии с уникальной специфичностью к клеткам хозяина. В зависимости от бактериальной разновидности инфицируют определенные клетки: грануло-циты, эндотелиальные клетки, моноциты, макрофаги, красные клетки крови, и клетки костного мозга. Эта уникальная специфичность к клеткам хозяина была главным препятствием, для выращивания этой группы бактерий. Поскольку эти бактерии не могут жить вне клетки хозяина, когда-то вышедшие из клеток хозяина, они должны быстро стимулировать сигналы для внедрения в другую клетку хозяина, уникальную к каждой разновидности. Когда эти бактерии взаимодействуют с клетками хозяина, сигналы преобразуются и внутри клеток хозяина и внутри бактерий. Сигналы, преобразованные внутри бактерий, позволяют им точно настраивать их метаболизм и физиологию в новой окружающей среде клетки хозяина, так, чтобы их пребывание не повредило физиологию клетки хозяина, пока они не достаточно размножились (Y. Rikihisa, 2003).

Anaplasma marginale - это риккетсия развивающаяся в основном в организме жвачных животных и иксодовых клещей (R.A. Bram, 1975; G. Dikman, 1950; S.A. Ewing, 1981; M. Ristic, 1968). Передача возбудителя анаплазмоза крупному рогатому скоту осуществляется механическим путём, заражением крови, секретом слюнных желёз с помощью острого ротового аппарата насекомого, приблизительно у 20 видов клещей являющихся носителями данной болезни подобный биологический путь передачи, позволяет распространять её по всему свету (D.W. Anthony and Т.О. Roby, 1962; К.М. Kocan et al., 1980; К.М. Kocan et al., 1981; C.W. Rees, 1934; R.W. Stich, 1989). Anaplasma marginale развивается внутриклеточно в пределах вакуоли и специфически связана с циклом жизненного развития беспозвоночного хозяина (К.М. Kocan, 1986).

Анаплазмоз наносит большой экономический ущерб животноводству, который складывается из снижения мясомолочной продуктивности, снижения качества и количества продуктов животного происхождения, ущерб от недополучения молодняка и гибели животных.

Таким образом, в целях полного и всестороннего изучения данной проблемы, необходимо проводить клинико-эпизоотологические, патолого-анатомические, иммуноморфологические, микробиологические, серологические генетические исследования. Нужны объединенные исследования клиницистов, паразитологов, инфекционистов, патоморфологов, проводимые на органном, тканевом, клеточном, субклеточном и макромолекулярном уровнях.

Многие исследователи (Г.Г. Гасанов, 1968; Э.А. Шегидевич и др. 1982; С.А. Сулейманов, 1982; Е.М. Мирутян, А.А. Зацарян, 1986; А.А. Агаев, Н.М. Ширинов, 1988; А.И. Ятусевич, Н.Н. Андросик, 2001; Н.А. Казаков, 2003) отмечают, что в большинстве случаев анаплазмоз протекает в ассоциации с возбудителями протозойных, бактериальных, вирусных инфекций, гельминтозов; инкубационный период при этом значительно сокращается, клиническая болезнь проявляется в более тяжёлой форме.

Исследования смешанных инфекций обусловленных ассоциациями микроорганизмов, должны носить комплексный, всесторонний анализирующее-объясняющий характер с использованием современных методик соответствующих профилей, так как поверхностные исследования, фиксирующие лишь отклонения в клиническом и пато-морфологическом проявлении, не дают полной информации о заболевании (В.М. Апатенко, 1985).

Лечение не является идеальным методом борьбы с анаплазмозом, однако при отсутствии адекватных эффективных средств профилактики оно приобретает особую актуальность.

Создание рациональной и эффективной терапии является важной задачей при анаплазмозе рогатого скота. А если учесть, что из более чем 200 испытанных в мире препаратов выраженным лечебным эффектом обладают в большей степени лишь тетрациклиновые антибиотики, то важность проблемы, в плане расширения арсенала эффективных лечебных средств, приобретает особую актуальность. К тому же, применение препаратов из одной и той же группы может привести при длительном использовании к повышению устойчивости возбудителя к ним.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

Тема диссертационной работы самостоятельным разделом входит в комплексную государственную программу «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» и имеет номер государственной регистрации 01.2.001100602.

Работа проводилась в период с 2002 по 2005 годы в лаборатории микст-инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней, в лаборатории электронной микроскопии кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, в лаборатории зоонозных инфекций ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора, а также в хозяйствах Омской области.

Объектом исследований являлся клинически здоровый крупный рогатый скот различных возрастов и с выраженными клиническими признаками анаплазмоза.

Использовали эпизоотологические, клинические, патологоана-томические и лабораторные методы диагностики инфекционных болезней.

Прижизненно от животных исследовали пробы крови, молока, молозива, цервико-вагинальной слизи, бронхиальной жидкости, полученную методом бронхоальвеолярного лаважа, мазки крови. Кровь для серологических исследований брали из ярёмной, а для гематологических — из краевой ушной вен. Ма

Д1 РОССИЙрКАЯ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА териалом для посмертных исследований служил пробы патологического материала, полученные от вынужденно убитых и павших животных: печень, почки, селезенка, легкие, сердечная мышца, лимфоузлы. Всего исследовано 170 голов крупного рогатого скота в возрасте 1,5-3,5 лет и 55 телят 4-6 мес. возраста из разных хозяйств Омской области.

Применяли стандартные и дополнительные, разработанные в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней методы серологической диагностики — прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РПИФ и РНИФ) для прижизненного выявления антигенов и антител (А.П. Красиков, В.Э. Малошевич, 2005). Фиксацию мазков проводили по методу Мо-ди с соавт. (1958), а постановку РНИФ по методике, предложенной Уэллером и Кунсом (1945). В качестве антигенов применяли: антигены вакцинных штаммов и стандартные антигены, используемые для постановки РА и РСК, а в качестве антител — гомологичные антигенам кроличьи и бычьи антисыворотки, антивидовые для РНИФ и специфические сальмонеллезные, риккетсиозные, листери-озные для РПИФ люминесцентные сыворотки меченные ФИТЦ (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Мазки просматривали под люминесцентным микроскопом ЛЮМ Р-8 при увеличении в 900 раз. Степень флуоресценции антител оценивали по 4-х крестной системе (Вайтекер и др., 1958). При этом кроличьи сыворотки против возбудителей хламидиоза, ИРТ, диплококкоза, стрептококкоза и стафилококкоза были получены и изучены на специфичность и чувствительность в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней (Н.В. Лобанова, 2004).

В лабораторных опытах использовали белых мышей (6 дн. и 11,5 мес. возраста), кроликов (5-6 мес. возраста), культуры микроорганизмов, выделенные из патологического материала от крупного рогатого скота. В работе использованы также лабораторные линии клещей D. reticulatus (во втором поколении) и D. silvarum (в четвёртом поколении), полученные из клещей, собранных на территории

Тюкалинского района Омской области (D. reticulatus) и на территории Бурятии (D. silvarum).

В качестве материала для заражения иксодовых клещей использовали 10%-ную суспензию из селезёнки больной анаплазмозом коровы в острой форме (глубокая анемия, температура тела — 40,8°С, расстройство сердечной деятельности, истощение, атония желудочно-кишечного тракта, отёки век, подгрудка, паразитемия - 36% заражённых клеток).

Голодных половозрелых клещей (самец и самка) заражали интрацело-мально с помощью микроинъектора путём прокалывания мембраны у основания четвёртой коксы клеща, в дозе 0,2 - 0,3 мкл. Всего заражено 140 голодных половозрелых особей (самцы и самки) по 70 экземпляров на каждый вид клещей.

Для изучения восприимчивости клещей D. reticulatus и D. silvarum к возбудителю анаплазмоза крупного рогатого скота (A. sp. Omsk), их исследовали через 14 дней, а для определения сохраняемости в теле беспозвоночного, при итрацеломальном заражении - через 60 дней. Исследования проводили индивидуально по 30 особей от каждой линии клещей, путём тотального приготовления мазков-отпечатков. При индивидуальном исследовании членистоногих го-могенезировали в пластиковых пробирках для микропроб. В работе использовали 1 % суспензию клещей, гомогенаты из членистоногих суспензировали в 0,2 мл. 0,01 М ФСБР, рН 7,2 - 7,4. До исследования суспензии членистоногих хранили в течение суток при температуре +4°С, при более длительных сроках, при -20°С.

Клиническое проявление инфекционных болезней крупного рогатого скота наблюдали в хозяйствах Омской области. Из общих методов исследования использовали осмотр, пальпацию, термометрию, подсчет пульса и количества дыхательных движений. Гематологические исследования проводили по общепринятым методикам.

Вынужденному убою с диагностической целью подвергали животных с выраженными клиническими признаками болезни.

Отбор патологического материала для микроскопии и посева на клеточные культуры проводили согласно общепринятым методикам.

В процессе выделения чистых культур изучали их морфологические, тинкториальные, культуральные и вирулентные свойства.

Изучение морфологических и тинкториальных свойств выделенных микроорганизмов осуществляли при окраске мазков - препаратов по Романовскому-Гимза. Микроскопирование проводили при помощи светового микроскопа МБИ-15 с иммерсионным объективом при увеличении (100x15). Интенсивность паразитемии оценивали определением количества анаплазм в 100 полях зрения микроскопа.

Заражение культур клеток Vero проводили приготовленной суспензией из селезёнки от больной анаплазмозом коровы. Культуру клеток Vera выращивали в стеклянных флаконах в концентрации 150 тыс. на 1 мл. В качестве питательной среды использовали Игла MEM с двойным набором аминокислот, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и антибиотиков (пенициллин в дозе 1млн. ЕД. и стрептомицин в дозе 500тыс. ЕД. на 1 мл.). На следующие сутки после образования монослоя проводили замену среды роста на среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки). Подготовленные флаконы заражали суспензией полученной из селезёнки, в дозе 0,5 мл на флакон. Флаконы с заражёнными клетками Vera центрифугировали при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 1 часа, после центрифугирования среду поддержки меняли на новую. Флаконы помещали при анаэробных условиях и 36°С на 8 суток. После завершения инкубации все флаконы промораживали при -20°С в течение 30 мин, а затем оттаивали при +18°С. После оттаивания, клеточную взвесь центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин и для дальнейшей работы отбирали супернатант. Для накопления антигенной биомассы, анаплаз-мы пассировались до 8 пассажей. Культуру клеток с анаплазмами после каждого пассажа просматривали при помощи световой и люминесцентной микроскопии.

Патогенные свойства выделенных культур изучали при постановке биологической пробы на белых мышах, которым внутрибрю-шинно вводили по 1 мл на голову культуры A. sp. Omsk выращенной на культуре клеток Vero. Наблюдение проводили в течение 30 суток. Животных, оставшихся в живых, по истечении срока наблюдения де-витализировали с помощью эфира.

Трупы вскрывали, из внутренних органов готовили мазки-отпечатки, которые окрашивали по Романовскому-Гимза.

Для изучения субмикроскопического строения анаплазменных клеток взвеси исследуемых культур фиксировали в смеси глутарово-го и параформальдегидного растворов. После промывки фосфатным буфером и дополнительной фиксации в 1% растворе четырёх окиси осмия обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и ацетоне. Приготовленный материал заключали в аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме УМТП-4. После контрастирования срезы исследовали под электронным микроскопом ЭМ — 125.

Видоспецифические сыворотки к полевому штамму анаплазм получали путём гипериммунизации кроликов по схеме D. Schimmel в модификации Красикова А.П. и Новиковой Н.Н. (2002). Для постановки РНИФ использовали ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ, изготовленный НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Для постановки ПЦР из селезёнки вырезали кусочки размером 1x1x1 см3. Пробы паренхиматозных органов (селезёнка) тщательно растирали в отдельных фарфоровых ступках или стеклянных гомогенизаторах, добавляли по 1 см3 физиологического раствора и тщательно перемешивали. Смесь отстаивали при +20-25°С в течение 30 мин, затем верхний слой переносили в одноразовые полипропиленовые пробирки типа «эппендорф», содержащие лизирующий раствор 4-х молярного гуанидин - изоционата. Двухраундовую ПЦР с применением ро-доспецифических праймеров с последующим секвенированием положительных образцов ДНК проводили совместно с сотрудниками Новосибирского института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Опыты по сравнительному изучению химиотерапевтической эффективности некоторых препаратов тетрациклинового и фторхинолонового ряда, а также лекарственной смеси спирта с риванолом и азидина с нилвермом проводились в 3-х хозяйствах Омской области: в ЗАО «Колос» Павлоградского района, СПК «Большевик» Полтавского района, АОЗТ «Новороссийское» Нововаршавского района на спонтанно инфицированном крупном рогатом скоте. Для формирования опытных групп в данных хозяйствах провели обследование на анаплазмоз 120 голов крупного рогатого скота разных возрастных групп. По клиническим признакам (анемия, гипотония преджелудков, истощение), а также по положительным результатам гематологических исследований (микроскопия мазков крови из краевой вены уха) по принципу аналогов было сформировано 10 опытных и две контрольные группы животных, спонтанно инфицированных возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота. Схемы опытов представлены в табл. 3.1.1.

Расчёт экономической эффективности применения схем лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота осуществляли в соответствии с методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утверждённой Министерством сельского хозяйства и продовольствия РФ, Департаментом Ветеринарии, Московской государственной академией ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (1997).

Статистическую обработку материалов проводили согласно общепринятым методикам (А. М. Мерков, JI.E. Поляков, 1974).

Часть исследований была проведена совместно с сотрудниками Новосибирского института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН им. М. Лаврентьева (Pap В.А., Морозова О.В.), ФГУ Омского НИИ при-родно-очаговых инфекций Роспотребнадзора (И.Е. Самойленко, В.В. Якименко, Г.П. Юртова), а также с сотрудниками ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ: лабораторий электронной микроскопии (Т.А. Беспалова), резистентности молодняка (В. И. Зайнчковский, В. С. Сороковой), кафедр ветеринарной хирургии (В.И. Самчук), внутренних незаразных болезней, фармакологии и токсикологии (С.В. Савицкий), аспирантами (Н.П. Бронникова), ОмГМА (J1.B. Кумпан), которым выражаем глубокую благодарность.